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Microbiología del petróleo y sus derivados

Brenda Valderrama y Juan Téllez-Sosa,Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México,AP 510-3, Cuernavaca, Mor. 62250 México.

Introducción

La industria del petróleo es característica de nuestra época. Cadaaño se extraen cerca de un millón de toneladas de petróleo de yacimientossubterráneos, algunos de ellos en mar abierto. La mayor parte se utilizacomo combustible en forma de gasolina, diesel, turbosina, etc., y juntocon algunas fracciones volátiles (metano, propano y butano) son nuestraprincipal fuente de energía, tanto industrial como doméstica. Alrededor de15% del petróleo es utilizado como insumo para la síntesis de otroscompuestos, principalmente plásticos, un grupo heterogéneo que incluyepoli alquenos (como el polietileno, poli butileno, polipropileno), poliestirenos y cloruro de polivinilo (PVC). El resto del petróleo, lasfracciones más pesadas y menos valiosas llamados asfaltenos, se utilizancomo pavimento.

Químicamente, el petróleo es una mezcla compleja dehidrocarburos, es decir, de compuestos ricos en carbono e hidrógeno,aunque contiene otros elementos minoritarios como azufre, oxígeno ynitrógeno, así como trazas de metales. Es compleja porque dada lacapacidad del átomo de carbono de formar cuatro enlaces con otrosátomos de carbono, se pueden organizar como cadenas o como ciclos(Tabla 1) . Las cadenas se conocen como compuestos alifáticos, yconsisten en sucesiones de átomos de carbono unidos entre sí por enlacessencillos (alcanos), dobles (alquenos) o triples (alquinos) mientras que elresto de las valencias son ocupadas por hidrógenos. Los alcanos son lafamilia más numerosa en el petróleo crudo y se conocen como parafinas,pueden ser lineales o ramificados y su longitud varía de 1 a 40 carbonos,aunque se ha logrado detectar cadenas de 60 carbonos. Los alquenos sonconocidos como olefinas y son una fuente valiosa de reactantes para laindustria sintética. Los ciclos pueden ser saturados, donde varios carbonosse unen entre sí por medio de enlaces sencillos, ó pueden ser aromáticos,donde algunos carbonos del ciclo están unidos por enlaces dobles. Losciclos saturados se conocen como ciclo-alcanos, ciclo-parafinas o naftenosy son un componente minoritario del petróleo crudo. Los compuestosaromáticos son derivados del benceno, un anillo de seis carbonos unidos

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por tres enlaces sencillos y tres enlaces dobles alternados. Los anillospueden encontrarse fusionados entre ellos o sustituidos con cadenasalifáticas. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs) ó polinúcleo-aromáticos comprenden del 10 al 25% del petróleo crudo y son lasfracciones más pesadas (Tabla 1).

Para la industria petroquímica, la propiedad física del petróleo másimportante es la temperatura de ebullición ya que sus componentes suelenser separados por destilación mediante el incremento de la temperatura enetapas. Como pueden observar en la Tabla I las moléculas más pequeñasson volátiles a temperatura ambiente y conforme aumenta su masamolecular lo hace también su punto de ebullición. Una vez separadas atemperaturas específicas, cada fracción es sometida a diferentes procesosde purificación, dependiendo el uso al que estén destinadas. El contenidode azufre y de metales pesados afecta el valor del petróleo crudo y de susfracciones, ya que los procesos de remoción son costosos (ver másadelante).

México es un país exportador de petróleo, tenemos importantesyacimientos en explotación en las zonas del Golfo de México y en elIstmo de Tehuantepec y otros más en reserva. Desde la expropiación de1936, el petróleo existente bajo el suelo de nuestro país no puedepertenecer a particulares, sino que es administrado por el gobierno federala través de la compañía paraestatal Petróleos Mexicanos(http://www.pemex.com). Las divisas obtenidas por la venta de petróleocrudo y sus derivados son la principal fuente de ingresos para nuestropaís. La producción y el consumo de petróleo son de vital importancia enlas relaciones internacionales y ha sido frecuentemente un factor decisivoen la determinación de políticas exteriores. La posición de un país en elsistema depende en su capacidad de producción relacionada con suconsumo. Para cualquier país, la presencia o ausencia de yacimientos depetróleo dentro de sus fronteras ha sido de considerables consecuencias ensu economía, siendo uno de los factores determinantes entre ser un paísrico ó un país pobre.

Existen numerosos estudios sobre la composición y elprocesamiento del petróleo por lo que en este capítulo nos limitaremos arevisar aquellos aspectos donde se han utilizado microorganismos, ya seaen la producción y en la depuración del petróleo, o posteriormente en ladescontaminación por degradación. Este último tema es especialmenteimportante para nuestra generación, ya que el uso masivo de derivados delpetróleo ha incrementado la concentración de compuestos xenobióticos enla biosfera. Por xenobiótico entendemos aquellos compuestos que no

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provienen de los ecosistemas y por lo tanto, no existen actividadesenzimáticas capaces de utilizarlos eficientemente. En algunos casos, losxenobióticos no son biodegradables, es decir que no son utilizados pormicroorganismos, sino que se van acumulando en la superficie delplaneta. Ejemplo de esto son las toneladas de plaguicidas e insecticidasque se aplican cada año. Si sumamos el petróleo derramado durante laextracción o el transporte, veremos que uno de los mayores retos en lospróximos años será la generación de tecnología para su eliminación.

Origen biológico del petróleo

Para comenzar, ¿de dónde proviene el petróleo? Los combustiblesfósiles, como el petróleo ó el carbón de mina, reciben este nombre porprovenir de estratos geológicos de origen orgánico formados hacemillones de años. Se cree que el petróleo proviene de grandes cantidadesde plantas y animales marinos cuyos restos fueron cubiertos porsedimentos y formaron depósitos subterráneos. El material biológico quedió origen a los depósitos de petróleo se encuentra fuertemente degradado,por lo que no es fácil inferir los primeros pasos de su conversión. Sinembargo, existen otros tipos de yacimientos de hidrocarburos similares alpetróleo conocidos como rocas sedimentarias químicas, a las cuálespertenecen la turba, el lignito pardo, el lignito y el carbón o la hulla, y suestudio ha permitido elucubrar sobre las primeras etapas en la conversiónde restos orgánicos en hidrocarburos.

Las sustancias ricas en hidrocarburos producidas por destilaciónde estos materiales son los kerogenos. El kerogeno se define como uncomplejo de materia vegetal y animal diagenéticamente transformada enel estado sólido y de origen sapropélico (Figura 1). El material de partidapara los kerogenos son las plantas como los equisetos, los licopodios, losjuncos, las cañas, los arbustos, los musgos pantanosos, entre otros. Se creeque las plantas crecieron en pantanos y lagos de agua dulce, los cuales seinundaron ocasionalmente por mares llanos en un clima subtropical hastatropical. Con la ausencia de aguas subterráneas circulantes ladescomposición normal de los restos vegetales, que se basa en lapresencia de oxígeno, termina enseguida bajo la cobertura de sedimentosy de otros restos vegetales y se forman gases como el dióxido de carbonoy el metano.

A través de largos periodos de tiempo (millones de años), estosrestos pasaron por dos etapas de degradación, una biológica y otraabiótica. Se piensa que en la primera etapa, los microorganismos

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anaeróbicos convirtieron los restos orgánicos en algo parecido al kerogenoactual. Durante la fase abiótica siguiente, las altas presiones y el calorcambian los sedimentos a rocas sedimentarias y el kerogeno a petróleo.Esta conversión parece haber sido catalizada por metales y por las mismasarcillas de los estratos. Gracias a la acumulación de gases (metanoprincipalmente) que funcionan como propulsor, las pozas subterráneas depetróleo se movilizan hacia los poros y fracturas de las rocas yeventualmente afloran de manera espontánea a ras de suelo.

Desde el punto de vista microbiológico, la identificación de losmicroorganismos participantes en la formación del kerogeno es todo unreto, ya que se trata de partículas microscópicas que existieron hacemillones de años y cuyos remanentes se encuentran enterrados a cientosde metros de profundidad. Sin embargo, se ha logrado identificar algunasespecies microbianas viables asociadas a depósitos de petróleo enexplotación mediante herramientas moleculares, aunque no es posibleasegurar que provienen del yacimiento y no de contaminación conespecies contemporáneas (63, 64, 102). Una alternativa novedosa ha sidola búsqueda de microfósiles asociados a yacimientos de kerogeno. Bajocondiciones muy especiales se ha podido identificar algunos de estosmicrofósiles como miembros de los grupos cianobacterias y protozoarios(http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artoct99/kamast5.html).

Como una alternativa, se ha intentado la identificación de ciertotipo de moléculas orgánicas que sólo pueden provenir de organismosvivos, ya sean procariotes o eucariotes. Estos fósiles moleculares seconocen como “bioindicadores” y son derivados de los lípidos celulares yde membranas. Un estudio de este tipo ha sido aplicado a un yacimientode kerogeno en Australia y permitió establecer que los tres grandes gruposde seres vivos, eubacterias, arqueobacterias y eucariotes, ya existían hace3,800 millones de años y que son participantes potenciales en la faseb i o l ó g i c a d e l a f o r m a c i ó n d e l p e t r ó l e o(http://cas.bellarmine.edu/tietjen/Evolution/archean_molecular_fossils_and_th.htm).

Procesos microbianos en la industria petrolera

La industria del petróleo es eminentemente química, es más, es laindustria química por excelencia. La abundancia y el relativo bajo preciodel petróleo han generado una intrincada red de industrias dedicadas a larefinación, depuramiento y utilización de prácticamente todas lasfracciones del petróleo desde hace más de un siglo. A pesar de esta

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tendencia, nuestra generación comienza a ver cambios significativos enesta industria, ya que se estima que la explotación mundial de crudodecaerá irreversiblemente cerca del 2020 (97). Esta condición impondrá,eventualmente, la generación de nuevas técnicas de exploración y,alternativamente, de la explotación de yacimientos alternativos.Adicionalmente, y en respuesta a la presión ejercida por la opiniónpública, la industria petroquímica se verá en la necesidad de renovar susprocesos para ajustarse a criterios más estrictos de eficiencia y limpieza(97). Es bajo estas circunstancias que los microbiologos podemos teneruna participación relevante en la nueva industria petrolera. A continuaciónrevisaremos algunos de los procesos donde se han utilizadomicroorganismos o derivados de ellos como alternativa a los métodostradicionales.

Extracción de yacimientos. Bajo circunstancias ideales, elpetróleo surge espontáneamente de un pozo en el subsuelo. Sin embargo,aunque en muchas ocasiones se utilizan bombas para acelerar laextracción, solo se recupera un tercio del volumen del yacimiento,aproximadamente. Se ha implementado una variedad de métodos físicospara poder acceder al petróleo remanente en estos yacimientossecundarios, por ejemplo la inyección de gases o de agua caliente a altapresión para impulsar el petróleo hacia la superficie. Ninguno de estosmétodos permite recuperar la totalidad del volumen del yacimiento y hasido necesario generar nuevas tecnologías para poder explotar lo que seconoce como yacimientos terciarios. Entre estas estrategias se encuentranla adición de solventes, surfactantes y polímeros (86). En particular, unpolímero producido por Xanthomonas campestris conocido como gomade xantana, ha sido extensivamente usado debido a sus excelentespropiedades fisicoquímicas, que incluyen una sustancial viscosidad, aún abajas concentraciones, combinada con una alta fluidez, lo que le permitepasar libremente a través de pequeños poros. La goma de xantana es unheteropolisacárido ramificado cuya cadena principal está formada porresiduos de glucosa unidos linealmente mediante enlaces b1_4. La cadenaramificada es un trisacárido formado por glucosa, manosa y ácidoglucurónico (Figura 2).

La demanda mundial por goma de xantana supera las 25,000toneladas anuales. La producción de éste polímero a estos niveles hagenerado grandes retos tanto a nivel microbiológico como de ingenieríade bioprocesos (36). Desde el punto de vista microbiológico,

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mencionaremos tres de los aspectos que han sido más estudiados con lafinalidad de incrementar la productividad del proceso.

Xanthomonas campestris es una bacteria fitopatógena que infectaprincipalmente a plantas de la familia Cruciferae. Con la intención deobtener aislados con mejor capacidad natural de producción se realizó unmonitoreo exhaustivo de variedades de Xanthomonas tanto de coleccionespúblicas cómo de aislados de calabazas, coliflores, zanahorias y nueces decastilla infectadas. Estas cepas fueron sometidas a pruebas bioquímicas,de producción de polímero bajo condiciones definidas, así como aevaluaciones de infectividad. No se encontró correlación aparente entrelas características fenotípicas de los aislados con la capacidad de producirel polímero, a excepción de la virulencia, lo que sugiere un papelimportante para el polímero dentro del proceso infeccioso.

Otra alternativa para la recuperación de yacimientos terciarios esla aplicación directa (in situ) de microorganismos en un proceso conocidocomo MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery). El fundamento de ésteproceso es que el crecimiento microbiano sobre la superficie de las rocasdel depósito promueva el desalojo del petróleo, ya sea directamente pordesplazamiento físico o indirectamente mediante la producción demetabolitos gaseosos ó surfactantes. Estos últimos provienen de laoxidación de parafinas hasta ácidos grasos, los cuáles actúan comodetergentes.

Antes de iniciar cada proyecto de MEOR se deben analizarmuestras del agua coproducida por el yacimiento. A partir de losresultados de éste análisis, se decidirá la composición de la mezclanutritiva que se adicionará y que suele consistir en nitratos, fosfatos ysulfatos e inclusive un carbohidrato fermentable. Debido a que lascondiciones a las que se encuentran sometidos los microorganismos distande ser óptimas, no basta con inocular los yacimientos, sino que se debenproveer las condiciones adecuadas para la proliferación celular,especialmente el oxígeno disuelto. Otros factores difíciles de controlar acientos de metros de profundidad, como la salinidad, el pH, la temperaturaasí como un bajo potencial redox pueden resultar limitantes en extremo(75). El costo operacional de esta metodología va de $2.00 a $4.00 dólaresamericanos de incremento por barril de petróleo proporcion.

Finalmente, además de los pozos profundos, existen otros tipos dedepósitos de hidrocarburos, las llamadas tierras y pizarras bituminosas,que contienen cantidades variables de materia orgánica (20% a 60%) enforma de bitumen y kerogeno, embebidas en formaciones rocosassedimentarias más o menos compactas. La extracción de hidrocarburos a

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partir de estos materiales se lleva a cabo mediante métodos térmicos,resultando en un proceso caro y poco eficiente. Bajo estas circunstancias,la utilización de métodos microbiológicos, por ejemplo para la producciónde surfactantes in situ, pudiera generar alternativas económicamentesignificativas (17).

Depuración de combustibles. Debido a su origen biológico, elpetróleo preserva no solamente el carbono y el hidrógeno de la biomasaoriginal en forma de los hidrocarburos que ya observamos en la Figura 1,sino también otros elementos, como el azufre y el nitrógeno e inclusiveuna variedad de metales de transición, como hierro, vanadio, níquel, etc.El azufre y el nitrógeno se encuentran incorporados como heteroátomosen una variedad de compuestos, pudiendo representar alrededor del 5% dela masa en algunos depósitos (Figura 3). Al quemarse como combustible,el azufre contenido en el diesel se convierte en óxidos de azufre que seliberan a la atmósfera. En presencia de agua, los óxidos gaseosos seconvierten en ácidos, que se disuelven y se precipitan junto con el agua delluvia. Este proceso se conoce como lluvia ácida y es frecuente en lasciudades con gran carga vehicular.

Actualmente las lluvias ácidas han disminuido notablemente,gracias a que las normas sobre el contenido máximo de azufre encombustibles se rigidizan cada vez más desde finales de los años 60s. Laimplementación de estas normas requirió que se desarrollaran una serie demétodos para la depuración del azufre en las fracciones dedicadas acombustibles. El más común de estos métodos es la hidrodesulfuracióncatalítica, que consiste en la conversión del azufre orgánico en sulfuro dehidrógeno usando altas temperaturas y presiones de hidrógeno molecular.El oneroso costo de la hidrodesulfuración catalítica, debidoprincipalmente al alto consumo de hidrógeno y al envenenamiento de loscatalizadores por metales pesados, aunado a una limitación intrínseca dereducir los niveles de azufre por debajo de 500 ppm (partes por millón),muy por arriba de las 15 ppm requeridas por la norma, ha ocasionado quese busquen nuevas alternativas.

El azufre es un elemento esencial para la vida. Aunque el azufreinorgánico es la fuente predilecta de azufre para la mayor parte de losmicroorganismos, en su ausencia, una variedad de compuestosorganoazufrados pueden ser metabolizados para proveer el indispensableelemento. Este hecho es el principio básico de uno de las más interesantesaplicaciones de la microbiología en la industria del petróleo, labiodesulfuración.

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El caso mejor estudiado de biodesulfuración oxidativa es lautilización de dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre porRhodococcus sp. El DBT y sus derivados alquilados son losorganoazufrados más abundantes en el diesel primario y se hanestablecido como compuestos modelo para este tipo de estudios. La cepaIGTS8 de Rhododoccus erythropolis se ha destacado por su capacidadpara remover selectivamente el azufre del DBT sin degradar el esqueletocarbonado y es la base del proceso comercial propuesto por la compañíanorteamericana Energy Biosystems Corporation (37, 65). Esta cepa es elprototipo de microorganismo biodesulfurador, sin embargo, existenaislados de otros géneros que comparten estas características. La cepaGTIS10 de Mycobacterium phlei presenta la misma vía degradatoria quela cepa IGTS8, con la ventaja adicional que es moderadamente termófilo,por lo que la fermentación puede llevarse a cabo a 50°C, mejorando lasolubilidad del diesel en agua (35, 55). Se han reportado aislados deGordona cepa CYKS1 (80) y de Nocardia sp. cepa CYKS2 (21) capacesde crecer en DBT como única fuente de azufre. En México, investigadoresdel Instituto Mexicano del Petróleo han aislado cepas de Rhodococcus desitios contaminados con petróleo en México capaces de desulfurarmuestras de diesel (18).

La vía de degradación del DBT en la cepa IGTS8 involucra a lasmonooxigenasas dependientes de FMNH2 (flavin mononucleotidoreducido) DszC/DszA. DszC convierte el azufre del DBT en sulfóxido ysubsecuentemente en sulfona (DBTO2). La sulfona es convertida porDszA en 2-hidroxibifenil-2-sulfinato (HBFS), el cual es modificado porDszB, una desulfinasa, a 2-hidroxibifenil (2HBF) y sulfato, que puede serasimilado como fuente de azufre. El FMNH2 no está unidocovalentemente a la monooxigenasa sino que es reemplazado cada ciclocatalítico por DszD, una FMNH2-oxidoreductasa dependiente de NADHespecífica (Figura 4).

Este proceso es típicamente capaz de reducir más de la mitad delcontenido de azufre en diesel, por lo que se considera como unaimportante alternativa a la hidrodesulfuración catalítica. Sin embargo,existen dos importantes inconvenientes para la incorporación de ésteproceso a nivel industrial. La primera es que, dado de que el diesel no essoluble en agua, deben mezclarse grandes cantidades del cultivobacteriano con porciones del combustible a tratar. Debido a los grandesvolúmenes de diesel que se requiere procesar, el mezclado de losfermentadores se vuelve un factor limitante. La segunda es el tiemporequerido para este proceso, demasiado lento para los flujos habituales en

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una refinería. Una fermentación típica requiere de por lo menos siete díaspara reducir el 60% del contenido de azufre del diesel (18).

Como alternativa a las limitaciones intrínsecas de unafermentación, se podría pensar en purificar las enzimas de la vía parausarlas como catalizadores. Muchas enzimas pueden llevar a caboreacciones en presencia de solventes orgánicos, trabajar a altastemperaturas, son reutilizables y además pueden ser altamente específicaso, por lo contrario, ser promiscuas, dependiendo del caso. Por todas estasrazones constituyen un frente alternativo a muchos procesos industriales,inclusive en la industria petrolera (100). En este caso particular, elobstáculo infranqueable para la generación de un catalizador enzimático,es la necesidad de un cofactor regenerable para la actividad de DszAC.Mientras que la adición del FMN reducido de manera exógena esimpensable por razones de costo, la actividad in vitro de la FMN-reductasa específica es muy baja, ya que ésta misma requiere de laregeneración de NADH. Por todas estas razones, y a pesar de lo exitosaque pueda ser la biodesulfuración a nivel de planta piloto, es posible queno se consolide como proceso a nivel de refinería.

La opción actual es la utilización de otras actividades enzimáticas,que no requieran de la regeneración de cofactores, como base de loscatalizadores. En particular, se ha demostrado que la enzimacloroperoxidasa del hongo Caldariomyces fumago puede oxidarselectivamente el azufre de los organoazufrados del diesel, los cuálespueden ser removidos eficientemente de la mezcla mediante unadestilación convencional (5)

Biosíntesis microbiana de hidrocarburos

El petróleo es uno de los recursos naturales no renovables másimportantes, no solo porque es considerado como la fuente energética porexcelencia, sino que también porque algunos de sus derivados se utilizanen numerosos procesos de síntesis. Desafortunadamente, la gran demandaenergética en todo el mundo ha propiciado la explotación masiva de losyacimientos de petróleo, lo cual, además de provocar que nuestroambiente se deteriore progresivamente, y lógicamente, se contempla queen un futuro este importante recurso comience a escasear. Por esta razón,resulta prioritaria la búsqueda de fuentes alternativas de energía,preferentemente renovables, cuya generación tenga un bajo impactoambiental. En este sentido, la biotecnología ha jugado un papel muyimportante, particularmente con aquellos estudios enfocados a la

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conversión biológica de la biomasa para generar distintos compuestosenergéticos tales como el metano, el etanol y el hidrógeno (67).

Desde el punto de vista biotecnológico, los lípidos que seacumulan de manera natural en algunas plantas y microalgas tienenpotencial como combustibles alternativos. Estos compuestos pueden serextraídos y transesterificados para generar substitutos de diesel conocidoscomo biodiesel. Alternativamente, la hidrogenación de la biomasa demicroalgas para producir hidrocarburos (50). Se pude recuperar sustanciasaceitosas vía la liquefacción de la biomasa de algunas algas a través dereacciones realizadas en condiciones de alta presión y temperatura (57,66).

Los hidrocarburos, componentes esenciales del petróleo, suelenutilizarse en sistemas de combustión rutinarios. La microalga verdeBotrycoccus braunii ha sido ampliamente estudiada por su capacidad deproducir y acumular elevadas concentraciones de lípidos altamentesaturados, es decir, de hidrocarburos. Se ha reportado que de maneranatural, algunas variedades B. braunii son capaces de acumular arriba del86% de su peso seco en hidrocarburos. B. braunii es una microalgaplanctónica de aguas dulces de distribución mundial que pertenece algrupo de las Chlorococcales. Estudios de microscopía electrónica handefinido que una fracción pequeña de los hidrocarburos producidos por B.braunii son mantenidos en el citoplasma en pequeños cuerpos (vesículas)y que la mayor parte (95%) son secretados a las capas externas de la paredcelular formando las llamadas vainas trilaminares.

A la fecha se han descrito tres variedades distintas de B. braunii(A, B y L), cada una de estas es capaz de producir, independientemente dela fase y condiciones de cultivo, principalmente solo un tipo dehidrocarburo. Las cepas de la variedad A producen hidrocarburos decadena larga (entre 25 y 31 carbonos), principalmente alcadienos yalcatrienos. El contenido de estos hidrocarburos en las distintas cepas dela variedad A fluctúa entre el 15 y el 61% del peso seco. Las cepas de lavariedad B generan principalmente isoprenoides cíclicos, normalmenteramificados y altamente insaturados, denominados botriococenos, cuyaformula general es CnH2n-10 (donde n= 30-37). En estas algas, el contenidode hidrocarburos varía ente el 24 y el 86% del peso seco. Las cepas de lavariedad L sintetizan casi exclusivamente un tetraterpenoide de 40carbonos llamado licopadieno y conforman únicamente entre el 2 y el 8%del peso seco (para una revisión sobre este tema consultar (98) ). Algunosreportes describen que la ruta biosintética por la cual B. braunii produceestos hidrocarburos es similar a la ruta que se presentan en plantas

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superiores, es decir, los alcanos son sintetizados por la elongación deácido palmítico, vía la adición de unidades acetil y descarboxilacionessubsecuentes (16, 93).

El rompimiento catalítico (Cracking) de los hidrocarburosgenerados por B. braunii produjo una fracción del 67% de gasolina, 15%de diesel y 15% de turbosina (39). Sin embargo, a la fecha restan porrealizarse estudios enfocados al uso de los hidrocarburos producidos porB. braunii en distintos procesos de síntesis. Finalmente, no obstante laestupenda capacidad de B. braunii para sintetizar hidrocarburos, supotencial biotecnológico esta limitado principalmente por su bajavelocidad de crecimiento y su prolongados tiempos de duplicación.

Existen muy pocos estudios acerca de la producción dehidrocarburos por bacterias. Recientemente se aisló de una planta detratamiento de aguas residuales en Osaka, Japón, una bacteriahalotolerante capaz de producir y excretar altas cantidades dehidrocarburos (47). La secuencia de ADN de su genes para la partícula16S ribosomal permitió identificar a este aislado como Vibrio furnissi.Esta bacteria es capaz de excretar al medio hasta un 120% del peso secode hidrocarburos cuando se encuentra en fase de crecimiento pre-estacionaria. Esta fracción está compuesta básicamente de alcanosalifáticos de 15 a 24 carbones (71). En términos generales se desconocenlas rutas biosintéticas de estos hidrocarburos.

Finalmente, los estudios enfocados a la producción dehidrocarburos basados en microorganismos como V. furnissi o B. braunii,representan un reto biotecnológico sumamente atractivo y cuyo potencialpara la generación de hidrocarburos, para uso como combustible o enprocesos de síntesis.

El petróleo y los problemas ambientales

La utilización masiva de combustibles fósiles ha provocadocambios sustanciales en el clima. De manera natural, el clima del planetaestá determinado por el equilibrio entre la fracción de la energía solarabsorbida por la superficie y la restante, que es mandada de vuelta alespacio. El clima se balancea en función de cuanta de ésta energía sealmacena en la atmósfera al calentar a algunos de los componentesgaseosos. Existe un grupo de gases conocidos como invernadero quecomprende al bióxido de carbono, al bióxido nitroso, al metano, los cloro-fluoro-carbones, otros compuestos halogenados y al vapor de agua. Estosgases absorben la radiación reflejada provocando el caliento global de la

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atmósfera baja y cambiando dramáticamente el clima del planeta. Losgases invernadero provienen tanto de fuentes naturales comoantropogénicas, entre las cuáles se encuentra la utilización decombustibles fósiles. Nuestro planeta contiene alrededor de 1.5 x 1012

millones de toneladas de carbono y alrededor de 15% de éste se encuentraen yacimientos subterráneos. Hemos extraído una pequeña parte (menosdel 0.4% de todo el carbono del planeta) para usarlo como combustible,sin embargo cada año estamos incorporando 2,800 millones de toneladasde bióxido de carbono a las 76,000 millones de toneladas existentes ennuestra atmósfera. La acumulación de bióxido de carbono provocaactualmente una incremento de 1% adicional al calor generado por lasradiaciones solares y sigue aumentando. Sólo existe una vía paraincorporar el bióxido de carbono atmosférico a otras formas de menorimpacto ambiental y es a través de la fotosíntesis, un proceso exclusivo delas plantas y algunas bacterias. Como podemos ver en la Figura 5, lamayor parte de la fotosíntesis se lleva a cabo en el mar, donde se asimilan2,500 millones de toneladas de carbono al año, mientras que en la tierra seincorporan 500 millones de toneladas de carbono al año. Lacontaminación de los mares y la tala inmoderada de los bosques,especialmente en las zonas tropicales, reduce nuestras reservas defotosíntesis y agrava el problema.

Adicionalmente a los cambios climáticos globales, el uso masivodel petróleo como fuente de energía y como materia prima, ha generado elfenómeno de la contaminación ambiental, desconocido hasta hace 50años. La contaminación ocasiona el deterioro progresivo de la calidad delmedio ambiente y genera una amenaza real a la salud pública, así como laextinción de gran cantidad de especies vegetales y animales. Estacondición reta a nuestra sociedad para buscar medidas efectivas queremedien los efectos negativos del avance tecnológico (12). Una medidaque ha tenido un éxito significativo es la aplicación de técnicas debiorremediación. Como un ejemplo bien documentado al respecto,recomendamos la revisión de un caso de contaminación accidental porpetróleo crudo en la costa de Japón recientemente publicado que seremedia con una preparación microbiana (43, 95, 96). La biorremediaciónutiliza generalmente microorganismos (bacterias, hongos, levaduras yalgas), y recientemente han comenzado a utilizarse plantas superiores paraalgunas aplicaciones. Aunque nuevos enfoques en la biorremediación hansurgido basados en la biología molecular y la ingeniería de bioprocesos, labiorremediación clásica continúa siendo el enfoque favorito para procesardesechos biológicos y evitar la propagación de bacterias patógenas (6, 11,

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41, 60). La biorremediación también juega un papel cada vez másimportante en la concentración de metales y en la recuperación demateriales radioactivos (15, 81).

Algunos microorganismos pueden degradar de manera naturalcompuestos orgánicos y esta capacidad se explota para facilitar ladegradación de contaminantes y para operaciones de limpieza de desechosin situ. La aplicación de ensayos de monitoreo sencillos y de altaresolución ha permitido identificar aquellas especies capaces de degradarcontaminantes mientras que el uso de sondas génicas específicas permitedeterminar la abundancia relativa de estos microorganismos (83). El usode novedosas técnicas y herramientas para la biorremediación in situ, enbio-filtros y en bio-reactores ha contribuido al rápido crecimiento de estecampo. La biorremediación ha demostrado ser un complemento costeabley benéfico para ser usado en combinación con métodos químicos y físicostradicionales como el composteo, la incineración y la extracción consolventes, en el tratamiento de desechos y en la descontaminación delmedio ambiente.

De las diferentes fracciones del petróleo, los hidrocarburospolicíclicos aromáticos (HPAs) son los de mayor toxicidad y al mismotiempo los más recalcitrantes a los métodos convencionales deremediación. Los HPAs son un grupo de compuestos aromáticosconteniendo dos o más anillos bencénicos fusionados en arreglosangulares, lineales o agrupados (Figura 3) , contaminantes ubicuos que seforman naturalmente en el curso de algunas reacciones geológicasincluyendo la fosilización de plantas o antropogénicamente en relación alas industrias del petróleo, de la producción de gas y de la preservación demadera. Los HPAs de bajo peso molecular son susceptibles debiorremediación, sin embargo, los de alto peso molecular sonrecalcitrantes a la degradación biológica (19, 70, 106). Las tasas dedegradación de HPAs son variables y no dependen solamente de suestructura, sino también de los parámetros fisicoquímicos del sitio, asícomo del número y variedad de microorganismos presentes (101). Lasvariables más importantes que limitan la biorremediación de HPAs dealto peso molecular son la transferencia de masa, las heterogeneidadesespaciales y las pérdidas abióticas. Dada la baja solubilidad de estoscompuestos en agua, una de las estrategias para la biorremediación ensuelo es la adición de surfactantes, naturales o sintéticos, que solubilicen alos HPAs y aumenten su biodisponibilidad (4, 7, 27, 78, 85, 86). Unavariación interesante es la identificación de organismos que degradentanto los compuestos contaminantes como los surfactantes, de manera de

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no acumular otros compuestos xenobióticos al suelo (32). Es importanteconsiderar que los productos de degradación de los HPAs no sonnecesariamente menos tóxico que las moléculas parentales, por lo que esimprescindible incorporar procedimientos de monitoreo de toxicidad enlas diferentes etapas de la biorremediación.

Biorremediación de compuestos recalcitrantes. El desarrollo dequímicos sintéticos derivados del petróleo provee muchos materialesextremadamente útiles, tales como plásticos, pesticidas, aislantes,refrigerantes y retardantes de flama. Muchos de estos materiales nuncahabían existido en la naturaleza y por lo tanto los microorganismos noposeen enzimas para degradarlos. De aquí que se consideren nobiodegradables o recalcitrantes. Los términos no son completamenteprecisos sin embargo, ya que ahora se sabe que muchos compuestosclasificados como recalcitrantes son degradados lentamente en el suelo oen medios acuosos. Ejemplos de tales compuestos tóxicos que hancausado desastres ecológicos incluyen al DDT (diclorofeniltricloroetano),los bifenilos policlorados y el pentaclorofenol (1, 2, 52).

Los compuestos recalcitrantes no sirven usualmente como fuentesde carbón ó de energía para el crecimiento microbiano. Si acaso sedegradan, es mediante un proceso de cometabolismo, durante el cual otroscompuestos son utilizados como fuente de energía (el cometabolito) conla degradación lateral del compuesto blanco. La degradación completa(mineralización) de moléculas orgánicas relativamente complejas abióxido de carbono o metano requiere el esfuerzo concertado de bacteriasde diferentes grupos, por ejemplo, de las fermentativas hidrolíticas(eubacterias, p. ej. Chlorobium), las acetogénicas (eubacterias, p. ej.Desulfovibrio y Desulfomatuculum) y las metanogénicas (arqueobacterias,p. ej. Methanosaeta y Methanospirillum). Debido a su condición deasociaciones sintróficas (Figura 6) , el aislamiento de cultivos puros apartir de los consorcios metanogénicos es difícil y ha ocasionado erroresen la clasificación taxonómica de sus elementos.

El estudio de la diversidad microbiana y las dinámicas de suspoblaciones en consorcios biodegradadores está creciendo notablementeen el área de la ecología microbiana (texto adicional ecología microbiana).El interés en esta área ha sido catalizado por el rápido avance de métodosde ecología molecular ya que a través de su uso se tiene una mejorperspectiva de la composición de comunidades microbianas nocultivables. De hecho, se está ha vuelto factible definir las causas de loscambios temporales en la salud de un ecosistema alterado basándose en la

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estructura de su población. En particular, el estudio de comunidadesmicrobianas que toman parte en la biodegradación in situ dehidrocarburos ha sido un reto para los microbiólogos. La razón de esto esque la mayor parte de las especies (~90 a 99%) que componen lascomunidades degradadoras no son cultivables. La estimación debiomarcadores lipídicos, específicamente fosfolípidos, junto con técnicasde identificación basadas en la secuencia de la subunidad 16S de losribosomas es una poderosa combinación de técnicas para la elucidación dela ecología microbiana de comunidades biorremediadoras. El uso de estastécnicas provee una apreciación clara de varias características importantesde las comunidades microbianas, específicamente la biomasa viable, laestructura de la comunidad y el estado nutricional o la presencia derespuestas a estrés en bacterias Gram-negativas (48).

Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminadostienden a ser dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/ode sobrevivir a los compuestos tóxicos (62). Como resultado, estascomunidades son menos diversas que aquellos sistemas de referencia nocontaminados, aunque la diversidad también puede estar influenciada porla complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo quelas poblaciones han estado expuestas (44, 105). Sin embargo, cuando lasbacterias Gram-negativas dominan el sistema (como es frecuente en elcaso de ambientes contaminados con hidrocarburos), el conocimientoderivado de los biomarcadores lipídicos se limita al estado nutricional ofisiológico de la comunidad bacteriana más que a su diversidad.

A pesar de la relativamente larga historia de investigación en labiorremediación de derrames de petróleo, ésta continúa siendo unadisciplina esencialmente empírica y muchos de los factores biológicos quecontrolan los procesos no han sido adecuadamente comprendidos. Porejemplo, la adición de nutrientes es una práctica ampliamente aceptada enla limpieza de derrames aunque es escaso el conocimiento de sus efectosdurante el progreso de la biorremediación Existen evidenciasexperimentales que indican que los niveles de nutrientes, y suconcentración relativa con respecto a los contaminantes, influencian lacomposición de las poblaciones de microorganismos degradadores, lo cuala su vez afecta la tasa de degradación de los contaminantes (74).

Características de los microorganismos biodegradadores.Como puede observarse en la Tabla 2 existe una gran variedad demicroorganismos identificados en la degradación de compuestosderivados del petróleo. Interesantemente, casi todos son eubacterias,

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aunque en algunos casos se encontraron arqueobacterias y eucariotes.Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estosmicroorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, quepermiten la oxidación más ó menos específicas de algunas fracciones delpetróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos,haciéndolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando suconversión a bióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no esnecesario llegar a la mineralización, sino que basta una oxidación paradisminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua,incrementando su biodisponibilidad (99).

Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos no-convencionales es Rhodococcus, un grupo único consistente enmicroorganismos que presentan una gran diversidad metabólica,particularmente hacia la utilización de compuestos hidrofóbicos talescomo hidrocarburos, fenoles clorados, esteroides, lignina, carbón ypetróleo. Algunas cepas de Rhodococcus han sido utilizadas enaplicaciones industriales y ambientales, incluyendo la producción de ácidoacrílico y acrilamida, conversiones de esteroides y biorremediación dehidrocarburos clorados y fenoles. Estos microorganismos presentan unanotable capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos halogenados ynumerosos compuestos aromáticos, incluyendo algunos sustituidos porhalógenos, así como hidrocarburos policíclicos aromáticos (31, 104).

Las bacterias del género Rhododoccus poseen una gran variedadde vías metabólicas para la degradación y modificación de compuestosaromáticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y mono-oxigenasasobre anillos así como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aisladospresentan también la vía del 3-oxoadipato. La tolerancia de éstasbacterias a la falta de nutrientes, su carencia de un sistema de represióncatabólica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas paralos tratamientos de biorremediación. Algunas cepas producen poli-3-hidroxialcanoatos, otras acumulan metales pesados y otras son fuente deenzimas útiles como la fenilalanina deshidrogenasa y endoglucosidasas.Otras aplicaciones potenciales de los Rhodococos incluyen labiodesulfuración de combustibles, la deshalogenación de emisionesgaseosas y la construcción de biosensores (29, 31, 37, 104).

En este punto quizá estés preguntándote cómo adquirieron losmicroorganismos la capacidad de degradar compuestos que a los quenunca habían estado expuestos. Para entenderlo hay que tener enconsideración que para cualquier organismo (inclusive para los humanos)lo más importante es reproducirse y perpetuar sus genes, por lo que

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cualquier condición ambiental o nutricional que reduzca su probabilidadde reproducirse despertará una reacción inmediata a nivel metabólico y ensegunda instancia a nivel genético.

Algunas de las estrategias que se han observado en respuestas deeste tipo de retos son: 1.-Reclutamiento. Cuando un organismo seencuentra ante una condición ambiental completamente desconocida demanera abrupta sólo puede utilizar lo que ya tiene. Es decir, que puedeexplotar alguna actividad enzimática existente para degradar uncompuesto nuevo y sobrevivir al reto. Ejemplo de esto es la utilización deenzimas dedicadas a la degradación de lignína (un componente de lacorteza de los árboles) para degradar HPAs por algunos hongos (8, 9). 2.-Transferencia horizontal. Sabemos que es común entre bacterias laincorporación de material genético de organismos similares por medio demecanismos celulares de transferencia (conjugación), pero tambiénpueden incorporarlo de organismos distantes e inclusive completamentediferentes por medio de virus (transducción) o directamente del medio(transformación) (24) (Animación 1 ). El material genético incorporadopuede integrarse al de la bacteria, enriqueciendo su repertorio metabólicocon nuevas funciones, incluyendo aquellas que le permitan degradarcompuestos xenobióticos. Un ejemplo de esto es la transferencia en suelode los genes para degradar fenol entre diferentes especies dePseudomonas (73).

Estrategias recombinantes. Muchos contaminantes ambientalesson degradados eficientemente por microorganismos, sin embargo otrospersisten y constituyen un riesgo severo a la salud pública. En algunasinstancias, la persistencia es una consecuencia del inadecuado potencialcatabólico de los microorganismos disponibles. La tecnología del ADNrecombinante (ADNrc), aunado a un sólido conocimiento de víascatabólicas y de fisiología microbiana, capacita el desarrollo experimentalde actividades catabólicas nuevas o mejoradas sobre esos contaminantes(22, 23, 51, 53, 94).

Aunque una gran variedad de microorganismos capaces dedegradar xenobióticos tóxicos altamente estables han sido identificados,todavía muchos contaminantes persisten en el ambiente. Avancesrecientes en el campo de la tecnología del ADNrc han proporcionadosoluciones a estos problemas. Clásicamente, uno de los factores limitantesen la biorremediación de sitos contaminados ha sido la baja tasa dedegradación. Mediante el uso de métodos de ADNrc es posible extenderel rango de los sustratos que un organismo puede utilizar y la tasa de

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consumo, inclusive se puede ampliar la capacidad de un microorganismopara degradar un grupo predeterminado de xenobióticos. Dado que losprocesos biotecnológicos están basados en actividades naturales demicroorganismos, y sólo constituyen variaciones en el tratamientoconvencional de deshechos, son aceptados públicamente. Esta es un áreadonde la ingeniería genética puede hacer importantes aportaciones almanipular los genes catabólicos.

A diferencia de las bacterias utilizadas en el trabajo de laboratorio,los organismos genéticamente modificados destinados a ser liberados almedio ambiente como agentes biorremediadores deben ser capaces deexpresar su fenotipo bajo el control de señales externas presentes en elmedio al cual van a incorporarse. Esta es una diferencia significativa conrespecto a otros procesos biotecnológicos (por ejemplo un bioreactor) enel cual las condiciones de trabajo pueden establecerse a voluntad deloperador. En el campo, las condiciones de operación se determinan por elambiente externo. El principal problema es, por lo tanto, como programarfisiológica y regulatoriamente a las bacterias modificadas genéticamente(BMG) para expresar el fenotipo deseado al nivel y en el momentopreciso, bajo circunstancias fisicoquímicas sobre las cuales no se tienecontrol. Este reto ha motivado el desarrollo de una nueva generación desistemas de expresión de amplio rango específicamente diseñados parabacterias, particularmente Pseudomonas , pero también para otrosorganismos Gram-negativos (25).

Impacto ecológico de la liberación al medio ambiente demicroorganismos modificados genéticamente. La transferenciahorizontal de genes entre bacterias ha sido ampliamente demostrada bajocondiciones naturales (Animación 1). En estos casos, el material genéticoes transferido entre bacterias mediante los procesos de transformación,transducción o conjugación (24). En muchas ocasiones los genes quecodifican para enzimas involucradas en la degradación de contaminantesse localizan en moléculas extracromosomales llamadas plásmidos. Elentendimiento de las dinámicas de transferencia horizontal esimprescindible para comprender la evolución y la ecología de plásmidos,así como para la evaluación de riesgos, o sea, del impacto ecológico de laliberación intencional de bacterias naturales o recombinantes para usosagronómicos o de biorremediación. Este impacto ecológico depende decómo el nuevo material genético sea expresado en el organismo receptor yen cómo operen los procesos de selección natural en los receptores.Aunque existe la posibilidad de transferencia genética entre todos los

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miembros de una comunidad bacteriana, se ha encontrado que existe unaclara delimitación entre las especies que efectivamente reciben y expresanuna nueva capacidad metabólica siempre en función de sus propiascaracterísticas (68).

El uso extensivo de plásmidos con determinantes de resistencia aantibióticos podría tener consecuencias en la transferencia horizontal deesta resistencia acoplado a presiones selectivas impuestas por el uso (y elmal uso) de antibióticos en medicina y en ganadería. Por ejemplo, uno delos microorganismos mas usados en biorremediación es Pseudomonasaeruginosa, bacteria que presenta una serie muy interesante de actividadesnaturales sobre xenobióticos (73). Lamentablemente, también es conocidapor ser un patógeno oportunista en humanos y causante de complicacionesgraves en personas inmuno-suprimidas, con quemaduras severas o confibrosis quística. Por estas razones existe mucho interés en el estudio delas relaciones filogenéticas entre aislados clínicos y ambientales.Recientemente se demostró que la única diferencia aparente entre estosdos grupos es la presencia de un plásmido que correlaciona con lacapacidad de degradar gasolina y aunque no se demostró que las cepasambientales fueran infecciosas, es una llamada de atención sobre lasposibles consecuencias de liberar sin control bacterias recombinantes en elmedio ambiente (33).

Burkho lder ia es otro género bacteriano utilizado parabiorremediación de herbicidas y pesticidas recalcitrantes y también esusado para proteger cultivos contra hongos. Igual que Pseudomonas, hasido identificado como patógeno oportunista en humanos, particularmenteen pacientes con fibrosis quística. Debido a su genoma extremadamenteflexible, Burkholderia cepacia tiene una gran capacidad de mutación yadaptación. Es inherentemente resistente a múltiples antibióticos y éstacapacidad es altamente transmisible entre especies. Por todas estasrazones, la selección de cepas “seguras” para su uso ambiental no esposible por el momento y su uso en la agricultura también debe sercauteloso (42).

Una respuesta muy ingeniosa a este conflicto es la construcción deplásmidos “suicidas”, que sólo puedan propagarse en la cepa receptoraoriginal y que no puedan ser transferidos. Usando sofisticados sistemasgenéticos se han implementado estas funciones “suicidas” en losplásmidos de tal manera que no sean susceptibles de inactivación porproceso celulares naturales, como recombinación, pérdida o inactivaciónpor inserción (58).

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Enfoques genómicos para la microbiología ambiental

Mucho de la historia de la microbiología se ha basado en técnicasde cultivo axénico. Aunque esta estrategia ha llevado a descubrimientosnotables, ahora sabemos que la historia está incompleta debido a laenorme cantidad de evidencia indicando la existencia de numerososorganismos no cultivables. Se han desarrollado novedosos métodos quepermiten el análisis de muestras de material genético aislado directamentede suelo y el uso de técnicas de amplificación-clonación ha permitidoidentificar una gran cantidad de nuevos microorganismos dándonos unanueva perspectiva de la biodiversidad real de diferentes ecosistemas (89,103).

Con la finalidad de explotar el repertorio de actividades catalíticasde organismos no utilizados tradicionalmente, se ha desarrollado unanueva estrategia conocida como bioprospección. Esta estrategia no selimita a microorganismos, sino que cualquier miembro de un ecosistemapuede ser analizado con modernas herramientas moleculares para detectarnuevas capacidades metabólicas. Con respecto a microorganismos, nosolo se han explorado ecosistemas convencionales como suelo y agua,sino que los más espectaculares descubrimientos han surgido del estudiode ecosistemas extremos, como el subsuelo en los polos, cráteres devolcanes, manantiales sulfurosos, etc.

Colectivamente, los genomas de la microbiota total contenida en lanaturaleza, denominado metagenoma, representan mucho másinformación genética de la contenida en el subgrupo cultivable. Dada laprofunda utilidad e importancia de los microorganismos para todos lossistemas biológicos, se requieren nuevos métodos para acceder a lariqueza de información contenida en el metagenoma. Una estrategiaexitosa propuesta por el grupo dirigido por Jo Handelsman a este respecto,ha sido la clonación de fragmentos grandes de ADN aislado directamentede los microbios de muestras ambientales (84). La aplicación de estaestrategia permitirá no solo una evaluación más realista de labiodiversidad microbiana en diferentes ambientes, sino la recuperación deun sinfín de nuevas actividades, o de actividades ya conocidas con nuevaspropiedades.

Adicionalmente al enfoque de búsqueda de diversidad, se estallevando a cabo un esfuerzo muy interesante para el análisiscomputacional de algunos genomas secuenciados completamente quepermitan la predicción de reacciones aisladas o de vías bioquímicas

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completas involucradas en la degradación de xenobióticos. Hasta elmomento, el grupo dirigido por Lynda Ellis tiene identificadas más de 100vías metabólicas, 650 reacciones, 600 compuestos y 400 enzimasparticipantes en la degradación de contaminantes. Toda esta informaciónestá disponible en la base de datos sobre Biocatálisis y Biodegradación dela Universidad de Minnesota (http://www.labmed.umn.edu/umbbd/)fundada en 1995 (30).

Conclusiones

Aunque existían indicios de la complejidad microbiana, no es sinohasta recientemente que estamos adquiriendo conciencia de la enormecantidad de recursos bioquímicos que están esperando ser descubiertos.Las principales firmas biotecnológicas están invirtiendo grandescantidades a la búsqueda de nuevas actividades enzimáticas que puedanser aplicadas a productos existentes o que inspiren nuevas formulaciones.Existe la consideración general de que muchos de los procesosindustriales que se implementarán en los próximos 50 años tendrán sufundamento en recursos biotecnológicos: deberán ser eficientes, limpios yauto sustentables. Los métodos tradicionales de procesamiento delpetróleo también se enriquecerán con la generación de nuevasbiotecnologías.

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