tÉcnicas bÁsicas de biologia molecular ii · -fago-cosmÍdio - cromosomas artificiais de...
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VÁRIOS OBJETIVOS- BUSCA DE UM GENE ESPECÍFICO
- PROJETOS GENOMA
VÁRIOS VETÔRES- PLASMÍDIO
- FAGO
- COSMÍDIO
- CROMOSOMAS ARTIFICIAIS DE BACTÉRIA OU LEVEDURA.
Tamanho máximo aproximado de DNA que pode ser clonado em vários tipos de vetôres
Vector Type Cloned DNA (kb)
Plasmid 20
λ phage 25
Cosmid 45
BAC (bacterial artificial chromosome) 300
YAC (yeast artificial chromosome) 1000
BIBLIOTECA DE EXPRESSÃO
A PARTIR DE mRNA, PORTANTO...
- só regiões transcritas
- especificidades, por exemplo, de tecidos
- células especializadas, mais fácil de isolar genes específicos:eritrócitos->hemoglobina
- sequencias não interrompidas dos genes (sem introns)
Vetor Lambda ZAP® II (Stratagene)
•Vetor lambda de alta eficiência com versatilidade de plasmídio. •Excisão in vivo de fragmentos clonados em vetor fagemídio.•Expressão de proteinas de fusão sob o controle de um promotor lac.•Sondagem com anticorpos ou sondas de ácidos nuclêicos.
Applicações•Construção de bibliotecas de cDNA em vetor lambda excisável.•Bibliotecas genômicas de oprganismos com genomas pequenos.
MAPA DE EMBL3
Applications•High-quality genomic libraries •High-resolution restriction mapping and rapid chromosomal walking
Cloning Capacity•9-23 kb
Host Strains•XL1-Blue MRA and XL1-Blue MRA(P2)
•TEL: TELÔMERO, PROTEGE DE DEGRADAÇÃO
• CEN: CENTRÔMER, NECESSÁRIO PARA A SEPARAÇÃO CORRETA DE CROMOSOMAS EM CÉLULAS EM DIVISÃO.
•ORI: ORIGEM DE REPLICAÇÃO.
•A and B: MARCADORES DE SELEÇÃO.
•SÍTIOS DE RESTRIÇÃO PARA EcoRI and BamHI.
TODOS PROJETOS GENOMA DEPENDEM DA CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS
ESTRATÉGIA DE SEQUENCIAMENTO DO GENOMA HUMANO (BACs)
Clones genômicos (YACs E COSMÍDIOS) sobrepostos, cobrindo uma pequena região de um cromosoma do nematódio Caenorhabditis
elegans representando 0.3% do genoma total
SEQUENCIAMENTO DE ESTs (expressed sequence tags, ou etiquetas de sequências expressas)
1998, 1999, 2000, 2001
Towards the Physical Map of the Trypanosoma cruzi NuclearGenome: Construction of YAC and BAC Libraries of the Reference Clone T. cruzi CL-Brener Vol. 92(6): 843-852I Ferrari, H Lorenzi, MR Santos*, S Brandariz, JM Requena**, A Schijman, MVázquez, JF da Silveira*, C Ben-Dov, C Medrano, S Ghío, P López Bergami, I Cano*, B Zingales***, TP Urmenyi****, E Rondinelli****, A González*****, A Cortes*****, MC Lopez*****, MC Thomas*****, C Alonso**, JLRamírez******, MA Chiurrillo******, R Rangel Aldao*******, A Brandão********, W Degrave********, V Perrot, *********, MSaumier*********, A Billaut*********, D Cohen*********, D Le Paslier **********, MJ Levin/+
Fig. 2: analysis of sizes of YACs. Eleven randomly selected YAC clones were analyzed by (A) PFGE (conditions of the run aredescribed in Materials and Methods); and (B) Southern blot.The Southern blots were probed with labeled Trypanosoma
cruzi total DNA .
Distribuição por tamanho de uma biblioteca de Trypasomona cruziem YAC. 58 clones foram escolhidos ao acaso e o tamanho determinado por PFGE. O tamanho médio foi de 365 kb.
A: Diatribuição por tamanho de clones de
uma biblioteca em BACs. Um total de 59 BACs foram analisados. B: sondagem do filtro
contendo 236 BACs com uma sonda E13, uma sequência repetitiva.
(Requena 1993).
Sondagem de uma biblioteca em lambda gt 11 (Levy Yeyatti 1991) com um pool de soros de pacientes com cardiopatia chagásica
grave. (Levin 1989).
CONHECIMENTO BÁSICO DA BIOLOGIA E
FISIOLOGIA DO MOSQUITO DA MALÁRIA,
COM O OBJETIVO, A MÉDIO E LONGO
PRAZO, DE INTERFERIR NA
TRANSMISSÃO DA DOENÇA.
J Biol Chem 1998 Jul 10;273(28):17665-70
A Type I Peritrophic Matrix Protein from the MalariaVector Anopheles gambiae Binds to Chitin CLONING, EXPRESSION, AND CHARACTERIZATION*
Zhicheng Shen and Marcelo Jacobs-Lorena
Como achar os genes que codificam as proteínas da matriz peritrofica de um inseto?
“By antibody screening of an expression library we have identifiedand partially characterized a cDNA
encoding a putative PM protein,termed Anopheles gambiae adult
peritrophin 1 (Ag-Aper1). Ag-Aper1 is the first cloned PM gene from a
disease vector.”
Liberação dosmacrófagos
Multiplicação
Transformação
Ingestão
Flebotomíneo
Hospedeiro Vertebrado Inoculação
Ligação efagocitose
Transformação
Multiplicação re-infeção
Hibridização subtrativa, usada para isolar cDNAs raros. Bom para comparar populações de RNAs vindas de tecidos relacionados. Exemplo: tubo digestivo de flebotomíneo alimentado ou não com sangue.
mRNAs
GAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAACAAAAAAAAAAA
CAAAAAAAAAAAGTTTTTTTTTTTCGAA
GTTTTTTTTTTTCGAA
GTTTTTTTTTTTCGAA
Reverse transcription
Anchor primers
Anchor primers
H-T GH-T CH-T A
11
11
11
PCR amplification H-AP or AP primersα33P-dATP
(H-AP1primer)AAGCTTGATTGCC
(H-AP1primer)AAGCTTGATTGCC
PAGE
cDNA sample:
GS GB
+
-
SEQUENCIAMENTO DE ESTs A PARTIR DE BIBLIOTECAS DE EXPRESSÃO DE TUBO
DIGESTIVO DE FLEBOTOMÍNEO SOB DIVERSAS CONDIÇÕES:
- ALIMENTADO OU NÃO COM SANGUE
-INFECTADO OU NÃO POR LEISHMANIA
PLACAPLACA CONTENDO COLÔNIAS DE EXCISÃO DE UMA BIBLIOTECA DE
EXPRESSÃO EM λ ZAP: colônias claras são recombinantesCOM
COLÔNIAS AZUIS (SEM INSERTO)
E BRANCAS (COM INSERTO)
Tabela IV - ESTs identificadas por sequenciamento
Identificação Tamanho HomologiaY2 (cDNA25) 360 pb RNAHelicase ATP dependenteY10 (cDNA28) 60 pb Proteína Elastina-likeY101 330 pb Sem homologiaY11 (CDNA11R) 340 pb Citocromo oxidase C subunidade IIY27 (CDNA27R) 200 pb Proteína ribosomal S8Y30 (cDNA30) 190 pb Dienoil-CoA isomerase/ Enoil hidrataseperoxisomalY33 375 pb Proteína “Zinc finger”Y35 (cDNA35) 155 pb Proteína “Zinc finger”Y39 Citocrome oxidase IY41 (cDNA41) 2 200 pb Enzima de conjug. de ubiquitina / RAD6 homólogaM4 (19-11cdna4) 210 pb Proteína ligadora de célula apresentadora deantígenoM53 140 pb Possível fator de “splicing” (H. sapiens)M6 204 pb Proteína ligadora de DNAM9 (19-11cdna9) 4 190 pb Similar a A. thaliana F17F8.11M11 (19-11cdna11) 5 179 pb 16S rRNA A. gambiae por FastaM13 (19-11cdna13) 6 185 pb NADH A. gambiae por FastaM14 (19-11cdna14) 240 pb Serine hidroxi-metil-transferaseM17 (19-11cdna17) 386 pb Anon2 (evolução acelerada)/antena-específicoM18 (19-11cdna18) 305 pb Proteína ribosomal 60S L7AM19 (19-11cdna19) 222 pb Proteína ligadora de guanina (“G binding”)M22 (19-11cdna22) 330 pb Fumarilacetoacetase
BIBLIOTECA DE PHAGE DISPLAY
Fago mostrando DNA e a sequencia nucleotídica randômica que codifica um peptídio. Células da glândula salivar expressamreceptor. Neste caso o peptídio vermelho encaixa no receptor, permitindo a seleção deste fago.
Ghosh A, Moreira LA, Jacobs-Lorena M
Targeting Plasmodium ligands on mosquito salivary glands andmidgut with a phage display peptide library. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 98 (2001), pp. 13278–13281.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 September 26; 97 (20): 10895–10898Genetics
Robust gut-specific gene expression in transgenic Aedes aegypti mosquitoes
Luciano A. Moreira,* Marten J. Edwards,† Faisal Adhami,* Nijole Jasinskiene,‡ Anthony A.James,‡ and Marcelo Jacobs-Lorena*§
* Department of Genetics, School of Medicine, Case Western Reserve University, 10900 Euclid Avenue, Cleveland, OH 44106-4955; † Department of Zoology, Ohio Wesleyan University,Delaware, OH 43015; and ‡ Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, CA 92697-3900
Abstract
Genetic modification of the vectorial capacity of mosquito vectors of human disease requires promoters capable of drivinggene expression with appropriate tissue and stage specificity.We report on the characterization in transgenic Aedes aegypti of two mosquito gut-specific promoters. A 1.4-kb DNA fragment adjacent to the 5′ end of the coding region of the Ae.aegypti carboxypeptidase (AeCP) gene and a corresponding 3.4-kb DNA fragment at the 5′ end of the Anopheles gambiae carboxypeptidase (AgCP) gene were linked to a firefly luciferase reporter gene and introduced into the Ae. aegypti germ line by using Hermes and mariner(Mos1) transposons. ..
Insect Biochem Mol Biol 2003 Mar;33(3):279-87
Molecular characterization of Llchit1, a midgut chitinase cDNA from the leishmaniasisvector Lutzomyia longipalpis.
Ramalho-Ortigão JM, Traub-Cseko YM.
APESAR DO GENE DE QUITINASE DE
Lutzomyia longipalpis
TER +/- 1300 PB,
O PCR DO CLONE GENÔMICO DEU ORIGEM A UM
FRAGMENTO DE QUASE 4000 PB
4
1 2
3
5
Esquema do gene de quitinase e dos oligonucleotídeos utilizados nos primeiros sequenciamentos do gene.
Exon
Intron
M K T L V F L C V A L S I L G L A V T E K
K I V C Y H G T W S Y Y R Q G N G K F G V A Q I D P F L C T H L V Y T F F G I S S E G G
I R I L D P Y L D L D E N Y G L G N I R K F N E L K K V N P K L K T I A G V G G W N E G
S V T F S Q c a g g t c a g t g a a a c a g a t c t c a c g a t t t t t a a g a a g a t
t t c a t t t t g a g a c t t t t t c c t c t a t t a g ( * )
V V N D P R K R Q N F V K N S L E F L K K Y N F D G L D V D W E Y P A Q R G G N Q E K D
K E A Y T L L L K E L S E F L H P K G Y S L S A A V A S A E F S A K I S Y N I A E V S K
t a a g t t c a a a g g a a t t t t t t a g g g a a g a t t g g g c t a a a c t a t t c
a a a t g a g t a t g a a a a a a t g g a a a a t t a a t t a a a a t t t g c t t t a a
a a a c a t t t t t t g c a a g g t t n g a g a a c a g t t t t t g t t c a a a a a t t
t a a g a t c t a a a g a c c g t a a a a a a t c n a a a t c c c a t a a t t a a t a a
a t t t g g g a a a g t a a t t t a t n c n t a a a a c c t t a a t t t t a c c c c n a
a g c t t t c t n a a a n a a t t c a t t t t t t c c c n t a a t t t t t t t n c c a c
c t n c a a c c t t g a a a a g g a c c c g t t c c n c a n t t t t t c n c a a a a t t
t g t t n c c c n a a t t c t t t a a n t t t c c g g n t n t t t g a a n g c a a ( * )
Y L D F I G V M T Y D G S W D P K I G N N A P L Y A G S W E Q T E L E K Q L N V D A A I
K Y W L S N G G A P E K L L L G V P L Y G R G F R M V N G Q N K P G S V H G G P C Q A G
P Y T Q T P G M M G F N E L C E K R R N E K W I D F W D D E Q F V P Y S T K N
D Q W I G F D D E K S I K F K S N Y V N S H N L G G V I V W S I E T D D F R G F C G R G
T F P L L K E L N A S L L G N N g t g a g t a c c t c c a a t g a a a c a g a t c c c g
a g a t c a t g t c c c t c c t t t c c g c g g a g a g g a a g a a a a c a g c a g c a
t t g a a g a a a t t c a t t c a t g a t t t c t t c t t c a a g a c c t t c c a g c c
a a a g t a t c a g a a a c t c a t t c a g t t c a a t t t a c t c a a a g a a a a a t
a t t t t t c c g a a a g c t t c a c c g a a c t c t a c g g t a c a t a c g t t c a a
a t g c t c t c a g a c a c a t a c a a g a g t g a a a a t g a t t t a t a a g c a g g
a a t t a a g t t t a t t t t t t c t a t a c t t a a c c c t t t a g c g t c c a a c g
t g a a a c a c t a a a a c a t t g a a a c a t g c g c t c t t t t a t c g c g a t t t
t t a t t c t a t g a a t t t t t t t a g a g g a c t t t t c t c a a t c a g a a c g t
c t t c t t t g a c c c c t t a t g c g t g a a t t g g a t g c a t t t g t a a c a t g
g a a a a a c a a t t a c a t t c t t a a a t a a t t g a a a a a a t a a a a t g t t t
c a c g t t t g g g t c a g c g t a t g a c c c a a a a a a c g t t a a a a g g g t t a
a t t t t t g t g t t t t t t t t t t a t t g a g a a t a a g t a t t t a t a g t c t c
t a a t g g a t t a a t g g t c a t a a a t a t a c a c t t a c t t a a t g c a a t t t
a c g g a a a a t a a a a t c n c t t t g c g c g g a t t t c a a g t g a t t t a g c a
c t t g a g g g c a t t c t t c a t t g g c t g a a a g g g n g c a a g c t t t g t t t
t t t t g c t g c n c t t c c g g a t a t c t a c g a a a g c a g g g a a g a g t t a a
CLONE cDNA
CLONE GENÔMICO
introns
Liberação dosmacrófagos
Multiplicação
Transformação
Ingestão
Flebotomíneo
Hospedeiro Vertebrado Inoculação
Ligação efagocitose
Transformação
Multiplicação re-infeção
Endereçamento da cisteína proteinase Lpcys2 ao lisosoma em leishmania
Costa-Pinto D, Trindade LS, McMahon-Pratt D, Traub-Cseko YM. Cellular trafficking in trypanosomatids: a new target for therapies? Int J Parasitol 2001 May 1;31(5-6):536-43
Existe um sinal de endereçamento no domínio pró de Lpcys2 responsável pelo direcionamento.
SISTEMA DE DOIS HÍBRIDOS DE LEVEDURA
“ YEAST TWO HYBRID SYSTEM”
Domínio ativador
Proteína desconhecida
Proteína “isca”
Domínio de ligação
YEAST TWO HYBRID SYSTEM
AD
a - libraryPRO
BDlacZ Reporter Gene
UAS
PRO a - library
lacZ Reporter GeneBD
AD
UAS
Isto é só parte da história, existem outras maneiras de
“clonar” e produzir proteínas recombinantes.
Exemplo: produçao de proteína C, ou outras proteínas envolvidas em coagulação.
- Hemofílicos : fator VIII, fator IX.
- Erro inatos de metabolismo na produção de prot. C (no controle de coagulação), e também em certos tipos de cirurgia.
- Proteína ativadora de plasminogênio (que dissolve coágulos), para pacientes de derrames e ataques cardíacos.
- Anti-tripsina alfa-1 para certas formas de enfisema.
PROBLEMA...
- PRESENTES EM SANGUE DE DOADORES EM QUANTIDADES ÍNFIMAS.
- Portanto muito caras: tratamento de hemofilia com fator VIII (normalmente apenas quando o paciente está sangrando) custa milhares de dólares por ano. O custo do fornecimento constante da proteína custaria mais que US$ 100.000,00.
ANTES
- sangue humano doado, processado em grandes quantidades.
- ou de vasto número de células crescidas em bioreatores.
ALTERNATIVA?
Animais trangênicos como fábricas de drogas
VANTAGENS?
- BENEFÍCIOS ECONÔMICOS.
- RISCOS MENORES DE CONTAMINAÇÃO (HIV, HEPATITE C, DOENÇA DE CREUZFELDT-JAKOB).
COMO? Histórico:
- 1980, Gordon JW, Universidade de Yale: embriões de camundongo capazes de incorporar DNA estranho.
- 1987, Wagner TE, Universidade de Ohio: DNA de coelho incorporado em camundongos-, Hennighasen e Clark na Escócia, ativaram genes estranhos na glândula mamária de camundongos, com o produto sendo secretado no leite: ativador de plasminogêniohumano; beta-galactoglobulina de carneiro;
- Em seguida carneiros: fator X.
EXPRESSÃO EM PORCOS (Genie). Porque?
- período de gestação e gerações curtas.
- ninhada grande.
- 300 litros de leite por ano/animal.
Biologicamente ativo?
Modificações pós-traducionais corretas? (processamento e modificações?)
- 1/3 da proteína C ativa.
- ausência de furina para processar
- 1995 em camundongo: transgênico duplo
Direções futuras?
ANIMAIS TRANSGÊNICOS COMO “FÁBRICAS” DE DROGASScientific American janeiro de 1997 (Velander, WH,Lubon H, Drohan WM)