guia de metodos de analisis por hplc 2012

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

ESCUELA DE QUIMICA

FACULTAD DE CIENCIAS

INSTRUMENTAL ANALITICO

GUIA DE METODOS DE ANALISIS POR

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

Caracas 2008

Profa. Rosa Amaro

Prof. Luis Gómez

Prfa. Yosmery Vita

TABLA DE CONTENIDO

Contenido Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C. ............................................................... 3

Justificación .............................................................................................................................................. 3

Objetivos. ................................................................................................................................................. 3

Parte Experimentales ................................................................................................................................ 3

Referencia ................................................................................................................................................. 5

Determinación de cafeína en refresco (PEPSI) ............................................................................................ 6

Justificación .............................................................................................................................................. 6

Objetivos .................................................................................................................................................. 6

Parte Experimentales ................................................................................................................................ 7

Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico ............................................. 9

Justificación .............................................................................................................................................. 9

Objetivos .................................................................................................................................................. 9

Parte Experimental ................................................................................................................................. 10

Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra

biológica ..................................................................................................................................................... 13

Justificación ............................................................................................................................................ 13

Objetivos ................................................................................................................................................ 14


Bibliografia ............................................................................................................................................. 16

Determinación de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en analgésicos. ................................... 18

Justificación ............................................................................................................................................ 18

Objetivos. ............................................................................................................................................... 19


Estudio Cualitativo ................................................................................................................................. 21

Estudio Cuantitativo ............................................................................................................................... 22

Referencias ............................................................................................................................................. 23

Determinación de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C.

Justificación

Objetivos.

GGeenneerraall::

Determinar el contenido de ácido ascórbico en una pastilla de vitamina C

usando la técnica de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC), a

fin de familiarizar al alumno en el uso de dicha técnica.

EEssppeeccííffiiccooss::

Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de

cromatografía líquida de alta eficiencia.

AApprreennddeerr eell ttrraattaammiieennttoo aaddeeccuuaaddoo ddee llooss ssoollvveenntteess yy mmuueessttrraa:: ffiillttrraacciióónn yy

ddeessggaassiiffiiccaacciióónn ddee llooss mmiissmmooss..

Ajustar los parámetros instrumentales, que permitan obtener una buena

separación de los picos en la muestra de vitamina C.

Preparar patrones de ácido ascórbico.

Analizar cuantitativamente la pastilla de vitamina mediante el uso de una

curva de calibración.

Parte Experimentales

Instrumentación

Cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia: Jasco L6-2080-02 Terniary gradient, Jasco

PU-2080 plus HPLC pump, Desgasys Populaire.

Detector: UV/Vis – 2075 plus ( Fotomultiplicador)

Jeringa: Tipo Hamilton, apreciación: 2 μL

Columna de acero Inoxidable (C18) Longitud: 250 mm Diámetro interno: 4.6 mm y

Tamaño de partícula: 5 (μm)

Preparación del Sistema HPLC

1. Emplear eluentes grado HPLC.

2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica.

3. Desgasificar los eluentes por un tiempo aproximado de 10 min con

ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He..

4. Escoger el eluente y/o los eluentes a utilizar en la separación cromatográfica

para poder realizar la purga con estos.

5. Realizar la purga del equipo mediante la apertura de la válvula de la bomba

(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow en un

valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido luego

de esto presionar el botón “pump” para encender la bomba y dejar la purga por 5

min. aproximadamente.

6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo

contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos.

7. Colocar el flujo en 0,2 mL/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se

hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la

bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1

mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la

muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.

Condiciones Experimentales

Volumen de inyección 10μL

Detección a 254 nm

Flujo: 1mL/min

Fase móvil: 50 mM de KH2PO4

Preparación de la curva de calibración.

Se prepara una madre de 200 ppm de

acido ascórbico.

Se preparara cuatro patrones de 5/10/15/

20 ppm a partir de esta madre

Se inyectan al HPLC y se realiza una curva de calibración

graficando los valores de área de pico en función de la

concentración

Preparación de la muestra

Se pesa la pastilla inicialmente (Dato que debe ser colocado en el informe)

SSee ppuullvveerriizzaa llaa ppaassttiillllaa::

ssee ppeessaann ttrreess mmuueessttrraass ddee 00..3300000000 gg

SSee ddiissuueellvveenn eenn aagguuaa yy ssee eennrraazzaann eenn 110000mmLL..

SSee rreeaalliizzaa uunnaa ddiilluucciióónn ddee 00..4400mmLL eenn 2255 mmLL ddee ccaaddaa uunnaa ddeessppuuééss

ddee ffiillttrraarr llaa mmuueessttrraa eenn uunn ffiillttrroo ddee cceelluulloossaa

Se inyectan al cromatógrafo por triplicado

Referencia

Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001

Editorial Mc Graw Hill.

Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág.

636-677. Año 2001.

Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. “Determinación de

fósforo y cafeína en bebidas de cola”. Educación química. V.12, pág. 116-120,

año.2001.

http://www.fad.es/sustancias/psicofármacosestimulantes., Revisado 12/11/07.

Determinación de cafeína en refresco (PEPSI)

Justificación Un grupo importante de consumidores de refrescos es la población universitaria. Se

piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un

excesivo consumo de estos productos no causa más daño que caries dental y un

aumento de peso debido al alto contenido de azúcar. Un refresco contiene ácido

fosfórico, cafeína y nuez de cola entre sus componentes principales, estos elementos

pueden llegar a causar diferentes trastornos al organismo. El fósforo está relacionado

con el calcio tanto en la nutrición humana como en la absorción de este mineral... La

cafeína, por su parte, es la droga psicotrópica de mayor consumo en el mundo, es un

compuesto alcaloide (del grupo de las xantinas) que actúa como estimulante en los

humanos. La cafeína produce vasoconstricción; presenta efectos a nivel de los sistemas

cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, actúa a nivel de los

músculos esqueléticos, del flujo sanguíneo renal, la glucogenólisis y de la lipólisis. El

consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicación. Sus síntomas son

insomnio, nerviosismo, excitación, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas

gastrointestinales. En algunas personas los síntomas aparecen consumiendo cantidades

muy pequeñas, como 250 mg por día. Más allá de un gramo al día puede producir

contracciones musculares involuntarias, desvaríos, arritmia cardiaca, y agitaciones

psicomotrices. Los síntomas de la intoxicación con cafeína son similares a los del

pánico y de ansiedad generalizada. La *LD50 estimada de la cafeína es de 10 g, cuyo

equivalente es de un promedio de 51 tazas de café.

Objetivos

General:

Determinar el contenido de cafeína en una lata de refresco (PEPSI) por HPLC.

Específicos:

Ajustar las condiciones experimentales para la determinación de la cafeína en el

refresco.

Determinar el contenido de cafeína en la muestra problema aplicando el método de

calibración absoluta.

Determinar la exactitud y la precisión de los resultados analíticos obtenidos a través

del método aplicado.

http://es.wikipedia.org/wiki/Alcaloide

http://es.wikipedia.org/wiki/Metilxantina

http://es.wikipedia.org/wiki/Estimulante

http://es.wikipedia.org/wiki/P%C3%A1nico

http://es.wikipedia.org/wiki/Ansiedad

http://es.wikipedia.org/wiki/LD50

Parte Experimentales

Instrumentación















(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow en

un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como preestablecido

luego de esto presionar el botón “pump” para encender la bomba y dejar la purga

por 5 min. aproximadamente.

6. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario

si se va emplear mezcla de eluente colocar programación de los mismos.


hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a la

bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1

mL/min hasta llegar a 1 mL/min.

8. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra

a analizar y los patrones para la cuantificación.



Detección a 254nm

Flujo: 1mL/min

Fase móvil: 60% agua, 40% metanol



La muestra es desgasificada en un ultrasonido por 15

min o una corriente de He por 3 min.

La muestra es diluida en un factor de ~1/4, se filtra en

un filtro de celulosa y esta se inyecto directamente al

cromatógrafo

Se prepara una madre de 2000 ppm de

cafeína.

Patrón de 100 ppm

Se prepararon cinco patrones de 10/20/30/

40/50 ppm

Se inyecta los patrones y se realiza una curva de calibración

graficando los valores de área de pico en función de la

concentración

Determinación cualitativa y cuantitativa de HAP en particulado atmosférico

Justificación El particulado atmosférico contiene muchos metales pesados, óxidos acídicos,

sustancias orgánicas y virus bacteriales, los cuales afectan el ambiente atmosférico y

causan daños a la salud humana. Por lo tanto, el estudio del particulado atmosférico es

un campo vital de la ciencia ambiental. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)

están ampliamente distribuidos en el ambiente, y algunos tipos de PAHs tienen

características orgánicas carcinógenas y/o mutagénicas.

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son compuestos constituidos por anillos

bencénicos condensados. Son compuestos cancerígenos cuyos efectos se activan por

medio de una enzima, el citocromo P450, presente en el hígado. Esta enzima metaboliza

el tolueno y otras sustancias xenobióticas (moléculas extrañas al organismo). La enzima

incorpora oxígeno a la estructura del PAH, originando aductos tipo epóxidos, que

reaccionan fácilmente con las bases heterocíclicas del ADN, alterando los genes.

Los PAHs se forman como subproductos de la combustión del carbón. Aunque se

encuentran presentes a bajas concentraciones en los gases de escape de los automóviles,

su presencia aumenta en las partículas de hollín emitidas por los motores Diesel o en el

humo desprendido en la quema de carbón o incendios forestales.

En los últimos años, se ha focalizado la investigación de los PAHs en particulado

atmosférico, en particular, se ha evaluado el tipo de particulado, distribución del tamaño

de partícula, la concentración y fuentes de PAHs, específicamente, por técnicas

cromatográficas acoplados a masas. Basados en todas la investigaciones previas, el

objetivo de este trabajo es, determinar y cuantificar los PAHs presentes en muestras

determinadas de particulado, atmosférico y de suelos, por medio de cromatografía de

gases y cromatografía líquida de alta eficiencia a fin de comparar los resultados

obtenidos por ambas técnicas y establecer las ventajas y desventajas de cada técnica

Objetivos General

Análisis cualitativa de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) en una

muestra de particulado atmosférico líquida de (naftaleno, antraceno,

fenantreno, fluoreno y criceno)

Determinación cuantitativa de los HAP en una muestra de Particulado

atmosférico.

Específicos

Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de

líquidos (HPLC).

Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en

la manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.

Estudiar los diferentes parámetros operativos que pueden afectar la

separación (fase móvil, flujo) y encontrar las condiciones óptimas de

análisis.

Realizar el análisis cualitativo por (HPLC) para la identificación de los

componentes de la muestra mediante el uso de estándares.

Análisis cuantitativo de HAP en particulado atmosférico.

Parte Experimental

Instrumentación















(solo dar dos vueltas), y colocar el flujo en el botón designado como 2/flow

en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como

preestablecido luego de esto presionar el botón “pump” para encender la

bomba y dejar la purga por 5 min. aproximadamente.


hace pasar el eluente(s) por la columna y las demás conexiones contiguas a

la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,2 a 2 mL/min y esperar

unos 10 min.


muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.



Detección a 254 nm

Flujo: 2 mL/min

Fase móvil: 65% acetonitrilo-35% agua desionizada

Preparación de muestra

Para la muestra pese 0,5000 g y extraiga con 5 mL de acetronitrilo por una hora en un

ultrasonido, filtre en forma cuantitativa la solución y recoja el filtrado en un balón de 25

mL y luego enrace. La muestra antes de inyectar debe ser filtrada con un filtro para

jeringa para solvente orgánico de 0,45 um

Preparación de Patrones

Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en Metanol:

Tabla 1. Concentración de los hidrocarburos aromáticos policiclicos.

Compuesto Peso (g)

Pureza

(%)

Volumen aforo

(mL)

Concentración

(ppm)

Naftaleno 200

Antraceno 100

Fenantreno 100

Fluoreno 100

Pireno 100

Una vez obtenidas una dilución (solo una por componente) de cada patrón según

los rangos de trabajo mostrado en la tabla 2, inyecte los mismos para determinar

los tiempos de retención de cada PAH.

Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma

Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de

calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se

encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2

Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva

de calibración.

Compuesto Rango de concentración para la curva de calibración

Naftaleno 40-100 ppm

Antraceno 1-4 ppm

Fenantreno 5-40 ppm

Fluoreno 10-60 ppm

Criseno 10-60 ppm

Determinación del ácido hipúrico, y los isómeros orto, meta y para del ácido metil hipúrico en muestra biológica

Justificación Los solventes orgánicos se utilizan ampliamente en la industria química en general;

constituyen los componentes básicos de productos comerciales como los adelgazadores,

pinturas, tintas y adhesivos, entre otros. El abuso de estos productos puede causar

dependencia hacia la sustancia inhalada, desarrollo de tolerancia a algunos de sus

efectos y la presentación de un síndrome de abstinencia al suspender su consumo

caracterizado por estados de ansiedad, depresión, irritabilidad, fatiga y falta de

apetito (1)

. Los disolventes también están presentes en ciertos ambientes de trabajo. La

exposición industrial afecta principalmente a los empleados que desempeñan su trabajo

en la fabricación de pinturas, gomas, productos de limpieza, motores, pegamentos,

tintas o cualquier otro servicio que involucre disolventes industriales. Entre los

solventes orgánicos estudiados con particular énfasis dado su elevado grado de

toxicidad están los hidrocarburos aromáticos, los cuales son compuestos derivados del

petróleo, mediante una serie de procesos petroquímicos, en particular la destilación

catalítica, la destilación del petróleo crudo y la alquilación de hidrocarburos aromáticos

de las series más bajas (2)

. Las investigaciones que se han hecho sobre la toxicidad de los

hidrocarburos aromáticos, están principalmente enfocadas sobre tres compuestos en

particular: benceno, tolueno, y xileno, dado los efectos perjudiciales que ejercen sobre

la salud: actúan directamente como depresores del sistema nervioso central, la

intoxicación aguda por estos compuestos produce cefalea, náuseas, mareo,

desorientación, confusión e inquietud. La exposición aguda a dosis altas puede incluso

provocar pérdida de consciencia y depresión respiratoria. Uno de los efectos agudos

más conocidos es la irritación respiratoria (tos y dolor de garganta). También se han

observado síntomas cardiovasculares, como palpitaciones y mareos. Los síntomas

neurológicos de la exposición crónica pueden ser cambios de conducta, depresión,

alteraciones del estado de ánimo y cambios de la personalidad y de la función

intelectual. Por lo que existen límites máximos de exposición, reportados en

concentraciones de ppm, permitidos en personas expuestas. Estos hidrocarburos

aromáticos se absorben fácilmente en el organismo humano por diversas vías: mediante

inhalación, ingestión y en poca cantidad por vía cutánea, se metabolizan mediante la

biooxidación del anillo; si existen cadenas laterales, preferiblemente de grupos metilo,

éstas se oxidan y el anillo permanece sin modificar. En gran parte se convierten en

compuestos hidrosolubles y posteriormente se conjugan con glicina, ácido glucurónico

o ácido sulfúrico y se eliminan en la orina. Se presentan entonces ciertos metabolitos

que pueden monitorearse biológicamente; los cuales serán indicativos de los niveles

absorbidos por un individuo expuesto a estos compuestos. Para el tolueno el metabolito

correspondiente es el denominado ácido hipúrico (AH) y los isómeros orto, meta y para,

del acido metilhipúrico, los son de la exposición al xileno (3)

. El Ácido Hipúrico es un

metabolito inespecífico del Tolueno, ya que se puede producir también en la

metabolización del Etil-benceno, Ácido Benzoico, Benzoato de Sodio, ciruelas y

arándanos 11(4)

. Además, la excreción urinaria del Acido Hipúrico se inhibe con el

Etanol (5)

. Asimismo, hay supresión mutua del Tolueno con el Benceno (6)

. No obstante

sigue utilizándose como un indicador clásico de los niveles de tolueno en orina, aunque

últimamente se ha propuesto la medida de cresol, como indicador del mismo (3)

. Se

recomienda tomar la muestra urinaria del Tolueno al final de la jornada de trabajo, o

incluso, durante la jornada de trabajo, ya que la vida media biológica de éste asciende a

1.5 hrs. Con respecto a los Ácidos Metilhipúricos Urinarios (orto, meta y para) si son

metabolitos específicos de los Xilenos (o-m-p). En razón de la vida media biológica del

xileno que es de 3.6 hrs. se recomienda que las tomas de muestras urinarias se realicen

al final de la jornada de trabajo (4)

. Una parte insignificante se deposita en el tejido

adiposo con una vida media biológica de 30 hrs. pero no tiene ningún efecto

significativo en la excreción urinaria de los Ácidos Metilhipúricos 18(5)

. Dado que la

determinación de estos metabolitos se realiza en muestras de orina, debe señalarse que

el ácido hipúrico es un componente habitual de la orina, que presenta valores de

referencia (0,00 - 0,37) g de AH/ g creatinina, en personas no expuestas, mientras que el

valor límite de exposición reportado es (1,6 g de AH/ g creatinina), para el ácido

metilhipúrico dicho valor límite es de (1,5g/gr creatinina), establecidos por la American

Conference of Governmental Industrial Hygienists( ACGIH)(3)

, que determinan la

cantidad mínima de éste ácido que debe contener un individuo para no encontrarse

contaminado. Es importante señalar que estos valores de los metabolitos se reportan con

respecto a la creatinina; porque esta se usa para normalizar las orinas diluidas o

concentradas; dado que esta es un catabolito que se excreta, en términos generales, de

manera uniforme y regular, salvo que haya alguna patología, sobre todo renal, que

pueda trastocarla; por lo que la creatinina se debe medir en cada muestra(6)

.

Objetivos General

Determinar el ácido hipúrico y los isómeros (orto, meta y para) de ácido

metilhipúrico en muestras de orina, utilizando un método de fase reversa con

detector de ultravioleta/Cromatografía líquida de alta resolución.

Específicos

Familiarizar al estudiante con el uso de equipos de cromatografía de líquidos

(HPLC).

Adiestrar al estudiante en el procedimiento de inyección de la muestra y en la

manipulación y mantenimiento de la jeringa y la columna.

Evidenciar cualitativamente la presencia de ácido hipúrico y los isómeros del

ácido metilhipúrico en orina de individuos expuestos y no-expuestos a solventes

orgánicos.

Establecer las condiciones experimentales adecuadas para la aplicación del

método al análisis cuantitativo.

Parte Experimental

Instrumentación
















en un valor de 5 mL/min. presionar enter para dejar este valor como





la bomba. Al estabilizarse aumentar el flujo de 0,1 a 2 mL/min y esperar

unos 10 min.


muestra a analizar y los patrones para la identificación y cuantificación.


Velocidad de flujo: 1,4 mL/ min

Volumen de inyección: 10 µL

Detector: UV/Vis a 254 nm

Fase móvil: 1% ac. acético, 40% metanol, resto de agua desionizada (59%)

Presión del sistema:

Preparación de muestra

Se acidifican una alícuota de 20 mL a pH=2 con ácido clorhídrico concentrado se lleva

a un balón de 25 mL y se filtra con filtros de 0,45 m, adaptables a jeringa de celulosa y

posteriormente se inyecta directamente al puerto de inyección para su análisis por

HPLC

Preparación de Patrones

Prepara los siguientes patrones disolviéndolos en la fase móvil:

Tabla 1. Concentración de las madres.

Compuesto Pureza % Peso (g) Vol aforo (mL) Concentración (ppm)

ac. Hipurico 99 50 1000

2-metil ac. hipurico 98 50 1000



Con estas soluciones madres se hallara el factor de dilución de manera de no

saturar el sistema, para ello inicie con una solución de 100ppm

Una vez obtenidas las diluciones de los patrones, inyecte los mismos para

determinar los tiempos de retención de cada ácido.

Inyecte la muestra e identifique que componentes están presentes en la misma

Una vez identificado los componentes de la muestra realice las curvas de

calibración directa de cada componentes preparando 4 patrones que se

encuentren dentro de los rangos recomendados en la tabla 2

Tabla 2. Rango de concentración recomendados para prepara los patrones para la curva

de calibración.

Compuesto Rango de concentración para la curva de calibración

ac. Hipurico 0.05 – 2.0

2-metil ac. hipurico 0.05 – 2.0



Bibliografia

1. García Liñan, C. ¿Qué son las drogas?. Inhalables. Editorial Arbol S.A. de C.V.

México, 1990.

2. Enciclopedia de la Salud y el Trabajo , pp.104-282.

3. Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo. Ministerio de Trabajo y

Asuntos Sociales, Vizcaya, España. Norma MTA/MB-022/A95. Determinación De

los ácidos fenilglioxílico, mándelico, hipúrico y orto y para-metilhipúrico en

orina. Método de Fase reversa con detector ultravioleta/Cromatografía líquida de

Alta Resolución. www.mtas.es.

http://www.mtas.es/

4. American Conference of Governmental Industrial Hygienists Inc. Documentation of

the Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices, 1991, Sixth Edition,

Volume 1, BEI-171.

5. SATO Akio et. al. Chapter 28. Effects of Ethanol on Uptake, Distribution, and

Elimination of Inhaled Vapor of Organic Solvents, Biological Monitoring of

Exposure to Industrial Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana

Ogata, ACGIH Inc.1990; pp. 155-158.

6. IKEDA Masayuki, Chapter 27, Suppression of Metabolism in Workers Exposed

to Mixtures of Benzene and Toluene and to Thrichloroethylene and

Tetrachloroethylene, Biological Monitoring of Exposure to Industrial

Chemicals, Editors: Vera Fiserova-Bergerova, Masana Ogata, ACGIH Inc. 1990;

pp. 151-154.

7. Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág. 636-

677. Año 2001.

8. Daniel C Harris Análisis Químico Cuantitativo 3era Edición Editorial Reverte, Pag.

548-577 y 607-639. 2007 (Nota esta edición es la que tiene la información

requerida)

9. Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001


Determinación de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico en analgésicos.

Justificación

Los analgésicos son medicinas que reducen o alivian los dolores de cabeza,

musculares, artríticos y muchos otros achaques y dolores. Existen muchos tipos

diferentes de analgésicos y cada uno tiene sus ventajas y riesgos. Algunos tipos de dolor

responden mejor a determinadas medicinas que a otras. Además, cada persona puede

tener una respuesta ligeramente distinta a un analgésico.

La cafeína es una sustancia bastante conocida por todos pero de la que en

realidad, se ignoran muchos aspectos que pueden influir en la actividad física. La

cafeína ha sido consumida por el hombre desde hace siglos. Constituye la sustancia

psicoactiva más empleada en el mundo y se encuentra naturalmente en las hojas de té,

los granos de café y en el cacao. La cafeína es un estimulante directo y moderado del

sistema nervioso central y también estimula el corazón y el sistema cardiovascular.

La combinación del acetaminofén y la cafeína tienen como finalidad obtener un

sinergismo en cuanto al efecto analgésico. La cafeína se ha usado durante muchos años

como adyuvante analgésico. Sin embargo, los efectos analgésicos adyuvantes de la

cafeína no han sido seriamente investigados desde un pool de análisis que se realizaron

en 1984 y que demostraron que la cafeína reduce la cantidad de acetaminofén que se

necesita para conseguir el mismo efecto en aproximadamente un 40%.

Investigaciones in-vitro e in-vivo han proporcionado alguna evidencia de que la

cafeína puede tener acciones antinociceptivas por medio del bloqueo de los receptores

de la adenosina, inhibición de la síntesis de la ciclo-oxigenasa-2, o por cambios en

estados de emoción. Pero esta acción sólo se tiene en cuenta en algunos casos. Esto

sugiere que las actuales dosis usadas de analgésico y cafeína pueden influir en los

efectos analgésicos adyuvantes de la cafeína. Ensayos clínicos sugieren que la cafeína

en dosis mayores de 65mg puede ser provechosa para el aumento de la analgesia, sin

embargo, excepto para el dolor de cabeza, los beneficios son ambiguos.

En este experimento se determinará el contenido de la cafeína, acetaminofén y/o

acetilsalicílico presente en analgésicos disponibles comercialmente, usando la técnica de

curva de calibración externa. Para ello se estudiarán los efectos que tiene el cambio de

la composición de la fase móvil sobre la separación de los componentes de una mezcla

patrón de estos compuestos y se realizará un estudio cualitativo para determinar que

componentes están presentes en la muestra para su posterior estudio cuantitativo.

Objetivos.

GGeenneerraall::

Determinar el contenido de cafeína, acetaminofén y/ó acido acetilsalicílico

en una pastilla de un analgésico usando la técnica de cromatografía de

líquidos de alta eficiencia (HPLC), a fin de familiarizar al alumno en el uso

de dicha técnica.

EEssppeeccííffiiccooss::

Adiestrar al alumno de forma general en el manejo de equipos de

cromatografía líquida de alta eficiencia.

Aprender el tratamiento adecuado de los solventes y muestra: filtración y

desgasificación de los mismos.

Estudiar los efectos que tiene el cambio de la composición de la fase móvil

sobre la separación de los componentes de una mezcla.

Determinar los componentes de una muestra.

Analizar cuantitativamente la pastilla de analgésico mediante el uso de una

curva de calibración.

Parte Experimental

Instrumentación



Detector: UV/Vis – 2075 plus (Fotomultiplicador)






2. Filtrar los eluentes a utilizar en la práctica (soluciones A y B) al vacío y

emplear un filtro de 0,45μm, resistente al disolvente empleado (para la

solución

3. B emplear filtro de teflón o nylon).


ultrasonido o 3 min con burbujeo de gas He.


para poder realizar la purga con estos (ver tabla abajo).



en un valor de 1,5 mL

/min. presionar “enter” para dejar este valor como



7. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo

contrario si se va emplear mezcla de eluentes colocar programación de los

mismos.

8. Colocar el flujo en 0,2 mL

/min. y luego cerrar la válvula y de esta manera se


la bomba. Al estabilizarse la presión se puede ir aumentando el flujo de 0,2

en 0,2 mL

/min hasta llegar a 1,2 mL

/min.


muestra a analizar y los patrones para la cuantificación.


Volumen de inyección 10 μL

Detección a 254 nm

Flujo 1,2 mL

/min

Fase móvil preparar:

Una solución A con la mezcla de 10,00 mL de ácido acético y agua

grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL

Una solución B con la mezcla de 10,00 mL de ácido acético y Metanol

grado HPLC hasta llevarla a 1000,00 mL.

Estudio Cualitativo

Procedimiento:

1.- Prepare soluciones madres de 1000 mg/L de cada patrón. Para ello se disuelve cada

solido en 40,0 mL de la solución B y se enraza a un volumen 100,0 mL usando la

solución A.

2.- Prepare 50 mL de soluciones estándares individuales que contengan 10 mg/L de

acetaminofén, 300 mg/L de acetilsalicílico y 60 mg/L de cafeína. Use la fase móvil A

para realizar el enrase de cada uno de ellos.

Efecto de la Composición de fase móvil

3.- Estudie el efecto sobre el tiempo de retención de los tres componentes en estudio al

usar los tres tipos de fase móvil indicadas a continuación.

Condición % A (H2O/Hac) % B (CH3OH/Hac)

1 80 20

2 55 45

3 65 35

4.- Para ello inyecte cada uno de los patrones preparados anteriormente, una vez

filtrados en un filtro de inyectadora de nylon de 0,45 um, en las condiciones de cada

fase móvil propuesta en la tabla.

5. Proponga la fase móvil que debe utilizar para la separación de una mezcla de los tres

compuestos en estudio.

7.- Prepare 50 mL de una solución estándar que contengan 10 mg/L de acetaminofén,

300 mg/L de acetilsalicílico y 60 mg/L de cafeína. Use la fase móvil A para realizar el

enrase.

8.- Realice la separación de la mezcla de los componentes en estudio con la fase móvil

propuesta (inyecte por triplicado para el calculo de parámetros cromatográficos).

Análisis Cualitativo

9.- Prepare una solución de su muestra desconocida pesando 150 mg y disolviéndolo en

20 mL de la mezcla B y luego enrace a un volumen de 50,0 mL usando la solución A.

10.- Para determinar los componentes de la muestra de mayor concentración diluya 1

mL de la solución anterior en un balón aforado de 100 mL usando la solución A,

seguidamente para determinar los componentes de menor concentración de la muestra

tome una alícuota de 2 mL de la solución anterior y llévela a 10 mL en un balón usando

la solución A, filtre las soluciones antes de inyectarlas al cromatógrafo.

10.- Obtenga los cromatogramas de las disoluciones de la muestra desconocida.

11.- Compare los tiempos de retención obtenidos para los picos en los cromatogramas

de su muestra de analgésicos e identifique los compuestos presentes en ella.

Estudio Cuantitativo


Se prepare madres de 1000 ppm de los compuestos identificados

en la muestra disolviendo el solido en 40,0 mL de la solución B

y se enraza a un volumen

100,0 mL usando la solución A.

Prepare cuatro patrones de 25, 50 o 100 mL

(los rangos de trabajo se muestran abajo y los

patrones son mezcla de los componentes en estudio si

fuera necesario)

Compuesto Rango de concentraciones

Acetaminofen ( 5 - 20 ) ppm

Ácido acetilsalicílico ( 100 - 400 ) ppm

Cafeína ( 20 - 80 ) ppm

Se inyectan por triplicado al HPLC y se realiza una curva de

calibración graficando los valores de área de pico en

función de la concentración. Debe comprobar la linealidad

de la curva


Se determina el contenido de cafeína, acetaminofen o acido acetilsalicílico según la

muestra e indicaciones del profesor

Referencias

Principios de Análisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001


Rubinson K, Rubinson J, “Análisis Instrumental”. Prentice Hall, España, Pág.

636-677. Año 2001.

http://www.osanet.euskadi.net/r85publ01/es/contenidos/informacion/sinopsis_ce

vime/es_1225/sinopsis099.html#02

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/painrelievers.html

ttp://www.howtodothings.com/es/salud-y-vida-sana/c%C3%B3mo-utilizar-la-

cafe%C3%ADna-para-el-tratamiento-de-las-migra%C3%B1as.

Se pesa la pastilla

(Dato que debe ser colocado en el informe)

Se pulveriza la pastilla(s)

Se pesan tres muestras de 0.1500 g

Se disuelven en 40,0 mL de la solución B y se enrazan a

un volumen 100,0 mL usando la solución A

Se filtran 5 mL de las muestras con un filtro de celulosa o

nylon de 0.45 um

Se inyectan al cromatógrafo por triplicado

Se diluye la muestra 1 en 100 mL o 2 en 10 mL si lo que se

desea determinar son componentes de alta o baja

concentración, respectivamente

guia de metodos de analisis por hplc 2012

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