fago lambda

7/26/2019 fago lambda

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Bacteriófago Lambda

Introducción

El estudio de las bacterias estaría incompleto sin el estudio de sus elementosextra-cromosomales como son los plásmidos y sus virus (bacteriófagos ófagos). Estos elementos son autónomos ya que pueden replicarse por si solos,

portan información gentica y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades. !os bacteriófagos al igual que las bacterias, pueden encontrarse

en casi todos los lugares, pero se presentarán generalmente donde estn sus"uspedes obligatorios.

!os fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos# los

fagos virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentosse inicia infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos ytraducidos para producir sus propias proteínas, las cuales son necesarias para

la replicación de su genoma, para la formación de su cápside y tallo, para elempaquetamiento del nuevo material gentico sinteti$ado y para la lisis

bacteriana, y teniendo como ob%etivo final la producción de las partículas oviriones maduros. !os fagos temperados pueden seguir al igual que los fagos

virulentos la vía lítica, pero a diferencia de stos, pueden convivir como profagos dentro de la bacteria. & la bacteria que posee un fago integrado se le

denomina bacteria lisógena, y al fago integrado se le denomina profago. En la

vía lisognica, como en el caso del bacteriófago ' (lambda) que infecta a su"usped Escherichia coli, su & inyectado en forma lineal es primeramentecirculari$ado para ser posteriormente integrado al cromosoma bacteriano. El

& de ' integrado estará formando parte del cromosoma bacteriano. !areplicación del & se lleva en forma pasiva, o sea, solo se replicará si sereplica la del cromosoma del "usped. !as funciones para que se desarrolle la

vía lítica estarán reprimidas y por consiguiente permanecerá en un estado delatencia. Este estado puede continuar a travs de un n*mero indefinido de

generaciones, "asta que alg*n disturbio ambiental indu$ca la se+al para que el& se escinda. !as funciones líticas se verán reactivadas y se producirán

nuevos viriones (ig. ).

http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap18/imagenes/c18im1.html




El bacteriófago ' se caracteri$a por estar constituida aproximadamente de lamitad de proteína y la otra mitad de &. u cromosoma la forma una

molcula de & de doble cadena y consta de /0,123 pb, conteniendoaproximadamente 12 genes, que codifican para 1 proteínas relacionadas con la

regulación, 4 con la recombinación, 3 con la morfognesis de la cápside ytallo, 3 con la replicación y 3 con la lisis bacteriana. El genoma del fago ' está

organi$ado de tal forma que presenta grupo de genes en unidades funcionales.& la derec"a del sitio att 5 (sitio de integración del fago), se locali$an los genes

relacionados con la recombinación, posteriormente los genes relacionados a laregulación, le siguen los de replicación, los de lisis y finalmente los genes

relacionados para la formación de la cápside y del tallo (ig. 3). !a cápsidetiene una estructura icosadrica, con un diámetro aproximado de 2.21 6, yunido a sta, una proyección tubular de 2.1 6 de longitud.





!ambda fue descubierto por Est"er !ederberg en 71, y a partir de sudescubrimiento el estudio con el fago ' sigue siendo un factor importante en

la contribución al conocimiento de la 8entica 9olecular.

En este capítulo, nos enfocaremos en la descripción del desarrollo del fago ',

iniciando con la infección fágica, y el control de la regulación de la expresiónde genes necesarios para su desarrollo lítico o lisognico, continuaremos con

el establecimiento y mantenimiento de la represión. 5osteriormentedescribiremos la recombinación integrativa y las diferentes formas de

replicación, terminaremos con el ensambla%e de la cápside, empaquetamientodel & y la lisis celular.

Infección

!a infección es reali$ada básicamente en dos etapas, la adsorción y la

inyección del &. !a adsorción es reversible a ba%as temperaturas, peroresulta irreversible una ve$ que el & "a sido inyectado. !ambda infecta



eficientemente a la temperatura de :4;<. El proceso de la infección requiere

de energía metabólica del "usped. El producto del gen J del fago ', el cualestá formando parte del extremo distal del tallo de ' reconoce al receptor de

maltosa !am= ubicado en la membrana externa del "usped. !a inyeccióneficiente del & requiere además el producto del gen pst 9, proteína

relacionada en el transporte de fosfato y ubicada en la membrana interna. e"a observado que la infección por ' ocurre sin cambios contráctiles en la

estructura del tallo, a diferencia de lo que sucede con el fago >/. ?na ve$ queel & "a penetrado a la clula, es circulari$ado por unión de sus extremos

co"esivos en los sitios cos (regiones de cadena sencilla de & de 3nucleótidos y cuyas secuencias se complementan). 5osteriormente los

extremos del & son unidos en forma covalente por la ligasa del "usped.

Desarrollo lítico del fago lambda

espus de la infección, ' puede desarrollarse en forma lítica o lisognica,seleccionando funciones para cualquiera de estas dos vías. i ' opta por el

desarrollo lítico requerirá de la expresión concertada de varias funciones, producto de genes virales y del "usped, y las funciones propias de la

lisogenia serán reprimidas, así el fago ' seguirá un estricto plan de desarrollo.

El programa lítico empie$a con la iniciación simultánea de la transcripción de

dos promotores# el i$quierdo p! y el derec"o p@. El transcrito temprano de p!termina en el terminador de la transcripción t! y produce un transcrito de

A,222 nts, equivalente a un &@m 3. El transcrito del promotor p@ termina en t@ y produce un &@m equivalente de 7. El transcrito temprano

de p! contiene al gen N y cuyo producto suprime los terminadores de latranscripción. El transcrito temprano de p@ contiene al gencro, y su producto

es un represor transcripcional que regula negativamente la síntesis del represor <B, así como de los transcritos de p! y p@ (ig. 3).

Transcripción temprana-tardía

!a proteína modifica a la &@ polimerasa que transcribe a partir del

promotor p!. Esta desconoce a los terminadores de la transcripción t!, t!3, ya otros más locali$ados en el operón i$quierdo, produciendo transcritos C4,222nts que incluyen la región b, más allá del sitio att 5 (ig. :). El mensa%ero a

partir del promotor p@ termina A12D en t@. !a proteína , modifica a la&@ polimerasa y transcribe eficientemente los genes cII , O, P y Q (ig. :).Entre los genes P y Q se encuentra un segundo terminador t@3. Este

terminador es muc"o más eficiente que t@ y solamente es suprimido por la presencia de . &sí, la ausencia de , no permite que sea expresada. in

embargo, fagos con deleciones en t@3 (' nin), pueden parcialmente,

propagarse en forma lítica a*n en ausencia de la proteína .









e "a observado que varios minutos despus de la infección, la síntesis de los

genes tempranos ( N y cro), así como de los genes tempranos tardíos (del ladoderec"o cII , O, P F del lado i$quierdo cII , gam, beta, etc.), empie$a a disminuir

por la in"ibición de la transcripción de p! y p@. Esto es debido a que la proteína <ro se une a los operadores o! y o@, que se traslapan con sus

respectivos promotores p! y p@. !a in"ibición debida a <ro resulta esencial para el programa lítico, ya que una excesiva actividad de p!, así como de p@

puede ser letal para el desarrollo de '. e "a observado que lasobreproducción de varios productos de ' produce efectos adversos en el

metabolismo de "usped, así como del fago.

Transcripción tardía

!a siguiente etapa, en la expresión de los genes tardíos de ' se requiere del

producto del gen Q, el cual act*a como un antiterminador para la transcripciónde p@G. Este promotor esta locali$ado entre el gen Q y el gen R. !a

transcripción de p@G es constitutiva. El &@m H producido corresponde a laregión del inicio de la transcripción s@G al terminador t@G. Este transcrito es

detectado a*n en una lisógena reprimida. &sí, el transcrito de p@G por laacción de se extiende a travs de los genes tardíos que en su mayoría

codifican para las proteínas estructurales, y termina en alg*n lugar de laregión b (ig. :).





Regulación del programa Lítico

Mecanismo de acción de N

El producto del gen es una proteína de A3,322 daltones, que activa laexpresión de los genes de ', antagoni$ando con la función de los terminadores

de la transcripción. e "a observado que solamente los transcritos originadosde los promotores p! y p@ son susceptibles de ser antiterminados por laacción de la proteína . alstrom y $balsIi en 740 reportaron una región en

el operón p! necesario para que se llevara la antiterminación, y ladenominaron nut (esta región esta compuesta a su ve$ por dos sitios# box&

ybox=), locali$ado entre el promotor p! y el terminador t!. 9utaciones eneste sitio, a*n en presencia de , provocan que la transcripción termine en

t!. 5osteriores estudios ubicaron a esta región en los primeros 42 pb con

relación al inicio de la transcripción de s!. El análisis por secuencia revelóque las mutaciones que no eran capaces de antiterminar caían en una región desimetría de repetidos invertidos y que forman una estructura de "orquilla

(box=), por el apareamiento de sus bases. En forma similar, para el operón de p@ se identificó una secuencia muy parecida a box= de nut !, de unos H-4

pb entre el carboxilo terminal del gen cro y el terminador t@. Este sitio fuedenominado box=, que %unto con box& de nut @, constituyeron la región

necesaria para la reali$ación de la antiterminación.

5or otro lado, se "a demostrado que se requieren factores del "usped para

que la actividad de la proteína sea efectiva. & estos factores se les denominó us. e seleccionaron mutantes de E. coli incapaces de crecer ' pero que

invariablemente permitieron el crecimiento de fagos ' nin (independientes de ). !as mutantes llamadas nus ónus- fueron locali$ados en cinco

genes# nus&, nus=, nus<, nus (rho) y nusE, e ubicados en el genoma de E.coli en los minutos# H7, , 00, 0/ y 43, respectivamente. 5osteriormente se

encontró a otro gen nus8, cuyo producto está involucrado en laantiterminación.

El modelo que explica la intervención de para que realice su funciónantiterminadora es ciertamente comple%o. e forma un comple%o

comprendiendo a la &@ polimerasa, los factores del "usped (us&, us=, usE y us8), así como del fago y el sitio nut del &@m. !a parte amino

terminal de la proteína "asta el residuo 7 reconoce a la ca%a = de nut , laregión comprendida entre los aminoácidos :/ a /4 interacciona con el factor

us&, y la parte carboxilo terminal de los residuos 4: a la 24 reconoce a la&@ polimerasa. El factor us& al igual que la proteína , reconocen las dos

ca%as & y = de nut e interacciona a su ve$ con la &@ polimerasa. 9enosestudiadas son las interacciones de los factores us= y usE (equivalente a la

proteína ribosomal 2), pero ambas son capaces de reconocer a la ca%a &.&dicionalmente ambos factores interaccionan directamente con la &@



polimerasa. !a proteína us8, interacciona con la &@ polimerasa y con

us (equivalente al factor r de la terminación). &sí este comple%o transcribey desconoce los terminadores de la transcripción (ig. /). &dicionalmente, el

comple%o permanece unido al sitio nut del &@m formando un &@ en formade asa que crece a medida que avan$a la &@ polimerasa.

La proteína Q y su función

!a expresión de los genes tardíos requiere de la función antiterminadora de latranscripción de la proteína . El producto de los genes @ y son los

primeros en transcribirse a partir del promotor p@J y están relacionados con lalisis bacteriana. El producto de 2 genes que se transcriben posterior

a R y S se relacionan con el ensambla%e de la cápside, y el producto de 3genes posterior a los genes que codifican para la estructura de la cápside se

relacionan con el ensambla%e del tallo.

El producto del gen Q es una proteína de A33,122 daltones. El mecanismo por

la cual antitermina es diferente al de . !a proteína act*a sobre el & enun sitio denominado qut el cual está locali$ado entre la posición -2 y -:1 del

promotor p@G. !a unión de a qut ocurre mientras est presente el factor deiniciación K42 en la &@ polimerasa, ya que es necesario un cambio

conformacional del templado de cerrado a abierto en el comple%o deiniciación. 5ara que act*e se necesita que la &@ polimerasa "aya iniciado





la transcripción, y "aga una pausa alrededor de los nucleótidos LH y L4. in

embargo, una doble mutación en -1 y -: de la secuencia del promotor reduce la antiterminación por alrededor de unas 2 veces sin cambiar la

pausa en LHML4. !a región posterior al inicio de la transcripción es tambinnecesaria ya que mutaciones en L3 y LH, impiden la acción por , y eliminan

o reducen sustancialmente la pausa inicial. &l parecer, el *nico factor del"usped necesario para la antiterminación por es us&, ya que estimula la

actividad de la &@ polimerasa en una forma considerable sobre losterminadores de la transcripción. Este transcrito tardío es sinteti$ado en forma

continua y se extiende alrededor de unos 3H Ib.

El "ec"o de que ' utilice otro regulador positivo , en adición a , para llevar

a cabo su desarrollo lítico, pudiera explicarse en la fuer$a de estos activadores.Estudios de la medición de la vida media del &@m indican que la región

tardía es uniformemente transcrita. En contraste con la de p!, ba%o lainfluencia de , disminuye rápidamente con la distancia.

Establecimiento y Mantenimiento de la Represión

i despus de la infección, el fago ' opta por la vía lisognica, deberá

integrarse al cromosoma bacteriano y "abrá de mantener reprimidos los promotores p! y p@. En el estado lisognico el sistema de represión está

funcionalmente activo manteniendo constantes los niveles del represor <Bmientras no exista alg*n disturbio que active el desarrollo lítico.

El represor <B es sinteti$ado a partir de los mensa%eros de dos promotores

diferentes# p@E y p@9. &mbos promotores tienen como función principal lade transcribir al gen cI , pero act*an a diferentes tiempos en la vía lisognica.

5ara que el estado lisognico inicie despus de la infección, se requiere de latranscripción del promotor p@E. Este promotor está locali$ado A/22 pb a la

derec"a del gen cI , y se solapa con la región 1Jterminal del gen cII . !atranscripción de p@E es en contrasentido al del promotor p@ y requiere del

activador <BB. ?na ve$ iniciada la transcripción del promotor p@E, estos

transcritos en contrasentido a los de p@ pueden complementarse y unirse conlos de p@ formando una doble "lice de &@. Esta estructura deberá in"ibir laexpresión de <ro, así como la de <BB. !a in"ibición de <ro es fácilmente

entendible, ya que esta proteína act*a en forma antagónica al represor <B. 5arael proceso lisognico se requiere que los niveles de <ro estn en su mínimaexpresión. in embargo, resulta más difícil entender la disminución de la

expresión de <BB, ya que sta es requerida para la producción de <B. Es probable que en el momento en que <BB activa al promotor p@E, los niveles de

<BB en la clula están lo suficientemente altos, y no requiera de una síntesis

adicional de <BB para establecer la lisogenia. &dicionalmente, cabe mencionar que el transcrito proveniente de p@E que transcribe al gen cB tiene un "ine



algarno lo bastante fuerte para que <B sea traducido en forma eficiente. El

regulador positivo <BB tambin act*a sobre el promotor pB que transcribe algen int, y cuyo producto es necesario para que el cromosoma de ' se integre al

cromosoma bacteriano. !os niveles de la proteína <BB en la clula deben estar lo suficientemente altos para activar a p@E y a pB. ebido a que <BB es

metabólicamente inestable y es degradada fácilmente por la acción de la proteasa Nfl& del "usped, se requiere un factor adicional del fago, la proteína

<BBB, que contrarresta la acción de esta proteasa. &sí, <BBB %unto con <BB sonrequeridos para que se lleve una eficientemente lisogeni$ación. in embargo,

<BBB no será necesario si el "usped contiene un gen "fl& inactivo (ig. 1).

Mantenimiento de la Represión

El mantenimiento del estado lisognico es debido a la acción del represor <B,

producido de la transcripción del promotor p@9. Este promotor requiere de laacción del mismo represor <B para activarse. El promotor p@9 se solapa con

uno de los sitios de la región del operador O@ , el sitio O@ :. 5ara elmantenimiento de la represión se requiere primeramente que el represor <B

act*e impidiendo la transcripción de los promotores p! y p@, por medio deuna unión en forma "omodímera de <B, sobre el lado derec"o en los sitios O @

y O@ 3 (los cuales se solapan con el promotor p@), y del lado i$quierdo a lossitios O! y O!3 (que se solapan con el promotor p!). El dímero de <B se une

preferentemente a la región O@ del lado derec"o, y a O! del lado i$quierdo.





Estas uniones permiten que de manera cooperativa el siguiente "omodímero

de <B se una a O@ 3 y O!3, respectivamente. <oncentraciones PnormalesP delrepresor en la clula, permiten que los sitios O@ y O@ 3 estn ocupados

generalmente, y esta interacción no se extienda al sitio O@ :. 9utaciones en elsitio O@ , "acen que el dímero se una a los sitios O@ 3 y O@ :, indicando que la

unión es cooperativa entre los dímeros de los represores. !a unión del represor al sitio O@ 3 permite que la &@ polimerasa unida al promotor p@9, se active

y transcriba al gen cI , producindose más represor. i las concentraciones de<B siguen en aumento, el promotor p@9 se apagará debido a que el represor

se une al sitio O@ :. Este sitio y parte del sitio O@ 3 se solapan con el promotor p@9. espus de un cierto tiempo, el represor decae, su concentración ba%a y

el sitio O@ : es el primero en quedar libre por tener menor afinidad. !os otrossitios O@ 3 y O@ quedarían libres, sino fuera porque el represor <B unido a

O@3 es capa$ de activar nuevamente a la &@ polimerasa de p@9. e esta

manera se autorregula la expresión de <B, manteniendo constantes los nivelesde <B en el citoplasma (ig. H). El represor <B es mantenido en A322 copias

por clula y no sólo impide la transcripción de genes del profago, sino

tambin la transcripción de otros genes de fagos infectantes "omólogos, por launión del represor <B a las regiones operadoras O! y O@ del fago(s) infectante.

Este mecanismo en la que una bacteria lisógena es capa$ de in"ibir lainfección por un fago "omólogo (fago con la misma especificidad del

represor) es denominado inmunidad. &sí, el represor <B es específico parafagos que tienen la misma región de inmunidad.





Integración y Escisión del profago

El & del fago entra a la clula en forma lineal pero enseguida se circulari$a

por complementación de los extremos co"esivos y ligación de los PnicIsPcorrespondientes. En la respuesta lisognica las funciones líticas, inclusive la

replicación, están reprimidas por lo que, cuando la bacteria se divide, el &circular del fago ' podría ser segregado desigualmente entre la progenie. Este



evento se evita por la integración del & de ' al genoma de la bacteria, en

forma que al replicarse el profago se transmite igualmente a las clulas "i%as.

!a integración se efect*a por un evento de recombinación sitio-específica

mediado por la integrasa (Bnt) codificada por ' y por proteínas del "uspedllamadas factores de integración (BN). <uando se levanta la represión de una

lisógena se requiere que el profago se escinda del cromosoma bacteriano. !aescisión requiere tambin de Bnt y de los BN, pero además necesita Qis, el

producto del gen xis adyacente a la derec"a de int .

E!presión de Int durante la lisis

!a transcripción del mensa%e policistrónico a partir de p! es afectada por la

acción de la proteína antiterminadora (ver arriba). El &@ contiene, entre

otros, los mensa%es de xis e int , pero además contiene la región sib (por sitioin"ibidor de la región b) responsable del control postranscripcionalde int llamado retroregulación. !a región sib se locali$a a la i$quierda delgen int distal al sitio att 5, donde se efect*a la recombinación integrativa, y

reduce la síntesis de proteína Bnt. El &@m que contiene la regiónretroreguladora sib forma una estructura de tallo y asa que es procesada por la

@asa BBB. El extremo :G generado es susceptible a la degradación por 55asay @asa BB. Estas en$imas son exonucleasas que degradan el &@

progresivamente en dirección :G a 1G, lo cual implica que el mensa%erode int sea eliminado. o suceden así con el gen xis en el extremo 1G del

mismo transcrito porque dentro del mensa%e de int se forma una estructurasecundaria que resiste la acción de las exonucleasas. Este evento explica que

no se sintetice suficiente proteína Bnt a partir del &@m originado en p! para poder integrar el & del fago (ig. 4). !a proteína Bnt no es necesaria si la

bacteria infectada está comprometida a una respuesta lítica.





E!presión de int durante el establecimiento de la lisogenia

<uando despus de la infección por ' la concentración de <BB alcan$a niveles

relativamente altos en la clula, se favorece la ruta lisognica. !a proteína <BBestimula la transcripción en los promotores p@E y pB que está asociada con el

establecimiento de la lisogenia. !a transcripción a partir de p@E permite lasíntesis del represor de la lisogenia <B y a partir de pB se expresa Bnt, la



proteína que media la integración. Ra que el inicio de la transcripción de pB

ocurre dentro del gen xis, que precede a int , el &@m generado se traduce enBnt pero no Qis. !a transcripción a partir de pB se detiene en el terminador t B

una estructura de tallo y asa que está contenida pero no es idntica a laestructura sib mencionada antes. El de pB es un mensa%ero que sólo

contiene int que es estable debido a la estructura del terminador tB y que setraduce eficientemente en la Bntegrasa.

Recombinación sitio especifica de

!os sitios donde se lleva a cabo la recombinación integrativa son att 5 en el

& del fago y att = entre los operones gal y bio del cromosoma bacteriano.Estos sitios mantienen "omología limitada a unos :2 pb. Ra que las

recombinaciones generales de la bacteria o la del fago, requieren de

"omología en las secuencias de cientos de pares de bases de &, es claroque la integración requiere de otro sistema. Este sistema se le "a llamadoPrecombinación sitio específicaP y se caracteri$a por su alto grado de

especificidad y direccionalidad.

El sitio de recombinación att 5 del fago, además de un n*cleo de 1 pb,

involucra otras secuencias adyacentes (12 pb a la i$quierda y 40 pb a laderec"a)F asimismo att = consta de un n*cleo de 1 pb de secuencia idntica a

la de att 5 y secuencias adyacentes que son parcialmente "omólogas a lasecuencia de '. !a recombinación entre ambos sitios att se lleva a cabo

gracias a la participación de la integrasa del fago y las proteínas BN del"usped. !a recombinación se efect*a por un mecanismo de corte y reunión

en el n*cleo com*n. El símbolo de la región com*n es O y está flanqueado por los bra$os o regiones adyacentes simboli$adas 5 y 5G que representan los

bra$os i$quierdo y derec"o de att 5. = y =G simboli$an las regionescorrespondientes de att =. !as reacciones de inserción y escisión se

acostumbran abreviar por la siguiente ecuación#

Bnt BN termosensible

5O5G (att 5) L =O=G (att =) ST TC =O5G (att !) L 5O=G(att @)

Bnt, Qis, BN termoestable

!as secuencias att ! y att @ son productos de la recombinación integrativa y

sustratos para la escisión. !a proteína integrasa participa en ambos procesos, yes esencial para la integración ya que requiere de una mayor concentración

de int , mientras que la escisión ocurre cuando "ay una mayor concentraciónde Qis que de Bnt.

"ormación del intasoma



!a integrasa es un polipptido de A/2,222 daltones, con funciones de

recombinasa, unión especifica al & de att 5 y de topoisomerasa. Estaen$ima es capa$ de cortar y ligar las cadenas de & para rela%ar su

estructura y promover el intercambio de cadenas con el & de la bacteria.!a proteína Bnt se une al & formando multímeros consistentes de / a 0

monómeros al n*cleo de att 5 (donde el entrecru$amiento de cadenas ocurre)reconociendo un par de secuencias de invertidas repetidas que se encuentran

uniendo al n*cleo y a los bra$os flanqueadores del att 5.

Bnt tambin se une a una sequencia que se repite 1 veces en los bra$os de att 5.

!a proteína BN de E. coli tiene tres sitios de unión en los bra$os de att 5. =a%ola influencia del superenrollamiento del &, att 5, Bnt y BN, se forma una

estructura superenrollada denominada intasoma que es la especie activa de larecombinación integrativa. En contraste el sitio att =, es sencillo y no contiene

secuencias de unión para BN como los bra$os de att 5, tampoco es necesarioel superenrollamiento en esta región del & para la recombinación. !a

región att = tiene la misma secuencia de 1 pb que se "alla en el n*cleodel att 5 y algunos pares de bases que le flanquean completan el par de sitios

de unión para Bnt (ig. 0). & estos sitios de unión en att = se unirán las proteínas Bnt que forman parte del intasoma y no así la proteína Bnt presente en

el citoplasma.

El modelo de recombinación integrativa postula la formación de una

estructura sináptica entre las cuatro cadenas de & en sus regiones

"omólogas. El acercamiento de las cuatro cadenas auxiliadas por el intasoma permite que ocurra el corte en uno de los extremos del n*cleo de lasregiones att , las dos cadenas con la misma polaridad son cortadas, ocurre la

rotación de estas cadenas alrededor de las que no "an sido cortadas que permite alinearlas con las nuevas cadenas compa+eras para ser finalmente

ligadas a estas.

Este primer intercambio de cadenas tiene la topología de una estructura de

Nolliday. 5ara resolver el entrecru$amiento de las cadenas remanentes, estasson cortadas en el otro extremo del n*cleo, rotan y son religadas a las nuevas

cadenas correspondientes. 5ara esta reacción la presencia de BN no esnecesaria y la proteína Bnt la puede llevar a cabo. En cambio para el primer

entrecru$amiento de cadenas si es necesaria la presencia de BN.

La escisión del profago

!a escisión del & del fago requiere de las proteínas Bnt y Qis. !osgenes int y xis se locali$an %untos inmediatamente a la derec"a del sitio att5.

!as secuencias de estos genes tienen una superposición de 32 pb. entre el

extremo 1Gde int y el :Gde xis.





<uando se induce la fase lítica se requiere la escisión del & del fago. !a

inactivación del represor <B producida por la proteasa @ec& permite latranscripción a partir de p! para producir un &@m que contiene al

gen xis e int , pero no la región sib que fue separada físicamente durante larecombinación del sitio att 5 con att =. Este transcrito no será degradado y

permite la traducción de ambos genes eficientemente, y cuyos productos sonnecesarios para la escisión (ig. 0).

!a escisión es de tipo sitio especifica y requiere de Bnt, Qis e BN. 5ara estolas cadenas con los sitios att ! y att @ son intercambiadas para restaurar los

sitios att 5 y att =. !a escisión requiere de Qis la cual tiene 3 sitios de unión enel att @. e piensa que Qis estabili$a la unión de Bnt para promover un nuevo

evento de recombinación entre att @ yatt !. !a reacción de escisión esresistente a la temperatura a diferencia de la integración que es in"ibida por la

temperatura y altas concentraciones de Qis.






Replicación del fago

!a replicación del & del fago ' puede llevarse a cabo en forma pasiva o en

forma activa. !a replicación en forma pasiva es reali$ada por la replicacióndel cromosoma bacteriano, ya que el & de ' esta integrado, y al replicarse

el cromosoma bacteriano, se replica tambin el de '. !a replicación activa esindependiente de la replicación del cromosoma del "usped. Esta es llevada a



cabo en dos fases# la temprana y la tardía. En la fase temprana, la replicación

es iniciada a partir de un *nico origen. Es reali$ada en forma bi-direccionalgenerando molculas de & circulares. !a replicación sigue la forma U por

la seme%an$a de las estructuras intermedias con la letra griega Tetha. En lafase tardía de la infección, la replicación sigue la forma del circulo rodante (s),

generando m*ltiples molculas lineales de & de l (ig. 2).

5ara que se lleve a cabo la replicación, se requiere de la maquinaria

replicativa, la cual consta de un gran n*mero de proteínas, y de las cuales lamayoría provienen del "usped. olamente dos proteínas fágicas, codificadas

por el producto de los genes O y P , participan directamente en la iniciación dela replicación. &sí, la replicación posterior a su inicio sigue el mecanismo

establecido del "usped E. coli. !a mayoría de las proteínas implicadas en lareplicación, fueron identificada retando al fago ' a replicarse ba%o las

condiciones no permisivas de temperatura en cepas mutantes termo-sensibles para la replicación de E. coli.





Replicación Temprana

5osterior a la inyección de la molcula lineal del & de ', esta es convertida

a una molcula circular covalentemente cerrada por apareamiento de susextremos co"esivos de 3 nts (sitios cos) y su posterior ligación (ig. 2). Esta

molcula circular por la acción de la & girasa se superenrollanegativamente formando el sustrato replicativo.





e "a observado ba%o el microscopio electrónico que la mayoría de las

molculas tienen la forma de U en el estadio replicativo temprano. Estasestructuras presentan dos cadenas de la misma longitud, correspondiente a la

región replicada, y unido a sus extremos, un tercer segmento el cual no "a sidoreplicado. &dicionalmente, se observa que existe un peque+o porcenta%e de

círculos con una peque+a "ebra unida a sta, indicando que la replicacióntambin sigue el modelo del círculo rodante.

!a replicación empie$a en un origen *nico y procede bidireccionalmente. !asasas replicativas, donde se lleva a cabo la síntesis del &, se mueven en

forma divergente a su origen y progresan a travs del círculo con velocidadesmuy similares.

!a reiniciación en el origen, está regulada y normalmente no ocurre, "asta que

el ciclo replicativo se "aya completado. in embargo, se "a observado que ba%o ciertas condiciones, como la adición de cafeína 3m9 al medio, es posiblela reiniciación, observándose que A32D de las molculas "an reiniciado, a*n

cuando el ciclo replicativo anterior no "aya finali$ado. e propone que ladroga act*a ba%ando la estabilidad "elicoidal del &, o sea cambiando la

estructura del templado y facilitando por consiguiente la reiniciación de lareplicación.

&mbas cadenas del & parental son copiadas, de acuerdo al modeloreplicativo U. in embargo, una observación más cuidadosa de las

microfotografías electrónicas de alta resolución revelan que en varias de lasestructuras q, en la posición de las asas replicativas, o sea, en los inicios de la

síntesis del &, se presentan peque+as regiones de & de cadena sencilla.Estas regiones pueden ser observadas en ambas asas y estando siempre en el

inicio y en bra$os opuestos. Esta asimetría in"erente en la progresión de lasasas replicativas y sabiendo que la &-polimerasa lleva a cabo siempre su

síntesis en dirección 1G a :G, y que la constitución de la doble "lice esantiparalela, puede explicarse que una de las cadenas es replicada en forma

continua y la otra en forma discontinua. !a longitud de estas cadenas cortas de& de simple cadena coincide con el tama+o de los fragmentos de OIasaIi.

e acuerdo a este modelo, la replicación contin*a "asta terminar en el poloopuesto al origen de replicación. Es muy probable que despus de este ciclo

replicativo, las dos nuevas cadenas circulares que forman dos cromosomas delfago se presenten en forma concatenada. !a separación de estas no sería

posible sin la intervención de una &-topoisomerasa.

!a replicación temprana procede en forma exponencial, y el n*mero de

molculas se duplica cada 3 - : min. in embargo, no todas las molculasestán en estado replicativo en cualquier momento, sólo A32D de las molculas

se replican. &dicionalmente, puede observarse que alrededor de 12 molculas



transcripción a partir del promotor p@. e "a observado que cuando la síntesis

del & es retardada por la limitación de la cantidad de las proteínas O y 5activas despus de la infección, las primeras formas replicativas observadas

son generalmente de la forma K.

El producto del gen gam de ' , claramente %uega un papel importante en la

síntesis de concatmeros de &, y el producto del gen re pudiera tambinser de importancia. !a doble mutante gam--re -- de ', es incapa$ de formar

placas en un tapi$ bacteriano rec&-- (deficiente en recombinación). =a%o estascondiciones, la síntesis de & ocurre, pero se acumulan muy pocos

concatmeros de &. &lgunas formas del tipo K pueden ser detectadas, perosus cadenas laterales son muy cortas. in embargo, el defecto de la replicación

del circulo rodante de la mutante gam--re -- de ' puede ser restituida por ladoble mutante del "usped rec&-- y re =-- o re <-- o rec--, sinteti$ando

concatmeros eficientemente. &sí, la función crítica de la proteína 8am es lade in"ibir la actividad de la exonucleasa V codificada por los genes rec=, rec<

y rec que destruye los concatmeros.

!a función de @ed y las funciones de recombinación del "usped son menos

claras, posiblemente generan recombinantes entre monómeros circulares. !osmultímeros resultantes llevarían al menos dos sitios cos, sustratos para una

eficiente encapsidación. En efecto, si la replicación normal es bloqueada, larecombinación llega a ser necesaria para la maduración de los cromosomas de

'.

Iniciación de la Replicación de

@esulta claro que tanto para la forma U, así como para el /2D de la forma K,la replicación, se inicia en un origen *nico ori. El origen de replicación en sus

inicios fue determinado por mapeo con las microfotografias electrónicas,tomando desde el origen de las asas replicativas y extrapolando a la región

cero de replicación. Esto ubicó al orientre 0.4 W 3.7D en relación al extremoi$quierdo del genoma de ', y muy cerca de los genes O y P . 5osteriormente,

estudios genticos determinaron con más precisión el sitio de control para lainiciación de la replicación. Este sitio estuvo locali$ado dentro del gen O,

aproximadamente a 02.1 - 02.HD del extremo i$quierdo del genoma '. Elorigen de replicación fue determinado probando diferentes mutantes con

deleciones cercanas a y dentro del gen O, observándose si la replicación sellevaba a cabo o no en profagos. ?na ve$ delimitada esta región, se clonó en

regiones no esenciales de fagos o en plásmidos, y por complementación de Oy 5, se observaron si eran capaces de replicar o no. ?na región entre el

promotor p@ y un sitio Eco@B dentro del gen O permite que se repliqueeficientemente tanto en el sistema de profagos y de plásmidos. in embargo,

una región de :/ pb a la derec"a del sitio Eco@B incrementó la replicación de32 a :2 veces en el sistema plasmídico. &sí, pruebas con deleciones indicaron



que los límites de ori están comprendidos a no mas de 322 pb del sitio Eco@B.

e "an propuestos otros sitios mas distantes como el sitio ice (inceptor sequence) dentro del gen cII y locali$ado a H22 pb a la i$quierda de ori que

facilitan la replicación. in embargo, deleciones en este sitio "an permitidouna buena replicación, por lo que a ori se le considera el *nico sitio

indispensable para que se lleve a cabo una replicación normal. ebido a lacapacidad de suplir la actividad de O por complementación, se pudieron "acer

ensayos más finos mutando el origen de replicación (dentro del gen O) y sedefinió un segmento mínimo de H: pb como el origen de la replicación.

orprendentemente, esta región presenta cuatro ca%as muy parecidas de 7 pbconteniendo repetidos invertidos y separados unos de otro por pocas bases. El

& de esta región puede modelarse como una estructura de un trbolcomple%o, sugiriendo que pudiese ser el estado activo del & para el inicio

de la replicación. El origen ori tiene otra estructura no usual a la derec"a de

los repetidos, la cual es rica en pares de &X> y exponiendo una distribuciónasimtrica de purinas y pirimidinas. Estas propiedades deben facilitar ladesnaturali$ación local de la doble "lice.

!a interacción específica entre la proteína O y el segmento ori "a sidoidentificado por análisis genticos y bioquímicos. !a proteína O, de :/,222

daltones, act*a en forma dimrica. !a región amino terminal de O es esencial para el reconocimiento del & y se une a una región de 71 pb en la cual

están contenidas las cuatro ca%as.

!a proteína 5 es una proteína de 3H,222 daltones que de acuerdo a lasevidencias genticas sugieren que tambin puede interactuar con la proteínaO. 9utaciones del tipo temperatura sensible pueden ser suprimidas por

mutaciones que mapean en 5. !a proteína "íbrida O que contiene la parteamino terminal de ' y la parte carboxilo terminal O de Y02, funciona

eficientemente para la replicación con la proteína 5 del fago Y02 pero no conla proteína 5 de ', indicando que la interacción a 5 es con la parte carboxilo

terminal de O. !a proteína 5 interact*a con diferentes proteínas del "usped,entre estas la me%or caracteri$ada es con la "elicasa del "usped na=. !a

asociación con la proteína na= y su modificación en su actividad podrían permitir que na= entre al comple%o replicativo del & de '.

5ara que se inicie la replicación se requiere de la salida de 5 del comple%o deiniciación, para sto naZMna[ se asocian a 5 de%ando libre a na=. El

producto de los genes grp y grpE están involucrados tambin en la salida yregeneración de 5. &demás de las proteínas replicativas y al sitio ori, la

iniciación de la replicación requiere una activación transcripcional de lasíntesis de un &@ cercano al origen de la replicación. En una lisógena para '

cuando se coinfecta con el mismo fago y un fago auxiliar "eteroinmune que

provee las proteínas O y 5 de ', el genoma reprimido de lambda no es capa$de replicarse indicando la necesidad de la activación transcripcional.



Existen algunos antibióticos como la rifampicina que in"iben la replicación.

u acción es indirecta, ya que al in"ibir la transcripción de p@, evita laactivación transcripcional para la replicación. imilarmente, existen otros

antibióticos que in"iben indirectamente la replicación como son el &c. alidíxico y la <oumermicina, in"ibidores de la &-girasa. Esto sugiere que

el sustrato para la iniciación de la replicación debe ser un sistema de &superenrollado. El mecanismo propiamente de la replicación como el

reconocimiento para su iniciación, el comple%o &@ polimerasa para laelongación y para la terminación es muy similar a la que ocurre con su

"usped E. coli y se recomienda ver el capítulo de la @eplicación en E. coli.

Ensambla$e de las partículas %irales de lambda

' presenta la cápside en forma de icosaedro, que contiene el & de doble

cadena. Estas son partículas víricas peque+as de 11 nm de diámetro queguardan en su interior al genoma completo de ' de H,122 nm de largo. !aconstrucción de la cápside y el posterior empaquetamiento del &

comprende la participación de proteínas del fago y de la bacteria.

El & concatemrico, producto de la replicación de la forma K, y los

precursores de las cápsides interact*an mediante el reconocimiento de lasregiones cos por parte de la en$ima terminasa que se encarga del

empaquetamiento y corte posterior en la región cos. !a entrada de solamenteuna unidad cromosomal por cápside es controlada por el reconocimiento del

sitio cos terminal por la terminasa. in embargo, es posible introducir &"eterólogo con gran eficiencia en vectores que cuenten con las regiones cos al

ser empaquetados en reacciones in !itro.

!a cápside del virión se forma independientemente del ensamble del tallo, y al

unirse ambos conforman la partícula viral madura. e requiere de la participación de cuatro proteínas del fago y por lo menos de dos proteínas de

la bacteria para formar la cápside. !a proteína E forma la estructura del poliedro principal y la proteína se encuentra en la superficie formando un

arreglo eicosadrico en la cápside madura.

!as proteínas =, < y u: del fago %unto con las proteínas 8roE! y 8roE del"usped interact*an para formar la cápside primitiva. !as proteínas del

"usped son necesarias para evitar malformaciones de la cápside alensamblarse las proteínas E y u:. !a proteína u: facilita el ensamble de las

proteínas E, = y < en la estructura del precursor. !a proteína = forma el

conector entre la cápside y el tallo del virión, el cual está dispuesto en formade un anillo con un orificio central. Este será el orificio de la entrada del

&. urante la maduración de la cápside, la proteína = es escindida para

formar la proteína =\ en tanto que la proteína u: es degradada y removida



de la estructura. !as proteínas < y E participan en una fusión para formar

proteínas "íbridas Q y Q3 (ig. ).

<omo se mencionó antes, en la etapa final de maduración requiere del

empaquetamiento del & dentro de la cápside. El & concatemrico delfago es reconocido en el sitio cos por la terminasa (comple%o B), tambin se

necesita la participación de dos proteínas del "ospedero, las proteínas BN y>N, para que se realice el corte en el sitio cos. !a terminasa de ' consiste de

dos subunidades (u y &) que reconoce secuencias especificas en laregión cos. olo se sinteti$an de 22 a 322 molculas de terminasa en el curso

de una infección. El reconocimiento es llevado a cabo gracias al motivo ]"lice -vuelta- ] "lice de la subunidad peque+a de la en$ima u. Esta

subunidad se une a : o a / secuencias repetidas en la región cos. !a subunidadmayor tiene actividad de endonucleasa que rompe el enlace fosfodiester en

una de las cadenas (nicI). En el sitio cos se locali$an dos de estos sitios encadenas opuestas y a una distancia de 3 nucleótidos. !a afinidad de la

terminasa en la región de cos es estimulada por la unión y doblamiento del&, efectuado por el factor BN del "usped.

!a unión del comple%o B al precursor de la cápside genera el comple%o BB, cuyareacción es potenciada por la proteína B del fago (ig. ). !a entrada del

genoma de ' a la cápside se reali$a en forma polar, es decir, la dirección deempaquetamiento del & es del gen Nu a @. !a terminasa no solo se

encarga del reconocimiento de los sitios cos, sino tambin de la unión de este

con el precursor de la cápside, y establece el origen y dirección deempaquetamiento. El empaquetamiento requiere de la "idrólisis de &>5 parala condensación del & de :2 a 322 veces dentro de la cápside. urante el

empaquetamiento del &, la cápside sufre una expansión del 41D en sutama+o, de%ando espacios en la estructura de la red conformada por la proteína

E. Estos nuevos espacios son ocupados por la proteína en un n*meroequivalente al de la proteína E, brindándole estabilidad a la cápside madura.

El corte del & en su región cos termina con el empaquetamiento, laterminasa se disocia de la cápside madura pero continua unida al &

concatemrico para formar un nuevo comple%o BB con otro precursor de lacápside. En tanto que las proteínas ^ y BB se unen al conector del tallo para

evitar la salida del & y formar el sitio de unión del tallo con la cápsidemadura.

En tanto, el ensambla%e del tallo se lleva a cabo en forma independiente de lacápside. El tallo del fago ' consiste de un tubo flexible (no contráctil como en

el caso de >/) de :1 nm con un extremo cónico de 1 nm, una fibra terminalde 3: nm. e compone principalmente de :3 anillos apilados compuesto cada

uno de H subunidades de la proteína V. El producto del gen Z compone la fibra

terminal que interacciona directamente con el receptor !am= de la superficiede la bacteria.








El ensambla%e de la partícula viral se debe principalmente a un fino equilibrio

de las diferentes proteínas de la cápside y tallo. !os genes estructurales no seencuentran dispuesto al a$ar en el genoma de ' sino que los genes de la

cápside y del tallo se "allan agrupados en dos regiones que no se solapan. Esinteresante notar que los productos de genes que interact*an durante el

ensambla%e se encuentran codificados en genes adyacentes. !os polipptidos precursores son sinteti$ados secuencialmente en las cantidades apropiadas

durante el ensambla%e, a pesar de ser transcriptos a partir de un solo promotor (p@J).

Esto se explica por la expresión diferencial de las proteínas, producto de latraducción diferencial de los cistrones. 5ero si se altera la producción de

algunas proteínas, se produce un ensambla%e inadecuado que deriva en laformación de cápsides defectuosas.



Lisis #elular

?na ve$ formadas las partículas virales, stas deberán salir y dispersarse para

encontrar nuevas bacterias y poder multiplicarse. ?na de las principales barreras para la salida de las partículas es la malla continua de peptidoglicanos

de la pared celular. Esta estructura es estable y resistente y permite mantener la presión osmótica interna de la clula.



!a estrategia que sigue el bacteriófago para sortear esta barrera es producir

una endolisina para degradar los componentes de la pared celular. !aendolisina es una transglicosilasa que por si sola no es capa$ de llegar a su

sustrato porque la pared celular se encuentra separado del citosol por lamembrana celular, y para llegar a ste requiere de un segundo factor lítico, la

"olina. Esta es una proteína de membrana que da+a a la membrana interna yda libre acceso de la endolisina a la pared celular ( ig.3).

!os genes de la "olina y endolisina, S y R respectivamente del genoma delfago ', están locali$ados en el inicio de la unidad transcripcional tardía, ba%o

el control del promotor p@G. Este se PprendeP aproximadamente a los 0 mindel ciclo vegetativo y se expresa en forma constitutiva. !a endolisina activa se

acumula en el citosol, no teniendo acceso inmediato a su sustrato. !a "olinaforma lesiones en la membrana que terminan con la respiración y permiten

que la endolisina ataque a la mureína. !a más simple explicación, es que la"olina forme poros, y permita que la endolisina cruce la membrana celular.

eleciones en los genes de los "olina permite que la respiración contin*e, asícomo la síntesis macromolecular, observándose un incremento de la masa

celular, con una acumulación de viriones en el citosol. ?na característicacom*n del sistema basado en la "olina es su dependencia con la membrana

energi$ada, ya que la adición de venenos contra su sistema energtico,instantáneamente disparan la acción de la "olina. Este fenómeno de la lisis

prematura sugiere que el mecanismo de cronometra%e de la lisis depende de lamembrana energi$ada.





&ropiedades de la 'olina

El gen S de la "olina codifica para dos pptidos# uno de 21 aminoácidos y

otro similar, pero con 3 aminoácidos adicionales, o sea de 24 aminoácidos, presenta : regiones transmembranales con la topología amino terminal

siempre "acia fuera y el carboxilo terminal "acia el citosol. !a "olina puedeunirse al menos en multímeros de seis para formar el poro. !a parte



citoplasmática del carboxilo terminal es necesaria para la formación del poro

y tiene un papel regulatorio, dependiendo de sus residuos cargados positivamente. e "a observado que una misma mutación en la región

transmembranal 3 (>93) que cambia la alanina por valina (&13V), le confiereun defecto total en la lisis, acumulándose los viriones mas de la cuenta.

9ientras que la mutación alanina por glicina (&138) causa una catastróficalisis temprana, A32 min, antes de que el primer virion sea ensamblado. i no

se tiene algo adicional, esta es una prueba de que la "olina tiene dos funcionesesenciales# causar la lisis permeabili$ando la membrana y retardar la lisis

"asta que el programa del ensambla%e del virión "aya generado un n*merosuficiente de viriones.

Regulación de la función de la 'olina

_u es lo que "ace que la "olina dispare la formación del poro en el minuto12 sin "acerlo antes o despus`, y sabiendo que ciertos venenos queinterfieren con el proceso energtico disparan prematuramente la lisis. _<uál

es el papel de las membranas energi$adas`. 5arte de la respuesta está en la proteína de 24 residuos. >anto la "olina activa de 21 aminoácidos, así como

la in"ibitoria de 24 aminoácidos, son traducidas de diferentes "inealgarno. El cronometra%e de la lisis depende de la proporción de las dos

proteínas, la cual es 3# a favor de la de 21 aminoácidos, ba%o condicionesestándares de cultivo. !a función in"ibitoria de la proteína de 24 es su carga

positiva de la posición 3 (lisina). 8rasc"opf y =lsi fusionando una secuencia

se+al en la parte amino terminal de 24, eliminan su capacidad in"ibitoria y laconvierte en una "olina activa. Estas consideraciones "an permitido proponer un modelo para el evento del disparo de la "olina, su dependencia energtica,

y su mecanismo in"ibitorio.

!a "olina es insertada en la membrana formando una estructura de "orquilla

con las regiones >93 y >9:. !a formación del poro deberá requerir que laestructura final tenga : regiones >9, por la penetración amino terminal a

travs de la capa bilipídica. &sí, el in"ibidor 24 es defectuosa en llevar acabo este reacomodo ya que presenta una carga positiva extra en la porción

amino terminal.

&lterando artificialmente la proporción del in"ibidor o de la "olina, se puede

retardar o acelerar la lisis, respectivamente, sugiriendo que la "abilidad pararetardar la lisis del in"ibidor 24 es un evento poblacional.

ebería parecer que la relación "olina - in"ibidor estuviera activamenteregulado ba%o condiciones fisiológicas, donde un ciclo vegetativo más

extendido pudiera ser favorecido, pero a*n no se tienen evidencias que tal

regulación "aya sido reportado.

fago lambda

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