FAC. CS. BIOQUÍMICAS

Y FARMACÉUTICAS

UNR

La historia de Pneumocystis se inicia en los albores del siglos XX.

Hace ya más de 100 años

Hongo ?

Protozoo?

1960 a 1980

• Los primeros inmunodeprimidos

1980 a 2008

• Pneumocystis y SIDA.

Hasta fines de los 80s

• Se lo considera un protozoo

1988

• Edman aporta evidencia molecular de que se trata de un hongo

2001/2

• Pneumocystis jirovecii (nombre que había sido propuesto en 1976 por Frenkel)

La ubicación taxonómica de Pneumocystis se ha discutido largamente.

morfología

imposibilidad de cultivarlo y

su respuesta a los fármacos antiparasitarios y no a las drogasantifúngicas.

Sin embargo, estudios moleculares más recientes de varios genes que

codifican enzimas esenciales para su metabolismo como ATPasa,

superóxidodismutasa, dihidroperato sintetasa, dihidrofolato

sintetasa y timidilato sintetasa son semejantes a los de los hongos.

Inicialmente se pensaba que era un protozoario, pero el análisis de ADN realizado

por Edman y otros en 1988, fue la primera evidencia molecular de que este

microorganismo, Pneumocystis, es un hongo, a pesar de carecer de ergosterol (es la

razón de la falta de sensibilidad a los antifúngicos) y presentar un crecimiento en

cultivos muy difícil.

La secuencia nucleotídica del gen 18 S del rRNA Pneumocystis presentaba mayor

similitud con los hongos que la de los protozoos. Además, otros genes importantes

como la subunidad mayor del RNA del ribosoma mitocondrial (mt LSU rRNA, siglas en

inglés) y otros 7 genes contiguos mitocondriales mostraron similitud con genes de

hongos.

Otras evidencias importantes la presencia en Pneumocystis de un tercer factor de

elongación en la síntesis proteica, que se encuentra ausente en el resto de los

organismos eucariotas.

Finalmente, la timidilato sintasa (TS) y la dihidrofolato reductasa (DHFR) en

Pneumocystis son dos enzimas diferentes, mientras en los protozoos es una

proteína con doble función.

Después de determinar el reino, los datos adicionales aportados por el ADN mostró

que los organismos Pneumocystis en diferentes mamíferos, son muy diferentes, lo

que condujo a un cambio de nombre, apareciendo un nuevo binomio en 1999.

El organismo que causa PcP en el humano es ahora llamado en honor del

parasitólogo Checo, Otto Jirovec:

Pneumocystis jirovecii

Reino: Fungi

Phylum: Ascomycota

Clase: Pneumocystidomycetes

Orden: Pneumocystidales

Familia: Pneumocystidacae

Género: Pneumocystis

Especie: jirovecii

Pneumocystis carinii

Pneumocystis wakefieldiae

Pneumocystis jirovecii

La reproducción puede ser sexual o asexual

Los trofozoítos se unen a neumocitos tipo I y se activan

macrófagos alveolares

Se desarrolla en un ciclo sexual de tres estadios:

Trofozoito o estado trófico, que es

haploide, el más pequeño (1.5 a 5 mu)

Prequíste (esporocito) de tamaño

intermedio, producto de la conjugación de

dos células haploides, y que pasa por fases

de meiosis y mitosis, dando lugar a un

cigoto oval de cuatro núcleos, y

Quiste (5 a 8 mu) de pared gruesa que

da lugar a ocho esporas o ascosporas y que

ya vacíos tienen forma de copa o sombrero.

Infección producida por “Pneumocystis”

EucariotaUniceluarDistribuido universalmenteTropismo por vías respiratoriasAfecta diversas especies de mamíferoHUMANO patógeno oportunista

PcP: PnemocystisPneumonia

Malnutrición

Citotoxicos o

Corticoides

Onco

hematológicos SIDA

Inmuno deficiencias

congénitas

Transplantados

PAT Ó G E N O O P O R T U N I STA

Enfermedad rara y poco frecuente

Pneumonía común y enfermedad marcadora de

SIDA

1989 QUIMIOPROFILAXIS anti PcP incidencia

Inhalación de quistes de Pneumocystis jirovecii por parte de un individuo inmunocomprometido.

Pneumocystis jirovecii prolifera en su forma trofozoítica la cualse asocia preferentemente al neumocito tipo I el cual muere.

El neumocito tipo II pareciera también ser afectado yreacciona ante esto proliferando.

Formación del relleno espumoso característico en el alveolo:

• descamación persistente de las paredes alveolares

• la proliferación de trofozoitos, formación de quistes.

• a la reacción del hospedero al daño tisular conpresencia de células inflamatorias y exudado proteináceo.

Con la evolución de este cuadro el relleno se va condensando y va obstruyendo los bronquios más finos.

Hiperplasia e hipertrofia de neumocito tipo II junto con la infiltración de linfocitos y células plasmáticas se produce un engrosamiento del intersticio pulmonar, además del edema de los tabiques interalveolares.

Con todo esto se impide una hematosis normal que en síntesis se debe a:

engrosamiento de los tabiques

al relleno alveolar progresivo

Compromiso pulmonar atípico:

Se ha visto en algunos pacientes con SIDA, aparece como cavitaciones y zonas de necrosis.

Compromiso extra pulmonar:

También principalmente en pacientes con SIDA.

Glicoproteína de 120 kDa, estimula producción de anticuerpos y lainmunidad mediada por células.

Complejo proteico de 45 a 55 kDa, estimula la inmunidad mediadapor células.

Una vez que la forma trófica de Pneumocystis se adhiere alalveolocito, se inicia un proceso inflamatorio cuyo resultado final es laproducción de una neumonitis intersticial.

Histopatológia ( exudado proteináceo, ligeramente eosinófilo en laluz alveolar, con proliferación de células alveolares y engrosamientode los tabiques interalveolares, acompañado con un intensoinfiltrado).

Respuesta Fisiológica : proliferación de los neumonocitos de tipo II y fibrosiscolágena (pulmón rígido). Estas alteraciones de la estructura pulmonarproducen hipoxemia, aumento del gradiente alveólo-capilar y alcalosisrespiratoria.

Respuesta Inmunitaria:

La inmunidad mediada por células: respuesta de tipo Th1 x T CD4 = IL12e interferón Y, que activan a los macrófagos.

La inmunidad innata y humoral: Los anticuerpos de tipo IgG e IgM,asociados al complemento opsonizan los elementos parasitarios dePneumocystis, facilitando su fagocitosis por medio de los neumonocitos detipo 1 y éstos destruyen algunas formas parasitarias de este hongo pormedio del anión superóxido.

Formas graves de neumocistosis se vinculan a alguna causa de depresión

de la inmunidad mediada por células

AsintomáticaInfantil epidémica o neumonía plasmocitariaFormas respiratorias esporádicas en inmunodeficientesExtrapulmonar

Factores de riesgo para PcP en pacientes VIH (+)

LT CD4 < 200/mm3

Fiebre de origen desconocido >38 ̊C por mas de dos semanas

Historia de candidiasis orofaríngea u otras enf. marcadoras deSIDA

Episodios previos de PcP

Malnutrición severa

Síndrome Toxi-infeccioso

Síndrome Respiratorio

Signos Rx

•Fiebre > 38 °C•Sudores nocturnos•Astenia•Anorexia•Pérdida de peso

•Disnea•Taquipnea•Tos seca•Cianosis•Presión torácica inspiratoria

•Sugestivos pero inespecíficos•Indican daño pulmonar•Infiltrados difusos•Condensación lobular•Cavidades

Puede haber afección extrapulmonar (1 a 3%, órganos ricos en sistema monocítico-histiocitario) en: ganglios, bazo, hígado, huesos, ojos, glándulas suprarrenales, gl. Tiroides, aparatos digestivo y urinario y de piel

Clínica: Fiebre elevada Astenia Pérdida de peso Disnea Hepatoesplenomegalia Lesiones papulosas o nodulares en piel Derrame pleural Perdida de la agudeza visual

Estudios de laboratorio complementarios:

L.D.H. (elevada) resultado normal no excluye PcP

Hemograma sp

E.A.B. hipoxemia (leve pO2>70, o complicada pO2<40-50mmHg) sin

alteraciones del CO2)

Ensayo serológico

o Detección de Ac, pero existen desde temprana edado Determinar 1-3 ß-D-glucano (S 92,3%. E 86,1%)

Inmunoflorescencia directa (ID) Sensibilidad cercana a 100 %Especificidad alrededor de 96 %

Otras metodologías:

Biología molecular

Alta sensibilidad, muestra no invasiva (buches)

Alto costo

Presencia de ADN en el ambiente

Indistinguible infección de portación

Evaluación de pronóstico de la enfermedad

oPresencia de mutación en el gen que codifica DHPS

(dihidropteroato sintetasa) posibles resistencia a sulfas

Ante la ausencia de un sistema de cultivo in vitro para P. jirovecii,

la base para el diagnóstico de la PcP es la visualización de los

diferentes estadios del ciclo de vida de este patógeno.

EL DIAGNOSTICO DEFINITIVO DE PcP SE BASA EN

LA DEMOSTRACIÓN MORFOLÓGICA DEL

MICROORGANISMO POR MICROSCOPIA

B.A.L.

Esputo inducido

Biopsia tranbronquial

Biopsia de pulmón a cielo abierto

Otros especímenes derivados del TR

De elección

B.A.L.

ESPUTO INDUCIDO

n-acetilcisteína (NAC)

ESPUTO INDUCIDO: Por inhalación de Sol. Salina hipertónica.Sensibilidad BAJA, Especificidad ALTA. Rendimiento diagnóstico: 50– 90 %.

OBSERVACION EN FRESCO

COLORACION DEPARED QUISTICA

COLORACION DEELEMENTOS NO

QUISTICOS

COLORACION DEPARED QUISTICA

FUNDAMENTO:

Se colorea debido a la composición de la pared del quiste que

contiene: polisacáridos, quitina y polímeros de glucanos.

Gomori – Grocott (argéntica)

Azul de toluidina O

Gram-Weigert

PAS

Blanco de Calcoflúor

Técnica de Tinción Azul de Toluidina

Preparación de reactivos

Reactivo de Sulfatación

Acido Acético Glacial 45 ml Acido Sulfúrico 15 ml

Reactivo Azul de Toluidina

Azul de Toluidina 0.16 gr. Agua Destilada 60 ml Acido Clorhídrico 2 ml Alcohol Etílico Absoluto 140 ml

Preparación de la muestra a procesar:

Lavado broncoalveolar:

Centrifugar a 2.500 rpm 5 min. Y realizar con el

sedimento al menos tres frotis.

Esputo ó secreción bronquial:

Agregar perlas de vidrio y dos o tres gotas de

hidróxido de sodio al 10 % . Realizar al menos 6

frotis.

Técnica de coloración

1) Reactivo de Sulfatación 10 minutos 2) Agua corriente bajo la canilla (lado opuesto al

preparado) 1 minuto 3) Reactivo azul de toluidina 10 minutos o mas según

la antiguedad del reactivo 4) Alcohol etilico al 95 % 10 segundos

Observación Microscópica Observación microscópica con aumento 100 x

QUISTES

400 x

QUISTES

QUISTES

1000x

QUISTES

COLORACION DEELEMENTOS NO

QUISTICOS

FUNDAMENTO:

Permite la observación de trofozoitos y CIQ (cuerpos

intraquísticos)

Giemsa

Modificaciones rápidas de Giemsa

IF (única que permite ver Q, T y CIQ)

Se diagnostica por la presencia de quistes en forma de copa, con las sales argentias se ve las paredes quisticas de color negro, con giemsa no tiñe las paredes quisticas pero tiñe el contenido del quiste.

CUERPOS INTRAQUISTICOS

• Ideal es la prevención de la neumocistosis en los pacientes conriesgo de presentarla, destacando los inmunodeprimidos, pacienteshematooncológicos y los pacientes con SIDA.

• Se realiza con cotrimoxazol trisemanal en dosis habituales.

• Pacientes en estado de inmunosupresión transitoria, la utilizaciónde cotrimoxazol está ampliamente difundida y documentada.

• Pacientes adultos con SIDA: quimioprofilaxis con cotrimoxazol sedebe iniciar cuando la concentración de CD4 sea menor o igual a200 cels por ml.

• Hijos de madre con SIDA: quimioprofilaxis con cotrimoxazol debeiniciarse al mes de vida habiéndose o no confirmado el diagnosticode VIH (+) en el niño.

P jirovecii es un hongo atípico oportunista

Diagnóstico diferencial con:

Tuberculosis Histoplasmosis Infecciones por Rhodococcus

La incidencia de PcP está subestimada

El diagnostico es exclusivo del laboratorio

NO existe una coloración Gold-Standard

Es aconsejable realizar coloraciones complementarias