clase 1 - cultivo in vitro de vegetales 2008

8/8/2019 Clase 1 - Cultivo in vitro de vegetales 2008

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Curso de Micropropagacin y

Proyectos de Produccin2008

Universidad de la Repblica Facultad de Agronoma

rea de Biologa Vegetal Laboratorio de Biotecnologa

Docentes:

Ing. Agr. Silvia Ross M.Sc.

Ing. Agr. Mnica Krause

Ing. Agr. Gabriela Pagliano M.Sc.


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OObjetivos generales

Se espera que el participante logre:

1. Adquirir los conocimientos tericos que fundamentan eluso del cultivo in vitro en la produccin vegetal.

2. Desarrollar la capacidad de observacin, anlisis y

discusin mediante la confrontacin terico-prctica.

3. Conocer las diferentes tcnicas de cultivo in vitro y suaplicacin a la resolucin de problemas productivos.


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Objetivos Especficos

1. Conocer los fundamentos tericos de la propagacin vegetativay los principios biolgicos bsicos que fundamentan el uso delcultivo in vitro en la produccin vegetal.

2. Realizar las operaciones bsicas de laboratorio que permitan elestablecimiento de cultivos in vitro.

3. Analizar metodologas de micropropagacin en diferentescultivos (hortcolas, frutales, forestales, ornamentales).


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Unidades Temticas

1. Introduccin al cultivo in vitro de tejidos vegetales. Resea histrica, principales

aplicaciones de las tcnicas de cultivo in vitro, asepsia-esterilizacin,composicin y preparacin de medios.

2. Morfognesis in vitro. Posibles vas morfognicas y factores que la controlan.Organognesis y embriognesis somtica.

3. Micropropagacin como alternativa a la propagacin vegetativa convencional en laproduccin frutcola, hortcola, forestal y ornamental. Etapas del proceso demicropropagacin. Principales problemticas asociadas. Sistemas de cultivo enmedios lquidos, empleo de bioreactores.

4. Obtencin de material de sanidad controlada en especies propagadas en formavegetativa. Cultivo de meristemas. Programa de Certificacin. Microinjerto enCitrus para la creacin de un banco de yemas saneadas. Mtodos de indexaje ycontrol del material saneado.

5. Anlisis de factibilidad de proyectos empresariales y anlisis de costos de lamicropropagacin.


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Metodologa

1. Clases terico-prctico (8 clases semanales de 3hs. de duracin)(24hs).

2. Seminarios(3 clases de 2hs. de duracin y 6hs. Presenciales y 6hs de

trabajo grupal). Los estudiantes presentarn y discutirn un artculo cientficoentregado con anticipacin por la ctedra sobre uno de los temas tratados.(12hs.)

Visitas a Laboratorios de cultivo in vitro: Unidad de Biotecnologa INIA, Las Brujas yEmpresa Sta. Rosa (2 excursiones de 6 hs cada una). (12 hs.) Posible visita aBiosur.

3. Sistema de evaluacin

El curso se evaluar con la presentacin del seminario (40%) y una prueba escrita(60%) y se requiere un 60% de los puntos para su aprobacin.

El exmen se exonera con el 80% de los puntos.


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Laboratorio de Biotecnologa

Antecedentes del Grupo de Investigacin en Especies ForestalesProyectos ejecutados

Contribucin de asociaciones ectomicorrticas en rbolesforestales de importancia econmica en Uruguay (19951997).Financiado por IFS (International Foundation for Science).

Estudios sobre la embriognesis somtica de Eucalyptusgrandis (Hill) Maiden (19951997). Financiado por CSIC (ComisinSectorial de Investigacin Cientfica).

Micropropagacin de rboles adultos de Eucalyptus grandis(Hill) Maiden (1992 1994). Financiado por INIA Facultad de Agronoma.

Estudio sobre las tcnicas de conservacin de germoplasmaen Eucalyptus grandis (Hill) Maiden (19971999). Financiado porCSIC.

Estudio del comportamiento in vitro de especies deLaurceas nativas de inters maderero. Financiado por CSIC.

Obtencin y validacin de la sonda del viroide del Peach

Latent Mosaic del duraznero. Convenio Fac. Agronoma-INIA. Financiado porFac.Agr.-INIA (2004)


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Laboratorio de Biotecnologa

Antecedentes del Grupo de Investigacin- CITRUSProyectos ejecutados

Desarrollo de biotecnologas de diagnstico de virus yviroides patgenos de ctricos. Financiado por BID-CONICYT.Instituciones participantes: Divisin Biologa Molecular IIBCE, Laboratorio deBiotecnologa Facultad de Agronoma y Servicios de Proteccin Agrcola MGAP.(1995-1999).

Saneamiento de virus y viroides de germoplasma de citrus deMILAGRO S.A. Financiado por MILAGRO S.A.

Desarrollo de un kit de diagnstico rpido para la deteccinde viroides de citrus en el Uruguay. Financiado por INIA (2000 2002).

Mtodos moleculares de diagnstico de viroides para suaplicacin en cuarentena y produccin vegetal. Financiacin: FondoClemente Estable. (2000-2002).


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Produccin de plantas de ctricos resistentes a Psorosis yTristeza mediante silenciamiento gnico. Financiacin :CSIC (2002-

2004).Obtencin de las construcciones de Psorosis y Tristeza parala obtencin de portainjertos de citrus silenciados. Tesis deMaestra Lic.Juan Pablo Gallino.

Obtencin y validacin de la sonda de los virus de Psorosis yTristeza para su diagnstico. Tesis de grado de Rosana Michelazzo. (2006)

Obtencin de un kit de diagnstico para todos los viroidespresentes en las plantaciones citrcolas de Uruguay. Financiadopor PDT. Tesis de Maestra de Carolina Palav.

Obtencin de un kit de diagnstico para todos los viroidescuarentenarios en las plantaciones citrcolas de Uruguay.Financiado por PDT. Tesis de Maestra de Lic.Rodolfo Umaa.


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Estudio preliminar de caracterizacin de la diversidadgentica y comportamiento in vitro deAcca sellowiana (Berg)

Burret. Financiado por CSIC (2004-2006)Validacin de la sonda del viroide del tubrculo ahusado de la

papa para su deteccin en anlisis masivos. Convenio Facultad deAgronoma-MGAP. Financiado por MGAP (2004-2006) Tesis de grado de Carolina Palav.

Evaluacin de sistemas avanzados de cultivo in vitro parapropagacin clonal de especies leosas y semileosas deinters productivo. Tesis de Maestra de la Ing.Agr. Silvia Ross.


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Unidad I

Micropropagacin y Proyectos deproduccin

Cultivo in vitro de vegetales


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Principales Aplicaciones de la Biotecnologa

Resolucin de problemas productivos

Estudio de procesos fisiolgicos y bioqumicos.

-Ingeniera gentica en plantas y animales.

-Produccin de inoculantes para leguminosas.

-Fermentaciones microbianas.

-Produccin de reactivos de diagnstico de enfermedadesde plantas y animales.

-Conservacin de germoplasma.

-Fertilizacin in vitro-Transplante de embriones.

-Produccin de hormonas.

-Produccin de enzimas para la industria lctea.


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Historia del cultivo de tejidos


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Unidad II

Organizacin, funcionamiento yequipos del laboratorio.

Equipos

Asepsia y Esterilizacin


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Organizacin y

Funcionamiento delLaboratorio

1- rea de oficinas

2- rea de observacin yexamen.

3- rea de preparacin demedios de cultivos.

4- rea de lavado yesterilizacin.

3- Almacn.

4- rea de incubacin o decrecimiento in vivo.

7- rea de flujos laminares ode transferencia.


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1- rea depreparacin

Material devidrio e

instrumentos


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Balanza de precisin


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Productos qumicos, mscara y guantes


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Agitador Magntico y Shaker


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2-rea de lavado y esterilizacin


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3- rea de transferencia


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Cmara de flujo laminar horizontal


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Instrumentos,

materiales y equiposen el rea detransferencia.


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4- rea de incubacin


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E t bl i i t di i d i i t d l l


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Establecimiento y condiciones de crecimiento del elcultivo in vitro

Para tener xito en los cultivos in vitro es necesario:

1- ASEPSIA Y ESTERILIZACIN

2- ELECCIN DE LOS EXPLANTES

3- ELECCIN DEL MEDIO DE CULTIVO

4- BUENAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO

1- Asepsia:- Ausencia de microorganismos patgenos

- Es una condicin esencial en el xito del cultivo in vitro

Para trabajar con cultivos aspticos es necesario:-Trabajar en ambientes adecuados.

- Esterilizacin de instrumentos y medios de cultivo

- Esterilizacin de recipientes de cultivo

- Precaucin del operario


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ESTERILIZACIN

Proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficiese libera de cualquier microorganismo vivo o espora.

Procedimientos de esterilizacin

1- Calor seco (170C 2 o 3 horas)

2- Vapor bajo presin.- 121C, 20 minutos.- Sacarosa Glucosa + Fructosa- Cambio de pH baja 0,3 a 0,5 unidades

- Caramelizacin de los azcares (160C) y formacin decompuestos txicos.- Precipitacin de sales.- Depolimerizacin del agar.

3- Calor hmedo a 100C.

4- Filtracin


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2- Preparar y desinfectar los explantosPreparacin de los explantos agua,fertilizacin,etiolacin,

sanidad,pulverizaciones peridicas)

Desinfeccin de los explantes (etanol 70%,hipoclorito de sodio 1-3%,hipoclorito de calcio 6 a 12 %,cloruro de mercurio 0,1 a 1,5 %).

3-Eleccin del medio de cultivoComposicin qumica: agua, sales minerales, vitaminas, agar, carbohidratos,aminocidos, reguladores de crecimiento y otros.

El xito de la utilizacin de un medio es lograr las concentraciones lo ms cercanas al ptimo

de las clulas o plantas para su crecimiento y diferenciacin.

4- Buenas condiciones de crecimientoPara tener xito en los cultivos in vitro es necesario:

cmara de crecimiento (temperatura , luz y humedad).

Temperatura


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Temperatura

1- constante 25, rango 17-32C.

clima tropicales algodn, arroz ,citrus 28C

clima templado 22C

especies bulbosas 18C

2- diferencias de temperatura de la cmara y recipientes3- Problemas: altas y bajas temp. disminuye el crecimiento

4- tratamientos de frio - bulbillos- dormancia 1-10C.- plantas leosas-dormancia GA3 o fro 2-4C

Luz

Requerimientos in vitro

Fotoperiodo 16hrs luz/8hrs oscuridadtubos fluorescentes 1000-5000lux (luz blanca fra)


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HUMEDAD RELATIVA

Cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa

Tapado y tipo de los recipientes

Importancia: desecacin e infecciones

Tapones: aluminio, rollo pack, plstico, algodn.

Tener en cuenta: intercambio gaseoso, humedad en el recipiente, pasaje de luz


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4- rea de incubacin


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