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Universidad Nacional
Autónoma de México
Curso de Genética y Biología Molecular
Licenciatura
Química Farmacéutico Biológica (1630)
Química en Alimentos (0144) (Optativa)
Facultad de Química
Dra. Herminia Loza TaveraProfesora Titular de Carrera
Departamento de BioquímicaLaboratorio 105, Edificio E
5622-5280
M en C. Gabriele BigoniProfesor en Formación
Programa 121Facultad de Química
VIII. PRINCIPIOS DE INGENIERÍA
GENÉTICA
• Objetivo general
– Conocerá los principios de la tecnología del DNA recombinante y su potencial para generar organismos genéticamente modificados.
Objetivos particulares
El alumno... Conoci-
miento
Compren-
sión
Aplica-
ción
1. Generación de
moléculas de DNA
recombinante
1.1. Conocerá las características y funcionamiento de las
enzimas de restricción.X
1.2. Conocerá las características principales de los plásmidos y
otros vectores de clonación (fagos, cósmidos, BACs y YACs).X
1.3. Describirá las técnicas y pasos para la clonación,
empleando enzimas de restricción y expresión de moléculas
recombinantes de DNA en organismos heterólogos.
X
1.4. Comprenderá la técnica de clonación empleando
recombinasas.X
1.5. Distinguirá las diferencias entre bibliotecas genómicas y de
cDNA.X
1.6. Conocerá los métodos utilizados en la expresión de
proteínas recombinantes en organismos heterólogos.X
2. Aplicaciones de
la Ingeniería
Genética
2.1. Conocerá la aplicación de los organismos transgénicos en
la agricultura, farmacia y medicina.X
2.2. Conocerá la aplicación de producción fármacos y vacunas
en animales y plantas transgénicos.X
2.3. Conocerá las estrategias generales de clonación de
células de mamíferos.X
2.4. Conocerá las características generales de las células
troncales y las aplicaciones potenciales de éstas en la terapia.X
Ingeniería Genética
Cuando los científicos comprendieron la
estructura de los genes y cómo la
información que portaban se traducía en
funciones o características, comenzaron a
buscar la forma de aislarlos, analizarlos,
modificarlos y hasta transferirlos de un
organismo a otro para conferirle una
nueva característica.
Esto fue posible gracias al descubrimiento
de las enzimas de restricción y de los
plásmidos que permitió la clonación
molecular.
Clonación Molecular
Clonar: Hacer una copiagenéticamente exacta dealgo.
La clonación molecular esuna técnica de biologíamolecular que hace muchascopias idénticas de unfragmento de ADN o de ungen para su posteriorestudio.
Esto se lo hace a través deluso de plásmidos.
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento
de DNA a clonar y
preparar el vector
molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las células
que han incorporado el
DNA recombinante.
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ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS POR
ESPECTROFOTOMETRÍA
DNA: Absorción máxima a 260
nm
La relación A260/A280 sirve
para
determinar la cantidad de
contaminación con proteínas.
A260/A280= 1.8-2.0 muestra de
DNA bastante pura.
La relación A260/A230 sirve
para
determinar la cantidad de
contaminación con
polisacáridos.
A260/A230= 2.0-2.2 muestra de
DNA bastante pura.
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
-Separación en geles de
agarosa.
-Migran al ánodo (DNA carga
negativa).
-Dependiendo del tamaño del
fragmento dependerá la
concentración del gel.
-Azul de bromofenol para
comprobar el progreso de la
electroforésis.
-Para visualizar el ADN se usa
bromuro de etidio o GelRed
que se excitan con luz UV a
254nm.
-Estos compuestos se
intercalan en el DNA.
ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento
de DNA a clonar y
preparar el vector
molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las células
que han incorporado el
DNA recombinante.
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Son moléculas de DNA circular y se
replican de forma independiente al
genoma bacteriano ya que tienen su
propio origen de replicación.
Tienen un sitio múltiple de clonación
donde son reconocidos por diferentes
enzimas de restricción.
También contienen marcadores de
resistencia a antibióticos que permiten
la selección de bacterias transformadas.
Se pueden clonar fragmentos entre
1,000 y 10,000 nucleótidos.
VECTORES DE CLONACIÓN
PLÁSMIDOS
Otros vectores moleculares
FAGOS
CÓSMIDO
Es un plásmido que permite
clonar fragmentos de DNA
de gran tamaño. La
particularidad, es que tiene
una secuencia de DNA
llamada cos proveniente del
fago Lambda (partícula viral
que específicamente infecta
E.Coli).
CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE BACTERIAS (BACs)
Para analizar genomas
eucarioticos complejos, se
ha desarrollado un vector
multiuso denominado
cromosoma artificial
bacteriano (BAC) basado
en el factor F de bacterias.
El factor F es un plásmido
que se replica
independientemente en
bacterias. Han sido
diseñados para que
funcionen como vectores
de DNA eucariotico.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA (YACs)
Vector de levadura donde pueden insertarse segmentos de DNA de más de 1 Mb. La
capacidad de clonar grandes trozos de DNA en estos vectores los ha convertido en
herramientas importantes para construir mapas físicos de genomas eucarioticos,
incluyendo el genoma humano.
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento de
DNA a clonar y preparar
el vector molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las células
que han incorporado el
DNA recombinante.
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
-Son endonucleasas.
-Cortan ADN de doble
cadena cuando
reconocen un patrón de
secuencia específico
-Reconocen secuencias
palindrómicas
específicas de 4, 6 u 8
pb (secuencias que se
leen igual en ambas
direcciones)
5’ protruyentes
3’ protruyentes
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
CORTE DEL DNA
5’ protruyentes
5’ protruyentes
5’ protruyentes
3’ protruyentes
romos
romos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN MECANISMO
DE DEFENSA DE LAS BACTERIAS
Eliminación de ADN foráneo.
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento de
DNA a clonar y preparar
el vector molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las células
que han incorporado el
DNA recombinante.
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Ligación de DNA exogeno en un vector molecular
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento de
DNA a clonar y preparar
el vector molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las células
que han incorporado el
DNA recombinante.
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TRANSFORMACIÓN DE LAS
BACTERIAS
Transformación es la introducción de un DNA foráneo a la célula
hospedera
PASOS DE LA CLONACIÓN MOLECULAR
1) Aislar el fragmento de
DNA a clonar y preparar
el vector molecular.
2) Cortar el DNA y el
vector molecular con la
misma enzima de
restricción.
3) Ligar el DNA al vector
molecular mediante una
DNA ligasa.
4) Introducir el DNA
recombinante a un
organismo para su
amplificación.
5) Seleccionar las
células que han
incorporado el DNA
recombinante.
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CARACTERÍSTICAS DE LOS
PLÁSMIDOS
Permite que la
molécula se
replique
Sitio
múltiple de
clonación
Marcador de
resistencia a
antibióticos
Operon Lac
Jacob, Monod y Lwoff. Nobel de Medicina, 1965.
Off On
Lactose
b-galactosidaseactivity
Inducer
X-gal puede ser hidrolizado por la b-galactosidasa dando color azul
IPTG: Inductor
gratuito
Cuando se cultivan colonias silvestres (wild type) en presencia de X-gal y se induce la expresión de b-galactosidasa con un inductor gratuito (IPTG), el X-gal es cortado produciendo un pigmento azul y por lo tanto las colonias son azules.
b-gal
color azul
El gen lacZ tiene dos variantes: DM15 y péptido aque no son capaces de producir b-galactosidasaactiva.
Fenotipos de los mutantes lacZ en X-gal
Sin embargo, cuando estos dos genes se encuentran en una misma célula, el a
péptido se combina con la proteína de DM15 generando una b-galactosidasa activa la cual hidroliza a X-gal, produciendo colonias azules.
a-complementación
Aplicación de la a-complementación para la selección de moléculas recombinantes
El MCS del vector está insertado entre el promotor y el péptido a, en el extremo 5’
Cuando el vector contiene un fragmento de DNA insertado en el MCS, la b-galactosidasa no es activa y por lo tanto el X-gal no es hidrolizado y no se producen colonias azules,
las colonias son blancas.
Selección por a-complementación
LB-Amp+ IPTG+X-Gal
Recombinación sitio-específica
att B x att P ⇒ att L x att R.
Cada reacción es mediada pordiferentes enzimas.
Cuando el DNA de Lambda se integra (attP), en el
cromosoma de E. coli (attB), se generan los sitios att L y
att R, que flanquean al profago integrado. Los
sitios att son reconocidospor una recombinase
(integrasa).
Integrase host integrationfactor (IHF).
Integrase, IHF,excisionase [Xis])
Integration sites
Clonando con recombinasas de
Lambda
Gateway ™ Technology (Invitrogen)
ccdB (control of cell death): gen que codifica una proteína que interfiere con la girasa de
E. coli.
¿Cómo funciona la topoisomerasa I?
La Topoisomerasa I del virus Vaccinia se une a un DNA dúplex en sitios específicos y rompiendo los enlaces fosfodiéster después de 5’-CCCTT en una cadena. La energía de esta ruptura es conservada uniendo al 3’ fosfato de la cadena cortada al residuo Tyr-274 de la topoisomerasa I. El enlace fosfo-tirosil entre el DNA y la enzima puede ser atacado por el 5’ hidroxil de la cadena original cortada, revirtiendo la reacción y liberando a la topoisomerasa. TOPO Cloning explota esta reacción para eficientemente clonar productos de PCR.
BIBLIOTECAS GENÓMICAS
Una biblioteca genómica es una
colección de fragmentos de DNA,
en la que se esperan que estén
incluidas el mayor número de
secuencias posibles de un genoma
o las secuencias contenidas en un
cromosoma.
Para el análisis de uno o varios
genes completos o que contengan
sus secuencias reguladoras.
BIBLIOTECAS DE cDNA
- mRNA
- RT
- Rnase H
- Oligo dT
- dNTPsWatson et al., Molecular Biology of thegene. 2014
- Solo un subconjunto de todos los genes
del genoma.
- No contienen las secuencias
promotoras adyacentes al gen y
tampoco contienen los intrones.
- Las bibliotecas de cDNA utilizan mRNA
como punto de partida.
HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS
Sonda de hibridación: es un
fragmento de DNA de longitud
variable (100-1000 bases), que
se utiliza para detectar
fragmentos de DNA que son
complementarios a la sonda y
que son de nuestro interés.
Las sondas pueden ser de dos
tipos: No radioactivas con
fluoróforos o biotina y
radioactivas con 32P
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
¿Qué son las proteínas recombinantes?
Proteínas producidas artificialmente a
partir de genes clonados.
¿Para que sirven?
Áreas básicas como Biología,
Cristalografía, Bioquímica, etc.
Áreas aplicadas como en Salud,
Biotecnología, Agricultura.
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Características adicionales- Promotor regulable- Terminador de la transcripción- Sitio de reconocimiento para los ribosomas
• Consiste en fusionar nuestra
proteína con una proteína
estable en el propio
huésped para evitar la
degradación.
• Promotor regulable para
evitar que el gen de interés
se exprese constantemente
en un alto nivel.
• Etiquetas para poder
separar las proteínas al
momento de la purificación.
PURIFICACIÓN DE LA PROTEINA
Ruptura de las células Permeabilización,
congelación/descongelación,
ultrasonido.
Cromatografía de afinidad
por iones metálicos
Purificación con el uso de
“marcadores” colas de
histidina
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
PLANTAS TRANSGÉNICAS/PLÁMIDO Ti
PLANTAS
TRANSGÉNICAS
BOMBARDEO
El bombardeo con microproyectiles o
biobalistica, es el método alternativo
al plásmido Ti más importante para
transferir DNA a plantas. La técnica
consiste en bañar partículas esféricas
de oro con el DNA a introducir.
PLANTAS TRANSGÉNICAS
PLANTAS TRANSGÉNICAS
¿Qué es el algodón transgénico?
Algodón modificado genéticamente
mediante técnicas de ingeniería
genética, con las que le han agregado
genes de organismos lejanos a él.
• La tolerancia a herbicidas.
• La resistencia a insectos.
CLONACIÓN EN CÉLULAS ANIMALES
A partir de una célula de un individuo se crea otro exactamente igual
a original
Métodos de selección
- Detección de actividad enzimática
- Resistencia a antibióticos
- Resistencia a inhibidores
CLONACIÓN EN CÉLULAS ANIMALES
ANIMALES TRANSGÉNICOS
Los animales transgénicos
son animales que han sido
modificados genéticamente,
añadiendo genes foráneos,
para cambiar alguna
característica del animal,
sea para añadirle alguna
funcionalidad o para
bloquear la expresión de
algún gen.
RATÓN/GEN DE LA HORMONA DE
CRECIMIENTO
APLICACIONES
• Farmacia se utilizan para la obtención de medicamentos
anticoagulantes y ciertas proteínas humanas como la insulina y la
hemoglobina humana.
• En animales se pueden estudiar ciertas enfermedades, como el
cáncer, mediante la inserción de genes para saber como funcionan
y probar diferentes tratamientos para curar la enfermedad.
• En plantas para resistencia a plagas y enfermedades (virus,
insectos, hongos), tolerancia a herbicidas o a condiciones
ambientales extremas (sequías, heladas, etc.)
CÉLULAS TRONCALES
CÉLULAS TRONCALES
TERAPIA GÉNICA, A QUE VAMOS...