TEMA 8 INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Introduccion a la microbiologia de alimentos: Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. Procesos patolgicos transmisibles por los alimentos: intoxicacin e infeccin. Regulaciones legales. Mtodos de preservacin de alimentos. Microorganismos en la produccin de alimentos. 1. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. - Alimento deteriorado: aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. - Aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. - Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. - Las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables. Durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de micoorganismos predominante la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. - Cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto cada asociacin es especifica. - De todos los microorganismos presentes en un alimento solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento resultando seleccionados. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin. a. Factores intrnsecos (aw, pH , redox, nutrientes, estructuras, agentes antimicrobianos), composicin del alimento. b. Tratamientos tecnolgicos: modifican flora inicial. c. Factores extrnsecos: condiciones fsicas del ambiente. d. Factores implcitos: relaciones entre los micoorganismos establecidas como consecuencia de los factores a, b y c. Estos cuatro factores determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. 2. Procesos patolgicos transmisibles por los alimentos: Intoxicacin e Infeccin. - Hay una gran variedad de respuestas patolgicas a los alimentos (alergias, intoxicaciones, toxiinfecciones). - Diferencia entre intoxicaciones e infeccin. - Microorganismos de origen endgeno (zoonosis) o exgeno. - Para que se produzca la toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: a. Suficiente nmero para colonizar el intestino. b. Suficiente nmero para intoxicar el intestino. c. Cantidades de toxina significativas.

- Las infecciones cumplen los postulados de Koch. - En las intoxicaciones hay que demostrar la presencia de toxnas. - La funcin del microbilogo de alimentos ha de ser principalmente la de prevencin y para ello hay que considerar: a. b. c. d. e. f. g. Las fuentes de contaminacin. Las rutas de infeccin. La resistencia de los patgenos a condiciones adversas. Las necesidades de crecimiento de los patgenos. Minimizar la contaminacin y el crecimiento de los microorganismos. Tcnicas de deteccin y aislamiento. Mtodo de muestreo proporcional al riesgo.

3. Regulaciones legales. - Definicin de cada tipo de alimento o producto alimentario. - Regulaciones sobre los lmites de tolerancia de microorganismos (no puede hablarse de asusencia total). 4. Mtodos de preservacin de alimentos. - Tratamiento trmico. - Radiacin ultravioleta: agentes oxidantes. - Radiaccin ionizante: rompen molculas. - Modulacin de la actividad de agua. - Modulacin del pH. - Potencial de oxido-reduccin. - Acidos orgnicos. - Sales de curado: interacciones complejas. - Gases conservantes. - Envasado. 5. Microorganismos en la produccin de alimentos. - Fermentaciones: lquidos, slidos: aumentan la estabilidad del alimento y mejorar sus cualidades organolpticas. Microbiologa de los alimentos Introduccin a la microbiologa de los alimentos. Los microorganismos como productores de alimentos. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos. Microorganismos como agentes patgenos

transmitidos por alimentos. Factores que afectan el crecimiento bacteriano en alimentos. Crecimiento de microorganismos en medios naturales. Eliminacin de los microorganismos de los alimentos. Antagonismo lctico. 1.- Introduccin a la microbiologa de los alimentos La microbiologa de los alimentos es la parte de la microbiologa que trata de los procesos en los que los microorganismos influyen en las caractersticas de los productos de consumo alimenticio humano o animal. La microbiologa de alimentos, por consiguiente, engloba aspectos de ecologa microbiana y de biotecnologa para la produccin. Se pueden distinguir cuatro aspectos diferentes en la nicrobiologa de alimentos: Los microorganismos como productores de alimentos Desde los tiempos histricos ms remotos se han utilizado microorganimos para producir alimentos. Los procesos microbianos dan lugar a alteraciones en los mismos que les confieren ms resistencia al deterioro o unas caractersticas organolpticas (sabor, textura, etc.) ms deseables. La mayora de los procesos de fabricacin de alimentos en los que intervienen microorganismos se basan en la produccin de procesos fermentativos, principalmente de fermentacin lctica, de los materiales de partida. Esta fermentacin suele ser llevada a cabo por bacterias del grupo lctico. Como consecuencia de ella, se produce un descenso del pH, lo que reduce la capacidad de supervivencia de especies bacterianas indeseables (principalmente bacterias entricas), se acumulan en el alimento cidos orgnicos de cadena corta que, adems de su efecto antibacteriano, le confieren caractersticas de sabor agradable, y, en cuiertos casos, se acumulan compuestos antibacterianos que reducen la carga microbiana del alimento incrementando su vida media o impiden la germinacin de esporas de bacterias Gram-positivas posibles causantes de intoxicaciones alimentarias (por ejemplo: la nisina, bacteriocina producida por ciertas bacterias lcticas, es capaz de inhibir la germinacin de esporas de Clostridium botulinum reduciendo el riesgo de intoxicacin por la toxina de esta bacteria). Los alimentos fermentados comprenden productos lcteos, crnicos, vegetales fermentados, pan y similares y productos alcohlicos. Los microorganismos como agentes de deterioro de alimentos Se considera alimento deteriorado aquel daado por agentes microbianos, qumicos o fsicos de forma que es inaceptable para el consumo humano. El deterioro de alimentos es una causa de prdidas econmicas muy importante: aproximadamente el 20% de las frutas y verduras recolectadas se pierden por deterioro microbiano producido por alguna de las 250 enfermedades de mercado. Los agentes causantes de deterioro pueden ser bacterias, mohos y levaduras; siendo bacterias y mohos lo ms importantes. De todos los microorganismos presentes en un alimento slo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el alimento por lo que resultando seleccionados con el tiempo de forma que la poblacin heterognea inicial presente en el alimento va quedando reducida a poblaciones ms homogneas y a, finalmente, un solo tipo de microorganismos que consiguen colonizar todo el alimento desplazando a los dems. Por consiguiente, durante el proceso de deterioro se va seleccionando una poblacin o tipo de micoorganismos predominante de forma que la variedad inicial indica poco deterioro y refleja las poblaciones iniciales. Existen una serie de factores que dirigen esta seleccin que determinan lo que se denomina resistencia a la colonizacin de un alimento. Estos factores son: Factores intrnsecos :

Constituyen los derivados de la composicin del alimento: actividad de agua (aw), pH, potencial redox, nutrientes, estructura del alimento, agentes antimicrobianos presentes, etc. Tratamientos tecnolgicos: Factores que modifican flora inicial como consecuencia del procesado del alimento. Factores extrnsecos Derivados de la condiciones fsicas del ambiente en el que se almacena el alimento. Factores implcitos Comprenden las relaciones entre los micoorganismos establecidas como consecuencia de los afactores a, b y c. Diferentes tipos de alimentos son difenretemente atacables por microorganismos. As cada tipo de alimento se deteriora por accin de un tipo de microorganismo concreto establecindose una asociacion es especifica entre el microorganismo alterante y el producto alterado: as, por ejemplo, las carnes son los alimentos ms fcilmente deteriorables debido a las favorables condiciones para el crecimiento de microorganismos derivadas de los factores anteriores. Los microorganismos como agentes patgenos transmitidos por alimentos Por otra parte, ciertos microorganismos patgenos son potencialmente transmisibles a travs de los alimentos. En estos casos, las patologas que se producen suelen ser de caracter gastrointestinal, aunque pueden dar lugar a cuadros ms extendidos en el organismo e, incluso, a septicemias. Las patologas asociadas a alimentos pueden aparecer como casos aislados, cuando el mal procesamiento del alimento se ha producido a nivel particular; pero suelen asociarse a brotes epidmicos ms o menos extendidos en el territorio; por ejemplo, el nmero de brotes epidmicos asociados a alimentos durante los ltimos aos en todo el territorio nacional ha oscilado entre 900 y 1000 brotes anuales. Las patologas asociadas a transmisin alimentaria pueden ser de dos tipos: infecciones alimentarias producidas por la ingestin de microorganismos o intoxicaciones alimentarias producidas como consecuencia de la ingestin de ytoxinas bacterianas producidas posr microorganismos presentes en los alimentos. En ciertos casos, pueden producirse alergias alimentarias causadas por la presencia de microorganismos. En cualquier caso, para que se produzca una toxiinfeccin es necesario que el microorganismo haya producido: a) Suficiente nmero para colonizar el intestino. b) Suficiente nmero para intoxicar el intestino. c) Cantidades de toxina significativas. Los tipos de microorganismos patgenos con importancia alimentaria comprenden bacterias, protozoos y virus, en el caso de las infecciones alimentarias, y bacterias y hongos (mohos) en el caso de las intoxicaciones. Para que una bacteria pueda causar una infeccin, adems de las condiciones anteriores es necesario que el microorganismo presente un rango de temperaturas de crecimiento compatible con la temperatura corporal de los organismos superiores (40C). Esto es la causa de que patgenos vegetales no sean patgenos animales y que la mayora de psicrfilos y psicrtrofos no sean de gran relevancia en patologa.

Por su parte, un virus ser patgeno nicamente en el caso de que las clulas animales presenten los receptores necesarios para que el virus pueda adsorberse a ellas. Esta es la razn por la que hay especificidad de reino entre virus animales, vegetales y bacterianos sin infecciones cruzadas entre reinos. La procedencia del microorganismo patgeno puede ser de dos tipos: microorganismos endgenos presentes en el interior del alimento, y microorganismos exgenos depositados en la superficie del alimento. Lospprimeros suelen estar asociados a alimentos animales ya que los patgenos de animales pueden serlo de humanos, mientras que los patgenos vegetales no pueden serlo ebido a las diferencias entre ambos tipos de microorganismos. Por ltimo, debido a la importancia en salud pblica de las toxiinfecciones alimentarias, la labor del microbiologo de alimentos se dirige, en muchos casos, al control destinado a evitar el consumo de productos elaborados en condiciones deficientes y que, por tanto, sean potencialmente peligrosos. Para ello, ha tenerse en cuenta, a la hora de realizar un anlisis microbiolgico de alimentos: a) Las fuentes de contaminacin del alimento. b) Las rutas de infeccin del patgeno. c) La resistencia de los patgenos a condiciones adversas. d) Las necesidades de crecimiento de los patgenos. e) Minimizar la contaminacin y el crecimiento de los microorganismos. f) Tcnicas de deteccin y aislamiento. g) Metodo de muestreo proporcional al riesgo. Todo lo anterior obliga a la regulacin legal de las caractersticas microbiolgicas de cada alimento, lo que comprende la definicin de cada alimento o producto alimentario y las regulaciones sobre la tolerancia del nmero de microorganismos permisibles. (los llamados valores de referencia). 2.- Factores que afectan al crecimiento bacteriano en los alimentos Cuando un microorganismo se encuentra en la superficie o en el interior de un alimento, actuan sobre l todos los factores fsicos o qumicos debidos a la composicin del alimento en s y a las condiciones en las que se encuentra. En este sentido, los factores que afectan al crecimiento bacteriano en los alimentos son parcialmente equivalesntes a los factores de resistencia a la colonizacin microbiana de un alimento. Especialmente relevantes, por ser susceptibles de manipulacin tecnolgica, son los siguientes: Tratamientos que manipulan la temperatura Refrigeracin Entendemos por refrigeracin la conservacin de alimentos a temperaturas inferiores a 10C y superiores al punto de congelacin del agua. La baja temperatura es, evidentemente, un factor limitante del crecimiento microbiano. Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser trmofilos, mesfilos y psicrotrofos. Al tratar la refrigeracin de alimentos, hay que considerar varios aspectos:

La refrigeracin es un factor de seleccin de poblaciones bacterianas A temperatura de refrigeracin (0 - 5 C) los organismos psicrfilos crecen ms rpidamente que los mesfilos y, por tanto, la baja temperatura per se supone un factor de seleccin de la flora del alimento de gran importancia. Este hecho, unido a que a temperaturas inferiores a la ptima los periodos de latencia se alargan mucho, especialmente en bacterias mesfilas, hace que la poblacin bacteriana esperable tras largos periodos de refrigeracin est constituida mayoritariamente por psicrfilos, y que, por consiguiente, los procesos que se produzcan a esta temperatura sean, predominantemente, de alteracin ms que de desarrollo de microorganismos patgenos. Choque de fro Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gramnegativas que en Gram-positivas. El fro produce alteraciones metablicas en los microorganismos A baja temperatura las rutas metablicas de los microorganismos se ven alteradas, como consecuencia de su adaptacin al fro. Estos cambios metablicos pueden dar lugar a que se produzcan deterioros diferentes a los causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas. En resumen, el deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos psicrofilos porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los periodos de almacenamiento son muy prolongados. Los microorganismos patgenos son, en su mayora, mesfilos y no muestran crecimiento apreciable, ni formacin de toxinas, a temperaturas de refrigeracin correctas. Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede producirse un desarrollo muy peligroso rpidamente. Refrigeracin Se entiende por congelacin la conservacin de alimentos a temperaturas inferiores al punto de congelacin del agua. Estas temperaturas pueden variar desde la que se obtiene en un congelador casero (en torno a -2 a -10C) y las conseguidas en sistemas de congelacin ms potentes que pueden llegar a -30 a -80C. La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias y mueren. A temperaturas ms bajas (-30 C) la supervivencia de las bacterias es mayor que en temperaturas de congelacin ms altas (-2 a -10 C), sin embargo estas temperaturas tambin deterioran el alimento ms que las ms bajas. La congelacin puede producir lesiones subletales en los microorganismos contaminantes de un alimento. Este aspecto hay que considerarlo al hacer control microbiolgico. Durante la congelacin la carga microbiana continua disminuyendo. Sin embargo, las actividades enzimticas de las bacterias pueden continuar dando lugar a ms deterioro. Tras la congelacin los microorganismos supervivientes pueden desarrollarse en un ambiente en el que la rotura de la integridad estructural del alimento como consecuencia de la congelacin puede producir un ambiente favorable para el deterioro microbiano. Altas temperaturas Las temperaturas superiores a las de crecimiento ptimo producen inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones subletales. Las clulas lesionadas pueden permanecer viables; pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesin haya sido reparada.

Aunque se han observado excepciones, est perfectamente establecido que la cintica de termodestruccin bacteriana es logartmica y en ella se pueden determinar para cada microorganismo y alimento los valores de termodestruccin D y z que, en conjunto con la medida de los valores de carga microbiana inicial del alimento permiten disear el tratamiento adecuado para conseguir los niveles microbiolgicos tcnicamente aceptables. La velocidad de termodestruccin se ve afectada por factores intrnsecos (diferencia de resistencia entre esporas y clulas vegetativas, localizacin intra o extracelular de las bacterias patgenas), factores ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad, temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico (pH, aw, tipo de alimento, sales, etc.). Radiacion ultravioleta La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por tanto se pueden calcular valores anlogos a D para la irradiacin. Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta. El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. Radiacion ionizante La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto los consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN. La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una mismas especie son generalmente lo suficientemente pequeas para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos. Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistentes. En general, la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas. Los virus son an ms resistente que las bacterias a la radiacin. Actividad de agua reducida. Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. La deshidratacin es un mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la a w, durante el curado y el salazonado, as como en el almbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser aadidos, descienden la a w. Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por otros factores antimicrobianos. La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores aw ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito (cesa el crecimiento). Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia a baja aw se denominan osmfilos, xerfilos y halfilos (segn va aumentando su requerimiento de sal). Sin embargo, la baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw protege los microorganismos durante tratamientos trmicos.

pH Y LA ACIDEZ. - En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes (inorgnicos) producen una rpida bajada del pH externo, aunque su presencia en la mayora de los alimentos es inaceptable. Los cidos orgnicos dbiles son ms efectivos que los inorgnicos en la aciclificacin del medio intracelular; se supone que esto ocurre porque es ms fcil su difusin a travs de la membrana celular en su forma no disorciada (lipoflica) y posteriormente se disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimtica. - La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular. 6.- POTENCIAL REDOX. - Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas sin recurrir al oxgeno molecular: los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango de valores redox 7.- ACIDOS ORGANICOS. - La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las molculas no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la ms soluble en las membranas celulares, por esto slo los cidos orgnicos lipoflicos tienen actividad antimicrobiana. - Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento del transporte de substratos y el transporte de electrones de la forforilacin oxiclativa. como consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energa y mueren. - La mayoras de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como nhibidores del crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son ms eficaces a altas concentraciones y pH ms bajos. (Cuando el estado disociado del cido es ms infrecuente). Su empleo ms frecuente es como micostticos. - De todos los cidos el ms efectivo es el actico. 8.- SALES DE CURADO Y SUBSTANCIAS ANALOGAS. - Las sales de curado son el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y potasio; estos productos modifican el alimento base en el color, aromas, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano. - A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida; ms bien retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los productos sin tratar por el calor y el de los termotolerantes no esporulados y evitan el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento trmico ms drstico aplicado a ciertos productos curados. - Se desconoce el mecanismos excto de la inhibicin de las bacterias por el nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su desarrollo. 9.- GASES COMO CONSERVADORES.

- Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los microorganismos. El nitrgeno y el oxgeno se usan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibicin de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con xito en la desinfeccin de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han aplicado a los alimentos. - El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con eficiencia creciente cuanto ms desciende la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Su mecanismos de inhibicin no se conoce con claridad, aunque se debe a la presencia del CO2 (y quiz a la formacin de cido carbnico) y no a la ausencia de oxgeno. Los mohos y las levaduras son alga ms resistentes al CO2 que las bacterias (las Gramnegativas ms sensibles que las Gram-positivas). - La actividad antimicrobiana del dixido de azufre est relacionada con la forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de accin, aunque este gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente celulares. Su accin txica es selectiva: las bacterias son ms resistentes que los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como antifngico. - El xido de etileno resulta muy txico para los microorganismos y su actividad est relacionada con su accin como agente alquilante. Los mohos y levaduras son ms sensibles que las bacterias y estas que las esporas.

PRINCIPIOS DE HIGIENE DE ALIMENTOS 1.- Objetivos del tema 2.- Principios de higiene de alimentos 2.1.- Los alimentos como vehculos de propagacin de enfermedades Los alimentos presentan siempre microorganismos en su superficie o en su interior. Estos microorganismos pueden ser, atendiendo a su origen, endgenos (ya presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmisibles al hombre y enfermedades vegetales no transmisibles al hombre) o exgenos (se incorporan al alimento durante su manipulacin y procesado); y, atendiendo a su relacin con el consumidor, pueden ser agentes patgenos o alterantes (saprfitos). Los agentes endgenos o son inocuos (patgenos de plantas) o son eliminados en mataderos (animales enfermos) o durante el procesado (pasteurizacin). En cualquier caso, los alimentos son una va importante de transmisin de microorganismos que pueden causar infecciones e intoxicaciones que, en general tienen un tiempo de incubacin corto (2-10 h.) y suelen cursar con sndromes gastrointestinales. Puesto que algunas de estas patologas tienen una DMI (dosis mnima infectiva) muy baja es muy necesaria la higiene de los alimentos y de los procesos de elaboracin. La incidencia real de las toxiinfecciones no est clara por que solo se declara un 10 % de estas enfermedades entre las que se encuentran salmonelosis, shigelosis o disentera bacilar, gastroenteritis por Escherichia coli enteropatgeno, enteritis causada por Yersinia enterocolitica, diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otros vibrios prximos al V. cholerae, enteritis causadas por Campylobacter, enteritis producidas por Bacillaceae, intoxicaciones alimentarias agudas como el botulismo (intoxicacin por Clostridium botulinum) y la intoxicacin estafiloccica, intoxicaciones alimentarias crnicas causadas por hongos, virosis transmitidas por alimentos como la hepatitis de tipo A, enfermedades causadas por protozoos y transmitidas por alimentos y enfermedades causadas por helmintos.

Aisladamente cada una de las patologas anteriores puede prevenirse mediante un tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado cuando se trata de produccin de alimentos o comidas a gran escala puesto que en estas condiciones es ms factible una contaminacin que produce un elevado nmero de vctimas. 2.2.- Puntos crticos: anlisis y tratamiento En la elaboracin de un alimentos se pueden identificar una serie de pasos en los que puede producirse la contaminacin del alimento por microorganismos o en los que los microorganismos ya presentes en el alimento pueden multiplicarse con mayor facilidad. Estos pasos del proceso se denominan puntos crticos y sobre ellos hay que actual a la hora de mejorar las caractersticas microbiolgicas del alimento en cuestin. Un producto tiene buena calidad microbiolgica cuando sus cargas microbianas son reducidas y constantes (esto es, no presentan variaciones estacionales o de cualquier otro tipo de periodicidad que impiden que el producto sea homogneo a lo largo del tiempo). Para lograr un aumento de la calidad microbiolgica de un alimento lo que hay que hacer es determinar en la Industria cules son los crticos del proceso y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribucin del alimento (BPE). La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el desarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depende de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asimismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE.

3. Principios de control microbiolgico de los alimentos 3.1.- Funcin del control microbiolgico de los alimentos El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. La prevencin se logra como se indic anteriormente. Puesto que el control microbiolgico es un proceso analtico es necesario seguir una serie de criterios sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales. En este sentido, es necesario considerar (1) la distribucin desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de

toma de muestras para obtener resultados representativos; (2) que el nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis y (3) que los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento porque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento. 3.2.- Protocolo de toma de muestras Un protocolo de anlisis de alimentos correcto debe considerar: (1) la heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, (2) el proceso de transporte de las muestras del sitio de recoleccin al laboratorio evitando la multiplicacin de los microorganismos presentes o la inactivacin de algn microorganismo; (3) que es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora sta inocua, utilizando medios selectivos; (4) los tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selectivos y es necesaria la utilizacin de medios de recuperacin y(5) que, en cualquier caso, es necesario realizar una evaluacin sistemtica de los medios de cultivo para prevenir la variabilidad debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo. El planteamiento del muestreo del alimento es diferente si se trata de un muestreo nico (caso de una partida que llega por primera o nica vez al centro de control microbiolgico) del muestreo repetido. Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del alimento. Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento y, como norma general, es conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. En el caso de un muestreo repetido, un sistema basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. 3.3.- Microorganismos ndice e indicadores Microorganismo ndice es aqul cuya presencia alertar de la posible presencia de un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. coli ndice de S. typhi). Mientras que microorganismo indicador es aquel cuyo n?mero indica un tratamiento inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado. Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad. Los principales marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield. 3.4.- Clculo de los valores microbiolgicos de referencia Se siguen varias etapas: 3.4.1.- Sondeos o estudios exploratorios. En primer lugar se seleccionan ms de 10 industrias y valorar sus BPE corrigindolas si es necesario. Cuando se han corregido errores se toman alrededor de 10 muestras por empresa y se valoran los criterios seleccionados y con los datos obtenidos se confeccionan curvas de distribucin, en las que se calcula el percentil 95% (Figura 1) ( ) que suele estar 1 2 rdenes de magnitud por debajo de los valores mximos aceptables (DMI o NMA nivel mnimo de alteracin). Si los valores de se aproximan a los DMI o a los NMA hay que revisar las tcnicas de elaboracin y distribucin de los alimentos antes de proceder a una nueva estimacin de los valores de referencia.

3.4.2.- Deduccin de los valores de referencia a partir de datos de sondeos. Normalmente se adopta un valor algo por encima del valor (el valor m en la Figura 1), cuando se trata de microorganismos no patgenos se suele aceptar una cierta tolerancia. en el valor. Se establece un valor M, nunca esperado si se cumplen las BPE. La diferencia entre M - m es la llamada Zona de alerta cuya amplitud se establece atendiendo a la variabilidad del mtodo de recuento, tipo de alimento, modo de preparacin y poblacin de riesgo. Este valor M ha de establecerse tericamente y la relacin M/m vera entre 3 y 103 dependiendo del tipo de alimento. 3.4.3.- Utilizacin de los valores de referencia Los valores de referencia se deben determinar para cada microorganismo (o grupo de microorganismos) y alimento particular. Estos valores son muy diferentes en funcin de las caractersticas qumicas de cada alimento y, por tanto, no pueden ser tomados como valores absolutos sino como erl reflejo del compromiso entre el coste del proceso de reduccin de la carga microbiana y el beneficio de la estabilizacin e inocuidad del alimento. En cualquier caso, los valores s que representan un lmite absoluto que permite consumir el alimento sin problemas sanitarios. Cuando se realiza el anlisis microbiolgico se pregunta si el alimento se prepar o no de acuerdo a las BPE, y esta pregunta se responde evaluando el nmero de microorganismos: si la prctica de preparacin fue la adecuada sus valores microbianos deben caer dentro del reango de la referencia, si lo exceden es que la prctica no fue buena.

Como norma general se aplica el siguiente cuadro de tolerancia para un anlisis de 10 muestras donde el valor de referencia es 10s y n es la carga microbiana Carga microbiana Nmero de muestras Muestra

n < 10s

10

Aceptada

n < 10s 10s < n < 10s+1

9 1

Aceptada

n < 10s

8 menos

Rechazada

n > 10s+1

una o ms

Rechazada

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 10 RESUMEN DE LAS PATOLOGIAS MAS IMPORTANTES TRANSMITIDAS A TRAVES DE LOS ALIMENTOS 9.- Enfermedades transmitidas por los alimentos. Origen de los microorganismos patgenos presentes en los alimentos. Generalidades sobre epidemiologa y etiologa de las enfermedades transmitidas por bacterias. Intoxicaciones alimentarias agudas: enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano. Intoxicaciones alimentarias crnicas: micotoxicosis provocadas por mohos productores de toxinas activas por va oral. Infecciones cuya va de transmisin principal no son los alimentos. Virosis transmitidas por los alimentos. Enfermedades por protozoos transmitidas por los alimentos. Enfermedades producidas por helmintos. A. ORIGEN DE LOS MICROORGANISMOS PATOGENOS PRESENTES EN LOS ALIMENTOS:

Pueden ser endgenos (ya estan presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar zoonosis, enfermedades animales no transmitibles al hombre y enfermedades vegetales no transmitibles al hombre) o exgenos (se incorporan al alimento durante su manipulacin y procesado). Pueden ser agentes patgenos o alterantes (saprfitos). Los agentes endgenos o son incuos (patgenos de plantas) o son eliminados en mataderos (amimales enfermos) o durante el procesado (pasteurizacin). B. GENERALIDADES SOBRE LA ETIOLOGIA Y EPIDEMIOLOGIA DE LAS ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS: 1. Transmisin: Hay que diferenciar entre infecciones e intoxicaciones y entre infecciones con DMI (dosis mnima infectiva) o DI50 (dosis infectiva que produce la enfermedad en el 50 % de la poblacin) bajas o altas. En muchos casos no est totalmente claro si el proceso es intoxicativo o infectivo. La DMI vara entre las personas dependiendo de su estado general de salud y de la forma como se ingieren las bacterias (en ciertas condiciones las DMI pueden ser muy baja por lo que es muy necesaria la higiene). En general las enfermedades tienen un tiempo de incubacin corto (2-10 h.) y suelen cursar con sndromes gastrointestinales. 2. Morbilidad: Solo se declara un 10 % de las toxiinfecciones (aprox.) por lo que la incidencia real de estas enfermedades no est clara. 3. Factores que contribuyen a la produccin de casos y brotes de enfermedades de etiologa microbiana transmitidas por los alimentos. En general hay un doble fallo: (1) Contaminacin del alimento seguido de (2) abuso de temperatura que permite que los microorganismos proliferen. Los alimentos afectados con ms frecuencia son los animales (90 %) y las fuentes de contaminacin suelen estar en los establecimientos donde fueron servidos ms que en las plantas de procesado. 4. Manifestaciones clnicas ms frecuentes y complicaciones de las enfermedades transmitidas por alimentos: En general son enfermedades breves y de buen pronstico. cursan tras 2 - 10 h. de incubacin con sndrome gastroinestinal (dolor intestinal, diarrea, vmitos). En general no tienen complicaciones salvo en poblaciones de riesgo. C. INFECCIONES ALIMENTARIAS TRANSMITIDAS POR BACTERIAS: 1. Salmonelosis: Producidas por algunos serotipos. Su incidencia va en aumento asociada al incremento de animales portadores. Los diferentes serotipos requieren DMI diferentes, aunque hay un gran nmero de ellos que son patgenos. El origen de las salmonelas puede ser endgeno (animales portadores asintomticos) o exgeno; las prcticas ganaderas favorecen la infeccin a travs de los piensos que pueden generar portadores asintomticos y del manejo de los animales en el matadero (aves, cerdos, terneros). En cualquier caso, los nmeros inicales suele ser

pequeos y la contaminacin aparece si el alimento no es tratado correctamente desde el punto de vista trmico. Las medidas profilcticas se dirigen al control de animales portadores, procesamiento de alimentos (pasteurizacin) y reduccin de las posibilidades de contaminacin exgena. Puede ser invasiva o toxignica. 2. Shigelosis o disentera bacilar. Microorganismos productores de cuadros de disentera. Las shigelas son de origen humano y los animales no son reservarios de ellas, por lo que las contaminaciones se producen por va de la manipulacin humana del alimento. La DMI vara mucho dependiendo de si se ingiere la bacteria con alimentos slidos (alta) o lquidos como leche o agua (baja). Las medidas de prevencin se basan en reducir e higienizar la manipulacin humana y evitar el desarrollo del microorganismo con una correcta refrigeracin. Es invasiva. 3. Gastroenteritis por Escherichia coli enteropatgeno. La mayora de los serotipos de E. coli son incuos; pero hay algunos enteropatgenos (enterotoxignicos no invasivos productores de una enterotoxina termolbil de alto peso molecular, TS; y enteroinvasivos que penetran en la mucosa intestinal) productores de enfermedades en nios y adultos y en animales. Para los adultos las vas de contagio son alimentos y agua. No est clara la patogenicidad de las cepas enteropatgenas de animales para el hombre y se supone que la principal va de contaminacin es la exgena. Las medidas profilcticas se dirigen a la eliminacin de animales enfermos, control de la contaminacin por manipulacin humana y refrigeracin adecuada para evitar el crecimiento de las bacterias presentes. 4. Enteritis por Yersinia enterocolitica: Yersimia enterocolitca en una bacteria psicrotrofa que probablemente causa zoonosis y puede transmitirse a travs de alimentos animales infectados. Produce una enfermedad con posibles complicaciones reumatoides. Las medidas profilcticas son similares a las de Salmonella aunque en este caso no sirve la conservacin a baja temperaturas por el carcter psicrotrofo. 5. Diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por otros vibrios prximos al V. cholerae. V. parahaemolyticus es un bacilo Gram-negativo presente en las aguas marinas, halotolerante. Produce al ingerirlo una gastroenteritis febril en la que las heces aparecen teidas de sangre. Se ingiere con productos marinos crudos o no bien tratados. Otras especies prximas aparecen en salmueras y salazones. La profilaxis se centra en su eliminacin por coccin, prevencin de la recontaminacin y prevencin de su multiplicacin mediante refrigeracin o congelacin. 6. Enteritis por Campylobacter. Bacteria presente en el intestino de ganado vacuno, perros, aves y ovejas. Causa una infeccin entrica con vmitos, dolor agudo y diarrea explosiva. Es un organismo microaerfilo. Se puede transmitir a travs de los mismo alimentos que Salmonella o Yersimia (carne cruda de cerdo o ave, leche cruda). Produce una infeccin invasiva del epitelio intestinal. La profilaxis se centra en eliminar la bacteria del alimento, prevenir la recontaminacin y conservar adecuadamente. 7. Gastroenteritis producidas por otras bacterias entricas.

La patogenicidad de muchas enterobacterias se debe a la presencia de plsmidos transmisibles a otras bacterias del grupo que no son habitualemtne patgenas. Las formas de propagacin, ditribucin y proliaxis frente a stas son las generales para las enterobacterias. 8. Gastroenteritis bacterianas transmitidas por alimentos de etiologa dudosa. Los alimentos, con excepcin de los fermentados y madurados, que tienen altos recuentos de microorganismos han de considerarse en pricipio, peligrosos, aunque no se detecte en ellos ningn microrganismo patgeno. 9. Enteritis producidas por Bacillaceae Producidas por Clostridum perfringens o por Bacillus cereus. Se requieren altos nmeros de bacterias (105 bact gr-1) y pueden producirse en alimentos tratados trmicamente e, incluso, protegidos frente a la recontaminacin. En C. perfringens los alimentos vehculo son carnes fras o recalentadas y platos a base de carne; en B. cereus arroz y pastas. Patolgicamente ambas enteritis son diferentes: la de perfringens se produce porque se ingieren muchas bacterias que al esporular reformadas (se trata de una intoxicacin), mientras que en B. cereus se trata de una intoxicacin por una toxina preformada. Las esporas de C. perfringens son ubcuas y pueden producir problemas en todo tipo de alimentos, sobre todo carnes, piezas grandes y alimentos precocinados. Las prevencin pasa por enfriar rpidamente el alimento cocinado que no vaya a ser consumido para evitar el desarrollo de las formas vegetativas de la bacteria. D INTOXICACIONES ALIMENTARIAS AGUDAS: enfermedades producidas por la presencia en los alimentos de toxinas preformadas de origen bacteriano. 1. Botulismo: intoxicacin por Clostsiclium botulinum. C. botulinum produce una intoxicacin mediante bajas dosis de una neurotoxina muy potente que produce al esporular. Es una bacteria anaerobia que puede crecer en conservas de alimentos de pH relativamente alto (>4.5) que no se han tratado trmicamente de forma adecuada. Se ha detectado un tipo de bofulismo infantil producido por la ingestin de esporas que germinan y vuelven a esporular en el intestino produciendo de nuevo la toxina. Profilaxis: tratamiento trmico adecuado de las conservas usando tratamiento 12 D u otros agentes coadyuvantes (sal, nitratos) para alimentos con pH > 4.5. La toxina botulnica es termolbil y se destruye si se calienta la conserva. 2. Intoxicacin estafiloccica. Producida por la ingestin de alimentos en los que ha crecido una cepa patgena de Staphylococus aureus productora de enterotoxina termorresistente. La principal reserva de S. aureus es la piel, y cavidad buconasal de operarios que pueden contaminar los alimentos cuyo contenido en agua es bajo (productos de pastelera, jamon curado...) porque a mayor aw otra flora sobrecrece a S. aureus. La enfermedad es muy rpida con vmitos y dolor aguado, suele durar menos de 30 horas. Las medidas profitcticas van encaminadas a dismisnuir la contaminacin y el desarrollo de las bacterias mediante tratamientos trmicos adecuados; la destruccin de las toxinas es muy difcil dada su termorresistencia. 3. Intoxicacin por Bacillus cereus.

B. cereus como C. perfingeus, una bacteria ubcua y su ingestin en bajas cantidades es incua. Produce dos tipos de sndromes: intoxicacin diarrica (asociada a una toxina termosensible similar a la de C. perfingens que se produce durante el crecimiento exponencial y que est asociada a alimentos como sopas de ave, carne, salsas, pudding...) y una forma emtica (asociada a una toxina termorresisitente similar a la de S. aureus y asociada a arroz, y otros alimentos ricos en almidn cocinados). Profilaxis: dada la termorresistencia de las esporas hay que procurar enfriar muy rpidamente los alimentos cocinados ricos en almidn, y conservarlos a baja temperatura, para evitar el crecimiento de las formas vegetativas. 4. Sndromes causados por bacterias productoras de aminas vasopresoras. Muchas bacterias son capaces de decarboxilar activamente aminocidos produciendo aminas vasopresoras causantes de manchas rojas en la piel, mareos y, a veces, dificultades respiratorias. La relaccin dosis - efecto varia mucho de unos individuos a otros. 5. Papel de otras bacterias toxignicas. Quiz algunos estreptococos del grupo D pueden producir algunas toxinas cuando estn en grandes concentraciones (casos exticos y poco relevantes para nosostros). E. INTOXICACIONES ALIMENTARIAS CRONICAS: micotoxicosis provocadas por mohos productores de toxinas activas por va oral. Muchos mohos son productores de substancias proticas de bajo peso molecular y accin txica conocidas como micotoxinas. Elevadas ingestiones de micotoxinas pueden producir cuadros agudos facilmente detectables; pero estos casos son raros, es ms frecuente la intoxicacin por bajas dosis de micotoxinas que pueden producir intoxicaciones crnicas con efectos oncognicos o inhabilitantes en diferentes rganos (hgado, rion, cerebro). Las micotoxinas pueden ingerirse por contaminacin con mohos de alimentos de baja actividad de agua (queso, mermelada, alimentos curados, cereales) o por piensos, en el caso de animales con intoxicaciones crnicas pueden transmitir las toxinas a travs de sus productos (huevos, leche). Debido al bajo peso molecular las micotoxinas suelen ser muy termorresistentes y pueden difundir grandes distancias en los alimentos por lo que tratamientos trmicos suelen ser inefectivos y la simple eliminacin del moho no evita la micotoxina. Existe una gran preocupacin por la actividad toxignica de los mohos considerados beneficiosos presentes en algunos alimentos (queso, embutidos). Las profilaxis se centran en evitar la contaminacin por hongos de los alimentos y piensos (quesos, pan, harinas, cereales, frutas y mermeladas) no solo por razones estticas sino tambin sanitarias. E. INFECCIONES CUYA VIA DE TRANSMISION PRINCIPAL NO SON LOS ALIMENTOS: 1. Bases epidemiolgicas. Hay enfermedades transmitidas por alimentos que no presentan el cuadro de gastroenteritis tpico. En este caso es necesaria la ingestin de un nmero muy reducido de micoorganismos (bacteria, virus o gusano). En el caso de bacterias, cuando estas se ingieren en agua o entre comidas pueden provocar los sndromes con mmeros mucho menores debido a que pasan rpidamente por el estmago y el cido gstrico no puede producir en ellas efecto.

2. Enfermedadades del aparato respiratorio transmitidas por los alimentos. Tanto la difteria, producida por Corynebacterium diphteriae, como la faringitis, producida por Staphylococus pyogenes, pueden ser transmitidas por los alimentos. Ambos microorganismos son termosensibles y un tratamiento trmico adecuado y medidas higinicas para evitar la posterior contaminacin del alimento son suficientes para evitarlo 3. Otras enfermedades transmitidas por los alimentos. Histricamente la leche de vacas mastticas ha sido una va de contagio de tuberculosis producida por Mycobacterium bovis, sin embargo las prcticas de pasteurizacin habituales han eliminado esta va de contagio. Ms relevantes son las bacterias del gnero Brucella. B. melitensis provoca la fiebre de malta y se transmite por la leche de cabra u oveja, B. abortus se transmite por la leche de vaca. Ambos tipos de bacterias pueden destruirse con los tratamientos trmicos habituales de la leche o de la nata o crema. En este sentido es especialmente relevante la utilizacin de leche pasteurizada en la producccin de quesos de cabra u oveja para evitar la transmisin de la brucelosis. 4. Enfermedades entricas bacterianas transmitidas principalmente por el agua: Como se ha comentado, algunos microorganismos tienen DMI muy bajas cuando se ingieren con agua y el estmago est vacio. Salmonella y Shigella pueden producir toxiinfecciones de esta forma. Asimismo Vibrio cholerae se transmite a travs del agua. Por consiguiente es necesario hacer tratamientos de higienizacin del agua para llegar a valores de nmero de microorganismos muy bajos, y utilizar aguas de alta calidad bacteriolgica para cualquier proceso relacionado con los alimentos. F. VIROSIS TRANSMITIDAS POR LOS ALIMENTOS. El nmero de unidades infectivas que puede producir la enfermedad es muy bajo. Normalmente no suelen aislarse en los laboratorios de microbiologa de alimentos porque su manipulacin es tcnicamente compleja. 1.- Hepatitis tipo A Este virus se transmite a travs del agua contaminada con materia fecal y de alimentos muy manipulados en condiciones de higiene deficientes (ensaladas de patatas, frutas contaminadas, zumos contaminados) y productos marinos presentes en zonas costeras contaminadas. El virus es termorresistente por lo que la proflaxis ha de centrarse en la higiene del operario, agua y productos. 2. Otras virosis entricas humanas. Su incidencia real no est muy clara, se han asociado a veces al consumo de productos marinos costeros como mejillones o percebes, presentes en aguas contaminadas y no tratadas adecuadamente desde el punto de vista trmico. 3. Virosis de origen animal. En general los virus que producen enfermedades en los animales no son patgenos para el hombre, ni siquiera los oncognicos productores de tumores. En cualquier caso, estos virus se inactivan por tratamiento trmico. 1.- PICORNAVIRUS: grupo complejo de virus con ARN de doble cadena (aunque no se si todos la tienen o slo algunos). A este grupo pertenece una serie de virus interesantes como el de la Hepatitis a (transmisible por alimentos),. el virus de la polio, el del resfriado, el de la fiebre aftosa (Foot and Mouth Desease) y una serie de virus denominados enterovirtus o echovirus que viven principalmente en el intestino y que pueden causar efectos

citopticos aunque en ocasiones las enfermedades que producen no son evidentes. Es interessante tambin tener en cuenta los denominados reovirus causantes de patologas tanto a nivel de tracto respiratorio (resfriados) como a nivel intestinal (diarreas); [quiz estos virus sean responsables de los procesos diarricos asociados a ciertos resfriados u otros procesos febriles, ] . (ref. H.J. Eggers, 1995. Picornaviruses: A Historical View. ASM News 61: 121-124). G. ENFERMEDADES ALIMENTOS. POR PROTOZOOS TRANSMITIDAS A TRAVES DE LOS

Los protozoos parsitos tienen como hbitat habitual el intestino humano de donde salen a travs de las heces para, a veces, ser transportados por otros portadores secundarios. En algunas ocasiones pueden atravesar la barrera intestinal y producir infestaciones masivas. Normalmente adoptan formas de resistencia denominados quistes. Su deteccin en animales es con frecuencia difcil y por tanto la medida profilctica ms segura es el tratamiento trmico adecuado puesto que son organismos termosensibles. Las patologas ms relevantes son la disentera amebiana (producida por Entamoeba histolytica, transmitida a travs del agua, frutas y verduras), giardiasis (producida por Giardia lamblia y transmitida a travs del agua en zonas endmicas), toxoplamosis (Toxoplasma gondii transmitido a travs de la carne cruda, zoomosis de animales de compaa) y la cristosporidiosis (Cryptosporidium parvum, transmitido a travs de la carne cruda). H. ENFERMEDADES POR HELMINTOS. Los helmintos tienen ciclos biolgicos ms complicados que los de los protozoos; pero como ellos forman quistes que, al ser ingeridos, producen la infestacin del hombre. Otra va de entrada son las aguas contaminadas con huevos de los gusanos. Las enfermedades ms importantes producidas por helmintos son: Teniasis (producidas por Tenia solium de origen porcino o T. saginata de origen vacuno, que forma en los animales unos quistes denominados cistercercos), Difolobotriasis (producida por Diphyllobothrium latum, parsito de peces), la Hidatidosis o Equinococosis (producida por Echinococcus granulosus, enfermedad muy grave por los quistes que causa el gusano; al hombre suele transmitirse por los perros, aunque otras carnes o aguas contaminadas pueden ser su vehculo), la triquinosis (producida por Trichinella spiralis que forma quiste intramusculares en cerdos de granja); la anisakiasis (producida por Anisakis marina transportada por peces como el arenque); Capilariasis (producida por Capillaria philipina y transmitida por el consumo de carnes o pescados crudos, en una enfermedad que no se ha descrito en nuestra zona geogrfica) y Ascaridiosis (producida por Ascaris lumbricoides transmitida por contacto persona-persona cuando la higiene no es correcta y hay contaminacin fecal. En general las enfermedades producida por helmintos se deben al consumo de alimentos contaminados endgenamente (animales infestados) o exgenamente (contaminacin fecal en aguas u hortalizas) que se consumen crudos o insuficientemente lavdados y cocinados. Las medidas profilctica, a parte de las higinicas, pasan por la congelacin y tratamiento trmico adecuado de las carnes infestadas para inactivar las larvas enquistadas. En muchos casos, el veterinario puede detectar la enfermedad por estudio de las canales (cisticercosis y triquinosis). CONCLUSION: Aisladamente cada una de las patologas anteriores puede prevenirse mediante un tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado cuando se trata de produccin de alimentos o comidas a gran escala puesto que en estas condiciones es ms factible una contaminacin que produce un elevado nmero de vctimas.

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 9 FACTORES QUE AFECTAN A LA SUPERVIVENCIA DE LOS MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos: Temperatura: Refrigeracin, Congelacin, Altas temperaturas. Radiacin ultravioleta. Radiacin ionizante. Actividad de agua reducida. El pH y la acidez. Potencial redox. Acidos orgnicos. Sales de curado y substancias anlogas. Los gases como conservantes. 1.- TEMPERATURA.. - Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser trmofilos, mesfilos y psicrotrofos. (Tabla 1) 1.1.- Refrigeracin. - A temperaturas inferiores a la ptima, la velocidad de crecimiento de los microorganismos disminuye y los periodos de latencia se alargan mucho. - A una temperatura de refrigeracin (0 - 5 C) los organismos psicrfilos crecen ms rpidamente que los mesfilos. Po tanto, la baja temperatura supone un factor de seleccin de la flora del alimento de gran importancia. - Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gramnegativas que en Gram-positivas. - A baja temperatura las rutas metablicas de los microorganismos se ven alteradas, como consecuencia de su adaptacin al fro. Estos cambios metablicos pueden dar lugar a que se produzcan deterioros diferentes, causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas. - El deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos psicrofilos porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los periodos de almacenamiento son muy prolongados. - Los microorganismos patgenos son, en su mayora, mesfilos y no muestran crecimiento apreciable, ni formacin de toxinas, a temperaturas de refrigeracin correctas. Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede producirse un desarrollo muy peligroso rpidamente. 1.2.- Congelacin. - La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias y mueren. - A temperaturas ms bajas (-30 C) la supervivencia de las bacterias es mayor que en temperaturas de congelacin ms altas (-2 a -10 C), sin embargo estas temperaturas tambin deterioran el alimento ms que las ms bajas. - La congelacin puede producir lesiones subletales en los microorganismos contaminantes de un alimento. Este aspecto hay que considerarlo al hacer control microbiolgico.

- Durante la congelacin la carga microbiana continua disminuyendo. Sin embargo, las actividades enzimticas de las bacterias pueden continuar dando lugar a ms deterioro. - Tras la congelacin los microorganismos supervivientes pueden desarrollarse en un ambiente en el que la rotura de la integridad estructural del alimento como consecuencia de la congelacin puede producir un ambiente favorable para el deterioro microbiano. 1.3.- Altas temperaturas. - Las temperaturas superiores a las de crecimiento ptimo producen inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones subletales. Las clulas lesionadas pueden permanecer viables; pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesin haya sido reparada. - Aunque se han observado excepciones, est perfectamente establecido que la cintica de termodestruccin bacteriana es logartmica. - Se pueden determinar para cada microorganismo y alimento los valores de termodestruccin D y z. - La velocidad de termodestruccin se ve afectada por factores intrnsecos (diferencia de resistencia entre esporas y clulas vegetativas), factores ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad, temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actan durante el tratamiento trmico (pH, aw tipo de alimento, sales, etc.). 2.- RADIACION ULTRAVIOLETA. - La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por tanto se pueden calcular los valores D para la irradiacin. - Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas de una misma especie pueden tener una resistencia distinta. - El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos. 3.-RADIACION IONIZANTE. - La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es uniforme. - Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto los consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN. - La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre cepas de una mismas especie son generalmente lo suficientemente pequeas para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos. - Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistentes. - En general, la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden que la de las formas vegetativas bacterianas.

- Los virus son an ms resistente que las bacterias a la radiacin.

4.- ACTIVIDAD DE AGUA REDUCIDA. - Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. - La deshidratacin es un mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la aw, durante el curado y el salazonado, as como en el almbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser aadidos, descienden la aw. -Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por otros factores antimicrobianos. - La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a valores aw ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito (cesa el crecimiento). - Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de alto contenido de sal (Baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia a baja aw se denominan osmfilos, xerfilos y halfilos (segn va aumentando su requerimiento de sal). - La baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw protege los microorganismos durante tratamientos trmicos. 5.- pH Y LA ACIDEZ. - En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes (inorgnicos) producen una rpida bajada del pH externo, aunque su presencia en la mayora de los alimentos es inaceptable. Los cidos orgnicos dbiles son ms efectivos que los inorgnicos en la aciclificacin del medio intracelular; se supone que esto ocurre porque es ms fcil su difusin a travs de la membrana celular en su forma no disorciada (lipoflica) y posteriormente se disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad enzimtica. - La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se produce la muerte celular. 6.- POTENCIAL REDOX. - Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar energa y sintetizar nuevas clulas sin

recurrir al oxgeno molecular: los microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios negativos. cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango de valores redox. 7.- ACIDOS ORGANICOS. - La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las molculas no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la ms soluble en las membranas celulares, por esto slo los cidos orgnicos lipoflicos tienen actividad antimicrobiana. - Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un desacoplamiento del transporte de substratos y el transporte de electrones de la forforilacin oxiclativa. como consecuencia de esto las bacterias no pueden obtener energa y mueren. - La mayoras de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como nhibidores del crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son ms eficaces a altas concentraciones y pH ms bajos. (Cuando el estado disociado del cido es ms infrecuente). Su empleo ms frecuente es como micostticos. - De todos los cidos el ms efectivo es el actico. 8.- SALES DE CURADO Y SUBSTANCIAS ANALOGAS. - Las sales de curado son el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y potasio; estos productos modifican el alimento base en el color, aromas, textura y sensibilidad al crecimiento microbiano. - A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida; ms bien retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los productos sin tratar por el calor y el de los termotolerantes no esporulados y evitan el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento trmico ms drstico aplicado a ciertos productos curados. - Se desconoce el mecanismos excto de la inhibicin de las bacterias por el nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su desarrollo. 9.- GASES COMO CONSERVADORES. - Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los microorganismos. El nitrgeno y el oxgeno se usan con frecuencia en el envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la inhibicin de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se han utilizado con xito en la desinfeccin de hospitales, establos y compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han aplicado a los alimentos. - El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con eficiencia creciente cuanto ms desciende la temperatura. Este efecto se manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Su mecanismos de inhibicin no se conoce con claridad, aunque se debe a la presencia del CO2 (y quiz a la formacin de cido carbnico) y no a la ausencia de oxgeno. Los mohos y las levaduras son alga ms resistentes al CO2 que las bacterias (las Gramnegativas ms sensibles que las Gram-positivas). - La actividad antimicrobiana del dixido de azufre est relacionada con la forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de accin, aunque este gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente celulares. Su accin txica es selectiva: las bacterias son ms resistentes que los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como antifngico.

- El xido de etileno resulta muy txico para los microorganismos y su actividad est relacionada con su accin como agente alquilante. Los mohos y levaduras son ms sensibles que las bacterias y estas que las esporas.

METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales: Principios ecolgicos, Fundamentos de los procedimientos analticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, dao o lesin subletal, evaluacin sistemtica de los medios de cultivo): Necesidad de valores de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras representativas. Utilizacin de microorganismos como marcadores (ndices e indicadores). 1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos. El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es determinar en la Industria cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin microbiana (los llamados Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribuccin del alimento (BPE). La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste beneficio muy baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). En el dasarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depede de de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento; asmismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo. La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula l = log10(N0/Nc) donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N0 la carga microbiana inicial para dicho microorganismo. Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite detectar alejamientos de las BPE. 2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los productos finales. A.- Principios ecolgicos: Es necesario considerar la distribucin desigual de los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos. El nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el nmero de anlisis. Los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento poque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo de alimento. B.- Fundamentos de los procedimientos analticos:

B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El factor ms importante en el anlisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluacin de la muestra necesaria para evitar la distorsin producida por los microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por ejemplo de las canales o de las mquinas, sistemas de alimentos heterogneos (ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinacin del modo ptimo de remocin del micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o transporte de muestras. B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de las muestras se produzca: (a) Multiplicacin de los microorganismos presentes y (b) Inactivacin de algn microorganismo. En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0 C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de grmenes termotrofos.7

B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar bacterias que suponen entre 10-4 y 10de la flora normal del alimento, flora sta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos microorganismos presentes en proporciones tan bajas. Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados para determinar su selectividad y su productividad; as como no debe usarse un medio diseado para un producto en otro producto diferente porque las condiciones ecolgicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorisin de los resultados.

B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos pueden producir daos subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos rigurosamente a medios selctivos. Son necesarios medios de recupe-racin en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter y la intensidad del dao infligido, (c) El tipo de alimento en el que est el microorganismo y (d) El medio selectivo final. Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperacin: recuperacin en lquido (2 h. 25 en agua peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar, incubando luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo). B.5.- Evaluacin siotemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, tanto los generales como los selectivos, es necesario hacer controles peridicos que permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de clulas aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran volumen). Este tipo de control de los medios de cultivo se denomina ecomtrico. C. Necesidad de valores de referencia. Es necesario comparar los resultados con valores microbiolgicos de referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones tericas de la carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la produccin del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prcticas de Elaboracin). La Microbiologa de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE). 3. Muestreo. El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote para someterlas al anlisis microbiolgico. A. Muestreo nico

Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de elaboracin y conservacin del alimento. Esto es especialmente importante en partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados. Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande y no aparece ninguna en malas condiciones microbiolgicas, an hay una probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiolgicamente defectuoso. Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones reales. Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las muestras nicas estn siempre sometidas a una gran probabilidad de falsos negativos. B. Analisis repetido. Se pueden definir dos tipos de riesgomicrobiolgico: (a) el riesgo del consumidor: probabilidad de aceptacin de lotes substndard y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substndard. Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. C Planes de muestreo de tres categoras. Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica establecida conforme a los valores microbiolgicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores ms altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento]. D. Toma de muestras representativas. Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse stas de forma estadsticamente representativa utilizando tablas de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher. 4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores). A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin. Historicamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coliaerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de contaminacin final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi. B. Terminologa Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. col ndice de S. typhi). Microorganismo indicador: aquel cuyo mumero indica un tratamiento inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado.

Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador simultaneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores por razones de economa, rapidez y sensibilidad. Los princiaples marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos del grupo D de Lancefield. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Tema 12 METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II. ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES Recuento de microorganismos viables totales. Mtodos fsicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos qumicos para la deteccin de microorganismos. Mtodos inmunolgicos. Exmen de superficies. Recuentos de mohos y levaduras. 1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras lquidas u homogeneizadas). - Se trata de conocer el nmero total de microorganismos presentes en el alimento. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. - Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no lctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubacin (mesfilos, psicrfilos) los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados al vaco), puede ser de inters hacer recuentos de anaerobios totales. - Se han desarrollado tcnicas que hacen posible la automatizacin del proceso. - Hay cuatro tcnicas biolgicas bsicas tcnicas de recuento de viables:. 1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count). 2.- Determinacin del nmero ms probable. 3.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables. 4.- Contaje microscpico directo. 1.- Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra.

2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables. 4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio. 5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. 6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. 8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos). 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios. 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. ---------------- X ---------------- Adems de las tcnicas de recuento basadas en la formacin de colonias observable (tcnicas biolgicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en tcnicas qumicas, fsicas e inmunolgicas.

2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 clulas por ml-1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones. B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio

de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. C) Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. B) Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido. C) Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. D) PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin. E) Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. F) Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. G) Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos. 4. Mtodos inmunolgicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias) A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. C) Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva

y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido. E) ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli. F) Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos. 5. Examen de superficies. - Mtodos dirigidos a detectar y medir los nmeros de microorganismos presentes en superficies contaminadas. - Algunas veces es necesario aadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie. - El mtodo ms clsico de obtencin de muestra es el uso de torundas de algodn o de alginato clcico. Las muestras se recogen en seco o en hmedo y se depositan sobre medios de cultivo lquido (generales o de enriquecimiento). - En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar. 6. Recuento de mohos y levaduras. Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22C o bien mediante diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario aadir agentes antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es ms rpido que el de los mohos. MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS Tema 13 Mtodos generales de anlisis microbiolgico de los alimentos. III Deteccin de microorganismos ndices e indicadores. Deteccin de enterobacterias: principios, aspectos prcticos, metodologa. Deteccin de Escherichia coli y coliformes: principios, metodologa. Estreptococos del grupo