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Clonación en Fagos
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Escrutinio de la biblioteca con sonda
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Bibliotecas genómicas
DNA genomico
Digestion con enzima de restriccion
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Bibliotecas de cDNA
Cebador de oligo dT Reverso transcripcion
Sintesis de DNA doble cadena
RNA mensajero
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Bibliotecas genómicas vs. Bibliotecas de cDNA
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Clonación en Cósmidos
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Cromosomas artificiales
Se pueden clonar hasta 1,000,000 nucleótidos
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La tecnología de DNA recombinante genera herramientas para estudiar los genes y sus productos
Insertar en vector de expresión
Transformar E. coli u otro hospedero
Deducir secuencia de aminoácidos
Preparar péptidos sintéticos
Preparar anticuerpos específicos para una proteína
Secuencia de aminoácidos
Anticuerpo específico
Sintetizar sonda específica
Escrutinio de una biblioteca de DNA por Southern blot
Escrutinio de una biblioteca de expresión por Western blot
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Análisis global de los genomas
TRANSCRIPTOMA
PROTEOMA
INTERACTOMA
METABOLOMA
SNPs
RNAs pequeños
Polimorfismos de un solo nucleótido: Este tipo de análisis permite detectar mutaciones, variaciones genéticas entre individuos, y base hereditaria en un organismo
Análisis global de la expresión genética: Permite obtener información rápida, detallada y comparativa del estado en la expresión de genes en diferentes tipos celulares, tejidos u órganos, estados de desarrollo, condiciones o mutantes específicas
Análisis global de la función de proteínas: Información de redes metabólicas y de interacción sistemática entre proteínas en un organismo
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Arreglos (Arrays, Chips) de DNA
Macroarreglos: el tamaño del spot es de ~ 300 micras
Colección ordenada de secuencias de ácido nucleico que proporciona un medio para aparearlas con una muestra problema facilitando la determinación de los niveles de dichas secuencias en la muestra y la identificacón de genes desconocidos.
Microarreglos: el tamaño del spot es de ~ 2-5 micras
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Análisis de microarreglos con dos marcas
problema control
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Transformacion en celulas eucariontes
Transformación directa
Biobalística
Microinyección
Virus
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Métodos de transfección Permeabilización química de las membranas Electroporación Liposomas
Vectores
Vectores derivados de virus animales SV40 Retrovirus Vacuna Vectores mixtos
Métodos de selección
Detección de actividades enzimáticas Resistencia a inhibidores Resistencia a antibióticos
Integración dirigida
Clonación en células animales
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Vectores de expresión para células animales
Promotor inducible para animales
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Creando ratones Knockout
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El resto de características de los vectores de expresión son similares
Promotor del gen X Gen reportero
5’UTR X 3’UTR X
Construcción de Reporteros
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Proteínas reporteras
Proteína verde fluorescente (GFP)
Beta-glucoronidasa (GUS)
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Luciferasa de luciérnaga (LUC)
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Las regiones reguladoras del promotor se pueden clonar individualmente ó en combinación
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Transformación de células vegetales
Agrobacterium tumefaciens
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Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens
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Transformación por biobalística
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¡ Muchas gracias por ser un grupo tan bueno y con ganas de saber !
El Fin ¿ O solo el principio ?