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EVALUACION DEL CULTIVO IN VITRO DE CAÑA DE AZUCAR (Saccharum
officinarum) VAR. CCSP 89-43 A PARTIR DE MERISTEMOS APICALES MEDIANTE
LA TÉCNICA DE ORGANOGÉNESIS.
JESSICA MARCELA BETANCOURT GUERRERO
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2017
EVALUACION DEL CULTIVO IN VITRO DE CAÑA DE AZUCAR (Saccharum
officinarum) VAR. CCSP 89-43 A PARTIR DE MERISTEMOS APICALES MEDIANTE
LA TÉCNICA DE ORGANOGÉNESIS.
JESSICA MARCELA BETANCOURT GUERRERO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito Para optar al título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
Director
CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO
Ing. MSc en Biotecnología Microbiano
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2017
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DEDICATORIA
Dedico esta tesis a mis padres, Mauricio Betancourt Ruiz y Marcela Guerrero Arias, quienes se
esforzaron y dieron todo de ellos para poder brindarme una educación superior, brindándome
siempre todo el apoyo necesario para salir adelante, llenándome el alma de sabiduría y amor en
los momentos de angustia, y levantándome cuando más me quería rendir. LOS AMO.
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AGRADECIMIENTOS
Primeramente agradezco a Dios por estar siempre conmigo, por cuidarme y brindarme la
oportunidad de culminar esta etapa profesional.
A mis amados padres por su gran esfuerzo y dedicación con esta hija que nunca los defraudara.
A mi director de tesis Christian Chacín Zambrano, por darme la oportunidad de pertenecer a su
grupo de investigación, brindándome siempre confianza, apoyo y grandes enseñanzas, pues sin
él no hubiera podido llevar a cabo esta grata investigación.
A mi hermanos Mauricio Betancourt y Luis Eduardo Santiago por su linda compañía en este
ciclo de vida, llenándome de risas, cariño y muchos momentos inolvidables.
A mi novio Javier Moreno, quien sin importar la situación ha estado a mi lado, brindándome las
fuerzas necesarias para seguir adelante y haciéndome ver que lo que se quiere se puede lograr.
A mi prima Katherine Guerrero, quien ha sido como una hermana para mí, quien ha estado
conmigo en momentos difíciles, escuchado y aconsejándome cuando más lo necesito.
A mi compañera de trabajo María Cañas quien me ayudo a la culminación de esta investigación,
disponiendo siempre de su tiempo para ayudarme en mis incertidumbres, mostrándome una cara
de alegría en momentos de desazón.
Gracias, Mil Gracias.
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CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 14
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .............................................................................. 15
2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................................ 15
3 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 16
2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 17
2.1 CAÑA DE AZUCAR (Saccharum officinarum) .............................................................. 17
2.1.1 Descripción botánica .............................................................................................. 17
2.1.2 Cultivo ..................................................................................................................... 17
2.1.3 Fenología ................................................................................................................. 18
2.1.4 Morfología .............................................................................................................. 20
2.2 Cultivo de Tejidos Vegetales ............................................................................................ 25
2.2.1 Fases del cultivo in vitro .............................................................................................. 25
2.1.3 Técnicas de Micropropagación Vegetal ............................................................... 26
3. MARCO REFERENCIAL ...................................................................................................... 28
3.1 Antecedentes ......................................................................................................................... 28
4. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 30
5.1 Objetivo general .............................................................................................................. 30
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................................ 30
5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 31
5.1 Localización de la investigación ........................................................................................... 31
5.2 Fases de la investigación ................................................................................................... 31
5.2.1 FASE I. Selección del protocolo de desinfección para los explantes de Caña de
Azúcar (Saccharum officinarum)........................................................................................31
5.2.2 FASE II. Desarrollo del medio de establecimiento para los explantes de caña
de azúcar (Saccharum officinarum)………………………………………………………34
5.2.3 FASE III. Multiplicación de los explantes de caña de azúcar (Saccharum
officinarum)………………………………………………………………………………...35
5.3 Análisis estadístico ........................................................................................................... 35
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................. 36
8
6.1 FASE I. Selección del proceso de desinfección de explantes de caña de azúcar .............. 36
6.1.1 Resultados de los explantes contaminados en etapa de desinfección. ............... 36
6.1.2 Resultados de explantes oxidados en etapa de desinfección.............................. 37
6.1.3 Resultados de explantes prosperos en etapa de desinfección. ........................... 40
6.2 FASE II. Desarrollo de la fase de establecimiento para meristemos apicales de caña de
azúcar. …………………………………………………………………………………..40
6.3 FASE III. Fase de multiplicación de explantes de caña de azúcar. ................................. 42
6.3.1 Porcentaje de plántulas oxidadas ............................................................................... 42
6.3.2 Longitud de las hojas de la caña en etapa de multiplicación. ........................... 43
6.3.3 Porcentaje de plántulas multiplicadas ................................................................ 44
7 CONCLUSIONES ................................................................................................................. 46
8 RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 47
9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 48
10. ANEXOS ........................................................................................................................... 50
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LISTA DE TABLAS
Tabla N°1: Tratamiento 1 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar .......................... 32
Tabla N°2: Tratamiento 2 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar ........................... 32
Tabla N°3: Tratamiento 3 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar ........................... 33
Tabla N°4: Tratamiento 4 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar ........................... 33
Tabla 5: Variables de medición para los tratamientos de desinfección. ..................................................... 34
Tabla N° 6: Imágenes macroscópicas y microscópicas de los hongos contaminantes de los meristemos
apicales de la caña de azúcar ....................................................................................................................... 38
Tabla N°7: Resultados de las variables evaluadas en la etapa de establecimiento. .................................... 41
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Etapas del cultivo de caña de azúcar ............................................................................. 20
Figura 2: Raíz de la caña ............................................................................................................... 21
Figura 3: Tallo de la caña de azúcar. ............................................................................................ 22
Figura 4: Hoja de la caña de azúcar .............................................................................................. 23
Figura 5: Inflorescencia de la caña de azúcar. .............................................................................. 24
Figura 6: Meristemo apical de la caña de azúcar. ......................................................................... 24
Figura 7: Porcentaje de explantes contaminados en etapa de desinfección .................................. 36
Figura 8: Porcentaje de explantes oxidados en etapa de desinfección .......................................... 39
Figura 9: Porcentaje de explantes prósperos en etapa de desinfección… ...................................... 40
Figura 10: Relación del porcentaje de la longitud de las hojas ...................................................... 43
Figura 11: Relación del porcentaje de plántulas multiplicada ...................................................... 44
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LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1. Medios de cultivo para establecimiento de caña de azúcar ....................................... 50
ANEXO 2. Medios de cultivo para multiplicación de caña de azúcar ......................................... 51
ANEXO 3. Análisis de Varianza de explantes contaminados en etapa de desinfección ................ 52
ANEXO 4. Análisis de Varianza de explantes oxidados en etapa de desinfección ..................... 52
ANEXO 5. Análisis de Varianza de explantes prósperos en etapa de desinfección ................... 53
ANEXO 6. Análisis de Varianza de número de brotes en etapa de establecimiento ................... 53
ANEXO 7. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc2 .................................................. 54
ANEXO 8. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc1 .................................................. 54
ANEXO 9. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc3 .................................................. 54
ANEXO 10. Análisis de Varianza de explantes oxidados en etapa de Multiplicación ............... 55
ANEXO 11. Análisis de Varianza de la Longitud de las hojas en etapa de Multiplicación…….55
ANEXO 12. Análisis de Varianza de explantes multiplicados .................................................... 56
ANEXO 13. Caña de azúcar a nivel In vitro ................................................................................ 56
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RESÚMEN
Título: EVALUACION DEL CULTIVO IN VITRO DE CAÑA DE AZUCAR (Saccharum
officinarum) VAR. CCSP 89-43 A PARTIR DE MERISTEMOS APICALES MEDIANTE LA
TÉCNICA DE ORGANOGÉNESIS.
Autor(a): Jessica Marcela Betancourt Guerrero.
Palabras clave: Cultivo in vitro, Desinfección, Saccharum officinarum, Meristemo apical, Murashige
Skoog (Ms).
Descripción:
El cultivo in vitro de tejidos vegetales en la actualidad ha tenido grandes avances, siendo de
gran importancia la incorporación de esta técnica en distintos cultivos, para lograr la multiplicación
y conservación de diferentes especies. El objetivo del presente proyecto de investigación fue
evaluar el cultivo in vitro de caña de azúcar (Saccharum officinarum) variedad CCSP 89-43 a
partir de meristemos apicales mediante la técnica de organogénesis.
Para el desarrollo de esta investigación se trazaron tres fases, la primer fase fue la selección
del protocolo, en esta fase se trabajó con cuatro protocolos de desinfección, los cuales fueron
evaluados de acuerdo con el porcentaje de explantes prósperos, explantes contaminados y
explantes oxidados, la segunda fase fue el desarrollo del medio de establecimiento, para esta fase
se formularon tres medios de cultivo (MEc1, MEc2, MEc3), y la tercera fase, fue la
multiplicación, en la cual igual que en la segunda fase se formularon tres medios de cultivo
(MMc1, MMc2, MMc3).
De acuerdo con el análisis de varianza (Anova) se determinó que el mejor tratamiento de
desinfección fue el número dos, el cual contenía sustancias como: Solución jabonosa en un 3%
con un tiempo de 2 minutos, alcohol en un 70% con un tiempo de 2 minutos, hipoclorito de sodio
al 5% con un tiempo de 15 minutos, y ácido cítrico al 3% con tiempo de 10 minutos. En lo que
respecta al medio de establecimiento el mejor fue el MEc2 el cual contaba con sales del medio
MS, la hormona 6-BAP (500 µ/L) y la hormona AG3 (100 µ/L), obteniendo una germinación en
un tiempo de 18 días, en el medio de multiplicación el que obtuvo mejores resultados de acuerdo
con explantes multiplicados y longitud de las hojas fue el MMc3, el cual contenía sales del medio
MS, Glicina (1500 µ/L) Arginina (1500 µ/L) y 6- BAP (750 µ/L).
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ABSTRACT
Title: EVALUATION OF CULTIVATION IN VITRO OF SUGAR CANE (Saccharum officinarum)
VAR. CCSP 89-43 FROM APICAL MERISTEMS THROUGH THE ORGANOGENESIS
TECHNIQUE
Author (a): Jessica Marcela Betancourt Guerrero.
Key words: In vitro culture, Disinfection, Saccharum officinarum, Apical meristem, Murashige Skoog
(Ms).
Description:
In vitro culture of plant tissues currently has great advances, being of great importance the
incorporation of this technique in various crops, to achieve the multiplication and conservation of
different species. The objective of this research project was the evaluation of the in vitro culture
of sugar cane (CCF) 89.83. CCSP 89-43 from apical meristems using the technique of
organogenesis.
For the development of this research three phases were drawn up, the first phase was the
selection of the protocol, in this phase we worked with four disinfection protocols, which were
evaluated according to the percentage of prosperous explants, contaminated explants and
oxidized explants, the second phase was the development of the establishment medium, for this
phase three culture media were formulated (MEc1, MEc2, MEc3), and the third phase was
multiplication, in which, as in the second phase, three media were formulated of culture (MMc1,
MMc2, MMc3).
According to the analysis of variance (Anova) it was determined that the best disinfection
treatment was number two, which contained the same recipe: Soapy Solution in 3% with a time
of 2 minutes, alcohol in 70% with a time of 2 minutes, 5% sodium hypochlorite with a time of 15
minutes, and citric acid at 3% with time of 10 minutes. Regarding the establishment medium, the
best was the MEc2 which had the sales of the MS medium, the hormone 6-BAP (500 μ / L) and
the hormone AG3 (100 μ / L), obtaining a germination in a time of 18 days, in the medium of
multiplication the one that obtains better results according to explants and length of the leaves was
the MMc3, which contained sales of the medium MS, Glycine (1500 μ / L) Arginine (1500 μ / L)
and 6- BAP (750 μ / L).
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1. INTRODUCCIÓN
El cultivo de Caña de azúcar (Saccharum officinarum) es un recurso natural, de gran uso a nivel
mundial, ya que a partir de este, se logran obtener diferentes subproductos con sostenibilidad
ecológica. Las melazas, son el principal subproducto, siendo la materia prima para las industrias
del alcohol y sus derivados, así mismo, el bagazo es usado para la producción de papel y la
generación de energía (combustibles). (NETAFIM, 2014)
A nivel mundial, se encuentran 121 países productores de caña de azúcar, donde los 15 países
con mayor producción son Brasil, India, China Tailandia, Pakistán, México, Cuba, Colombia,
Australia, USA, Filipinas, Sudáfrica, Argentina, Myanmar y Bangladesh, concentrando el 86.0%
de área y una producción total de 1333 millones de toneladas métricas. (OJEDA, 2014).
En Colombia el sector donde más se encuentra área cultivada de caña de azúcar es el valle
geográfico del río Cauca, que incluye 47 municipios desde el norte del departamento del Cauca,
la franja central del Valle del Cauca, hasta el sur del departamento de Risaralda. Encontrándose
225.560 hectáreas sembradas en caña para azúcar, de las cuales, el 25% corresponde a tierras de
los ingenios y el restante 75% a más de 2.750 cultivadores de caña. (ASOCAÑA, 2012) Estos
cultivadores se encargan de abastecer a 13 ingenios de la región valle caucana (Cabaña, Carmelita,
Manuelita, María Luisa, Mayagüez, Pichinche, Risaralda, San Carlos, Tumaco, Río paila-Castilla,
Incauca y Providencia). (PROCAÑA, 2015)
En Santander, el cultivo de caña de azúcar se encuentra distribuido en distintas municipios tales
como Suaita con 66.500 toneladas, Guepsa con 64.243 toneladas, San Benito con 31.350 toneladas,
Oiba con 14.000 toneladas, y Mogotes con 10.200 toneladas anuales, donde gran parte de esta
15
Producción es usada para la fabricación de azúcar, panela, mieles, guarapos y forrajes. (Mojica,
2014).
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En los últimos años la agricultura cañera de Santander ha tenido una serie de dificultades, que
han afectado la economía de los agricultores como a de los vendedores. Dentro de las
problemáticas más relevantes se encuentra la incorporación de nuevas variedades que han
generado la pérdida del acervo cultural del cultivo de la caña de azúcar a nivel regional. De igual
manera, la ausencia de bancos de germoplasma a nivel de campo que estén orientados a la
masificación de variedades con un interés agronómico y económico importante para el productor,
así como también, la falta de apoyo institucional en la tecnificación de los cultivos, ha ocasionado
una disminución en la producción de hasta un 50% debido al incremento de plagas y enfermedades
como la hormiga loca y el gusano barrenador, los cuales afectan desde la raíz a la hojas, causando
daño de la totalidad de la planta.
2.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Es posible la propagación in vitro de la caña de azúcar VAR. CCSP 89-43, a partir de
meristemos apicales?
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3 JUSTIFICACIÓN
A partir del planteamiento del problema, se desarrolló este proyecto de investigación con el
objetivo de establecer la propagación del cultivo in vitro de caña de azúcar (Saccharum
officinarum) VAR. CCSP 89-43 a partir de meristemos apicales mediante la técnica de
organogénesis en cooperación del Sena – Tecnoparqués. A partir de esta investigación se logró
contribuir a la masificación de esta especie agrícola a nivel in vitro, obteniendo de esta manera la
conservación de una especie de caña azúcar caracterizada por contener altos contenidos de
sacarosa, proporcionando a su vez que estas plantas se encuentren genéticamente estables, libres
de patógenos, que a largo plazo ayudara a mantener y mejorar la producción de esta especie
agrícola.
De acuerdo con esto se estandarizó una metodología que aportó nuevos conocimientos en los
procesos de desinfección, estandarización y multiplicación de la variedad CCSP 89-43,
disminuyendo tiempos de brotación y oxidación de los explantes en el proceso de propagación.
Desarrollando de esta manera un banco de germoplasmas de caña de azúcar en el departamento de
Santander, el cual servirá como referente para futuros estudios. Cabe resaltar que esta investigación
va de la mano con el plan departamental de desarrollo, Santander Nos Une 2016 - 2019, el cual
dará a los agricultores tecnología e innovación, en pos de mejora a la producción agrícola.
Finalmente la temática planteada en este proyecto servirá como soporte para la obtención del
título de Microbióloga Industrial.
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2. MARCO TEÓRICO
2.1 CAÑA DE AZUCAR (Saccharum officinarum)
2.1.1 Descripción botánica
La caña de azúcar hace parte de las plantas tropicales pertenecientes a la familia de las
gramíneas. El reconocer la caña de azúcar (Saccharum officinarum) morfológicamente nos permite
notar diferencias entre las variedades que existen; S. Barben, S. Robustum, S. Smence, y S.
Spontaneum, para después poder hacer una relación en cuanto al rendimiento y su adaptación y/o
comportamiento. (Vera I. L., 2006)
CLASIFICACIÓN BOTÁNICA
DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE
Reino: Plantae División: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Subclase: Commelinidae
Orden: Poales
Familia: Poaceae
Género: Saccharum
Especie: officinarum
(Ecured, 2017)
2.1.2 Cultivo
La caña de azúcar (Saccharum spp.) de la familia Poaceae, cuenta con una característica única
y es su alto contenido de azúcar, esta característica la ubica dentro de los cultivos tropicales más
importantes de Colombia y del mundo. La producción de caña de azúcar en el mundo es de 1,558
millones de toneladas, cultivadas en más de 22 millones de hectáreas alrededor del mundo, siendo
brasil el mayor fabricante con 556 millones de toneladas cosechadas en el periodo de 2012 (FAO,
18
2012) A nivel nacional, el cultivar este cultivo es una actividad de mucha importancia en la
economía agrícola, además del maíz, frijol, trigo y café. Teniendo en cuenta que el azúcar como
producto comercial está catalogado entre los cinco productos básicos alimenticios. Constituyendo
una fuente alta de ingresos en la población rural del país. (ASOCAÑA, 2012)
2.1.3 Fenología
- Factores ambientales
Como toda planta, el cultivo de la caña de azúcar puede sufrir distintos daños por parte de
un conjunto de factores ambientales que alteran su estabilidad, entre estos se encuentran:
a. Climatización: Este cultivo tiene la necesidad de contar con un clima cálido, tropical que
cuente con temperaturas atmosféricas altas, humedad atmosférica elevada y abundante
lluvia, sobre todo en su crecimiento. Es idóneo tener en cuenta que el cultivo de caña tiene
una exigencia diferente entre la fase de crecimiento y maduración. En lo que respecta al
crecimiento no debe existir una temperatura fría, y en la maduración no debe existir
abundancia de lluvias. (Ganaderia, 2007)
b. Temperaturas: la temperatura influye en el crecimiento del cultivo de la siguiente manera.
La temperatura óptima para el desarrollo de las raíces va de 26 c a 33 c, Si la temperatura
cae debajo de 20°c la germinación y el desarrollo serán demasiado lentos.
En lo que respecta al crecimiento, las temperaturas que caen debajo de las 15 c o suben
arriba de 38°c, paralizan su crecimiento, siendo la temperatura óptima de 30 c a 34 c.
c. Luz solar: El cultivo de caña es muy dependiente de la luz solar, de acuerdo con la
intensidad y la duración del día, ya que los nutrientes minerales son asimilados solo durante
el día y el grado de absorción del agua en caña dulce en un día soleado es doble con relación
a la que absorba bajo un cielo nublado. (Ganaderia, 2007)
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d. Precipitación: El promedio de precipitación con el que debe contar el cultivo es de 1200
a 1500 mm por año, además de lluvias moderadas y frecuentes, durante el periodo
vegetativo, la sequía es ineficiencia para la fotosíntesis, e interfiere en la absorción
radicular de nutrientes y provoca la desecación foliar. Por otro lado durante el período de
maduración, el agua es más reducido debido a que la sacarosa se almacena solo cuando la
caña detiene el crecimiento.
e. Ubicación Topográfica: El terreno debe ser plano o de pendientes suaves. En pendientes
muy pronunciadas son cultivadas únicamente en pequeñas cantidades.
f. Suelos: Para este cultivo es mejor un suelo franco-areno-arcilloso, el cual cuente con un
buen drenaje y gran tenor de materia orgánica, sin olvidar los factores físico-químicos. Este
suelo debe contar las siguientes condiciones:
1. Estructura: Fácil laboreo (Granular), además de alta capacidad para almacenar agua.
2. Composición mineral: calcio(Ca), nitrógeno(N), fósforo(P) y potasio(K), además otros
elementos como el boro(B), carbono(C), cobre(Cu), hierro(Fe), magnesio(Mg),
molibdeno(Mo), oxígeno(O), silicio(Si), sodio(Na), azufre(S) y zing(Zn), finalmente
materia orgánica.
3. Reacción del suelo: Suelo próspero con valores de pH entre 5,5 a 8.
4. Profundidad: Profundidad de 80 a 90 cm, con buen drenaje natural.
(Ganaderia, 2007)
20
5. Etapas de Crecimiento de la caña de azúcar.
Las etapas de la caña de azúcar se dividen en cinco. (1) Establecimiento, (2) Crecimiento
Vegetativo, (3) Crecimiento rápido, (4) Maduración, (5) Cosecha.
2.1.4 Morfología
La caña de azúcar cuenta con partes importantes en su desarrollo, las cuales están
involucradas en el buen funcionamiento de la planta a lo largo de su vida útil.
a. Raíz: Esta se encarga de anclar a la planta para que absorba agua y nutrientes minerales
del suelo. Su forma es cilíndrica y cuenta con las siguientes partes:
- Raíz Primaria: Ubicada en el embrión.
- Raíces Adventicias: Se encuentran de dos tipos; Primordiales y permanentes.
- Primordiales: adsorben agua y minerales, cuentan con una duración efímera. Son
delgadas y ramificadas.
Figura 1: Etapas del cultivo de caña de azúcar
FUENTE: (SIANEC, s.f.)
21
- Permanentes: Se desarrollan cuando brotan tallos nuevos, tienen un mayor diámetro y
largas. (Ruiz, 1995)
22
b. Tallo: Los tallos de la caña son de 2 a 3 m de longitud por año, llegando a formar un
aproximado de tallos de 1 hasta 23 por macolla; estos se dividen en primarios, secundarios
y mamones. Los tallos también se involucran en el transporte de agua y nutrientes extraídos
del suelo para abastecer la punta que está en crecimiento.
En el crecimiento se dan distintos comportamientos, donde el más ideal es en forma erecta.
Este tallo se logra dividir en dos partes; nudo y entrenudo.
Figura 2: Raíz de la caña Fuente:
(Estévez, 2008)
23
1. NUDO: Este se define como la parte del tallo donde se genera la hoja. El cual tiene las
siguientes partes; cicatriz foliar, Zona radical, anillo de crecimiento, Banda cerosa y
yemas.
2. ENTRENUDO: Este se comprende como el espacio entre nudo y nudo, contando con
las partes; Canal de la yema, Secciones corchosas, Rajaduras y Tricomas. (Ruiz, 1995)
c. Hojas: Las hojas son largas, delgadas y planas que miden generalmente entre 0.90 a 1.5 m
de largo y varían de 1 a 10 cm de ancho, según la variedad. Este órgano se encarga de llevar
a cabo el proceso de la fotosíntesis.
Partes de la Hoja: Lámina: Esta es de grosor ancho, longitud alta, ayudando a tener una
eficiencia en la fotosíntesis. Nervadura central: Estructura que recorre la lámina. Vaina: es
Figura 3: Tallo de la caña de azúcar.
FUENTE: (Estévez, 2008)
24
el soporte de la hoja en cada nudo, su forma es tubular más ancha en la base y gradualmente
se estrecha hacia la banda lígular. (Ruiz, 1995).
d. Inflorescencia: Está formada por pequeñas flores perfectas y sedosas, llamadas espigas.
La floración aparece al completar el ciclo vegetativo para luego iniciar el período
reproductivo.
Figura 4: Hoja de la caña de azúcar.
FUENTE: (Estévez, 2008)
25
e. Meristemo apical: Este meristemo apical se encuentra ubicado en la parte superior de la
caña, en el lugar queda origen a las hojas y al tallo. Este ápice se encuentra ubicado dentro
del verticilo caulinar de la planta. (UNLPAM).
Figura 5: Inflorescencia de la caña de
azúcar. FUENTE: (Estévez, 2008)
Figura 6: Meristemos apical de la caña de azúcar.
FUENTE: (Barbosa, 2015)
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2.2 Cultivo de Tejidos Vegetales
Es una técnica, que ayuda a aislar una porción de la planta (explante) y proporcionar
artificialmente condiciones físico-químicas apropiadas para que las células del explante tengan un
potencial intrínseco. Dentro de esta técnica se maneja el proceso de desinfección, para eliminar la
microbiota bacteriana. El uso del cultivo in vitro se da para estudios de fisiología, genética,
bioquímica, bioconversión y producción de compuestos, incremento de la variabilidad genética,
obtención de plantas libres de patógenos, propagación de plantas y conservación e intercambio de
germoplasma. (Villamizar, 2005)
2.2.1 Fases del cultivo in vitro.
La micropropagación cumple con cuatro etapas importantes en el proceso de cultivo in vitro,
los cuales son importantes para cumplir con todo el proceso de propagación.
Etapa 0: Preparación del material vegetal
La adecuada elección y preparación del explante influye directamente sobre la calidad y su
respuesta frente a problemas que afectan al establecimiento del cultivo, que son la contaminación
y la oxidación.
Existen factores que influyen sobre la buena calidad del explante como:
- Estado ontogénico y fisiológica del mismo.
- La estación: recolección del material vegetal
- El tamaño y la condición sanitaria.
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Etapa 1: Establecimiento del cultivo
En esta etapa se generan los requerimientos nutricionales necesarios para la adaptación en el
cultivo artificial. Aquí juega un papel importante el área de asepsia y las condiciones ambientales.
Etapa 2: Multiplicación
En esta etapa se mantienen y aumentan los brotes generados, obteniendo multiplicaciones
sucesivas. Existen dos vías de regeneración, organogénesis y embriogénesis, pueden darse en
forma directa o indirecta. Esta última forma los callos. En general, la organogénesis produce
vástagos unipolares que enraízan en etapas sucesivas, mientras que por embriogénesis somática se
forman embriones bipolares a través de etapas ontogénicas similares a la embriogénesis cigótica.
Etapa 3: Enraizamiento y Aclimatización
Ya que las raíces ayudan a absorber nutrientes, en esta etapa se produce la formación de raíces
adventicias. Este enraizamiento se puede realizar en condiciones in vitro o ex vitro. En In vitro
pueden emplearse substratos y reguladores de crecimiento (principalmente auxinas) para promover
la formación de raíz. (Olmos, 2015)
2.1.3 Técnicas de Micropropagación Vegetal
El uso de las técnicas de micropropagación vegetal inicialmente cuenta con distintas ventajas,
entre ellas está la dependencia de los factores climáticos de la naturaleza, el espacio en el cual se
cultivan los explantes, y una de las más importantes la multiplicación masiva de una sola parte de
la planta. (Malajovich, 2010)
28
2.13.1 Organogénesis.
Es el evento morfogenético en el que se obtiene un desarrollo unipolar a partir de una yema,
que más adelante es convertida en un brote vegetativo, existiendo así una conexión entre los nuevos
brotes y el tejido paternal.
La regeneración directa se compone de tallos o embriones que directamente crecen de los tejidos
de partida, y es regeneración indirecta cuando de tallos o embriones se produce un crecimiento
desorganizado de tejidos denominamos callo. (Carmina, 2010). En conclusión la embriogénesis
somática, es una vía que forma una planta completa, ya sea directa o indirecta.
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3. MARCO REFERENCIAL
3.1 Antecedentes
Uno de los primeros trabajos corresponde a José Cuellar en la investigación Propagación
vegetativa in vitro a partir de hojas jóvenes de caña de azúcar (Saccharum officinarum L.)
Propuesta en la que se evaluó la respuesta de dos variedades de la caña de azúcar: Mex 70-485 y
Mex 68-P-23, usando hojas jóvenes aún enrolladas, con un tamaño de alrededor 5 mm de longitud
en medio de Murashige y Skoog (1962) modificado para cada una de las etapas. Para la
callogénesis uso 3,0 mg/L. de 2,4-D, para el crecimiento y desarrollo de “callos” 2,0; 2,5 y 3,0
mg/L. de 2,4-D y para la diferenciación no se usó regulador. En la rizogénesis uso: un medio a
mitad de concentración de macronutrimentos, otro con la concentración total de las sales y otro
con las sales completas suplementado con 5 mg/L de AIA. En la fase de formación de callo, el
mayor problema fue la fenolización de los explantes. La mejor concentración de ácido 2,4-D fue
de 3,0 mg/l , tanto para la formación de callo como para su crecimiento y desarrollo; La
diferenciación se dio con la sustracción de ácido 2,4-D del medio, y la rizogénesis fue favorecida
con el suplemento de 5 mg/L de AIA. (Cuellar, 1996)
Como segundo trabajo Belay Tolera, Mulugeta Diro y Derbew Belew en su investigación In
VItro Aseptic Culture Establishment Of Sugarcane (Saccharum Officinarum L.) Varieties Using
Shoot Tip Explants Ensayaron dos variedades de caña de azúcar, 'B41-227' y 'N14' para la
respuesta de cinco niveles de BAP (0, 1, 2, 3 y 4 mg/L-1) y kinetina (0, 0,5, 1, 1,5 y 2 mg/L-1)
usando un tratamiento factorial de 2 * 5 * 5 combinaciones. Entre las diferentes Concentraciones
y combinaciones de BAP y kinetina, la mejor fue el medio con Murashige y Skoog (MS)
Suplementado con 3 mg/L - 1 BAP sin kinetina para B41 - 227; y 3 mg/L-1 BAP junto con 1,5
30
mg/L-l de kinetina para N14 mostrando mejor respuesta que las otras concentraciones en
formación de brotes, con menor número de explantes muertos, explantes sin respuesta, y mayor
longitud de la caña de azúcar. (Tolera, 2014)
Finalmente como tercer trabajo, Laureen Michelle Houllou y Robson Antônio De Souza*
en su investigación Protocol optimization for in vitro sugar cane establishment from stem cuttings
shoot tips, construyeron un protocolo óptimo para la variedad RB92579, usando como explantes
los tallos en edad de 8 a 11 meses, las recolecciones de tallos se hicieron en tres edades diferentes,
103 días (S1), 115 días (S2) y 145 días (S3) después de la siembra en el invernadero. El análisis
del desarrollo de explantes in vitro mostró que los explantes S3 fueron superiores a los explantes
S1 y S2. Observando la mejor viabilidad de explantes in vitro en los explantes S3 (47%), en
comparación con el 4% y 17% observados en los explantes S1 y S2, respectivamente. El descarte
de explantes in vitro, por contaminación por microorganismos, fueron más altas en los explantes
S1 (76%) que en S2 (17,4) y S3 (29%). Estos resultados indican que la edad de desarrollo de los
brotes puede influir en el éxito del establecimiento in vitro de caña de azúcar.
31
4. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Evaluar el cultivo in vitro de caña de azúcar (saccharum officinarum) variedad CCSP 89-
43 a partir de meristemos apicales mediante la técnica de organogénesis.
4.2 Objetivos específicos
Seleccionar el protocolo adecuado para la desinfección de los meristemos apicales de la
caña de azúcar (saccharum officinarum) obteniendo explantes libres de contaminación.
Desarrollar la fase de establecimiento para los meristemos apicales de la caña de azúcar
(saccharum officinarum) con el fin de iniciar el crecimiento in vitro de los explantes.
Establecer la fase de multiplicación a partir de meristemos apicales de la caña de azúcar
(saccharum officinarum) para generar una propagación masiva de la especie.
32
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Localización de la investigación
Esta investigación se realizó en el laboratorio de Tejidos Vegetales de la Universidad de
Santander UDES, ubicado en el campus lago del cacique, Bucaramanga, Colombia.
5.2 Fases de la investigación.
Para el desarrollo de esta investigación se llevaron a cabo tres fases para la propagación
in vitro de caña de azúcar.
5.2.1 FASE I. Selección del protocolo de desinfección para los explantes de Caña
de Azúcar (saccharum officinarum).
Para el cumplimiento de esta etapa se realizaron las siguientes actividades:
5.2.1.1 Obtención del material vegetal
El Material Vegetal de caña de azúcar, fue suministrado por el SENA seccional Guatiguará,
ubicado en el Municipio de Piedecuesta – Santander, a 17 Km de Bucaramanga, con una
temperatura de 23°C y una altitud de 1005 msnm aproximadamente. Para la selección de los
explantes de caña de azúcar, se tomaron cañas de la variedad CCSP 89-43, procedente de
CORPOICA, con edad de 3 a 4 meses, en buenas condiciones, sin presencia de daños físicos,
causados por insectos o microorganismos. El tejido vegetal fue transportado al laboratorio de
tejidos vegetales en bolsas Ziploc a una temperatura de 10ºC. Es importante resaltar que este
cultivo se seleccionó por contar con un alto contenido de azúcar, de interés para los agricultores,
siendo además una especie de cultivo nativo de la región.
33
5.2.1.2 Desinfección de los explantes de caña de azúcar
Se establecieron cuatro protocolos de desinfección (T1, T2, T3, y T4); estos tratamientos se
formularon en el laboratorio de Tejidos Vegetales de la Universidad de Santander, con ayuda de
revisión bibliográfica. Estos difieren en el tipo de desinfectante, concentración y tiempos de
exposición sobre el explante de caña de azúcar.
Tratamientos de desinfección:
Tabla N°1: Tratamiento 1 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar.
SOLUCIÓN DESINFECTANTE FORMULA
QUIMICA
PORCENTAJE (%) TIEMPO
(MIN)
SOLUCIÓN JABONOSA - 3 5
ALCOHOL C2H6O 70 5
HIPOCLORITO DE SODIO NaClO 5 5
ÁCIDO CÍTRICO C6H8O7 5 5
Tabla N°2: Tratamiento 2 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar.
SOLUCIÓN DESINFECTANTE FORMULA
QUIMICA
PORCENTAJE (%) TIEMPO
(MIN)
SOLUCIÓN JABONOSA - 3 2
ALCOHOL C2H6O 70 2
HIPOCLORITO DE SODIO NaClO 5 15
ÁCIDO CÍTRICO C6H8O7 3 10
(Bello, 2014)
34
Tabla N°3: Tratamiento 3 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar.
SOLUCIÓN DESINFECTANTE FORMULA
QUIMICA
PORCENTAJE (%) TIEMPO
(MIN)
SOLUCIÓN JABONOSA - 3 1
HIPOCLORITO DE SODIO NaClO 5 30
ÁCIDO CÍTRICO C6H8O7 5 3
Tabla N°4: Tratamiento 4 de desinfección para meristemos apicales de caña de azúcar.
SOLUCIÓN DESINFECTANTE FORMULA
QUIMICA
PORCENTAJE (%) TIEMPO
(MIN)
ISODINE - 3 10
ALCOHOL C2H6O 70 2
HIPOCLORITO DE SODIO NaClO 5 2
ÁCIDO CÍTRICO C6H8O7 3 10
(Esperanza Niubó, 2004)
Nota: Se realizaron tres lavados de agua destilada estéril en cada paso del proceso con el fin de
eliminar los residuos de las soluciones desinfectantes.
Para determinar el mejor tratamiento de desinfección se establecieron tres variables de
medición: Porcentaje de explantes prósperos, porcentaje de explantes oxidados, y finalmente
porcentaje de explantes contaminados.
35
Tabla 5: Variables de medición para los tratamientos de desinfección.
Porcentaje de explantes
prósperos (%EP) Porcentaje de explantes
oxidados (%EO)
Porcentaje de explantes
contaminados (%EC)
#𝐄𝐱𝐩𝐥𝐚𝐧𝐭𝐨𝐬 𝐩𝐫𝐨𝐬𝐩𝐞𝐫𝐨𝐬
%𝑬𝑷 = #𝑬𝒙𝒑𝒍𝒂𝒏𝒕𝒐𝒔 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆𝒔
∗ 𝟏𝟎𝟎
#Explantos oxidados
%𝐸𝑂 = #𝐸𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠
∗ 100
#Explantos oxidados
%𝐸𝑂 = #𝐸𝑥𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠
∗ 100
(Borges, 2009)
5.2.2 FASE II. Desarrollo del medio de establecimiento para los explantes de caña
de azúcar (Saccharum officinarum).
Para el desarrollo de la fase de establecimiento, se formularon tres medios de cultivos a
partir del medio basal MS (Murashige y Skoog 1969) los cuales variaban en la concentración de
hormonas de crecimiento vegetal y vitaminas. (Chavarria, 1999) (Ver anexo 1)
La siembra de los explantes se realizaron bajo condiciones de asepsia empleando una cámara de
flujo laminar, en frascos de vidrio, forrados con papel aluminio. Seguido de la siembra se llevaron
al área de incubación en condiciones de luz artificial proporcionado por lámparas fluorescentes
con fotoperiodos de 16 horas luz / 8 oscuridad; Humedad: 65% relativamente y una temperatura
de 18°C.
Parámetros para ser pasados a la siguiente fase de multiplicación: Explantes que obtuvieran un
desarrollo óptimo en cuanto a brotación y elongación.
Para determinar el medio más adecuado, se trabajó con un diseño experimental completamente al
azar, midiendo variables tales como; el tiempo de formación del brote y el porcentaje de formación
de brotes.
36
5.2.3 FASE III. Multiplicación de los explantes de caña de azúcar (Saccharum
officinarum).
Para la fase de multiplicación se formularon tres medios de cultivo a partir del medio basal
MS (Murashige y Skoog 1969), a estos medios se les modificaron las hormonas de crecimiento
vegetal, sus concentraciones y vitaminas. (Jalaja, 2008) (Ver anexo 2)
La siembra de los explantes se realizaron bajo condiciones de asepsia empleando una
cámara de flujo laminar en frascos de vidrio, forrados con papel aluminio. Seguido de la siembra
se llevaron al área de incubación en condiciones de luz artificial proporcionado por lámparas
fluorescentes con fotoperiodos de 16 horas luz / 8 oscuridad; Humedad: 65% relativamente y una
temperatura de 18°C.
Para determinar cuál de los tres tratamientos era el más eficiente se evaluaron las siguientes
variables: Plántulas oxidadas, plántulas multiplicadas y longitud de las hojas.
5.3 Análisis estadístico
Cada tratamiento se realizó por triplicado, con un total de 15 explantes por tratamiento, para
verificar si se generaban .diferencias significativas se llevó a cabo un análisis de varianza ANOVA
por medio de la prueba de Tukey en el software InfoStat.
37
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 FASE I. Selección del proceso de desinfección de explantes de caña de azúcar
De acuerdo con el proceso de desinfección se generaron los siguientes resultados.
6.1.1 Resultados de los explantes contaminados en etapa de desinfección.
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Explantes Contaminados
63%
30%
19%
8%
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4
Tratamientos de desinfección
Figura 6: Porcentaje de Explantes Contaminados en etapa
de desinfección
De acuerdo con la figura 6 se evidencian diferencias significativas en cada uno de los
tratamiento (p<0,05), (ver anexo 3) donde se logra determinar que el tratamiento con menor
contaminación fue el tratamiento número 2, con el cual se logró la disminución de algunos agentes
contaminantes con un porcentaje del 8%, como siguiente tratamiento con bajo porcentaje de
contaminación se reportó el tratamiento 1 mostrando un porcentaje de contaminación del 19%, el
tratamiento 3 y 4 mostraron la mayor contaminación con porcentajes del 63% y 30%
respectivamente en los explantes de caña de azúcar.
38
Esta baja contaminación evidenciada en el tratamiento 2 se generó por la aplicación de
hipoclorito de sodio al 5%, con un tiempo de exposición de 15 minutos, a diferencia de los otros
tratamientos que emplearon tiempos de 2 y 3 minutos, no fueron suficientes para eliminar la
microflora presente en los explantes. Esto concuerda con (Estrada, 2009), donde corrobora que el
uso del hipoclorito de sodio con tiempos de exposición entre 15 y 20 min, son más efectivos para
la eliminación de microorganismos, evidenciando también que el tratamiento 3 al tener un tiempo
de 30 minutos, genero oxidación en el explante, ya que este tiempo de exposición afecta los tejidos.
Kosky, R. G. (2003). Reporta que el alcohol ayuda a eliminar la presencia de hongos y
levaduras, en los tejidos superficiales, teniendo en cuenta esto se deduce que el tratamiento 3 al no
tener la presencia de alcohol, tuvo más proliferación en el desarrollo de contaminación por hongos.
De acuerdo con la contaminación causada en los meristemos apicales de caña de la azúcar, se
identificaron tres posibles agentes contaminantes, identificados como hongos. Es importante
resaltar que no se generó contaminación bacteriana. El hongo con mayor incidencia fue el género
Penicillium sp con un 50%, seguido del hongo sterilia con un 30%, y finalmente con un 20% se
encontró una levadura que invadía al medio de cultivo.
39
Tabla N° 6: Imágenes macroscópicas y microscópicas de los hongos contaminantes de los
meristemos apicales de la caña de azúcar.
GENERO MACROSCOPIA MICROSCOPIA
Penicillium Spp
Descripción:
Colonias aterciopeladas,
levantadas, plegadas de inicio
Descripción:
Conidióforos rectos, hialinos,
con fialides que nacen sobre
métulas. Conidias en cadena,
Sterilia
blanco que se tornan de color
verde-gris. Medio de cultivo
rosa bengala.
Descripción:
Colonias aterciopeladas,
levantadas, color blanco.
Medio de cultivo Nutritivo.
esféricas, hialinas. Tinción Azul
de metileno, 100x.
Descripción:
Sin estructura definida.
Tinción Azul de metileno,
100x.
Levadura
Descripción:
Colonias planas, cremosas,
borde regular, color blanco.
Descripción:
Blastoconidias globosas a
elipsoidales, con gemación
multilateral. Azul de metileno,
40x.
40
0% 0%
39%
6.1.2 Resultados de explantes oxidados en etapa de desinfección.
Explantes oxidados
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
83%
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4
Tratamientos de desinfección
Figura 7: Porcentaje de Explantes Oxidados en etapa de
desinfección
En lo que respecta a explantes oxidados se evidencian diferencias significativas en los cuatro
tratamientos (p<0.05). (Ver anexo 4). Evidenciando que los dos tratamientos que no mostraron
oxidación fueron los tratamientos 2 y 4, obteniendo resultados del 0% para ambos tratamientos de
desinfección, el tratamiento 1 con un 39% de oxidación, y el tratamiento 3 con un 83% de
oxidación.
Para el control de esta fenolización, se usó el ácido cítrico como antioxidante, donde se mostró
que el mejor tiempo fue de 10 minutos en el tratamiento 2 y el tratamiento 4, con un porcentaje de
concentración de 3%. De acuerdo con (Azafeifa, 2009) el ácido cítrico es el antioxidante crucial
para el cultivo in vitro de tejidos vegetales, ya que ayuda a proteger los tejidos de la liberación de
radicales libres.
41
6.1.3 Resultados de explantes oxidados en etapa de desinfección.
100%
Explantes prósperos
80%
60%
40%
20%
0%
tratamiento 1 tratamiento 2 tratamiento 3 tratamiento 4
Tratamientos de desinfección
Figura 8: Porcentaje de Explantes Prósperos en etapa de
desinfección
De acuerdo con los resultados de la figura 8 de explantes prósperos se evidencian diferencias
significativas en los cuatro tratamientos de desinfección (p<0.05) (ver anexo 5). Estos datos de
porcentajes determinaron que el tratamiento 2 fue el más eficiente, con un 91% de explantes
prósperos, seguido del tratamiento 4 que obtuvo un porcentaje del 72%, el tratamiento 1 con el
60% y el tratamiento 3 con un porcentaje del 0%.
6.2 FASE II. Desarrollo de la fase de establecimiento para meristemos apicales de
caña de azúcar.
De acuerdo con las variables evaluadas de tiempo de formación del brote y el porcentaje de
formación de brotes se generaron los siguientes resultados.
91%
72%
0%
60%
42
Tabla N°7: Resultados de las variables evaluadas en la etapa de establecimiento.
Medio de Cultivo Tiempo de formación del brote (Días) (%) formación de brote
MEc1
35
75
MEc2 18 95
MEc3 43 40
De acuerdo con los resultados obtenidos en porcentajes de formación de brotes en etapa de
establecimiento se evidencian diferencias significativas (p<0,05), (ver anexo 6) demostrando que
el medio de cultivo que dio origen a un mayor número de brotes en los meristemos apicales fue
el MEc2, con un porcentaje del 95%.
Se logró deducir que este medio fue el mejor ya que conto con una baja concentración de la
hormona 6-BAP, (Sharry) corrobora diciendo que al trabajar con esta hormona a bajas
concentraciones, regula la adaptación y estabilización del explante en un nuevo medio de
crecimiento ayudando a promover la brotación lateral, induciendo a la división celular.
Concluyendo que los medios MEc1 y el MEc3 al tener una concentración de hormonas alta, causa
retraso en su desarrollo y promueve a la muerte del tejido celular.
De acuerdo con los resultados obtenidos en tiempo de formación de brotes en etapa de
establecimiento se logró determinar que el medio MEc2 tuvo resultados más rápidos en un tiempo
de 18 días, mostrando una longitud del explante de caña más larga y la apariencia del explante
más vigorosa (ver anexo 7). Esto se generó gracias a que este medio disponía de la hormona AG3,
la cual de acuerdo con (Casaretto, 2006), esta giberilina ayuda a la elongación celular al
incrementar la plasticidad de la pared y aumentar el contenido de glucosa, generando expansión
43
en los microtúbulos, absorbiendo así de mejor manera el agua en las células, y finalmente
controlando el crecimiento de los tallos. En el medio MEc1 se presentó el desarrollo del explantes
a los 35 días, con una elongación corta y coloración del explante adecuada (ver anexo 8), en cuanto
al medio MEc3 se generó un retardo de brotación, pues la generación de explantes se observó a
los 43 días después de haber realizado la siembra, además se presentó oxidación en el explante y
la elongación no fue óptima (ver anexo 9).
6.3 FASE III. Fase de multiplicación de explantes de caña de azúcar.
De acuerdo con las variables de Plántulas oxidadas, Plántulas Multiplicadas y longitud de las
hojas se generaron los siguientes datos.
6.3.1 Porcentaje de plántulas oxidadas
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
% oxidación
MMc1 MMc2 MMc3
Medios de Multiplicación
Figura 9: Relación del Porcentaje de plántulas oxidadas en etapa de
Multiplicación.
En la figura 9 se evidencian diferencias significativas en cada uno de los tratamiento, (p<0,05),
(ver anexo 10) La etapa de multiplicación es una de las etapas más sensibles, debido a que el
explante se fragmenta para dar inicio a una producción masiva en la cual el explante sufre lesiones
73%
% 20
% 47
44
en el tejido vegetal, generando la fenolización, esto según (Azafeifa, 2009) quien argumenta que
esta consecuencia trae consigo la acción de enzimas oxidasas, frecuentemente nombradas como
polifenol oxidasas (PPOs), fenolasas y tirosinasas, así como de las peroxidasas (POX). Las cuales
son liberadas, sintetizadas o están presentes en ciertos sustratos y en condiciones oxidativas cuando
los tejidos son lesionados o se encuentran senescentes.
De acuerdo con la figura 9, el medio de cultivo MMc3 obtuvo el menor porcentaje de oxidación
en los explantes multiplicados y se determina que esta disminución se generó por la acción del
carbón activado en el medio de cultivo. Según (Azafeifa, 2009) Argumenta que el efecto benéfico
del Carbón Activado se atribuye a su capacidad para remover sustancias inhibitorias o tóxicas del
medio de cultivo que son producidas durante el autoclavado del medio o liberadas por el explantes.
6.3.2 Longitud de las hojas de la caña en etapa de multiplicación.
Longitud de la hoja 3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
MMc1 MMc2 MMc3
Medios de Multiplicación
Figura 10: Relación del porcentaje de longitud
de hojas.
La relación de longitud de la figura 10 muestra diferencias significativas en cada uno de los
tratamiento, (p<0,05). (Ver anexo 11). En lo que respecta a la longitud de las hojas el medio MMc3
fue el mejor ya que contenía la glicina y la arginina las cuales de acuerdo con (Gualdron, 2010)al
48 1,
33
1,
52 2,
Cm
45
40%
66%
relacionarse con la hormona 6-BAP, intervinieron en la síntesis de las porfirinas, de tal manera
que se estimula la clorofila y los estomas, absorbiendo y asimilando mejor los nutrientes. Por ende
las hojas en esta etapa se muestran con una coloración fuerte. El medio MMc1 contenía la
citoquinina Kinetina la cual ayuda al crecimiento de los tejidos, pero según lo reportado por
(Nuñez, 1989) esta relación de kinetina con glicina no es usado para este tipo de tejido vegetal y
en el caso del medio MMc2 la concentración de arginina y la hormona AIA no tienen la acción
adecuada en el desarrollo de las hojas de las plantas.
6.3.3 Porcentaje de plántulas multiplicadas
% Plantulas Multiplicadas
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
93%
MMC1 MMC2 MMC3
Medios de Multiplicación
Figura 11: Relación del porcentaje de plántulas
multiplicación.
Los porcentajes de plántulas multiplicadas de la figura 11 evidencia diferencias significativas
en cada uno de los tratamientos, (p<0,05). (Ver anexo 12). El MMc3 logró desarrollar el mayor
porcentaje de plántulas multiplicadas gracias a la acción de la glicina y la arginina, (Gualdron,
2010) reporta que estos aminoácidos tienen una reacción de regeneración en los tejidos de las
46
planta, acelerando las células totipotentes del tejido, y así favoreciendo a la formación de nuevos
brotes, sin dejar atrás el resto de componentes del medio MS.
Otra razón por la cual el MMc3 actuó de manera óptima, fue por las combinaciones de 6-BAP
que se usaron en el establecimiento (500 µ/L 6-BAP) y finalmente en la multiplicación (750 µ/L
6-BAP), ya que se manejaron concentraciones bajas. (Demenorval, 2011) Contempla que la
relación del regulador de crecimiento 6-BAP a bajas concentraciones es adecuada para estimular
significativamente los indicadores de la multiplicación y lo demás indicadores de desarrollo de
las plantas in vitro. El factor de multiplicación que se evidencio fue de 1 en 3.
47
7 CONCLUSIONES
- De acuerdo con los porcentajes obtenidos en el proceso de desinfección se llegó a
reportar que el tratamiento de desinfección con mejor eficiencia, fue el tratamiento número
2, el cual mostró un porcentaje de explantes prósperos del 91%, un porcentaje de explantes
oxidados del 0% y porcentaje de contaminación del 8%, permitiendo así, evidenciar un
protocolo de desinfección para meristemos apicales del cultivo de caña de azúcar, para
continuar con las siguientes etapas de propagación in vitro.
- El mejor tratamiento para la etapa de establecimiento de meristemos apicales de caña de
azúcar es el medio MEc2, el cual contaba con la hormona 6-BAP (500 µ/L) y AG3 (100
µ/L) que ayudaron al desarrollo de los brotes en un tiempo mínimo de 18 días.
- En la etapa de multiplicación el medio con mejor respuesta fue el MMc3, que tenía la
hormona 6-BAP (2000 µ/L), arginina (1500 µ/L) y glicina (750 µ/L), esta relación
respondió a los estímulos que necesitaba el explante para acelerar su desarrollo. Sin dejar
atrás el efecto del carbón activado (3,4g/L) que disminuyó la fenolización de los explantes
en esta etapa.
48
8 RECOMENDACIONES
1. Se recomienda trabajar con explantes en edades tempranas ya que sus células se
encuentran en mayor potencialidad, siendo capaces de adaptarse a las diferentes
condiciones que se generan en el cultivo in vitro.
2. El ácido cítrico es un antioxidante efectivo a la hora de cultivar meristemos apicales de
caña de azúcar, por tal motivo se recomienda usar el ácido cítrico en la etapa de
desinfección hasta el momento de su siembra.
3. El uso del carbón activado en etapa de multiplicación genera inhibición de oxidación del
explante y el medio de cultivo.
4. De acuerdo con esta investigación se recomienda seguir con proyectos encaminados al
cultivo in vitro de caña de azúcar, siguiendo con la etapa de Aclimatización del cultivo,
teniendo en cuenta que la variedad CCSP 89-43, cuenta con una característica especial y
es el alto contenido de azúcar que ayuda a la alta calidad de los productos.
49
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NTE+(Escallonia+myrtilloides+L.F)+EN+EL+LABORATORIO+DE+CULTIVOS+DE+TEJIDOS+DEL+JARD
%C3%8DN+BOT%C3%81
51
10. ANEXOS
ANEXO 1. Medios de cultivo para establecimiento de caña de azúcar.
COMPONENTES (MEc1) (MEc2) (MEc3)
CANTIDAD CANTIDAD CANTIDAD
Solución A 25 ml/L 25 ml/L 25 ml/L
Solución B 10 ml/L 10 ml/L 10 ml/L
Solución C 2,8 ml/L 2,8 ml/L 2,8 ml/L
Solución D 1 ml/L 1 ml/L 1 ml/L
Solución E 10 ml/L 10 ml/L 10 ml/L
Myoinositol 100 mg/L 100 mg/L 100 mg/L
Biotina 1800 µ/L 1800 µ/L 1800 µ/L
Tiamina 1000 µ/L 1000 µ/L 1000 µ/L
Ácido Cítrico 0,5 g/L 0,5 g/L 0,5 g/L
Ácido Ascórbico 1 g/L 1 g/L 1 g/L
Piridoxina 900 µ/L 900 µ/L 900 µ/L
Caseína Hidrolizada 1500 µ/L 1500 µ/L 1500 µ/L
Sacarosa 30 g/L 30 g/L 30 g/L
Glicina - - 200 µ/L
6-BAP 2000 µ/L 500 µ/L 1000 µ/L
AIA 1000 µ/L - -
AG3 - 100 µ/L -
2,4 D - - 1500 µ/L
Orthocide 0,08 g/L 0,08 g/L 0,08 g/L
Amoxicilina 0.012 g/L 0.012 g/L 0.012 g/L
Agar 7 g/L 7 g/L 7 g/L
52
ANEXO 2. Medios de cultivo para multiplicación de caña de azúcar.
COMPONENTES
(MMc1) (MMc2) (MMc3)
CANTIDAD CANTIDAD CANTIDAD
Solución A 25 ml/L 25 ml/L 25 ml/L
Solución B 10 ml/L 10 ml/L 10 ml/L
Solución C 2,8 ml/L 2,8 ml/L 2,8 ml/L
Solución D 1 ml/L 1 ml/L 1 ml/L
Solución E 10 ml/L 10 ml/L 10 ml/L
Myoinositol 100 mg/L 100 mg/L 100 mg/L
Biotina 1800 µ/L 1800 µ/L 1800 µ/L
Tiamina 1000 µ/L 1000 µ/L 1000 µ/L
Ácido Cítrico 0,5 g/L 0,5 g/L 0,5 g/L
Ácido Ascórbico 1 g/L 1 g/L 1 g/L
Piridoxina 900 µ/L 900 µ/L 900 µ/L
Caseína Hidrolizada 1500 µ/L 1500 µ/L 1500 µ/L
Sacarosa 30 g/L 30 g/L 30 g/L
Glicina 30 µ/L - 200 µ/L
Arginina 100 µ/L 1500 µ/L
Kinetina 1500 µ/L -
6-BAP 500 µ/L 600 µ/L 750 µ/L
AIA - 1500 µ/L -
AG3 - - -
2,4 D - - -
Carbón activado 3,4g/L
Orthocide 0,08 g/L 0,08 g/L 0,08 g/L
Amoxicilina 0.012 g/L 0.012 g/L 0.012 g/L
Agar 15 g/L 15 g/L 15 g/L
53
ANEXO 3. Análisis de Varianza de explantes contaminados en etapa de desinfección
ANEXO 4. Análisis de Varianza de explantes oxidados en etapa de desinfección
54
ANEXO 5. Análisis de Varianza de explantes prósperos en etapa de desinfección
ANEXO 6. Análisis de Varianza de número de brotes en etapa de establecimiento.
55
ANEXO 7. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc2
ANEXO 8. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc1
. ANEXO 9. Desarrollo de meristemo apical en el medio MEc3
56
ANEXO 10. Análisis de Varianza de explantes oxidados en etapa de Multiplicación.
ANEXO 11. Análisis de Varianza de la Longitud de las hojas en etapa de Multiplicación.
57
ANEXO 12. Análisis de Varianza de explantes multiplicados.
ANEXO 13. Caña De Azúcar a Nivel In Vitro.