cultivo in vitro de tejidos vegetales clase va

8/17/2019 Cultivo in Vitro de Tejidos Vegetales Clase Va

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CULTIVO IN VITRO DECÉLULAS Y TEJIDOS

VEGETALES


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INTRODUCCIÓN

• Es un método de propaa!"#nase$ua% – Se o&t"ene p%antas'

• Genét"!amente "dént"!as entre s( ) !onp%anta madre

• L"mp"as de pat#enos• A ran es!a%a

– S"r*e para'• +ropaa!"#n de *ar"edades é%"te• ,e-oram"ento "n *"tro•

Introdu!!"#n de enes .or/neos 0Inen"er(aGenét"!a


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INTRODUCCIÓN

• En 2ué !ons"ste' – Tomar una parte de %a p%anta 0e$p%ante1 – En !ond"!"ones asépt"!as

• Introdu!"r%a en re!"p"ente !on med"o de!u%t"*o

• Indu!"r &rota!"#n3 e%ona!"#n ) !re!"m"ento• Indu!"r enra"4am"ento• Adaptar a %as !ond"!"ones e$ternas• Trans.er"r a ma!etas en "n*ernadero• Trans.er"r a% *"*ero ) a% !ampo


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INTRODUCCIÓN

• En 2ué se &asa5 – En %a tot"poten!"a de %as !é%u%as

*eeta%es• Cada !é%u%a posee e% enoma !omp%eto• Capa!"dad de reenerar p%antas !omp%etas• So%o se re2u"ere reproramar %os enes

–

Cu/%es !é%u%as son tot"potentes5• Todas %as !é%u%as 2ue posean e% enoma!omp%eto

• Entre m/s -#*enes m/s ./!"% reproramarsus enes

• Cé%u%as mu) *"e-as o muertas p"erden

HORMONA

RECEPTOR

CAS

CADA

mRNA

PROTEINAS

FACTORTRANSCRIPCIÓN


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INTRODUCCIÓN

• Orden de tot"poten!"a%"dad – ,er"stemos

• Em&r"#n• Yemas ap"!a%es ) a$"%ares• +artes -#*enes de 6o-as3 pe!"o%os3 ta%%os3

ra(!es3 ped7n!u%os3 péta%os• +artes adu%tas• Cé%u%as muertas'

– Es!%erén2u"ma – Tu&os !r"&osos – Tr/2ueas ) tra2ue"das


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INTRODUCCIÓN

• Dos t"pos de e$p%antes' – ,er"stem/t"!o

• Em&r"ones3 )emas – 8/!"% propaar – No se re2u"ere "n!%u"r reu%adores de !re!"m"ento

en e% med"o de !u%t"*o3 por2ue posen un &a%an!e6ormona% end#eno ade!uado

– Est/n a!t"*ados %os enes de %a d"*"s"#n !e%u%ar

0m"tos"s1 – Est/n a!t"*ados %os enes de %a oranoénes"s


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INTRODUCCIÓN

• Dos t"pos de e$p%antes – D".eren!"ados o adu%tos

• Re2u"eren una .ase de desd".eren!"a!"#n

0!a%%o1 – Reprorama!"#n de enes – A!t"*a!"#n de enes de m"tos"s – A!t"*a!"#n de enes de mor.oénes"s


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INTRODUCCIÓN

• Cé%u%a mer"stem/t"!a *s9 Cé%u%aadu%ta – N7!%eo !entra% rande – Nu!%eo%o *o%um"noso – Re%a!"#n nu!%eop%/sm"!a e%e*ada – Va!uo%o redu!"da – Numerosas m"to!ondr"as – Ausen!"a de p%astos d".eren!"ados


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INTRODUCCIÓN

• D".eren!"a!"#n ) desd".eren!"a!"#nD".eren!"a!"#n

Desd".eren!"a!"#

:ormonas

Em&r"onar"as


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INTRODUCCIÓN• Ap%"!a!"ones'

– Cu%t"*o de sementos noda%es – Cu%t"*o de mer"stemos ; )emas ; %"mp"e4a de *"rus – Cu%t"*o de e$p%antos s"n )emas 0oranoénes"s1

• Var"a!"#n soma!%ona% – Em&r"oénes"s som/t"!a – Cu%t"*o de protop%astos – Cu%t"*o de !é%u%as en suspens"#n

– Cu%t"*o ) res!ate de em&r"ones – Cu%t"*o de anteras ) m"!roesporas – Cu%t"*o de sem"%%as de or2u(dea – +rodu!!"#n de meta&o%"tos se!undar"os

– Conser*a!"#n de ermop%asma "n *"tro


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Esta&%e!"m"ento de un %a&orator"o de!u%t"*o de te-"dos


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Disposición dellaboratorio

• A%e-ado de !am"nos de a%to tr/

A%e-ado de otros %a&orator"os de"nse!tos o m"!rooran"smos• A%e-ado de a%ma!enes de sem"%%as u

otro mater"a% *eeta%


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Cu"dados

• ,antener%o s"empre %"mp"o• No tener p%antas dentro de%

%a&orator"o – 8uente de /!aros ) otros !ontam"nantes

• Du!6arse ) !am&"arse de ropa antesde "nresar %ueo de 6a&er tra&a-adoen "n*ernadero ) !ampo


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=rea de prepara!"#n=rea de %a*ado ) ester"%"4a!"#n=rea de trans.eren!"a 0"no!u%a!"#n1=rea de "n!u&a!"#n=rea de o&ser*a!"#n ) E$amen=rea de o


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V A F

VA

F

VAF

VAF

Sala deincubación

Sala desiembra II

Sala desiembra I

Almacén

Sala delaad!"secad! #

es$erili%ad!

Sala de&re&araciónde medi!s

de cul$i! #$e'id!s

O(icina An$esala

)REAS DE *AS

+,E CONSTA ,N*A-ORATORIO

DE C,*TIVO DE

TE.IDOS


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• O


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Sala de lavado

1. Para lavar la cristalería en general2. También para el 1er. lavado con detergente

del material vegetativo.


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Debe haber el siguiente material! cristalería! gabinetes con puertas para la cristalería

! estu"a de secado por convecci#n! autoclave! agua caliente y "ría! destilador y desioni$ador de agua

! "regadero! instalaci#n eléctrica 11% y 22% &.

Sala de lavado


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Debe haber el siguiente material! gabinetes para los reactivos y materiales! cánulas para esterili$ar ca'as de Petri

! vehículo para transportar materiales y soluciones! agitadores magnéticos con calentamiento! relo' alarma de 12% min.! balan$a analítica

! potenci#metro! re"rigerador y congelador! instalaci#n de gas e instalaciones de vacío

S()( D* P+*P(+(,-/ D* 0*D- 0(T*+-() &*3*T(T-&


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*n esta sala se debe mantener asepsia má4ima5 se emplea cámaras de "lu'o laminar

utensillos estériles5cubrebocas5 gorras5 $apatos5 y

aire acondicionado y "iltradoestereomicroscopioinstalaci#n de gasinstrumentos de disecci#nlámpara de lu$ ultravioleta

S()( D* -/,6)(,-/ S-*07+(


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C)MARA DE F*,.O *AMINAR


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Area de s"em&ra

• &&&&


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OPERADOR


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SA*A DE SIEM-RA COMERCIA*


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)as di"erentes "ases de crecimiento de los in#culosnecesitan di"erentes "oto!períodos5 temperatura5intensidad lumínica5 etc.

Debe tener! aire acondicionado 22!289 ,! +egulador de "otoperíodo 1: lu$5 8 oscuridad

! anaqueles

SALA DE INCUBACIÓN

A d " & "#


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Area de "n!u&a!"#n )!re!"m"ento


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= d " & "# " "


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=rea de "n!u&a!"#n ) !re!"m"ento


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1. Para guardar reactivos y cristalería2. Debe haber ba'a humedad relativa y ba'a temperatura

ALMACÉN


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! regulaci#n de lu$5 tanto en intensidad como en"otoperíodo! regulaci#n de la temperatura! control de humedad

! pisos de concreto! e4clusi#n de insectos ;mosquiteros<! sistema de nebuli$aci#n

! "ertili$aci#n e irrigaci#n automática! me$cla de suelos estériles

INVERNADERO


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INVERNADERO

VIVERO


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VIVERO


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MEDIOS DE CULTIVO

• ,e4!%a de sa%es m"nera%es – ,a!ronutr"entes' N3 +3 >3 Ca3 ,3 S – ,"!ronutr"entes' Cu3 8e3 ,n3 Co3 C%3

•

8uente de !ar&ono 0ener(a1 – Sa!arosa – G%u!osa

• V"tam"nas• Reu%adores de !re!"m"ento• Aua• Otras sustan!"as


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MEDIOS DE CULTIVO

• O&-et"*o

– Crear !ond"!"ones nutr"!"ona%es3am&"enta%es 3 p: ) de osmo%ar"dad parae% !re!"m"ento de p%antas "n *"tro


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Medio de Cultivo Murashie ! S"oo #$%&'(STOC

) S*LES CO+CE+TR*CI,+

I+ICI*L -l

.inal /-lI N:?NO@ B9>NO@

II ,SO?9 :BO F9

,nSO?9 :

BO 9?

HnSO?9 :BO 9?@

CuSO?9 :BO 9FB

III CaC%B9 B:BO BB

>I 9?FCoC%B9:BO 9FB

IV >:B+O? 9

:@O@ 9@F

NaB,oO?9 B:BO 9FB

FF@

F9

99B

??9@

9BF9B

9BB9

@9@


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VIT*MI+*S0CO+CE+TR*CI,+ I+ICI*L 1 .I+*L

VIT*MI+*S C2 I+ICI*L

=!"do N"!ot(n"!o F ppm

+"r"do$"naK:C% F ppm

T"am"naK:C% F ppm

G%"!"na aa F ppm

mKInos"to% A%!o6o%a47!ar

F9 ppm

9

9

9F

B

F

C9 8"na%m%


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ME3CL* DE SUST*+CI*S 4OCODE.I+ID*S

E5tracto delevadura

Le!6e de !o!oE$tra!tos *eeta%es

:"dro%"4ado de !ase(na

+eptona ) tr"ptona


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Ant"o$"dantes ) Ant"&"#t"!os

=!"do as!#r&"!o o

*"tam"na C=!"do !(tr"!o

Carn a!t"*ado

Ant"&"#t"!os


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4RE4*R*CI,+ DE U+ LITRO DEM2S2

C$ 5 V$ 6 C' 5V'

C$0 7'28 -L 5 $999 / 67'2899 /-L

V$0 :

C'0 $&89 /-L

V'0 $999 /l

7'2999 /-L

VF M F mL $ Fm%


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4RE4*R*CI,+ DE U+ LITRO DE M2S2

S,LIDO

Sa!arosa

@ KKKKKKKKKKKKK F m%$ F m%

$ M @

Aar

KKKKKKKKKKKKKKK F m%$ F m%

$ M


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4RE4*R*CI,+ DE U+ LITRO DE M2S2

STOC

)

S*LES /l-L

I N:?NO@ B

>NO@

II ,SO?9 :BO F

,nSO?9 :BOHnSO?9 :BO

CuSO?9 :BO

III CaC%B9 B:BO F

>ICoC%B9:BO

IV >:B+O? F

:@O@

NaB,oO?9


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4RE4*R*CI,+ DE U+ LITRO DEM2S2

VIT*MI+*S /l-L=!"do N"!ot(n"!o '

+"r"do$"naK:C% '

T"am"naK:C% ' FG%"!"na' aa B

mKInos"to%' Aa%!o6o%a47!ar

F

Sa!arosa' A47!ar @

Aar

p: 9


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5. REGULADORES DE

CRECIMIENTO


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- !ompuestos or/n"!os- +rodu!"dos en %a p%anta o s"ntét"!amente- a!t7an en mu) pe2ueas !ant"dades

- In6"&en3 promue*en o mod"


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- son - Las !uatro pr"n!"pa%es .am"%"as son'K au$"nas K a&s!"s"nasK "&er"%"nas K otrosK !"to2u"n"nas

.itohor/onas0


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*u5inas ! citocininas

*UIN C"net"na M 0NK.ur.ur"%am"nopur"na1 :C% ) NaO:


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Au$"nas natura%es


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*u5inas sint>ticas


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AUPINAS' IAA3 IA3 NAA o B3?KD

,a)or !on!entra!"#n de au$"nas en #ranos -#*enes) en sem"%%as "nmaduras

IAA3 se produ!e en .orma natura% en p%antas Q 3F K FmL9

Las au$"nas s"ntét"!as ) m/s a!t"*as 0IA NAA ) B3?KD1 en Q 3FKF mL9Las au$"nas produ!en'K e%ona!"#n !e%u%ar

K e$pans"#n de %os te-"dosK d"*"s"#n !e%u%ar 0.orma!"#n de !a%%o1K .orma!"#n de ra(!es ad*ent"!"asK "n6"&"!"#n de %a .orma!"#n de */staos a$"%ares ) ad*ent"!"osK em&r"oénes"s en %os !u%t"*os en suspens"#n


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Acido 2,4-Diclorofenoxiacético' s"ntét"!o

K produ!e muta!"ones 0po!o uso1K "n6"&e .otos(ntes"s 07n"!amente1K po!as o!as"ones est"mu%a !re!"m"ento de

p%/ntu%as- en o!as"ones est"mu%a e% !re!"m"ento de %as

p%/ntu%as re!"én erm"nadasA!"do βK"ndo%a!ét"!o' se produ!e porderada!"#n en4"m/t"!a de prote(nas3pro*"ene de derada!"#n de am"no/!"dotr"pt#.ano9

C"to!"n"nas


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C"to!"n"nas


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Coto!"n"nas


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A!!"#n de %as !"to!"n"nas


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CITO?UI+I+*S0 0>"net"na3 A3 B"+ ) +A1

Se ut"%"4an para est"mu%ar e% !re!"m"ento ) e%desarro%%o9K est"mu%an %a d"*"s"#n !e%u%ar 0en presen!"a de

au$"na1

K en !on!entra!"ones e%e*adas 0FKF mL1pueden "ndu!"r %a .orma!"#n de */staosad*ent"!"os

K produ!en .rutos s"n sem"%%a ) s"n po%"n"4a!"#n

K retrasan e% en*e-e!"m"ento de %os #ranos*eeta%es9

K "n6"&e %a .orma!"#n de ra(!es

K promue*en %a .orma!"#n de */staos a$"%ares3


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a%an!es 6ormona%es

-A*ANCES HORMONA*ES


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A,/INAS CITO+,ININAS0A*TO1

0-A.O1

0A*TO10-A.O1

RA2CES

EM-RIONES

CA**OS

3EMASADVENTICIAS

-A*ANCES HORMONA*ES


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G"&ere%"nas


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@I=ERILI+*S0 #@*A(

In"!"a%mente a"s%adas de% 6ono giberella fujikuroi9Lueo se en!ontr# 2ue todas %as p%antas produ!enesta


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OTROS COM4UESTOS222

*CIDO *=SCBSICO0 *=*

K +rodu!e e.e!to neat"*o en %os !u%t"*os in vitroETILE+O0K Inu)e en %a em&r"oénes"s ) .orma!"#n de #ranos de %as

"mnospermas9

K A%unas *e!es e% !re!"m"ento in vitro puede serest"mu%ado por %apresen!"a de et"%eno9Es a%tamente produ!"do en !ond"!"ones mu) 6ermét"!as3en re!"p"entes de p%/st"!o3 en e% ameo9

K +OLIA,INASK 8ENILUREAK A,INO=CIDOS


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OTROS COM4UESTOS222Carbón activado0#CO+C2 9' A 4-V(

Se produ!e por %a !ar&on"4a!"#n de %a madera A&sor&e p"mentos t#$"!os3 marrones3 neros3 ) en

!u%t"*o de p%/tanoK A&sor&e otros !ompuestos or/n"!os 0au$"nas3

!"to"n"nas1K E% !%"ma %um"noso de% !u%t"*o !am&"a 0se o&s!ure!e1 )

.orma ra(!es9K +romue*e %a em&r"oénes"s som/t"!a ) %a

em&r"oénes"s en !u%t"*o de anterasK E.e!to est"mu%ador de% !re!"m"ento ) %a oranoénes"s

de %as espe!"es %eosas9K Esta&"%"4a e% p:

K A)uda a e*"tar %a o$"da!"#n


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ESTERILIHACIÓN


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ESTERILIHACIÓN

• E% é$"to de% !u%t"*o de te-"dosdepende de %a !apa!"dad demantener e% med"o %"&re de

m"!rooran"smos – Comp"ten por nutr"entes !on %as !é%u%as

*eeta%es•

Cre!en m/s r/p"do e "n*aden e% med"o – Se!retan sustan!"as t#$"!as 2ue matan

a% e$p%ante


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4RI+CI4*LES .UE+TES DECO+T*MI+*CI,+=rea de tra&a-o

Instrumentos

E$ter"or de %os re!"p"entesde !u%t"*o

,ater"a% *eeta%

In*est"ador


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Ester"%"4a!"#n

• Des"n.e!!"#n de e$p%antes• Ester"%"4a!"#n de med"os de !u%t"*o )

so%u!"ones• Ester"%"4a!"#n de mater"a% de *"dr"o )

6erram"entas• Ester"%"4a!"#n de pape%3 a%od#n3 et!


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Des"n.e!!"#n de e$p%antes

• A!onse-a&%e "n"!"ar !on p%antas!re!"das "n *"tro3 por tanto %"&res de!ontam"nantes

• De esto no ser pos"&%e' – In"!"ar !on mater"a% *eeta% !re!"do en

am&"entes !ontro%ados' "n*ernadero o

%a&orator"o – Des"n.e!tar%os antes de "ntrodu!"r%os "n

*"tro

• Nun!a'–


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• :"po!%or"to de !a%!"o 0KF por K@m"nutos1

• :"po!%or"to de sod"o 09 ; por K@

m"nutos1• In!%u"r en %a so%u!"#n des"n.e!tante

aentes 6ume!tantes 0etano% '3

unas otas de teen B1 u otrosdeterentes ; tens"#n super


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• S" a pesar de %a des"n.e!!"#n3 %ueode *ar"os d(as apare!en!ontam"nantes

• Es pro&a&%e 2ue %os m"!rooran"smosestén en e% "nter"or de% e$p%ante

• In!%u"r .un"st/t"!os o

&a!ter"ost/t"!os en e% med"o de!u%t"*o – e-9 su%.ato de entam"n!"na3 pen"!"%"na3

su%.ato de estreptom"!"na3 FK m


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• E% o&-et"*o de% pro!eso de des"n.e!!"#n es o&tener – E% m/$"mo de ester"%"dad 3 )3 – E% m/$"mo de so&re*"*en!"a de% te-"do *eeta%

• Ensa)ar para determ"nar e% me-or pro!ed"m"ento a

seu"r para !ada t"po de e$p%ante• Re!ordar 2ue %os te-"dos m/s e$puestos a %as

so%u!"ones des"n.e!tantes son a.e!tados en ma)oro menor med"da depend"endo de %a !on!entra!"#n

de %a so%u!"#n ) de% t"empo de e$pos"!"#n• e%"m"nar !on e% &"stur( estas 4onas a.e!tadas antes

de "n!%u"r %os e$p%antes en e% med"o de !u%t"*o

ESTERILIHACIÓN DE


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ESTERILIHACIÓN DESOLUCIONES

• AUTOCLAVEADO ; Ca%or 67medo ; *apor aua – +res"#n F ps" o BKB9B atm#s.eras – Temperatura FBFW C 0mueren esporas1Vo%umen m%T"empo m"n

B B BFBB@F@F ?


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Sustan!"as sens"&%es a% !a%or

• Los a47!ares pueden !arame%"4arse ;"n6"&en e% !re!"m"ento de% e$p%ante

• AG@ p"erde de a!t"*"dad• p: se redu!e• V"tam"nas ; e$!epto p"r"do$"na )

t"am"na• Ant"&"#t"!os•


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Control preventivode la conta/inación /icrobiana

Te-"dos 0e$p%antes1

8un"st/t"!os ) &a!ter"ost/t"!os de amp%"oespe!tro

Su%.ato de entam"!"na+en"!"%"naSu%.ato de estreptom"!"na

F a mL@ a ? oC


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P*ANTA


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EsteriliFación 6 *s>ptico

,étodos8(s"!os ) 2u(m"!os

A$én"!o

+repara!"ones %"&res de *"rus*"ro"des o m"!op%asmas


74/78

4reparación del e5plante

NaOC%F a% @ erm"!"da ) aenteo$"dante

A%!o6o% a% durante @ a seundos

"!%oruro de mer!ur"o :C%B

9F a F9 0p*1@ a ? m"nutos

ó


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4rocedi/ientos de esteriliFación

Ca%or se!o 0estu.a1F oC durante BK@ 6oras

Vapor &a-o pres"#n 0auto!%a*e1

man#metro

Ca%or 67medo a F oC

8"%tra!"#n


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*UTOCL*VES

ESTU


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ESTU.*


78/78

I+CU=*DOR*

cultivo in vitro de tejidos vegetales clase va

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