cultivo de tejidos vegetales i unidad 2. medios de cultivo

Universidad Abierta y a Distancia de México 0

Cultivo de tejidos vegetales I Unidad 2. Medios de cultivo

Cultivo de tejidos vegetales I

Medios de cultivo U2

Programa de la asignatura:


U2 Cultivo de tejidos vegetales I Medios de cultivo

Índice

Presentación de la unidad ......................................................................................................... 2

Propósitos de la unidad ............................................................................................................. 2

Competencia específica ............................................................................................................ 3

2.1. Reseña histórica del cultivo de tejidos vegetales............................................................... 3

2.1.1. Los primeros años ........................................................................................................... 4

2.1.2. La era de desarrollos técnicos ........................................................................................ 5

2.1.3. El pasado reciente y la era presente ............................................................................... 8

2.2. Medio de cultivo (Beyl CA, 2005) ..................................................................................... 10

2.2.1. Ingredientes (Beyl CA, 2005) ........................................................................................ 13

2.2.2. Preparación ................................................................................................................... 20

2.3. Reguladores de crecimiento vegetal (Gaba, VP, 2005) ................................................... 24

2.3.1. Auxinas .......................................................................................................................... 25

2.3.2. Citocininas ..................................................................................................................... 27

2.3.3. Giberelinas .................................................................................................................... 29

2.3.4. Ácido abscísico ............................................................................................................. 30

2.3.5. Etileno ............................................................................................................................ 31

Actividades .............................................................................................................................. 31

Autorreflexiones....................................................................................................................... 31

Cierre de la unidad .................................................................................................................. 32

Para saber más ....................................................................................................................... 32

Fuentes de consulta ................................................................................................................ 33

ANEXO .................................................................................................................................... 34



Presentación de la unidad

Después de una inmersión a conceptos variados, al

descubrimiento de la anatomía de la planta y a los

componentes de una célula, en esta unidad se busca

descubrir cómo el Cultivo de tejidos vegetales fue

construyéndose hasta el día de hoy.

El primer cultivo de tejidos de plantas exitoso, fue desarrollado

por Gottlieb Haberlandt, en el inicio del siglo XX; a partir de

ese momento, el desarrollo del conocimiento en este campo

implicó entre muchas otras cosas la elaboración de medios de

cultivo y el descubrimiento de reguladores de crecimiento,

puntos que también se abordarán en esta unidad.

Propósitos de la unidad

• Analizar el contexto histórico del cultivo de tejidos vegetales.

• Comparar los diferentes medios de cultivo empleados en cultivo in vitro.

• Analizar las necesidades de reguladores de crecimiento en el

establecimiento de un cultivo in vitro en relación a su destino final.

Figura 1. Gottlieb Haberlandt en 1903. Tomado de: Laimer M. y Rücker W., 2003



Competencia específica

Clasificar los diferentes tipos de medios de cultivos y reguladores de crecimiento, para su empleo en el cultivo de tejidos vegetales con el fin de establecer un cultivo in vitro en laboratorio, considerando el destino final del cultivo.

2.1. Reseña histórica del cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de células y tejidos, también referido como cultivo in vitro, axénico o estéril, es

una herramienta importante, ya sea en estudios básicos o en aplicaciones comerciales.

Quizás el paso más temprano hacia el cultivo de tejidos de plantas fue hecho por Henri-

Louis Duhumel du Monceau en 1756, quien, durante sus estudios pioneros sobre la

cicatrización de plantas, observó la formación de callos (Gautheret, 1985).

Estudios extensivos por medio del microscopio, condujeron al desarrollo independiente y

casi simultáneo a la teoría celular de Schleiden y Schwann (1839). Esta teoría sostiene

que la célula es la unidad de estructura y función en un organismo, y por lo tanto es capaz

de autonomía. Esta idea se puso a prueba por varios investigadores, pero el trabajo de

Vöchting (1878) sobre la formación de callos y sobre los límites a la divisibilidad de

segmentos de plantas fue quizás el más importante. Mostró que la parte superior de un

segmento de tallo, siempre produce yemas o brotes y la parte inferior, callos o raíces,

independientemente del tamaño, hasta alcanzar un segmento muy delgado. También

demostró el desarrollo polar y reconoció que era una función de las células y su ubicación

con relación a los extremos cortados.

Las bases teóricas para el cultivo de tejidos de plantas fueron propuestas por Gottlieb

Haberlandt en la Academia Alemana de Ciencias en 1902 sobre sus experimentos

relativos al cultivo de células individuales. Él opinó lo siguiente: “[a] mi conocimiento, no



se han hecho intentos organizados de manera sistemática al cultivo de células vegetativas

aisladas de plantas superiores. Sin embargo, los resultados de tales experimentos de

cultivos deben dar una idea interesante para las propiedades y potencialidades que posee

la célula como un organismo elemental” (Haberlandt, 1902). Él experimentó sin éxito, con

células aisladas de hojas y otras células funcionalmente diferenciadas, aun así, predijo

que “se podría cultivar con éxito embriones artificiales a partir de células vegetativas”. Así

estableció claramente el concepto de totipotencia e indicó además que “la técnica de

cultivos de células vegetales aisladas en solución nutritiva permite la investigación de los

problemas importantes a partir de un nuevo enfoque experimental”. Sobre la base de

1902 y su experimentación pionera antes y después, Haberlandt se reconoce

justificadamente como el padre del cultivo de tejidos de plantas. Mayores detalles sobre

los primeros eventos pioneros en el cultivo de tejidos vegetales se pueden observar con

los trabajos de White (1963), Bhojwani y Razdan (1983) y Gautheret (1985).

2.1.1. Los primeros años

Usando un enfoque diferente, Kotte (1922) (un estudiante de Haberlandt y Robins), logró

cultivar ápices de raíces aisladas. Este enfoque del uso de explantes con células

meristemáticas condujo al cultivo exitoso e indefinido de ápices de raíces de tomate por

White (1934). Estudios posteriores permitieron para el cultivo de raíces un medio definido

completo. Tales cultivos de raíces fueron usados inicialmente para estudios virales y más

Figura 2. Línea de tiempo del cultivo de tejidos vegetales Tomado de: Elaboración propia



tarde como una herramienta importante para los estudios fisiológicos (Street, 1969). El

éxito también se logró con el cultivo de yemas por Loo (1945) y Ball (1946).

El cultivo de embriones tuvo también su inicio a principios del siglo XX, cuando Hanning

en 1904, cultivó satisfactoriamente embriones de crucíferas y Brown en 1906 embriones

de cebada. Esto fue seguido por el exitoso rescate de embriones a partir de semillas no

viables de una cruza entre Linum perenne X L. austriacum (Laibach, 1929). Tukey (1934)

fue capaz de permitir el desarrollo de un embrión completo de algunas especies de

maduración temprana de árboles frutales, proporcionando de este modo una de las

primeras aplicaciones del cultivo in vitro.

Los primeros y verdaderos cultivos de tejidos vegetales se obtuvieron por Gautheret

(1934, 1935) a partir del tejido del cambium de Hacer pseudoplatanus. También tuvo éxito

con explantes similares de Ulmus campestre, Robina pseudoacacia y Salix caprea,

usando el medio de la solución de Knop con agar solidificado, glucosa y clorhidrato de

cisteína (cisteína-HCl). Posteriormente, la viabilidad de uso del ácido indol-acético y el

suplemento de vitaminas del grupo B permitieron que los tejidos pudieran estar en

crecimiento continuo e incluso lograr diferenciar raíces y brotes, esto fue reconocido en

las demostraciones casi simultaneas de Gautheret y Nobécourt (1939) con tejidos de raíz

de zanahorias y de White (1939) con tejido tumoral de un híbrido entre Nicotiana glauca X

N. langsdorffii, el cual no requirió de la auxina. Todos los explantes iniciales utilizados por

estos pioneros incluyeron el tejido meristemático. Estos resultados sientan las bases para

el aumento dramático en el uso de los cultivos in vitro en las décadas posteriores.

2.1.2. La era de desarrollos técnicos

Las décadas de 1940, 1950 y 1960 proveyeron de tiempos exitosos para el desarrollo de

nuevas técnicas y para el mejoramiento de aquellas ya disponibles. La aplicación del agua

de coco (frecuentemente referidas como leche de coco) por Van Overbeek et al. (1941)

permitieron el cultivo de embriones jóvenes y otros tejidos recalcitrantes, incluyendo de

monocotiledóneas. De igual forma el establecimiento de cultivos de callos de varias

especies, incluyendo de dicotiledóneas leñosas y herbáceas, de gimnospermas tales

como tejidos de “agalla de la corona” (tumor en plantas causado por Agrobacterium

tumefasiens). También en este mismo periodo de tiempo, fue reconocido que las células

en cultivo experimentan varios cambios, incluyendo pérdida de sensibilidad o habituación

al aplicar auxinas (Gautheret, 1942, 1955), así como la variabilidad de meristemos

formados de callos (Gautheret, 1955; Nobécourt, 1955). Sin embargo, fue durante este

periodo, que la mayoría de las técnicas in vitro empleadas en la actualidad se desarrollan

en gran medida.



Estudios por Skoog y sus asociados mostraron que la adición de adenina y altos niveles

de fosfato permitieron que tejidos de médula (pith) no meristemática fueran cultivados

produciendo brotes y raíces, pero solo en la presencia de tejido vascular (Skoog y Tsui,

1948). Estudios posteriores usando ácidos nucleícos permitieron descubrir la primera

citocinina (cinetina) como el producto de degradación del DNA de esperma de arenque

(Miller et al., 1955). La disponibilidad de cinetina, incrementó posteriormente el número de

especies que pueden ser cultivadas indefinidamente, pero quizás lo más importante, es

que permitió reconocer el balance exógeno de auxinas y citocininas en el medio influye el

destino morfogenético de callos de tabaco (Skoog y Miller, 1957). Un alto nivel relativo de

auxina/cinetina, favorecen el enraizamiento, a la inversa, conducen a la formación de

brotes, y los niveles intermedios a la proliferación de callos. Este modelo morfogénico ha

sido adecuado para operar en numerosas especies. Citocininas nativas fueron

descubiertas subsecuentemente en varios tejidos, incluyendo en el agua de coco

(Letham, 1974). Además, se reportaron independientemente por Reinert, (1958, 1959) y

Steward et al. (1958) la formación de yemas de brotes unipolares y raíces, la formación de

embriones bipolares somáticos (zanahoria).

El cultivo de células individuales (y pequeños agregados celulares) fue obtenido mediante

agitación de cultivo de callos de Tagetes erecta y tabaco, colocados subsecuentemente

sobre papel filtro, permaneciendo en él los callos bien establecidos, dando así origen al

llamado cultivo madre (Muir et al. 1954, 1958). Posteriormente, las células individuales

pueden ser crecidas en medio líquido, en los cuales los tejidos pueden ser crecidos.

Bergmann (1959) incorporó células individuales en una capa de 1 mm de medio sólido

donde fueron formadas algunas colonias. Esta técnica es ampliamente usada para clonar

células y en cultivo de protoplastos. El primer cultivo a gran escala de células de plantas

fue reportado por Tulecke y Nickell (1959), quien hizo crecer células en suspensión de

Ginkgo, Holly (Ilex), Lolium y rosas en simples garrafones de 20 litros.

Vasil y Hildebrandt (1965), utilizando agua de coco como un aditivo al medio fresco

finalmente realizaron el sueño de Haberlandt de producir una planta completa (tabaco) a

partir de una célula individual, demostrando así la totipotencia de las células de plantas.

Los primeros medios nutritivos usados para el crecimiento de tejidos de plantas in vitro

fueron basados en la formulación de nutrientes para plantas completas. Las soluciones de

Knop y la de Uspenski y Uspenskia fueron muy usadas proveyendo al menos 200 mg/l de

las sales totales. Heller (1953), basado en estudios sobre zanahorias y en tejidos de

enredadera de Virginia, incrementó la concentración de sales dos veces, y Nitsh y Nitsh

(1956) incrementaron posteriormente la concentración de sales a 4 g/l, basados en sus

trabajos con la alcachofa de Jerusalén. Sin embargo, estos cambios no proporcionaron el

crecimiento óptimo para tejidos, siendo requeridos frecuentemente complementos, tales

como el extracto de levadura, la proteína hidrolizada y el agua de coco. En diferentes

aproximaciones basadas en el estudio de la ceniza de los callos de tabaco, Murashige y

Skoog (1962) desarrollaron un nuevo medio. Las concentraciones de algunas sales fueron



25 veces más que las de la solución de Knop. En particular el nivel de NO3- y NH4

+ fueron

muy altos y el arreglo de micronutrientes se incrementó. Esta formulación permitió un

incremento en el número de especies de plantas cultivadas, muchas de ellas empleando

solo un medio definido consistiendo de macro y micro nutrientes, una fuente de carbono,

nitrógeno reducido, vitaminas del grupo B y reguladores de crecimiento.

Ball en 1946, produjo con éxito plántulas por cultivo de extremos de brotes, pero la

importancia de esta conclusión no fue reconocida sino hasta que Morel (1960), usando

esta aproximación obtuvo orquídeas libres de virus, realizando una potencial propagación

clonal. Este potencial fue rápidamente explotado, particularmente con ornamentales. Los

primeros estudios de White (1934) mostraron que el cultivo de los extremos de raíz (cofia)

era libre de virus. Posteriormente Limmaset y Cornuet (1949) observaron que la

concentración de virus en los brotes era muy lenta. Esto fue confirmado cuando plantas

libres de virus de Dhalia se obtuvieron a partir de plantas infectadas al cultivar extremos

de brotes (Morel y Martin, 1952). La eliminación de virus fue posible ya que el tejido

vascular, en el que el virus se encuentra, no se extiende a los ápices de brotes o raíces.

El método fue posteriormente refinado por Quack (1961) y es ahora usado rutinariamente.

Las técnicas para el cultivo in vitro de partes florales y semillas fueron desarrolladas

durante este periodo. El primer intento de un cultivo de ovarios fue realizado por LaRue,

C.D. (1942), quien obtuvo un crecimiento limitado de ovarios acompañados por enraizado

de pedicelos en muchas especies. Comparados a estudios con embriones, el éxito del

cultivo de óvulos fue muy limitado.

En la polinización y fertilización in vitro fueron pioneros Kanta, K. et al. (1962) usando

Papaver somniferum. La propuesta involucró el cultivo de óvulos extirpados y granos de

polen en el mismo medio, empleándose para producir híbridos inter-genéricos e inter-

específicos. Años antes, Tuleke (1953) obtuvo colonias de células en cultivo a partir de

granos de polen de Ginkgo, y Yamada et al. (1963) obtuvieron callos haploides a partir de

anteras de Tradescantia reflexa. Sin embargo, fue hasta los resultados de Guha y

Maheshwari (1964, 1966) que las plantas aploides pudieron ser obtenidos de cultivos de

anteras de Datura innoxia, abriendo una nueva era a la androgénesis. Plantas haploides

de tabaco fueron obtenidas por Bourgin y Nitsh (1967), conformando de esa manera la

totipotencia de los granos de polen.

Los protoplastos, o células de plantas sin sus paredes celulares, fueron aisladas primero

de manera mecánica a partir de tejidos plasmolizados hace más de 100 años por Klercker

en 1892, y la primera fusión fue lograda por Küster en 1909. Sin embargo, esta tecnología

permaneció sin explotar hasta el uso de celulasa fungal por Cocking (1960),

acomodándose a esta nueva era. En la década de 1970, la disponibilidad comercial de

enzimas degradadoras de pared celular, permitieron su amplio uso y el desarrollo de la

tecnología de protoplastos. La primera demostración de totipotencia de protoplastos fue

realizada por Takebe et al. (1971), quien obtuvo plantas de tabaco a partir de protoplastos



mesofílicos. Esto fue seguido por la generación de la primera planta hibrida inter-

específica (Nicotiana glauca X Nicotiana langsdorffii) realizada por Carlson et al. (1972).

Braun (1941) mostró que en el girasol Agrobacterium tumefaciens puede inducir tumores,

no solo en sitios inoculados, pero también a puntos distantes. Estos tumores secundarios

se encontraron libres de la bacteria y estas células pueden ser cultivadas sin auxinas

(Braun y White, 1943). Otros experimentos mostraron que tejidos de “agalla de la corona”,

libres de bacterias, contenían un principio activo inductor de tumores (PIT), el cual fue

probablemente una macromolécula (Braum 1950). La naturaleza del PIT, fue elaborada

en la década de 1970 (Zaenen et al. 1974), pero el trabajo de Braum sirvió de base para

las transformaciones basada en Agrobacterium. Hay que señalar que el hallazgo de

Ledoux (1965) en donde células de plantas podían tomar e integrar DNA, permaneció en

polémica por un tiempo mayor a esa década.

2.1.3. El pasado reciente y la era presente

Basándonos en la disponibilidad de las diferentes técnicas in vitro discutidas en los

párrafos anteriores, no es de sorprender, que lo que se inició en la década de 1960,

originó un incremento en las aplicaciones a los varios problemas en biología básica,

agricultura, horticultura y forestería a través de las décadas de 1970 y 1980. Estas

aplicaciones pueden ser divididas convenientemente en cinco grandes áreas:

a) comportamiento celular

b) modificación y mejoramiento de plantas

c) plantas libres de virus y almacenamiento de germoplasma

d) propagación clonal

e) formación de productos.

Durante la década de 1990 la expansión continúa en las aplicaciones de las tecnologías in

vitro se observan en un incremento en el número de especies de plantas. Las técnicas del

cultivo de tejidos de plantas han sido empleadas en todo tipo de plantas, incluyendo

cereales y pastos (Vasil y Vasil, 1994), legumbres (Davey et al. 1994), cultivos de

vegetales (Reynolds, 1994), papa (Jones, 1994) y otras raíces y cultivos de tubérculos

(Krikorian, 1994), semillas de aceite (Palmer y Keller, 1994), frutas de zonas templadas

(Zimmerman y Swartz, 1994) y tropicales (Grosser, 1994), cultivo de plantaciones frutales

(Krikorian, 1994), árboles forestales (Harry y Thorpe, 1994), y por supuesto plantas

ornamentales (Debergh, 1994). Como se ha podido ver hasta ahora, la aplicación de la

tecnología de células in vitro va más allá de la micropropagación y abarca a todos los

métodos in vitro que son relevantes o posibles para la especie y el problema(s) del que se

trate. Sin embargo, sólo se ha logrado un éxito limitado en la explotación de la variación

somaclonal o en la regeneración de plántulas útiles a partir de células mutantes; de igual

manera, la promesa inicial de la tecnología de protoplastos permanece en gran medida



sin cumplirse. Se está avanzando en la extensión de la tecnología de criopreservación

para el almacenamiento de germoplasma (Kartha y Engelmann, 1994). Progresos también

se están realizando en la tecnología de semillas artificiales (Redenbaugh,1993).

El cultivo de células ha permanecido como una herramienta importante en el estudio de

biología de plantas, por ejemplo, sobre cambios cromosómicos en cultivos celulares

(Kaeppler y Phlilips, 1993) y del ciclo celular (Komamine et al. 1993; Trehin et al. 1998).

Los cultivos celulares han permanecido como herramientas extremadamente importantes

en el estudio del metabolismo primario.; por ejemplo, el uso de células en suspensión

para desarrollar sistemas de transcripción in vitro (Suguira, 1997) o la regulación del

metabolismo de carbohidratos en transgénicos (Stitt y Sonnewald, 1995). El desarrollo de

técnicas de cultivo de células de plantas medicinales, ha permitido la identificación de más

de 80 enzimas de la biosíntesis de alcaloides (Kutchan, 1998). Información similar surge

de la utilización de cultivos celulares para estudios moleculares y bioquímicos en otras

áreas del metabolismo secundario, generando así actividad de investigación sobre

ingeniería metabólica sobre la producción de metabolitos secundarios (Verpoorte et al.

1998).

Los cultivos de células permanecen como herramienta importante en estudios de

morfogénesis. Estudios moleculares, fisiológicos y bioquímicos han permitido mejores

entendimientos sobre la citodiferenciación (Fukuda, 1997), organogénesis (Thorpe,

1993; Thompson & Thorpe, 1997), y embriogénesis somática (Nomura & Komamine,

1995; Dudits et al., 1995).

Avances en la biología molecular permitieron en ingeniería genética, inserciones precisas

de genes a partir de diversos sistemas biológicos.

La ola inicial de investigación en biotecnología de plantas ha sido conducida

principalmente por industrias de semillas y agroquímicos y ha sido concentrada en

“rasgos agronómicos” de relevancia directa a estas industrias, netamente al control de

insectos, malezas y enfermedades de plantas (Fraley, 1992). Al presente, más de 100

especies de plantas han sido manejadas genéticamente incluyendo casi todos los

principales cultivos de monocotiledóneas y de un número en incremento de algunas

plantas leñosas. La investigación común está dirigida a los sistemas de transferencia de

genes para todos los cultivos de importancia económica. La siguiente ola en biotecnología

agrícola está relacionada con los progresos con aplicaciones biotecnológicas de interés al

procesamiento de alimentos, especialmente de industrias químicas y farmacéuticas.

El énfasis común e importancia de la biotecnología de plantas puede ser extraída de las

conclusiones de Congresos Internacionales de Cultivo de células y tejidos de plantas, por

ejemplo, el ocurrido en Israel en junio de 1998 “Biotecnología de plantas y biología in vitro

en el siglo XXI” o el ocurrido en Estados Unidos en junio de 2002 con el tema

“Biotecnología de plantas y más allá”.



Ambos congresos fueron desarrollados a través de un programa científico que se centró

en los acontecimientos más importantes, tanto en desarrollos básicos como en los

aplicados, en las áreas de cultivo de tejidos vegetales y de biología molecular y su

impacto en la mejora de las plantas y la biotecnología. En ellos se muestra claramente al

cultivo de tejidos de hoy y hacia dónde se dirige (esto es, el cultivo de tejidos vegetales

como un socio igual con la biología molecular), como una herramienta de la biología

básica de las plantas y en diversas áreas de aplicación. De hecho, los avances en la

biotecnología aplicada de plantas están totalmente en juego y es, sin duda el estímulo al

progreso científico fundamental, que sigue siendo la mejor esperanza para lograr una

agricultura sostenible y estable medioambientalmente. Los avances realizados en los

últimos 100 años con la tecnología in vitro han ido mucho más allá de lo que Haberlandt y

los otros pioneros hubiera imaginado.

2.2. Medio de cultivo (Beyl CA, 2005)

La selección del medio de cultivo de tejidos vegetales, depende de la especie a ser

cultivada. Algunas especies son sensibles a la salinidad o con diferentes requerimientos

de reguladores de crecimiento de plantas (RCP). La edad de la planta también tiene

efecto. Por ejemplo, tejidos juveniles habitualmente regeneran raíces más rápidamente

que un tejido adulto. Es importante también el tipo de órganos a cultivar; por ejemplo, las

raíces requieren tiamina. Cada efecto de cultivo tiene sus requisitos, tales como auxinas

para la inducción de raíces adventicias, y la variación de la relación citocinina: auxina para

la iniciación y desarrollo de brotes adventicios.

El desarrollo de las formulaciones de los medios de cultivo fue el resultado de pruebas

sistemáticas y de experimentación. La tabla 1 provee una comparación de la composición

de los más comúnmente empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus

componentes en miligramos por litro y unidades molares (para lectura de fórmulas

químicas, diríjase al anexo de esta unidad). El medio Murashige y Skoog (MS) (1962) es

el medio de cultivo de tejidos base más adecuado y más comúnmente empleado para

regeneración de plantas a partir de tejidos y callos. Este medio fue desarrollado para

desarrollar plantas de tabaco y está basado principalmente sobre los análisis de minerales

obtenidos de tejidos de la planta de tabaco. Este medio es “alto en sales”, debido al

contenido de sales de K y N. El medio Linsmaier y Skoog (1965) es básicamente el

medio de Murashige y Skoog (MS) (1962) con respecto a sus porciones inorgánicas, en

donde solo el inositol y la tiamina HCl (tiamina clorhidrato) quedan entre los componentes

orgánicos. Para contrarrestar la sensibilidad a las sales de algunas especies leñosas,

Lloyd y McCow (1980) desarrollando el medio para plantas leñosas (WPM).

El medio de Gamborg (B5) (Gamborg et al., 1968) fue diseñado para el cultivo de callos

de soya, y contiene menos cantidades de nitratos y particularmente sales de amonio que



el medio MS. Sin embargo, el medio B5 fue originalmente desarrollado con el propósito de

obtener callos o para el uso en cultivos en suspensión, es adecuado para trabajar como

medio basal en la regeneración de plantas completas. Sheck y Hildebrandt (1972)

desarrollaron el medio SH para el cultivo de callos de mono y dicotiledóneas. El medio

de White (White, 1963), fue diseñado para el cultivo de raíces de tomate, este tiene una

baja concentración de sales en relación al medio MS. El medio de Nitsch (Nitsch y

Nitsch, 1969) fue desarrollado para el cultivo de anteras, contiene una concentración

intermedia de sales entre el medio MS y el de White.

Muchas compañías venden mezclas preparadas y empaquetadas de las recetas más

conocidas. Estas son fáciles de hacer ya que solamente es necesario disolver el

contenido del paquete, mezclar en un volumen específico de agua. Estas pueden ser

adquiridas como sales, vitaminas, o como mezcla entera con o sin reguladores de

crecimiento, agar y sacarosa. Esto es muy conveniente, ya que es menos propenso a

incluir errores individuales, y se evitan tener almacenadas soluciones innecesarias. Sin

embargo, estos son más caros que si se elaboran los medios por sí mismos.



Compuesto MS Gamborg B5 WP Nitsch and Nitsch Schenk and Hildebrandt White

Macronutrientes en mg/l (mM)

NH4NO3 1650 (20.6) - 400 (5.0) - - -

NH4H2PO4 - - - - 300 (2.6) -

(NH4)2SO4 - 134 (1.0) - - - -

CaCl2∙2H2O 332.2 (2.3) 150 (1.0) 96 (0.7) 166 (1.1) 151 (1.0) -

Ca(NO3)2∙4H2O - - 556 (2.4) - - 288 (1.2)

MgSO4∙7H2O 370 (1.5) 250 (1.0) 370 (1.5) 185 (0.75) 400 (1.6) 737 (3.0)

KCl - - - - - 65 (0.9)

KNO3 1900 (18.8) 2500 (24.8) - 950 (9.4) 2500 (24.8) 80 (0.8)

K2SO4 - - 990 - - -

KH2PO4 170 (1.3) - 170 (1.3) 68 (0.5) - -

NaH2PO4 - 130.5 (0.9) - - - 16.5 (0.12)

Na2SO4 - - - - - 200 (1.4)

Micronutrientes en mg/l (mM)

H3BO3 6.2 (100) 3.0 (49) 6.2 (100) 10 (162) 5 (80) 1.5 (25)

CoCl2∙6H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) - - 0.1 (0.4) -

CuSO4∙5H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) 0.25 (1) 0.025 (0.1) 0.2 (0.08) 0.01 (0.04)

Na2EDTA 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 20.1 (54) -

Fe2(SO4)3 - - - - - 2.5 (6.2)

FeSO4∙7H2O 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 15.4 (54) -

MnSO4∙H2O 16.9 (100) 10.0 (59) 22.3 (132) 18.9 (112) 10.0 (59) 5.04 (30)

KI 0.83 (5) 0.75 (5) - - 0.1 (0.4) -

MoO3 - - - - - 0.001 (0.001)

Na2MoO4∙2H2O 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.1 (0.4) -

ZnSO4∙7H2O 8.6 (30) 2.0 (7.0) 8.6 (30) 10 (35) 1 (3) 2.67 (9)

Orgánicos en mg/l (µM)

Mio-inositol 100 (550) 100 (550) 100 (550) 100 (550) 1000 (5500) -

Glicina 2.0 (26.6) - 2.0 (26.6) 2.0 (26.6) - 3.0 (40)

Ác. nicotínico 0.5 (4.1) 1.0 (8.2) 0.5 (4.1) 5.0 (40.6) 5.0 (40.6) 0.5 (4.1)

Pirodoxina HCl 0.5 (2.4) 0.1 (0.45) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.1 (0.45)

Tiamina HCl 0.1 (0.3) 10.0 (30) 1.0 (3.0) 0.5 (1.5) 5.0 (14.8) 0.1 (0.3)

Biotina - - - 0.2 (0.05) - -

Tabla 1. Composición de cinco medios de cultivo de tejidos más comunes en concentraciones de miligramos por litro y concentraciones molares (Beyl CA, 2005)



2.2.1. Ingredientes (Beyl CA, 2005)

El crecimiento y desarrollo de explantes in vitro es el producto de la genética, del medio

ambiente que lo rodea y componentes del medio de cultivo de tejidos.

El medio de cultivo de tejidos consiste de 95% de agua, macro y micro-nutrientes, RCP,

vitaminas, azúcar (ya que las plantas no son fotosintéticamente competentes), y en

algunas ocasiones varios materiales orgánicos simples o complejos. Considerándolo todo,

cerca de veinte diferentes componentes son generalmente necesarios.

Agua

Agua de alta calidad es un ingrediente requerido del medio de cultivo de tejidos de

plantas. De manera ordinaria, el agua de la llave contiene cationes, aniones, partículas de

varios tipos, microorganismos, y gases que la hacen no útil para su uso en el medio de

cultivo de tejidos. Existen varios métodos para tratar el agua, incluyendo filtración a través

de carbón activado para remover compuestos orgánicos y cloro, des-ionizar o

desmineralizar haciendo pasar agua a través de resinas de intercambio iónico para

remover impurezas ionizadas disueltas, y la destilación, la cual elimina muchos iones e

impurezas particuladas, químicos volátiles y no volátiles, materia orgánica y

microoganismos. El proceso de ósmosis inversa, remueve el 99% de impurezas ionizadas

disueltas, este proceso hace uso de membranas semipermeables a través del cual una

porción de agua es forzada a atravesar bajo presión; el resto del agua conteniendo

impurezas es eliminado. El método universalmente más fiable para la purificación de agua

para el cultivo de tejidos es un tratamiento de desionización seguida por una o dos veces

la destilación en vidrio, aunque la simple desionización algunas veces es usada

satisfactoriamente. En algunos casos, los nuevos equipos de purificación por ósmosis

inversa (Milli-RO™, Millipore™, RO pure™, Barnstead™, Bion™, Pierce™), combinado

con cartuchos de intercambio iónico, adsorción, y equipos por filtrado con membrana, han

reemplazado la tradicional destilación de agua en vidrio.



Elementos inorgánicos minerales

Así como el crecimiento de plantas in vivo requiere muchos elementos diferentes, ya sea

del suelo o de fertilizantes el crecimiento de tejidos de plantas in vitro requiere una

combinación de macro y micronutrientes (ver Tabla 2). La selección de las micro o macro

sales y sus concentraciones es dependiente de la especie. El medio MS es muy popular

ya que muchas plantas reaccionan a él favorablemente; si no es así, será debido al alto

contenido de sales.

Los macronutrientes son requeridos en cantidades milimolares (mM) en la mayoría de los

medios basales de plantas. El nitrógeno (N) es generalmente suministrado en forma de

iones de amonio (NH4+) y nitrato (NO3

-); sin embargo, es usado también en algunas

ocasiones en forma de fuentes orgánicas complejas, tales como la urea, aminoácidos

tales como la glutamina, o caseína hidrolizada, la cual es una mezcla compleja de

aminoácidos y amonio. Aun así, muchas plantas prefieren NO3- a NH4

+, y pueden

diferenciarse en el balance correcto de los dos iones para un óptimo crecimiento y

desarrollo in vitro para las especies seleccionadas.

Figura 3. Equipo de purificación por ósmosis inversa Tomado de: http://www.sci-support.com/items/Millipore-Milli-RO-10-Plus-Water-Purification-System-1695.htm



Para notas a, b y c, leer el texto.

Además, el suministro de nitrógeno, potasio, magnesio, calcio, fósforo y azufre en el

medio de cultivo como diferentes compuestos, referenciados como macro-sales. MgSO4

provee de ya sea magnesio y azufre; NH4H2PO4, KH2PO4 o NaH2PO4 proveen de fósforo;

CaCl2∙2H2O o Ca(NO3)2∙4H2O provee de calcio; y KCl, KNO3 o KH2PO4 provee de potasio.

El cloro es provisto por el KCl y/o CaCl2∙2H2O.

Las micro-sales típicas incluyen boro (H3BO3), cobalto (CoCl2∙6H2O), hierro (un complejo

de FeSO4∙7H2O y Na2EDTA, o raramente, Fe2[SO4]3), manganeso (MnSO4∙H2O),

molibdeno (NaMoO3), cobre (CuSO4∙5H2O) y zinc (ZnSO4∙7H2O). Las micro-sales son

necesarias en concentraciones más bajas (micromolar [µM]) que los macro-nutrientes.

Algunos medios contienen muy pocas cantidades de yodo (KI), pero cantidades

suficientes de muchos de los elementos traza, ya que éstos pasan inadvertidos como

contaminantes inorgánicos en muchos químicos de grado reactivo (ver Tabla 2).

Con respecto a la tabla 2, su objetivo es preparar una solución concentrada o “stock”, por

lo que el número de gramos o miligramos indicados en la columna de cantidad debe ser

Stock (100X) Componente Cantidad

Nitrato NH4NO3

KNO3

165.0 g

190.0 g

Sulfato MgSO4∙7H2O

MnSO4∙H2O

ZnSO4∙7H2O

CuSO4∙5H2O

37.0 g

1.7 g

0.86 g

250 mga

Haluros CaCl2∙2H2O

KI

CoCl2∙6H2O

44.0 g

83.0 mg

250 mga

PBMo KH2PO4

H3BO3

Na2MoO4

17.0 g

620.0 mg

25.0 mg

NaFeEDTAc FeSO4∙7H2O

NaEDTA

2.78 g

3.74 g

Tabla 2. Soluciones (100X) de macro y micro nutrientes del medio Murashige y Skoog (MS) (Beyl CA, 2005)



adicionado a 1000 ml de agua des-ionizada para preparar 1 litro de la solución “stock”

necesaria.

Posteriormente, para cada litro de medio a elaborar, deben ser usados 10 ml de cada

solución “stock”.

Para preparar una solución “stock” 100X para alguno de los medios listados en la Tabla 1,

multiplicar la cantidad del químico listado en la tabla por 100 y disolver en un litro de agua

desionizada-destilada.

Con respecto a la nota “a” para CuSO4∙5H2O, considerar lo siguiente: ya que esta

cantidad (250 mg) es muy pequeña para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de

CuSO4∙5H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada, para después adicionar 10 ml de

esta solución a la solución “stock” de sulfatos.

“b” para CoCl2∙6H2O, proceder de manera similar, ya que esta cantidad es muy pequeña

para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de CoCl2∙6H2O en 100 ml de agua

desionizada-destilada, después adicionar 10 ml de esta solución a la solución “stock” de

haluros.

“c” Mezclar el FeSO4∙7H2O y el NaEDTA juntos y calentar ligeramente hasta que la

solución se torne naranja. Almacenar en frascos ámbar o protegerla de la luz.

Compuestos orgánicos

El azúcar es una muy importante parte de cualquier medio de cultivo, y su suministro es

esencial para el crecimiento in vitro y desarrollo del cultivo. Muchos cultivos de plantas por

varias razones están inhabilitados para fotosintetizar de manera efectiva, incluyendo una

organización celular y desarrollo de tejidos insuficientes, falta de clorofila, intercambio

limitado de gases y CO2 en el recipiente del cultivo de tejidos, y pobres condiciones

medioambientales, tales como baja luz. Una concentración de 20-60 g/l de sacarosa

(disacárido formado por glucosa y fructosa) es la más frecuentemente usada fuente de

carbono o energía, ya que este azúcar es también sintetizada y transportada naturalmente

por la planta. Pueden ser usados otros tipos de mono – disacáridos o azúcares alcohol

tales como glucosa, fructosa, sorbitol y maltosa. La concentración de azúcar elegida

depende del tipo y edad del explante en el cultivo. Por ejemplo, embriones muy jóvenes

requieren una alta concentración relativa de azúcar (>3%). Para yemas de mora in vitro, la

fructosa es mejor que la sacarosa, glucosa, maltosa, rafinosa o lactosa (Coffin et al.

1976). Para manzanos, el sorbitol y la sacarosa soportan igual de bien, la iniciación de

callos y crecimiento, pero el sorbitol es mejor para el durazno después de cuatro

subcultivos (Oka y Ohyama, 1982). El azúcar (sacarosa) comprado ordinariamente en el

mercado es generalmente adecuado, pero que su origen sea solamente de caña de



azúcar, ya que el proveniente de maíz es principalmente fructosa. La caña de azúcar es

purificada y, de acuerdo a los análisis de los productores de azúcar, éste consiste de

99.94% sacarosa, 0.02% de agua y 0.04% de otros materiales (elementos inorgánicos

tales como rafinosa, fructosa y glucosa). Las sales de nutrientes contribuyen

aproximadamente entre el 20-50% del potencial osmótico del medio de cultivo, quedando

responsable la sacarosa del resto. La contribución de la sacarosa al potencial osmótico se

incrementa cuando este es hidrolizado a glucosa y fructosa durante el autoclaveado. Esto

debe de ser tomado en consideración cuando se desarrollan procedimientos sensibles

tales como el cultivo y aislación de protoplastos.

Las vitaminas son sustancias orgánicas que forman parte de enzimas o cofactores para

funciones metabólicas esenciales. De las vitaminas, sólo la tiamina (vitamina B1 a 0.1-5.0

mg/l) es esencial en un cultivo, ya que está involucrada en el metabolismo de

carbohidratos y en la biosíntesis de algunos aminoácidos. Es usual adicionar al medio de

cultivo de tejidos tiamina HCl. El ácido nicotínico, también conocido como niacina,

vitamina B3, o vitamina PP, forma parte de una coenzima respiratoria y es usada en

concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/l. El medio MS contiene tiamina-HCl, así como otras

dos vitaminas, el ácido nicotínico y la piridoxina (vitamina B6) en la forma HCl. La

piridoxina es una coenzima importante en muchas reacciones metabólicas y es usada en

medios en concentraciones de 0.1-1.0 mg/l. La biotina (vitamina H) es adicionada

comúnmente a medios de cultivo de tejidos a 0.01-1.0 mg/l. Otras vitaminas que son

comúnmente usadas son el ácido fólico (vitamina M; 0.1-0.5 mg/l), riboflavina (vitamina B2;

0.1-10 mg/l), ácido aspártico (vitamina C; 1-1000 mg/l), ácido pantotenico (vitamina B5;

0.5-2.5 mg/l), tocoferol (vitamina E; 1-50 mg/l) y ácido p-aminobenzoíco (0.5-1.0 mg/l).

El inositol es algunas veces caracterizado como uno de las vitaminas del complejo B, pero

es realmente un azúcar alcohol involucrado en la síntesis de fosfolípidos, pectinas de

pared celular y sistemas de membranas en citoplasma celular. Esta es adicionada a

medios de cultivo de tejidos a concentraciones de 0.1-1.0 g/l y ha sido demostrado

necesario para algunas mono, dicotiledóneas y gimnospermas.

Además, otros aminoácidos son algunas veces usados en medios de cultivo de tejidos.

Estas incluyen L-glutamina, asparagina, serina y prolina, que son usadas como fuentes de

nitrógeno orgánico reducido, especialmente para inducir y mantener la embriogénesis

somática. La glicina, un aminoácido simple, es un aditivo común, ya que es esencial en la

síntesis de purinas y constituye una parte del anillo de porfirinas en la estructura de la

clorofila.

Compuestos orgánicos complejos son un grupo de suplementos indefinidos tales como

caseína hidrolizada, leche de coco (el líquido del endospermo del coco, i.e. agua de

coco), jugo de naranja, jugo de tomate, jugo de uva, jugo de piña, savia de abedul, puré

de plátano y así por el estilo. Estos compuestos son usados frecuentemente cuando no

existe ninguna otra combinación de componentes conocidos definidos para producir el



crecimiento y desarrollo deseado. Sin embargo, la composición de estos suplementos es

básicamente desconocida y pueden variar de un lote a otro, causando respuestas

variables. Por ejemplo, el agua de coco (usada en una dilución de 50-150 ml/l), es una

fuente natural de zeatina (RCP) y su concentración no solo difiere entre cocos jóvenes y

maduros, sino también entre cocos de la misma edad.

Algunos compuestos de complejos orgánicos son usados como fuentes de nitrógeno

orgánico, tales como el hidrolizado de caseína, una mezcla de cerca de 20 diferentes

aminoácidos y amonio (0.1-1.0 g/l), peptona (0.25-3.0 g/l), triptona (0.25-2.0 g/l), y

extracto de malta (0.5-1.0 g/l). El extracto de levadura (0.25-2.0 g/l) es usado ya que

contienen altas concentraciones y alta calidad de vitaminas del grupo B.

Las poliaminas, particularmente putrescina y espermidina, son algunas veces benéficas

para la embriogénesis somática. Las poliaminas son también cofactores para la formación

de raíces adventicias. La putrescina es capaz de sincronizar el proceso de embriogénesis

de la zanahoria.

El carbón activado es útil para la absorción de los pigmentos cafés y negros y de

compuestos fenólicos oxidados. Este es incorporado al medio en concentraciones de 0.2-

3.0% (p/v). Es útil para absorber otros compuestos orgánicos, incluyendo RCP, tales

como auxinas y citocininas, y otros materiales tales como vitaminas, y quelatos de hierro y

zinc (Nissen y Sutter, 1990). Los efectos de RCP son minimizados al adicionar carbón

activado cuando se transfieren explantes a medios sin RCP. Otras características del uso

de carbón activado es que cambia el medioambiente luminoso al oscurecer el medio, de

tal forma que auxilie en la formación y crecimiento de raíces. Puede también promover

embriogénesis somática y mejorar el crecimiento y organogénesis de especies

maderables.

Reguladores de crecimiento de plantas (RCP)

Los RCP ejercen efectos importantes a bajas concentraciones (0.001-10µM). Ellos

regulan la iniciación y desarrollo de brotes y raíces sobre explantes y embriones en

medios de cultivo semisólidos o líquidos.

La tabla 3 provee una comparación de la composición de los más comúnmente

empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus componentes en miligramos

por litro y unidades molares.

Ellos estimulan también la división y expansión celular. Aunque algunas veces un

explante es autotrófico y puede producir sus propios RCP, generalmente, los RCP deben

ser suministrados en el medio de cultivo para el crecimiento y desarrollo del cultivo.

Los más importantes tipos de RCP usados en el cultivo de tejidos son las auxinas y las

citocininas. El efecto relativo de las relaciones entre auxinas y citocininas sobre la



morfogénesis de cultivo de tejidos fue demostrado por Skoog y Miller en 1957 y sirve de

base para las manipulaciones del cultivo de tejidos de plantas en la actualidad.

Más adelante estudiaremos de manera más profunda este tema.

Agar y sistemas de soporte alternativo

El agar es usado para solidificar el cultivo de tejidos (gel). Este capacita al explante a ser

colocado en contacto preciso con el medio (sobre la superficie o embebido en él), pero

permanece aireado. El agar es un polisacárido de alto peso molecular que puede enlazar

el agua y es obtenida de algas marinas. El agar es adicionado al medio en intervalos de

concentraciones de 0.5 a 1.0% (p/v). Altas concentraciones de agar resultan en un medio

duro. Si una concentración baja de agar es empleada (0.4%) o si el pH es bajo, el medio

estará tan suave y no gelificará apropiadamente. La consistencia del agar puede también

influir en el crecimiento. Si es muy duro, el crecimiento de la planta será reducido. Si es

muy suave, pueden resultar plantas hiperhídricas (Singha, 1982). Para gelificar

apropiadamente, un medio con 0.6% de agar debe tener un pH por encima de 4.8.

Algunas veces el carbón activado en el medio interfiere con la gelificación. En cultivos de

tejidos típicos el agar se fusiona a 65ºC y se gelifica a 45ºC aproximadamente.

El agar también contiene contaminantes orgánicos e inorgánicos, la cantidad de ellos

varía entre las distintas marcas comerciales. Contaminantes comunes son: ácidos

orgánicos, compuestos fenólicos, ácidos grasos de cadena larga. Un análisis del

fabricante, muestra que los agares Difco® Bacto® contienen (cantidades en ppm): 0.0-0.5

cadmio; 0.0-0.1 cromo; 0.5-1.5 cobre; 1.5-5.0 hierro; 0.0-0.5 plomo; 210.0-430.0

magnesio; 0.1-0.5 manganeso y 5.0-10.0 zinc. Generalmente se realizan ensayos en los

cultivos de tejidos vegetales de plantas para determinar el tipo de agar que se debe

emplear. Una calidad pobre del agar puede interferir o inhibir el crecimiento de cultivos.

La agarosa es frecuentemente usada cuando se cultivan protoplastos o células

individuales. La agarosa es un extracto purificado el agar que deja atrás grupos de

agaropectina y sulfatos.

Gomas tales como Gelrite™ y Phytagel™ son alternativas de agentes gelificantes. Están

hechas de polisacáridos producidos por una bacteria. En lugar de ser traslúcidas (como el

agar) son claras, por lo que es mucho más fácil de detectar la contaminación.

Soportes mecánicos tales como puentes de papel filtro o plataformas de polietileno, no

dependen de un agente gelificante. Pueden ser usados con medios líquidos que circulen

mejor, manteniendo al explante en la superficie para que siga siendo oxigenado.



2.2.2. Preparación

El primer paso para elaborar un medio de cultivo es el de aprovisionarse de todos los

materiales y equipos necesarios para tal fin, por ejemplo:

Balanza, potenciómetro, autoclave, campana de flujo laminar, refrigerador, destilador,

des-ionizador, parrilla de agitación y de calentamiento, vaso de precipitados de 1 l, matraz

volumétrico de 1 l, parrilla, barra magnética, balanza, pipetas, varias soluciones “stock”

(soluciones madre, ver tabla 2), frascos para almacenar soluciones y medios preparados,

etc.

Aunque esperamos que ya se maneje adecuadamente las formas de medir concentración,

se incluyen algunos ejemplos para clarificar cualquier duda.

Unidades de concentración

Aunque es posible obtener la concentración de sustancias por otras vías, el siguiente

listado provee algunos métodos para indicar la concentración encontrada en la literatura

de cultivo de tejidos vegetales.

• Porcentaje basado sobre el volumen (v/v). Usado para diluir el agua de coco,

jugo de tomate y de naranja. Por ejemplo, si deseamos 100 ml de agua de coco al

5%, requerimos tomar 5 ml de agua de coco y diluirlo con agua hasta alcanzar 100

ml.

• Porcentaje basado en peso (p/v). Frecuentemente usado para expresar

concentraciones de agar o azúcar. Por ejemplo, para preparar una solución al 1%

de agar, es necesario disolver 10 g de agar en un litro de medio nutritivo.

• Solución molar. Para ello es necesario recordar que un mol (M) corresponde al

mismo número de gramos como peso molecular corresponda (número de

Avogadro), por lo tanto una solución 1M representa el peso molecular de la

sustancia en un litro de solución, y 0.01 M representa 0.01 veces el peso

Figura 4. Agar Tomado de: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:YPED_agar_plate.jpg



molecular contenido en un litro de solución. Por lo que una solución milimolar (mM)

representa 0.001 veces el peso molecular contenido en un litro. Las sustancias

tales como los RCP están activas a concentraciones de micromoles (µM). La

concentración molar es usada exactamente para comparar la reactividad relativa

entre diferentes compuestos. Por ejemplo, a la concentración 1 µM de AIA (ácido

indol acético) puede contener el mismo número de moléculas que 1 µM de

cinetina, aunque realizando las conversiones correspondientes, esto puede ser

también dichas en unidades basadas al peso (mg/ml). La tabla 3, ilustra la

conversión entre concentraciones molares y las dadas en mg/l.

• Miligramos por litro (mg/l). Aunque no es posible comparar sustancias con

exactitud molecular, esta es una forma simple para realizar cálculos y usarlo en

pesos directos. Cada medición directa es usada comúnmente en los

macronutrientes y en RCP. Un miligramo por litro significa el colocar 1 mg de la

sustancia deseada en un volumen final de 1 litro de solución. Recuerde que 1 mg

= 0.001 g (10-3 g).

• Microgramos por litro (µg/l). Este es usado con micronutrientes y también en

algunas ocasiones con RCP. Significa 1 µg de una sustancia y se lleva a un

volumen de 1 L de solución. 1 microgramo = 0.001 o 10-3 mg = 0.000001 o 10-6 g.

• Partes por millón (ppm). Algunos componentes de medios son expresados en

ppm, 1 ppm es igual a 1 mg/l.

Las instrucciones para preparar medios de cultivo, se describen en el recuadro naranja.

Estas instrucciones describen la preparación del medio MS, pero puede ser efectivo para

preparar cualquier otro medio: sólo seguir los mismos pasos y sustituir los componentes

de las soluciones madre de macro y micronutrientes del medio deseado. Omitir el agar si

lo que se desea es producir medio líquido para un cultivo en suspensión. Los RCP

pueden ser personalizados para el medio deseado, cuando sea necesario el inicializar a

callos, brotes, raíces o para algún otro propósito.



Regulador de Crecimiento de Plantas

Abreviatura P.M.

mg/l equivalentes para

concentraciones µM

µM equivalentes para

concentraciones en

mg/l

0.1 1.0 10.0 100.0 0.1 0.5 1.0 10.0

Ác. abscísico ABA 264.3 0.0264 0.264 2.64 26.4 0.38 1.89 3.78 37.8

Benciladedina BA 225.2 0.0225 0.225 2.25 22.5 0.44 2.22 4.44 44.4

Dihidrozeatina 2hZ 220.3 0.0220 0.220 2.20 22.0 0.45 2.27 4.53 45.3

Ác. giberélico GA3 346.4 0.0346 0.346 3.46 34.6 0.29 1.44 2.89 28.9

Ác. indolacético AIA 175.2 0.0175 0.175 1.75 17.5 0.57 2.85 5.71 57.1

Ac. Indolbutírico AIB 203.2 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.49 2.46 4.90 49.0

Sal de potasio de

AIB

K-IBA 241.3 0.0241 0.241 2.41 24.1 0.41 2.07 4.14 41.4

Cinetina Cin 215.2 0.0215 0.215 2.15 21.5 0.46 2.32 4.65 46.7

Ác. naftalenacético ANA 186.2 0.0186 0.186 1.86 18.6 0.54 2.69 5.37 53.7

Picloram Pic 241.5 0.0241 0.242 2.42 24.2 0.41 2.07 4.14 41.4

Zeatina Zea 219.2 0.0219 0.219 2.19 21.9 0.46 2.28 4.56 45.6

2-isopentenil

adenina

2-iP 203.3 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.49 2.46 4.92 49.2

Ác. 2-4

diclorofenoxiacético

2,4-D 221.04 0.0221 0.221 2.21 22.1 0.45 2.26 4.52 45.2

Tabla 3. Reguladores de crecimiento de plantas (RCP) (Beyl CA, 2005)



Paso Instrucciones y comentarios

1 Para preparar un litro de medio de cultivo, colocar la mitad del volumen

de agua desionizada-destilada en un vaso de precipitados y colocar

una barra magnética en él. Colocar el vaso sobre la parrilla de agitación

y encenderla para promover el mezclado de los diferentes

componentes.

2 Adicionar 10 ml de la solución “stock” correspondiente (ver Tabla 2):

nitratos, sulfatos, haluros, PBMo y NaFeEDTA.

3 Adicionar el volumen apropiado del “stock” de vitaminas. En este

momento, adicionar las cantidades apropiadas de inositol

(generalmente 100 mg) y sacarosa (entre 20 y 30 g/l).

4 Adicionar el volumen necesario del “stock” de RCP planeado.

5 Ajustar el pH usando 0.1-1.0 N de NaOH o HCl dependiendo si

deseamos bajarlo o subirlo. Para la mayoría de los medios, el pH debe

de encontrarse entre 5.4 y 5.8. Finalmente ajuste el volumen final (1

litro) con agua desionizada-destilada.

6 Para usar el medio líquido, se puede distribuir el medio en frascos

apropiados de acuerdo a un plan determinado y llevarlo a la autoclave

para esterilización.

Si el plan es usar medio sólido, pesar la cantidad necesario de agar o

agente gelificante al medio líquido. Colocar el medio de cultivo de

tejidos sobre la placa de calentamiento y agitar o usar el horno de

microondas. Verificar previamente el nivel de calentamiento del horno

de microondas. Distribuir en los frascos apropiados, colocar en

autoclave para esterilización. Esterilizar por 15 min a 121ºC. Si son

grandes cantidades de frascos, el tiempo de esterilización deberá

prolongarse.

Si el plan es el de distribuir el medio después de la esterilización (tales

como en cajas de petri estériles), cerrar los frascos con tapones de

algodón cubriéndolo posteriormente con una hoja de aluminio. Una vez

el medio esté tibio para que la mano lo tolere (cerca de 60ºC), puede

proceder a transferir el medio dentro de una campana de flujo laminar a

las cajas de petri.

Preparación paso a paso de un medio de cultivo (Beyl CA, 2005)



El ajuste del pH es un paso esencial. El cultivo de

células de plantas prefiere un pH ligeramente ácido,

generalmente entre 5.3 y 5.8. Cuando el pH es menor a

4.5 o mayor a 7.0, el crecimiento y desarrollo in vitro es

inhibido. Esto es debido probablemente a muchos

factores, incluyendo RCP, tales como el AIA y el ácido

giberélico, que llegar a ser menos estables; se

precipitan los fosfatos y las sales iónicas; la vitamina B1

y el ácido pantoténico son menos estables; se reduce la

toma de iones de amonio; se cambia la consistencia del

agar (el agar se licua a pH bajo).

El ajuste del pH es el último paso antes de adicionar y disolver el agar para después

distribuirlo en frascos de cultivo y “autoclavearlo” o esterilizar. Si el pH no se encuentra en

los intervalos establecidos, éste debe ser ajustado usando NaOH para elevar el pH o HCl

para bajarlo (0.1-1.0N). Mientras que el KOH puede ser usado, cuando existe un

indeseable incremento de iones de sodio. El pH en un medio de cultivo generalmente

decae de 0.3 a 0.5 unidades después del autoclaveado y después cambia a través del

periodo de cultivo, debido a la oxidación y a la toma diferencial y secreción de sustancias

del crecimiento de tejidos.

Las soluciones “stock” son incoloras y al final el medio de cultivo permanece incoloro. El

uso en nuestro caso de una autoclave horizontal, implica ordenar los frascos conteniendo

el medio de cultivo impidiendo que estos queden inclinados o que puedan derramarse.

Elaboración de soluciones “stock” de sales minerales

Las sales minerales pueden ser preparadas como soluciones madre o soluciones “stock”

de 10 a 100 veces (10X a 100X) la concentración especificada en el medio. Las sales

minerales son frecuentemente agrupadas en dos soluciones stock, una para macro-

elementos y una para micro-elementos, pero al menos que éstos se mantengan

relativamente diluidos (10X), la precipitación puede ocurrir. Con la finalidad de producir

soluciones más concentradas, el método preferido es el de agrupar los componentes por

los iones que ellos contienen, tales como nitratos, sulfatos, haluros, fósforo (P), boro (B),

molibdeno (Mo) y hierro (Fe) haciéndolos en “stocks” de 100X. La tabla 2 lista las

soluciones “stock” para el medio MS para una concentración final de 100X, lo cual

significa que 10 ml de cada solución “stock” será usada para elaborar un litro de medio de

cultivo. Algunas soluciones “stock” requieren pasos extras para obtener los componentes

Figura 5. Autoclave horizontal Tomado de: https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:Autoclave_de_laboratorio.jpg



de la solución (por ejemplo, el “stock” de NaFeEDTA), o que requieran una dilución serial

para obtener la cantidad de componentes traza de la solución “stock” (sulfatos o haluros).

Algunas veces la cantidad de componentes particulares necesarios para el medio de

cultivo de tejidos es tan pequeña que hace difícil el pesar la cantidad incluso para el

“stock” 100X. Por lo que estas cantidades tan pequeñas no pueden ser pesadas

exactamente, la técnica de diluciones seriales es usada. El siguiente ejemplo ilustra cómo

una dilución serial puede ser empleada para obtener la cantidad correcta de un

componente (en este caso CuSO4∙5H2O) del medio de cultivo para su apropiada solución

“stock”.

De acuerdo a las notas de la tabla 2, la solución “stock” pide 2.5 mg de CuSO4∙5H2O

como parte del “stock” de sulfatos del medio MS. Se elabora una solución “stock”

intermedia colocando 25 mg de CuSO4∙5H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada.

Después de agitar vigorosamente, usar 10 ml de la solución, el cual contendrá la cantidad

deseada de 2.5 mg, y colocarla en la solución “stock” de sulfatos. Este procedimiento

requiere solo de una dilución serial pero algún componente puede ser sujeto a una o más

diluciones para obtener la cantidad deseada. Una vez que la solución “stock” se ha

realizado, es necesario etiquetar adecuadamente el frasco que lo contiene, con el fin de

evitar errores y prevenir el mantener inadvertidamente de la solución “stock” en reserva

por mucho tiempo, un ejemplo de etiquetado se muestra a continuación.

Solución “stock” NITRATOS

(100X)

Murashige y Skoog (1962)

Use 10 ml/l de medio

14/09/2013

Jorge Méndez

Tipo de solución “stock”

Tipo de medio

Instrucciones

Fecha de elaboración

Nombre de quién lo

elaboró

2.3. Reguladores de crecimiento vegetal (Gaba, VP, 2005)

El proceso de crecimiento y desarrollo de plantas, tales como la germinación, elongación

del tallo, crecimiento y desarrollo de hojas, el florecimiento y crecimiento y maduración de

frutos, son controlados por los reguladores de crecimiento de plantas (RCP) llamados

comúnmente, pero de manera incorrecta, “hormonas de plantas”.



El estudio de la función de RCP puede ser complejo, ya que varios RCP trabajan de

manera típica en concierto con algunos otros y sus concentraciones en la planta cambian

con el tiempo, estación del año y etapa de desarrollo. Algunos RCP son sintetizados

localmente por las células para su propio consumo, mientras que otras son sintetizadas

en un órgano y transportado a otras partes de la planta para una acción específica, por lo

que en este caso su actividad puede ser muy similar a una “hormona” para la planta y son

referidos como RCP endógenos. En esta sección solo se describirán los RCPs naturales y

sintéticos identificados y comúnmente suministrados a plantas intactas y a cultivo de

tejidos, esto es RCP exógenos.

La concentración de RCP exógenos en los tejidos es determinada por la tasa relativa de

síntesis y la tasa de degradación (consumo) o conjugación. Los RCP exógenos son

aplicados a plantas en el campo para obtener respuestas agrícolas importantes, tales

como la defoliación del algodón o el crecimiento o el madurado de frutas tales como uvas

y duraznos. En el cultivo de tejidos vegetales, pequeños explantes son transferidos al

medio de cultivo. Frecuentemente cada explante es muy pequeño como para tener el

RCP necesario para una respuesta al desarrollo o al crecimiento. Sin embargo,

suministrando el medio con RCP exógenos es posible estimular la respuesta deseada del

tejido de planta, incluyendo el efecto de los RCP endógenos presentes en el explante.

Diferentes RCP análogos tienen diferentes efectos, dependiendo de la estructura química,

tejido de planta y genotipo. Algunas veces es necesario mezclar diferentes RCP del

mismo o diferente tipo para obtener el resultado deseado, o para obtener tratamientos

secuenciales con diferentes RCP.

Aunque el papel de los RCP en el cultivo de tejidos vegetales es crítico, los RCP

interactúan dentro de importantes determinantes biológicos. El factor más importante en el

cultivo de tejidos vegetales, es el genotipo; en otras palabras, la habilidad genética del

material vegetal para producir la respuesta deseada. Por ejemplo, algunas especies o

cultivos regeneran brotes, o producen embriones somáticos, con una relativa pequeña

estimulación, mientras que otros no. De forma adicional, el estado fisiológico del material

vegetal podrá determinar la respuesta biológica. Por lo tanto, ciertas partes de plantas

(explantes) tendrán una mejor respuesta que otros en el mismo lapso de tiempo.

Existen cinco principales grupos de RCP endógenas: auxinas, citocininas, giberelinas,

ácido abcísico y etileno. Muchos de éstos grupos tienen múltiples roles en el crecimiento y

desarrollo de plantas, y son muy usadas para la manipulación de plantas en el cultivo de

tejidos. Todos ellos pueden ser divididos en tres grupos, mismos que a continuación se

revisarán.

2.3.1. Auxinas

El primer RCP aislado fue la auxina endógena (natural), ácido indol-3-acético (AIA) (Fig.

3A). El AIA es rápidamente degradado ya sea en el medio de cultivo o en la planta, sin



embargo, existen análogos químicos más estables con los que pueden ser sustituidos.

Son llamados auxinas, debido a su actividad biológica similar al AIA. Auxinas sintéticas

tales como el 2,4-D (Fig. 3B), el ácido 3-indol butírico (AIB) (Fig. 3C) y al ácido 1-

naftalenacético (ANA) (Fig. 3D) son los más frecuentemente usados. Es interesante notar

en las auxinas las similitudes de las estructuras químicas.

Las auxinas tienen diversos papeles en el cultivo de tejidos, de acuerdo a su estructura

química, su concentración y al tejido de la planta a ser afectado. Las auxinas causan la

producción de callos y raíces tanto como el crecimiento en extensión de tallos. Las

auxinas generalmente estimulan la elongación celular, la división celular en el tejido del

cambium, y junto con la citocininas (próxima sección), estimulan la diferenciación del

floema y del xilema. Además, a altas concentraciones de una auxina exógena puede ser

inducido la embriogénesis somática. La función esencial de auxinas y citocininas es la

reprogramación de células somáticas que habían estado previamente en un estado de

diferenciación. La reprogramación causa desdiferenciación y los rediferencía a una nueva

vía de desarrollo. De esa manera, una célula que había sido destinada a desarrollarse

como parte de una hoja, por ejemplo, puede llegar a ser embriogénica, produciendo

embriones somáticos. El mecanismo por el cual una auxina causa desdiferenciación no es

aun conocido. Altas concentraciones de auxinas exógenas pueden causar toxicidad, en

gran parte porque ellas estimulan la producción de etileno, el cual causa inhibición al

crecimiento.

Figura 3. Estructuras químicas de algunos RCP tipo auxinas. (A) Ác. Indol-3-acético (AIA); (B) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D); (C) ácido 3-indol-butirico (AIB); (D) ácido 1-naftalenacético (ANA) Tomado de: (Gaba, VP, 2005)



Ejemplo: enraizado de brotes in vitro, el requerimiento de auxinas

Frecuentemente es necesario enraizar brotes in vitro, con el objetivo de convertir los

brotes a una planta funcional para así transferirlos a un invernadero. Los brotes con raíces

generalmente crecen rápido en un cultivo. En muchas especies de plantas (e.g. especies

de Nicotiana, pepino, especies de Acacias y algunos cultivos de rosas) la generación de

raíces en brotes in vitro se realiza fácilmente después de la transferencia de un medio de

regeneración, que por lo general contiene un alto nivel de citocinina, a un medio sin RCP.

El tratamiento con auxinas in vitro es análogo a los tratamientos para enraizados con

auxinas practicados por los jardineros. Las auxinas pueden inducir la iniciación radicular

después de pocas horas de su aplicación. Comúnmente el AIA (0.6-60 µM), AIB (2.5-1.5

µM) y/o ANA (0.25-6 µM) son usados para promover el enraizado in vitro. No todas las

auxinas indicadas tienen la misma eficiencia de promover el enraizado, su efectividad

varía con la especie de planta, aunque rutinariamente no tiene importancia el tipo de

auxina usada para enraizar. Es importante notar que la concentración de auxina provee

una mayor cantidad de raíces, pero esa concentración no produce mayores tasas de

sobrevivencia.

Ocasionalmente mezclas de auxinas, usualmente a bajas concentraciones comparadas

cuando se emplean solas, pueden promover la iniciación radicular mientras que auxinas

individuales no muestran actividad, como se ha visto en el olivo, Eucalyptus, Hevea y

Vitis. Altas concentraciones de auxinas pueden ser requeridas para inducir el

enraizamiento, las cuales pueden causar efectos colaterales indeseables, tales como la

inhibición al crecimiento de raíces inducidas y disturbio subsecuente del crecimiento de la

planta.

2.3.2. Citocininas

Las citocininas causan división celular. Cada división celular puede dirigir a regeneración

de brotes in vitro, por estímulo a la formación de brotes apicales meristemáticos y,

subsecuentemente a yemas. El término citocinina es usado para componentes con

actividad biológica similar. Además, la división celular causada por citocininas puede

producir callos no diferenciados. Generalmente, una alta concentración de citocininas

bloqueará el desarrollo de raíces. Las citocininas pueden causar la liberación de

dominancia apical de brotes, por lo tanto, estimulará el crecimiento de yemas laterales

resultando en múltiples formaciones de brotes. La primera citocinina aislada fue la cinetina

(Fig. 4A); un poco después de su descubriendo, la adenina fue identificada como

poseedora de actividad de citocininas (Fig. 4C), tales como muchos derivados de la

adenina (Fig. 4). La zeatina (Fig.4C) y la N6-2-isopentenil adenina (2-iP; Fig. 4D) son otras

dos citocininas que se encuentran de forma natural que se usan frecuentemente en cultivo

de tejidos. Adicionalmente, la citocininas sintética 6-benciladenina (BA) (también conocida

como 6-bencil aminopurina [BAP]; Fig. 4E) y thidiazuron (TDZ, Fig. 4F) son también



usadas en el cultivo de tejidos vegetales. La zeatina ribósido es un ejemplo de un RCP

acomplejado con una molécula de azúcar, alterando sus propiedades biológicas de un

RCP (Fig. 4 G).

Figura 4. Estructuras químicas de algunos RCP tipo citocininas. (A) cinetina; (B) adenina; (C) zeatina; (D) N6-2-isopentenil adenina (2-iP); (E) 6-benciladenina; (F) thidiazuron (TDZ); (G) zeatina ribósido Tomado de: (Imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005)



Ejemplo: Uso de citocininas en micropropagación

La micropropagación es la producción en masa de plantas in vitro para propósitos

comerciales. La micropropagación es realizada a través de la multiplicación de brotes

seguido del enraizamiento (generalmente también in vitro), o más raramente de

embriogénesis somática. La multiplicación de brotes, proceso que como ya se indicó es

de tipo industrial, con el fin de producir gran número de plantas libres de patógenos para

horticultura, donde el costo del producto final es importante. En el diseño de un proceso

de micropropagación, lo mejor es evitar las formas inestables de multiplicación, tales

como callos, debido a la probable variación somaclonal. Por ello, la vía principal para

micropropagación es el de utilizar brotes auxiliares, conocidos por su estabilidad genética.

La multiplicación de brotes es inducida por la aplicación de citocininas exógenas en el

medio de crecimiento. Las citocininas aplicadas rompen la dominancia apical de brotes

(en plantas dicotiledóneas), estimulando el crecimiento de yemas auxiliares a brotes. Una

alta concentración de citocininas aplicadas puede causar el crecimiento de pequeños

brotes, los cuales fallan al desarrollo.

2.3.3. Giberelinas

Las giberelinas son otro tipo de RCP con cerca de 100 diferentes variantes identificadas

de varias fuentes, todas ellas basadas en la misma estructura de giberelano. La actividad

de giberelinas exógenas aplicadas varía con el tipo de giberelinas y la especie de plantas

tratadas. Las giberelinas comúnmente aplicadas en el cultivo de tejidos vegetales es el

GA3, también conocida como ácido giberélico (Fig. 5A). Aunque las giberelinas tienen

importantes papeles en el ciclo de vida de plantas (controlando longitud del tallo,

florecimiento y secado del fruto), en el cultivo de tejidos el GA3 ha sido generalmente

usado para estimular ya sea la elongación del brote o la conversión de yemas a brotes.

GA3 interfiere con la iniciación de las yemas en estados muy tempranos de la formación

del meristemo, por lo que puede reducir la producción de brotes in vitro si se adiciona a

los cultivos de tejidos vegetales en la etapa de iniciación de brotes. De forma similar, GA3,

reduce la formación de raíces y la embriogénesis in vitro. Por lo anterior, para usos

prácticos, es necesario optimizar los efectos de la etapa específica de GA3.

Ejemplo: Efecto de giberelinas en la prolongación (extención) de tallos

Las giberelinas fueron descubiertas debido al efecto de la estimulación del crecimiento

sobre la elongación de plantas. Las giberelinas son principalmente usadas en el cultivo de

tejidos vegetales para estimular la elongación celular, produciendo por lo tanto elongación

de brotes. El uso de giberelinas en un medio de elongación es un método valioso para



convertir yemas a brotes funcionales. Por ejemplo, en algunas variedades de melón y

calabacín después de la inducción de brotes sobre el medio con AB (5 µM), la elongación

de brotes es mejor estimulada con un medio con una concentración reducida de

citocininas (0.5 µM) y la adición de AG3 (1.5-3 µM).

2.3.4. Ácido abscísico

El ácido abscísico (ABA; Fig. 5A) ha sido principalmente usado en cultivo de tejidos

vegetales para facilitar la maduración de embriones somáticos. En ciertas especies, los

embriones no pueden ser madurados adecuadamente por la falta de ABA exógeno. La

función del ABA exógeno es similar durante el desarrollo de semillas en plantas

monocotiledóneas, dicotiledóneas y coníferas. El ABA induce la formación de proteínas

esenciales LEA (late embriogenesis abundant) encontradas en etapas de embriogénesis

tardía en ya sea embriones somáticos o sexuales. Ocasionalmente, ABA puede estimular

algún proceso de regeneración y, raramente, puede también reducir la producción de

embriones somáticos. ABA es el único integrante de esta clase.

Figura 5. Estructuras químicas de RCP de acciones variadas. (A) Ácido giberélico (GA3); (B) ácido abscísico (ABA); (C) etileno; (D) ancymidol Tomado de: (imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005).



2.3.5. Etileno

El etileno es el único RCP gaseoso natural (Fig. 5C). A pesar de que el etileno se conoce

sobre todo en biología de plantas por sus efectos en la maduración de frutas, este es

naturalmente producido por todos los órganos de la planta superior en una manera

controlada. En el cultivo de tejidos de plantas, el etileno producido endógenamente puede

acumular en un recipiente cerrado a niveles que son perjudiciales para el crecimiento y

desarrollo de plantas. El resultado en especies sensibles al etileno, se muestra en un

síndrome típico de la reducción de la elongación del tallo, restringido crecimiento de hojas,

prematura senescencia foliar y, algunas veces, incremento en el crecimiento de yemas

auxiliares. Mejorando concentraciones de etileno, se puede estimular la formación de

callos, reduciendo la regeneración de yemas y brotes. La embriogénesis somática puede

ser afectada por la concentración de etileno –bajas concentraciones estimulan, mientras

que altas concentraciones lo inhiben.

Actividades

La elaboración de las actividades estará guiada por tu docente en línea, mismo

que te indicará, a través de la Planeación didáctica del docente en línea, la dinámica

que tú y tus compañeros (as) llevarán a cabo, así como los envíos que tendrán que

realizar.

Para el envío de tus trabajos usarás la siguiente nomenclatura: BCTV1

_U2_A1_XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la

unidad de conocimiento, A1 es el número de actividad, el cual debes sustituir

considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y

la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.

Autorreflexiones

Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de Autorreflexión indicadas por tu docente en línea y enviar tu archivo. Cabe recordar que esta actividad tiene una ponderación del 10% de tu evaluación. Para el envío de tu autorreflexión utiliza la siguiente nomenclatura: BCTV1 _U2_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la

asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu

nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu

apellido materno



Cierre de la unidad

Hemos realizado un breve atisbo sobre la historia en el desarrollo de medios de cultivo,

conocemos ahora que el cultivo de tejidos vegetales es importante comercialmente y en la

actualidad se emplea como una herramienta de investigación en campos

multidisciplinarios.

Uno de los principales pasos para desarrollar estas técnicas es el de conocer los

diferentes ingredientes que conforman el medio de cultivo y su función, por lo que, en la

siguiente unidad, concluiremos con la construcción del conocimiento relacionada al

establecimiento físico de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

Para saber más

Catálogo de medios de cultivo de tejidos vegetales, Sigma-Aldrich.

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/plant-

tissue-culture/product-lines.html

Academia Alemana de Ciencias

http://www.leopoldina.org/en/about-us/

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/plant-tissue-culture/product-lines.html

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/plant-tissue-culture/product-lines.html

http://www.leopoldina.org/en/about-us/



Fuentes de consulta

La gran mayoría de citas se encuentran referenciadas directamente en los documentos

revisados de Smith HR (2013) y Trigiano RN - Gray DJ (2005).

Beyl CA, (2005). Getting started with tissue culture: Media preparation, sterie technique, and

laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray DJ. Plant development and

biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6

Bhojwani, S.S., y Razdan, M.K. (1983). Plant tissue culture: Theory and practice:

Developments in crop science. Amsterdam: Elsevier.

Gautheret, R.J. (1985). “History of plant tissue and cell culture: A personal account”. En: I.K.

Vasil (Ed.) Cell culture and somatic cell genetics of plants (Vol. 2, pp. 1-59). New

York:Academic Press.

Haberlandt, G. (1902). Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad. Wiss.

Wien, Math,-Naturwiss. Kl., Abt. 1, 111, 69-92.

Laimer M. y Rücker W. (Eds) 2003. Plant Tissue Culture, 100 years since Gottlieb Haberlandt.

Vienna: Springer-Verlag Wien. ISBN 978-3-211-83839-6

SciPh (2013). Science photo library. London, UK. http://www.sciencephoto.com/

Thorpe T.A. (2013). History of plant cell culture. En: Smith HR. Plant Tissue Culture,

techniques and experiments (2 ed.). USA: Academic Press. ISBN 978-0-12-415920-4.

White, P.R. (1963). The cultivation of animal and plant cells (2ª ed.) New York: Ronald Press.

http://www.sciencephoto.com/



ANEXO

Nombres de algunos compuestos químicos que aparecen en esta etapa.

Compuesto Nombre

NH4NO3 Nitrato de amonio

NH4H2PO4 Fosfato de amonio monobásico

(NH4)2SO4 Sulfato de amonio

CaCl2∙2H2O Cloruro de calcio dihidratado

Ca(NO3)2∙4H2O Nitrato de calcio tetrahidratado

MgSO4∙7H2O Sulfato de magnesio

heptahidratado

KCl Cloruro de potasio

KNO3 Nitrato de potasio

K2SO4 Sulfato de potasio

KH2PO4 Fosfato de potasio monobásico

NaH2PO4 Fosfato monosódico anhidro

Na2SO4 Sulfato de sodio

H3BO3 Ác. Bórico

CoCl2∙6H2O Cloruro de cobalto hexahidratado

CuSO4∙5H2O Sulfato de cobre pentahidratado

Na2EDTA Ácido etilendiaminotetraacético,

sal disódica

Fe2(SO4)3 Sulfato férrico

FeSO4∙7H2O Sulfato ferroso heptahidratado

MnSO4∙H2O Sulfato de manganeso hidratado

KI Ioduro de potasio

MoO3 Trióxido de molibdeno

Na2MoO4∙2H2O Molibdato de sodio dihidratado

ZnSO4∙7H2O Sulfato de zinc heptahidratado

cultivo de tejidos vegetales i unidad 2. medios de cultivo

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