ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Análisis Microbiológico de Leche, Quesos y Helados a Base de Lácteos

ASIGNATURA : Microbiología de los Alimentos II

DOCENTE : Blgo. Díaz Zapata Alberto

INTEGRANTES :

Arias Matos Lisbeth

Aycachi Inga Rómulo

Chafloque Millones Alex M.

Culqui Lozada Liliana

GRUPO : Cinco (5)

CICLO : 2008 - I

Lambayeque, 22 de agosto de 2008.

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ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LECHE, QUESOS Y HELADOS A BASE DE

LÁCTEOSI. INTRODUCCION:

En su acepción más general, la leche es un alimento primordial segregado por las glándulas mamarias de los mamíferos con la finalidad de nutrir las crías en su primera fase de vida.Con la aparición de la producción láctea, los humanos inventamos un mecanismo inter – especies para amamantar a nuestra prole, así se alivió a la mujer de la función biológica a la que estaba atada, y comienza un ciclo de auto modificación, ajena a la evolución natural, en la que la cultura moldeará los futuros cambios genéticos de los organismos de su entorno, como de si mismo.Leches utilizadas en la alimentación desde tiempos ancestrales son las leches de oveja, cabra y vaca; siendo las de burra, yegua, reno y camello las menos relevantes.La composición de la leche varía con la especie, raza, tipo de alimentación, estado sanitario y fisiológico del animal, época del año y el número de ordeños:

Como se aprecia en el cuadro anterior las leches difieren ampliamente en su composición de acuerdo a especie de la que proviene: la humana es más rica en hidratos de carbono y más pobre en proteínas; la de oveja, búfalo y rena son las más ricas en energía debido a su alto contenido de grasas y proteínas.En la actualidad, el hombre utiliza para alimentarse en gran escala, un sucedáneo de la leche materna de su propia especie, la leche de vaca. La leche es el alimento más completo que entrega la naturaleza y tiene grandes posibilidades industriales para obtener diversos productos para la alimentación humana, industria farmacéutica y otros. Es considerada como un alimento completo puesto que contiene elementos nutritivos en cantidades adecuadas para el funcionamiento correcto de los procesos bioquímicos que se producen en el organismo. Sin embargo el estricto cumplimiento de las medidas higiénico sanitarias deben ser una premisa para garantizar que la leche se obtenga con una calidad optima, aspectos que son fácilmente de corroborar en los análisis que se realizan en un laboratorio.Los análisis microbiológicos y físicos-químicos que se le realizan no tienen carácter preventivo, sino que son inspecciones que permiten valorar la calidad del producto. Sin embargo la rapidez con que se realicen estas determinaciones va a proporcionar la disminución del tiempo de liberación de este alimento para el consumo, generalmente dirigido a la población más vulnerable. Esto a motivado al desarrollo de métodos

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rápidos y/o automatizados en el diagnostico de la calidad de la leche y sus productos. Constituye además en los últimos años una necesidad. Bajo las nuevas concepciones de calidad y comercialización que predominan en este sector, el enfoque fundamentalmente se dirige hacia la obtención de una respuesta en el menor tiempo posible, lo cual hace que se tomen medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva, antes de que el producto sea liberado al mercado.La complejidad bioquímica de la leche en su composición y su elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente la mayor parte de los microorganismos y bien se podría catalogar como un medio universal de cultivo. Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patógenos o de sus toxinas y el segundo a las características de conservación de la misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor numero de flora saprofitita, esta en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminución de las propiedades nutritiva y organolépticas del producto.Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la Industria Láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de la aplicación de las buenas practicas higiénicas. M.O indicadores:

- Bacterias aeróbicas mesófilas- Coliformes totales y fecales- Enterobacterias torales- Enterococo

Los métodos de análisis para evaluar la calidad higiénico sanitaria de la leche han evolucionado sustancialmente desde la década de los 60, llegando a oficializare los métodos convencionales de conteo en placa. Estos métodos universalmente conocidos tienen limitantes como son el excesivo tiempo de realización, amplia laboriosidad y utilización de gran cantidad de medios de cultivo, placas y otros insumos.Entre la flora bacteriana existente en la leche cruda, leche pasterizada, y productos lácteos hay importantes diferencias. Intervienen muchas variables y el tipo de bacterias y la contaminación de productos alimenticios dependen de:

1. Los microorganismos pueden producir cambios deseables en las características físico químicas de la leche durante la elaboración de diversos productos lácteos.2. Los productos lácteos y la leche pueden contaminarse con microorganismos patógenos o sus toxinas y provocar enfermedad en el consumidor.3. Los microorganismos pueden causar alteraciones de la leche y productos lácteos afectando la calidad de sus subproductos.

Contaminación inicial de la leche.Una vez que la leche ha atravesado el canal del pezón tiene un determinado número de bacterias. Es importante diferenciar y conocer el contenido de bacterias antes y después de la secreción.Es fundamental obtener leche con un bajo recuento inicial de bacterias y refrigerarla inmediatamente a 4 – 8ºC. Si se logra eso, tendremos bacteriológicamente hablando, una excelente materia prima.Para lograr una leche de buena calidad bacteriológica, es fundamental la participación y la autogestión de los tamberos.

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Contenido de bacterias de la leche antes de la secreción.Infecciones de la ubre. En infecciones agudas el contenido de bacterias de cuartos individuales al comienzo del ordeño puede superar el 1.000.000/ml (Ej: mastitis debidas a Streptococcus agalactiae). La leche de los cuartos con infecciones subclínicas debidas a streptococos y estafilococos contienen alrededor de 25.000 bacterias/ml en la leche mezcla de los cuartos. Infecciones latentes debida a estafilococos y estreptococos contienen alrededor de 40.000 bacterias/ml en el comienzo del ordeño y unas 3.000/ml. en la leche mezcla de los cuartos.

Canal del pezón: tiene una flora muy variada. Hay Staphilococcus aureus coagulasa positivos, Micrococcaceae, Corinebactrerium (especialmente bovis), estreptococos no patógenos. Aún cuando se toma una muestra de leche desinfectando bien la punta del pezón (durante 20 segundos con alcohol al 80%), no es posible eliminar esa flora. Trabajos de investigación han demostrado que la única forma de evitar esa flora del canal del pezón es, obtener la muestra de leche mediante punción de la cisterna de la ubre o del pezón.También se ha demostrado que no todas las bacterias que viven sobre la piel son capaces de desarrollarse en el canal del pezón. En la piel predominan los micrococos y no así en el canal del pezón. Mientras que los estafilococos, que no predominan en la piel, lo hacen en el canal del pezón.

Contaminación postsecretoria.Piel de los pezones: aquí se encuentra una amplia variedad de bacterias que pueden multiplicarse en los restos de la leche (cuando quedan restos de leche en los equipos por deficiente lavado). No obstante estas bacterias no influyen demasiado (son bacterias que aún no están adaptadas a leche) en el recuento total de bacterias.La proporción de bacterias provenientes de la piel de los pezones puede ser significativa cuando se ordeñan pezones sucios con barro y bosta, por el “efecto de lavado de los pezones” (teat washing effect). Eso es fácil de comprobar: si se ordeñan pezones sucios, al retirar las unidades de ordeño los encontramos limpios.Las bacterias provenientes de la materia fecal como Enterobacteriaceae, Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria, tienen un rol muy importante (como se verá mas adelante) en la calidad de la leche y los subproductos. Estas bacterias pueden demostrarse con cultivos específicos, en el recuento total de bacterias estas no aparecen, pero como se dijo, tienen mucha influencia sobre la calidad de los productos terminados (rutina de ordeño).

Del ambiente: con las actuales instalaciones y sistemas de ordeño, es escasa la contaminación del ambiente. Se debe fundamentalmente al polvo de los alimentos concentrados y bosta de los pisos que contaminan las pezoneras cuando éstas se caen. Las bacterias son Enterobacteriaceae, Micrococcus, Bacillus, Clostridium, etc.Equipamiento de ordeño y tanques de frío. Cuando estos equipos no están suficientemente higienizados, sin duda son la mas importante fuente de contaminación. La importancia aquí es doble:

- Por un lado los equipos de ordeño y de frío tienen una enorme superficie que está en contacto con toda la leche.- Por otro lado esas bacterias en presencia de restos de leche “se adaptan” y reproducen entre los tiempos de ordeño. Como consecuencia las superficies pueden tener una gran cantidad de bacterias y además “adaptadas” a leche.

Hay trabajos que demuestran que, cuando la leche del tanque tiene mas de 100.000 UFC/ml no hay una suficiente higiene del equipamiento.Del agua: el equipamiento de ordeño y los utensilios de ordeño deben enjuagarse con agua potable.

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El agua potable en 100 ml debe contener 0 coliformes y no mas de 100 bacterias saprofitas totales.

Los contaminantes mas comunes del agua son del Gén. Pseudomonas. Cuando el agua está contaminada, con el enjuague las bacterias contaminan el equipamiento y éste a la leche.No existen datos ni relevamientos, pero la contaminación de los pozos de agua en los tambos es alta. La solución mas común es clorinar el agua.Las fuentes de contaminación de la leche se pueden resumir en la siguiente escala:

Bacterias provenientes del aire ....................... 100 – 1.500 UFC/mlDe la ubre ........................................................ 300 – 4.000 UFC/mlPiel de los pezones .......................................... 500 – 15.000 UFC/mlInfecciones de la ubre ..................................... 300 – 25.000 UFC/mlEquipamiento ................................................... desde miles hasta millones de UFC/ml.

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II. OBJETIVOS:

- Determinar la calidad microbiológica de una muestra leche cruda obtenida en un Comedor Popular (“Vaso de Leche”).

- Determinar la calidad microbiológica una muestra de queso fresco obtenido en un puesto de expendio particular (Mercado de Abastos).

- Determinar la calidad microbiológica de una muestra de helado de crema cualquiera obtenida de cualquier expendio particular.

III. MATERIALES:

- Muestras Biológicas: o Leche fresca obtenida del Vaso de Leche “Ciudad de los Milagros” –

Ciudad Éten.o Queso fresco, obtenido en el “Mercado Modelo” de la Ciudad de

Chiclayo.o Crema de Helado, obtenido de un vendedor (heladero) de “Helados

Artika”.- Materiales:

o Placas de Petrio Viales o Pipetas o Mecheros de Bunsen

o Asa calibradao Agua peptonadao Agar: ENDO, Manitol

Salado y Salmonella - Shigela

- Equipos:o Estufa

IV. PROCEDIMIENTO:

- La muestra de leche, obtenida del Vaso de Leche “Ciudad de los Milagros” – Ciudad Éten, al ser una muestra liquida, no se le dio tratamiento previo, por tanto, se procedió a homogenizar con movimientos rotatorios por aprox. 10 min. para luego sembrar de manera directa, usando el asa calibrada (0.01 mL), a las placas respectivas.

- La muestra de queso, obtenido en un puesto de expendio obtenido en el “Mercado Modelo” de la Ciudad de Chiclayo, por tratarse de muestra solida, se tuvo que realizar un tratamiento previo (homogenizado). Para tal motivo se realizaron los sgtes. pasos:

o Se pesó 5 gr de la muestra, tratando de sacar la superficie de la misma.

o Luego, se lo agregó a un frasco estéril y se completó con 45 mL de agua destilada estéril.

o Luego se procedio a realizar movimientos rotatorios con el fin de homogenizar de manera total la muestra, esto por aprox. 10 min.

o Luego se paso a sembrar de manera directa haciendo uso del asa calibrada a las respectivas placas.

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Sembrar con asa calibrada

Siembra directa con asa calibrada al centésimo

Manitol salado

ENDO

Homogenizar: 5 gr muestra + 45 mL H2O destilada

Queso

Helado

Agar S - S

Manitol salado

ENDO

ENDO

Manitol salado

Agar S - SSembrar con asa

calibrada

Homogenizar: 5 gr muestra + 45 mL H2O destilada

Incubar a 37 ºC x 24 h.

Incubar a 37 ºC x 24 h.

Incubar a 37 ºC x 24 h.

- La muestra de helado, obtenido de un vendedor de helados “Artika”, por ser una muestra especial (crema), se le dio un tratamiento previo:

o Como en el caso anterior, en un frasco estéril se agrega aprox. 5 mL de la crema de helado (previamente “entibiada”) y se le completó con 45 mL de agua destilada estéril.

o Se homogenizó la muestra moviéndola de manera rotatoria por aprox. 10 min.

o Luego se paso a sembrar en las placas respectivas utilizando el asa calibrada.

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V. RESULTADOS:

- Pasadas las 24 horas de incubación se tuvieron los sgtes. resultados:

MUESTRA

MEDIOS

ENDO(Presencia de

coliformes – E. coli)

S – S(Presencia de Salmonella –

Shigella)

Manitol salado(Presencia de

S. aureus)

Leche fresca + No se sembró +Queso + - -Crema de helado + - -

Agar ENDOQueso - Leche

Agar ENDOHelado

Agar Manitol SaladoQueso

Agar Manitol SaladoLeche

Agar Manitol SaladoHelado

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Agar S – SQueso

Agar S – SHelado

VI. CONCLUSIONES:

- Los resultados obtenidos en la muestra de leche son normales en cuanto la presencia de S. aureus es parte de la flora normal de este producto. Como la identificación fue solo cualitativa (presencia – ausencia), no podemos asegurar que el microorganismo presente sea un productor de Enterotoxina o si se encuentra en una concentración (UFC) por encima de lo normal.

- En lo referente a la presencia en placa de colonias características de “coliformes”, este solo se podría considerar como un indicador de mala higiene a la hora de la toma de nuestra o la hora de la recolección de la leche (ordeño). Para mayor exactitiud se debería realizar un conteo de colonias (NMP).

- No se realizó el sembrado de la muestra en medio S – S.- En lo referente a la muestra de queso, solo se llegó a encontrar positividad en

el medio ENDO, o sea, presencia de colonias características a las de los coliformes. Este es un indicador de mala higiene en el expendio de este producto, además, por encontrarse a la intemperie, puede ser contaminada con moscas, polvo, mala manipulación y otros.

- En lo referente a la muestra de helado, se tuvo positividad en el medio ENDO a la presencia de coliformes, lo que indicaría malas practicas en el momento de la preparación de las cremas de helado para el expendio, la mala manipulación, la leche o el agua contaminada pueden contaminar al mismo tiempo a la crema de helado y estos microorganismos, al mantenerse a temperaturas bajas (4 ºC) pueden aun sobrevivir de forma latente. Una manera de eliminar a esta flora dañina seria la inmediata congelación (- 20 ºC) de las cremas. El paso de las cremas en carritos transportados por los vendedores podría ser también una fuente de contaminación, ya que en el momento del expendio el vendedor no tiene lavada las manos, usa cucharas para servir el producto que no están totalmente limpias (que han estado a exposición del polvo), además, el abrir y cerrar el carrito introduce polvo dentro del contenedor, condiciones que podrían contaminar las cremas.

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VII. REFERENCIAS:

- ACOSTA G., S. I. (2005). Enterococcus. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en www.codeinep.org/control/ Enterococcus .doc

- ANALISIS MICROBIOLOGICOS (2004) Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf

- DAVILA FERNANDEZ, N. y HERNANDEZ GARCIA, J. M. (2006). Métodos de ensayos rápidos de deteccion de microorganismos en la leche. Revista electrónic ade Veterinaria REDVET. Vol. VII. 18 pp. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf

- FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima.

- FUENTES, A. F. y otros (2005). Calidad Sanitaria de Alimentos Disponibles al Público de la Ciudad de Sonora, México. Revista Salud Pública y Nutrición. Vol. 6 Nº 3. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.respyn.uanl.mx/index.html

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Investigación de streptococos fecales. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- Límites microbiológicos: Index (2008). Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.tecal.net/recursos/microb/index.php?Ref=p

- MORENO M., M.; M. T., SILVA G. y CALDERON M., W. (2006). Guía de Prácticas: Microbiología General. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo – Facultad de Ciencias Biológicas. Lambayeque.

- NOTAS DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS (2005) Metodos de recuento de microorganismos. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiologia_de_los_al.htm

- THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.

- VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visión de la Industria Láctea. Obtenido el 19 de agosto de 2008 en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf

VIII. ANEXOS:

1.0 Grupo de Alimento: Leche y productos lácteos. Incluye todo tipo de productos lácteos derivados de la leche de cualquier animal que suele ser ordeñado (vaca, oveja, cabra, búfala). En esta categoría, un producto simple es uno que no contiene ningún saborizante, ni contiene frutas, verduras u otros ingredientes no lácteos; tampoco se ha mezclado con otros ingredientes no lácteos, salvo lo permitido por las normas correspondientes.[1] Similares son productos en los cuales la grasa láctea ha sido reemplazada parcial o totalmente por grasas o aceites vegetales1.1 Subgrupo del alimento: Leche fluida pasteurizada, con o sin saborizantes, con o sin aromatizantes

Parámetro CategoríaTipo de riesgo

Limite máximo permitido

10

Escherichia coli 10

A

< 3 NMP/ml

Salmonella spp/25 g 10 Ausencia

Staphylococcus aureus 7 102 UFC/ml

Listeria monocytogenes/25 g 10 Ausencia

LACTEOS

Producto: Leche pasterizada BOE: R.D.1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D. 402/96, B.O.E 8/4/96 Limite: n=5, c=1, m=0, M=5 (u.f.c./ ml, 30oC)

Producto: Mantequilla a base de leche o nata pasterizad a BOE: R.D. 1679/94, B.O.E. 249/94; RD. 402/96, B.O.E.8/4/96 Limite: n=5, c=2, m=0, M=10 (a 30oC)

Producto: Productos lácteos en polvo (excepto leche en polvo) BOE: R.D. 1679/94, BOE 24/9/94; R.D. 402/96, B.O.E 8/4/96 Limite: n=5, c=2, m=0, M=10 (a 30oC)

Producto: Productos lácteos helados (incluidos los helados y las cremas heladas) BOE: R.D .1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D.402/96, B.O.E 8/4/96

Limite: n=5, c=2, m=10, M=102 (a 30oC)

Producto: Productos lácteos líquidos BOE: R.D. 1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D. 402/96, B.O.E 8/4/96

Limite: n=5, c=2, m=0, M=5 (a 30oC)

Producto: Productos lácteos líquidos tratados térmicamente y no fermentados BOE: R.D. 1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D. 402/96, B.O.E 8/4/96

Limite: n=5, c=2, m=0, M=5 (a 30oC)

Producto: Queso de pasta blanda (a base de leche tratada térmicamente) BOE: R.D 1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D .402/96, B.O.E 8/4/96

Limite: n=5, c=2, m=104, M=105 (a 30oC)

Leche cruda de vaca destinada al consumo directo:

Analítica Límite

Aerobios mesófilos 5*104 (u.f.c./g o ml, 30oC)

Salmonella n=5, c=0, Ausencia (en 25ml)

S. aureos n=5, c=2, m=102, M=5*102 (en 1g)

Leche pasterizada:

Analítica Límite

Aerobios psicotrofos n=5, c=1, m=5*104, M=5*105 (u.f.c./ml, a 2oC tras preincubar 5días a 6oC) Coliformes n=5, c=1, m=0, M=5 (u.f.c./ ml, 30oC)

Salmonella n=5, c=0, Ausencia (en 25ml)

Otros límites La leche `pasterizada´ tendrá reacción fosfatasa negativa y peroxidasa positiva.La leche `ultrapasterizada´: Reacción fosfatasa y peroxidasa negativas.

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Listeria monocytogenes n=5, c=0, m=0, M=0

Leche en polvo:

Analítica Límite

Coliformes n=5, c=2, m=0, M=10 (u.f.c./ml, a 30oC)

Salmonella n=10, c=0, Ausencia (en 25g)

S. aureos n=5, c=2, m=10, M=102 (en 1g)

Otros límites Humedad máxima: 5% m/m

Listeria monocytogenes Ausencia (en 1 g)

Productos lácteos helados (incluidos los helados y las cremas heladas)

Analítica Límite

Aerobios mesófilos n=5, c=2, m=105, M=5*105 (u.f.c./ g, 30oC)

Coliformes n=5, c=2, m=10, M=102 (a 30oC)

Salmonella n=5, c=0, Ausencia (en 25g)

S. aureos n=5, c=2, m=10 M=102 (en 1g)

Listeria monocytogenes Ausencia (en 1 g)

Queso a base de leche cruda o terminada

Analítica Límite

E. coli n=5, c=2, m=104 M=105 (en 1g)

Salmonella n=5, c=0, Ausencia (en 25g)

S. aureos n=5, c=2, m=103 M=104 (en 1g)

Otros microorganismos Listeria monocytogenes: Para quesos, distintos de los de pasta dura: n=5, c=0, Ausencia (en 25g)

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