Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa I Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Gua Trabajos Prcticos 2011 Docentes: Alvarez Hedun, Facundo; Morgenfeld, Mauro;

Perez Castro, Carolina, Wirth Sonia

Trabajo Prctico N1:

PRODUCCIN DE AMILASAS FNGICAS

Objetivos:

1. Aislar cepas fngicas capaces de producir amilasas.

2. Producir extractos enzimticos con actividad amilasa.

3. Inmovilizar los extractos enzimticos conservando su actividad.

4. Determinar la actividad hidroltica del almidn en los extractos de cada cepa.

5. Evaluar el rendimiento del proceso de inmovilizacin

Introduccin:

La molcula de almidn puede ser degradada por un conjunto de enzimas que incluyen: -

amilasa, -amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras. Cada una de dichas enzimas posee una actividad caracterstica, generando diferentes productos como se muestra en la figura.

Las amilasas, tanto de origen fngico como bacteriano, son producidas a gran escala para su utilizacin en la industria alimenticia y de la produccin de combustibles. Sus usos ms importantes incluyen:

Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas utilizadas como espesantes;

Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizado en la fabricacin de numerosas confituras (dulces, helados y tortas entre otros);

Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y repostera, confituras y bebidas no alcohlicas;

Remocin del almidn utilizado como apresto en la industria textil;

Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa, sustrato de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa;

Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible.

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Diseo Experimental

Parte I: Aislamiento y Screening de los hongos productores de amilasas

Da 1: Aislamiento

Se colocan semillas en placas de Petri sconteniendo medio de agar slido (YPD) conteniendo 5 % NaCl (para evitar el desarrollo de especies del grupo Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28C durante 7 das.

Da 2: Screening de cepas productoras de amilasas

Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican con un escarbadiente o ansa estril en paralelo por un lado en cajas de Petri con agar YPD y por otro en cajas de Petri con medio slido de almidn 1 % y gar 2%. Se incuba a 28C durante 4-7 das.

Da 3: Screening de cepas productoras de amilasas (2 parte)

Las cepas productoras de enzimas hidrolticas del almidn se detectan observando el halo de degradacin del almidn (crculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la deteccin, se revela la presencia de almidn en el medio por el agregado de solucin de I2/KI (0.026 % I2 + 0.26 % KI) que se acompleja con el polisacrido dando una coloracin azul.

Parte II: Produccin de amilasas

Da 3: Produccin de esporas

Las colonias con actividad amilsica se repican en tubos en pico de flauta conteniendo medio de 5 % salvado triturado y agar 2 %. Se estra con ansa cada colonia en un pico de flauta. Se incuba a 28C durante 5 das.

Da 4: Produccin de enzimas por fermentacin en sustrato slido

Las esporas de cada pico de flauta se resuspenden en 5 mL de solucin acuosa de Sarkosyl 0.05 %. Se inocula 1 mL de la suspensin de esporas en Erlenmeyers de 250 mL conteniendo 5 g de salvado y 5 mL de agua destilada. Se incuba a 28C durante 5 das.

Da 5: Extraccin de las enzimas

La enzimas extracelulares producidas en la fermentacin del salvado por el hongo se extraen con 50 mL de NaCl 1 %. Agitar durante 30 min a temperatura ambiente. Filtrar por papel de filtro y conservar el eluido.

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Parte III: Inmovilizacin Enzimtica

Da 5: Inmovilizacin enzimtica

El extracto enzimtico se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacrido soluble en agua producido por algas. En una solucin con iones divalentes, como el Ca2+, el alginato polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al polimerizar una solucin de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se generan.

Para la inmovilizacin se colocan 10 mL del extracto enzimtico en un vaso de precipitado. se agregan 100 mg de alginato de sodio (1.0 % final) y se homogeiniza. Con pipeta automtica de 1ml se hace gotear la solucin en un vaso de precipitado conteniendo solucin de CaCl2 200 mM contando las gotas de forma de poder estimar el nmero de gotas equivalente a 1ml. Se producen esferas de 3-5 mm de dimetro que polimerizan al entrar en contacto con la solucin de CaCl2. Las esferas se estabilizan durante 1 h en la solucin de CaCl2 a temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer acetato 0.1 M, pH: 5.

Parte IV: Medicin de la actividad enzimtica

Da 5: Medicin de la actividad enzimtica

La actividad amilsica se determinar utilizando almidn como sustrato. Se cuantificar la desaparicin del sustrato a partir de un test colorimtrico basado en la reaccin del Yodo con el almidn mediante espectrofotometra.

La solucin de sustrato consiste en una solucin de almidn tamponada (0,1 % almidn, 0.15 M NaCl, 0,1 M acetato de sodio pH 5.0).

Cada grupo dispondr de dos tubos falcon con 25ml de sustrato rotulados con el nmero de cepa y el tipo de extracto a evaluar (soluble o inmovilizado). Los tubos se colocarn en un bao trmico a 28C al menos 5 antes de largar la reaccin. Se tomar 0,5ml

La reaccin enzimtica se detiene por el agregado de un revelador (0.006 % I2 + 0.06 % KI en HCl 0.02 M) del almidn remanente en la solucin de incubacin. El iodo de la solucin de I2/IK se acompleja con la amilosa nativa, con su estructura tridimensional intacta. El complejo iodo-amilosa se cuantifica midiendo la absorbancia a 640 nm con un espectrofotmetro.

La reaccin consiste en incubar 0,5mL de extracto enzimtico (soluble o su equivalente s inmovilizado en esferas) con 25 mL de solucin de sustrato. La incubacin se realiza a 37C y se detiene por el agregado de 1 V de solucin revelador. El protocolo se detalla a continuacin:

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Para cada cepa seleccionada:

1) Disponer falcon con 25ml de Sustrato en bao termosttico a 28C

2) Disponer 5 tubos eppendorf con 0,5ml de Revelador rotulados: 0, 5, 10, 20 y 40

3) Trasvasar 0,5ml de Sustrato al tubo 0

4) Agregar 0,5 ml de extracto enzimtico (o su equivalente en extracto inmovilizado) al falcon con sustrato, mezclar por inversin y prender cronmetro (t0)

5) Repetir paso 4) a los 5, 10, 20, y 40 con los tubos eppendorf respectivos (5, 10, 20 y 40).

6) Leer absorvancia 640nmCentrifugar

Paralelamente se realizar una curva de calibracin con diluciones de almidn en el rango 0,1%-0%. Para cada punto se agregar 1V de Revelador y se determinar la absorvancia a 640nm.

Unidad Amiloltica: es la cantidad de enzima capaz de degradar 1mg de almidn en 1 minuto en las condiciones de reaccin dadas (28C, almidn 0,1% , pH, etc, )

Curva Patrn Almidn:

Almidn

% 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

mg/ml 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

mg 25 20 15 10 5 0

Abs. 640 nm

1

2

prom. A partir de estos datos se determinar la constante que vincula Abs con [Almidn]

Datos Extractos:

Abs 640nm mg Almidn Cepa # Tipo extracto 0 5 10 20 40 0 5 10 20 40

SOLUBLE

promedio

INMOVILIZADO

promedio A partir de estos datos se determinar la cantidad de UA obtenidas en extracto as como su aactividad

especfica (UA/ ml) as como el rendimiento obtenido en el proceso de inmovilizacin (%)