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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA EDAD, RAZA Y SEXO EN LA LONGITUD DE LOS TELÓMEROS DE
CÉLULAS SANGUÍNEAS DE CABALLOS MEDIANTE EL USO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA EN TIEMPO REAL
Lourdes Sanmartín Sánchez
Córdoba, año 2012
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA EDAD, RAZA Y SEXO EN LA LONGITUD DE LOS TELÓMEROS DE CÉLULAS SANGUNEAS
DE CABALLOS, MEDIANTE EL USO DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL
Trabajo Fin de Máster realizado por
Lourdes Sanmartín Sánchez
Y dirigido por
Dr. D. José Luis Vega Pla
Para la obtención del título de
Máster de Zootecnia y Gestión Sostenible: Ganadería Ecológica e Integrada de la Universidad de Córdoba
Córdoba, 20 de noviembre del 2012
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Evaluación del efecto de la edad, raza y sexo en la longitud de los telómeros de células sanguíneas de caballos, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Lourdes Sanmartín Sánchez
RESUMEN.
Los telómeros son estructuras especializadas presentes en los extremos finales
de los cromosomas eucariotas, que juegan un importante papel en el
mantenimiento de la estabilidad e integridad celular. La longitud de los
telómeros ha sido determinada mediante diversas técnicas, estableciéndose
como uno de los posibles biomarcadores del envejecimiento celular. Con el
objetivo de determinar si la longitud de los telómeros se ve afectada no sólo por
la edad, sino también por otros factores como la raza o el sexo en caballos, se
tomaron muestras de sangre de 175 caballos de Pura Raza Española, Pura
Raza Inglés y Pura Raza Árabe, de distintos grupos de edad y de ambos
sexos. Se extrajo el DNA y se amplificó una secuencia repetitiva
correspondiente a los telómeros, junto a la de un gen de copia única
(Interleukina-2), mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la
Polimerasa a tiempo real (qPCR), y se estimó la longitud relativa de ambos.
Los resultados mostraron que existe correlación negativa entre la edad y la
longitud de los telómeros (R= -0,31, p<0,05), aunque no se encontró efecto
significativo ni de la raza, ni del sexo.
Palabras clave: caballo, telómero, Reacción en Cadena de la Polimerasa
(qPCR) edad, raza, sexo.
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INTRODUCCIÓN.
Los telómeros son estructuras cromatínicas especializadas que se
encuentran localizadas en los extremos de los cromosomas de la células
eucariotas. El DNA telomérico (DNAt) consiste en repeticiones en tándem de
pequeñas secuencias nucleotídicas (TTAGGG) con una distribución asimétrica
de los pares de bases de Guanina y Citosina (1). Están implicados en muchas
funciones celulares, especialmente las relacionadas con el control de la
duración de la vida de las diferentes estirpes celulares, y en otras como la
mitosis. Los telómeros protegen el final de los cromosomas aportando
estabilidad durante la replicación celular (2), jugando también un papel
fundamental en la respuesta celular al estrés y en consecuencia, sobre el daño
directo al DNA (3).
Se han puesto de manifiesto evidencias del acortamiento de los telómeros
asociadas directamente con el envejecimiento (4). De hecho, se ha sugerido
que este fenómeno sea la mayor causa de senescencia celular prematura (5,6),
como se muestra en numerosos estudios, tanto en la especie humana (7-9),
como en algunas especies animales (10-12). Así, Cawthon y col. (13)
encontraron correlación positiva entre el riesgo de muerte y el acortamiento de
los telómeros de humanos mayores de 60 años. Asimismo, otros estudios han
puesto de manifiesto correlaciones positivas entre el acortamiento de los
telómeros y una gran variedad de enfermedades relacionadas con la edad (14-
18).
El análisis para poner de manifiesto el acortamiento de estas estructuras
puede ser un indicador adicional para valorar el riesgo de padecer
enfermedades relacionadas con la edad, y en consecuencia, con la mortalidad
temprana en équidos. Este hecho podría ser muy significativo para el diseño de
planes de cubrición y selección de reproductores en el mundo equino. Además
dado que los mecanismos subyacentes, así como los factores que influyen en
la variación de la longitud de los telómeros, dentro y entre razas, son poco
conocidos; resulta de interés avanzar en la influencia de factores como la edad,
la raza y el sexo. Entre los métodos que se utilizan para la medición de la
longitud de los telómeros destacan: el análisis de fragmentos de restricción
terminales (TRF); la prueba de citometría de flujo de células y fluorescencia in
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situ (Flow-FISH); el análisis de fluorescencia mediante hibridación in situ (FISH)
con sonda PNA y la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR). Con la
excepción del ensayo de TRF, todos los métodos generan una medida relativa
de la longitud de los telómeros (19-21). Las ventajas de usar la qPCR es que, a
diferencia de los ensayos basados en la hibridación de sondas, se requieren
pequeñas cantidades de DNA y se pueden procesar un gran número de
muestras simultáneamente. Sin embargo, en muestras equinas todavía no ha
sido utilizada como herramienta para estimar la longitud de los telómeros.
Por tanto, se plantea como objetivo estudiar la longitud de los telómeros
en células sanguíneas, en ambos sexos, de caballos Pura Sangre Inglés, Pura
Raza Árabe y Pura Raza Español, mediante la técnica qPCR. Además, se
pretende comprobar si el incremento de la edad puede asociarse a una
reducción de la longitud de los telómeros usando la técnica citada.
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MATERIAL Y MÉTODOS.
Muestras.
Se seleccionaron 175 caballos de las razas Pura Raza Española (PRE)
Pura Raza Árabe (PRá) y Pura Sangre Inglés (PSI), procedentes del
Organismo Autónomo Cría Caballar de las Fuerzas Armadas del Ministerio de
Defensa. En la Tabla 1 se indica la conformación de la muestra
Tabla 1. Distribución de la muestra en función de la raza, sexo, edad. Se seleccionaron tres
grupos de edad con un tamaño muestral semejante para ambos sexos y que representan las
subpoblaciones de cada raza objeto de estudio.
Raza Sexo <1 año 9 años 21-28 años Total
PRE Hembra Macho
9 10
10 10
10 9
29 29
PRá Hembra Macho
9 10
10 10
9 9
28 29
PSI Hembra Macho
10 10
10 10
19 1*
39 21
Total 58 60 57 175
PRE: Pura Raza Español; PRá: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés 1* Sólo fue posible disponer de una muestra para su análisis
Extracción del DNA.
Las muestras se procesaron según un protocolo estándar para la
extracción del DNA. Inicialmente, se diluyeron en proporción 1/40 en TE (Tris-
HCl 10 mM; pH 7,5; EDTA 1 mM), se agitaron y se centrifugaron eliminando el
sobrenadante. A continuación, se añadieron 100 ul de TE, se agitaron y se
centrifugaron de nuevo; repitiendo este mismo proceso otras dos veces. Tras el
último centrifugado, el botón celular se resuspendió en 100 ul de una solución
que contiene Proteinasa K (Tris-HCl 10 mM, pH 8,5; MgCl2 2,5 mM; KCl 50
mM; Tween 20 al 0,5 %; Proteinasa K 100 ug/ml). Las muestras resuspendidas
se calentaron progresivamente; primero, a 56 ºC durante 45 min, a
8
continuación a 95 ºC durante 10 min, para posteriormente enfriarlas hasta
alcanzar una temperatura final de 8 ºC. Por último, se sellaron con papel
adhesivo plástico transparente y se almacenaron en congelación hasta el
momento en que se realizó el ensayo.
Amplificación mediante q PCR.
Mediante la técnica de qPCR se determinó, para cada muestra, la
fluorescencia acumulada. La cantidad de producto amplificado está
directamente relacionado con el incremento de fluorescencia. El procedimiento
para calcular la longitud de los telómeros se basó en el propuesto por Cawthon
y col. (19), que consiste en obtener una medida relativa de la longitud
mediante la amplificación de una secuencia repetitiva (TGAGGG)n propia de
los telómeros en mamíferos, usando un gen de copia única, Interleukina-2 (IL-
2) como calibrador de la amplificación. Se determinó la diferencia de ciclos de
cuantificación (Cq) entre ambas amplificaciones. La longitud relativa de los
telómeros se calculó como la relación de repeticiones teloméricas frente al gen
de copia única.
La composición de las reacciones de qPCR para la secuencia de
telómeros e IL-2 fueron idénticas, excepto para la composición
oligonucleotídica de los cebadores. Las concentraciones de reactivos utilizadas
corresponden a :1% EvaGreen (Biotum);Tris-HCl, pH 8, 15 mM ; KCl 50 mM;
MgCl2 3 mM;, dNTP 0,2 mM; MyTaq (Bioline) 0,5 U. La concentración final de
los cebadores fue de 0.3 µM. Se prepararon dos soluciones madre, una de
ellas con la pareja de cebadores para telómeros, y la otra con la pareja para
IL-2. Se añadieron 8,75 µl de la solución madre y 1,25 µl de cada muestra. Las
secuencias de los cebadores de telómeros (5´ 3´) fueron: Tel1: GGT TTT
TGA GGG TGA GGG TGA GGG TGA GGG TGA GG GT; Tel2: TCC CGA CTA
TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA TCC CTA; y para la IL-2 fueron IL-2
A: GGG AAA CAC AGC AAC TG; IL-2 B: GCC TTC TTG GGG ATG TTA AT.
Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador Rotor-Gene 6000
(Corbett Research Ltd, Cambridge, UK). Se programó un primer ciclo de
activación de la polimerasa de 95 ºC durante 1 min, 40 ciclos de 95 ºC 20 s, 60
ºC 30 s y 72 ºC 20 s, haciendo lecturas de fluorescencia en el último paso de
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cada ciclo térmico. Finalmente, se sometieron las muestras a un incremento
progresivo de temperatura para calcular el punto de fusión de los fragmentos
amplificados (desde 60ºC hasta 95ºC, elevándose la temperatura 1 ºC en cada
paso de 5 s). Se procesaron 34 muestras en cada tanda, realizándose la
amplificación de los telómeros y del gen de la IL-2 en pocillos diferentes
durante el mismo proceso de amplificación. Se utilizó una muestra de
referencia en todas las tandas para permitir la comparación de los resultados
en diferentes ejecuciones.
Cálculo del ciclo de cuantificación.
Dado que no se usaron curvas estándar para el cálculo del ciclo de
cuantificación (Cq), El Cq se determinó como el primer punto detectado a un
80% por debajo del nivel máximo de amplificación exponencial obtenido al
aplicar un cálculo de la segunda derivativa de la curva (Figura 1). Los datos
brutos de cada PCR se procesaron mediante el módulo de análisis
Comparative Quantitation (Rotor-Gene 6000 software, Corbett Research Ltd,
Cambridge, UK). Finalmente, se realizó un análisis de las curvas de fusión para
comprobar que las amplificaciones generaron fragmentos con características
similares en cuanto a su composición. Asimismo, se tipificó una misma muestra
en todas las tandas como calibrador y compensar las diferencias entre
experimentos. Por otro lado se tipificó una batería de 24 muestras en días
diferentes para comprobar si los resultados serían reproducibles.
Adicionalmente, algunas muestras fueron sometidas a una electroforesis
para observar si el tamaño de los fragmentos generados en la amplificación era
el esperado. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1% con una
solución de TBE (Tris 1,21 %; Ácido Bórico 0,62 %; EDTA 0,07 %). Se
mezclaron 10 µl del producto de la amplificación con 3 µl de una solución de
glicerol con colorantes (Azul de Bromofenol y Xilencianol). Se sumergió el gel
en un tampón TBE al que se le añadió 5 µl de un intercalante (Gold view©). Se
cargaron las muestras junto con un marcador de peso molecular (Cetimarker©)
en la columna control. El gel se sometió a un campo eléctrico hasta que los
colorantes indicaron la separación de las muestras. El gel fue expuesto a luz
10
ultravioleta para que el intercalante unido al DNA de las muestras se hiciera
visible y fotografiable.
2 deriv.
Cq
Figura 1. Determinación del ciclo de cuantificación: es el primer punto detectado a un 80% por debajo del nivel máximo de amplificación. (Abreviaturas; Cq.: ciclo de cuantificación; 2 deriv: segunda derivativa).
La estrategia seguida para determinar la longitud relativa de los telómeros
consistió en determinar la diferencia entre el número de ciclos en que se
adelanta la amplificación de las secuencias teloméricas con respecto al gen de
copia única para cada muestra de DNA. Dado que la cantidad de producto
amplificado se duplica aproximadamente en cada ciclo, la longitud relativa de
los telómeros se puede determinar según la fórmula del T/S ratio propuesta por
Cawton y col. (19)
[2Cq (telómeros)/2Cq (IL-2) ]-1 = 2-∆Cq.
La reproducibilidad de la cuantificación se probó mediante la amplificación
de 24 muestras elegidas aleatoriamente. Se realizó un análisis de regresión
lineal entre los Cq de las muestras del día de los análisis iniciales y los Cq
correspondientes a las mismas muestras analizadas otro día distinto.
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Análisis estadístico.
Los caballos fueron agrupados atendiendo a su edad (< 1 año, 9 años,
21-28 años); raza (Pura Raza Español, Pura raza Árabe, Pura Sangre Inglés) y
sexo (machos y hembras). Se calcularon dos variables de respuesta indicativas
de la longitud relativa de los telómeros de cada muestra: la Diferencia entre los
Ciclos de Cuantificación de ambos genes (Dif Cq); y el T/S ratio. Se contrastó
la normalidad y la homocedastidad de los valores obtenidos para ambas
variables, mediante el test de Shapiro y el contraste C de Cochran
respectivamente. Se utilizó un modelo de Análisis de la Varianza de tipo
factorial (ANOVA factorial) para valorar la influencia del efecto de la edad, la
raza y el sexo sobre la en la longitud de los telómeros medida como la Dif Cq.
Se empleó el test de Student Newman Keuls (SNK), para comprobar las
interacciones entre grupos. Para la variable T/S ratio, se utilizó la técnica no
paramétrica de Kruskall-Wallis, y se compararon los grupos de edad dos a dos
mediante el test Mann-Whitney.
Finalmente, se ensayaron varios modelos de regresión para
correlacionar cada variable de respuesta (Dif Cq y T/S ratio) con la edad. La
correlación entre ambas variables de respuesta y la edad fue modelada
mediante el test de correlación de Pearson. Se consideró un p-value menor o
igual a 0,05 suficientemente significativo para la comparación de las variables.
Para los análisis estadísticos se utilizó el software Statgraphics Plus
Professional 16.0.03.
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RESULTADOS
Los productos resultantes de la qPCR correspondientes a la secuencia de
los telómeros amplificaron con ciclos de cuantificación tempranos, siempre a
partir del ciclo 6, si bien en algunos casos llegaron al ciclo 20 de cuantificación.
Por una parte, se observó que la amplificación de secuencias repetitivas
correspondientes a los telómeros generaba gran cantidad de material genético
en algunos casos, mientras que en otros en que se generaron pocas copias
fueron necesarios más ciclos de amplificación. Todo esto, resultó en la gran
variabilidad observada entre los individuos.
CICLO40302010
FLUO
RES
CENC
IA
30
20
10
TELÓMEROS
IL-2
Figura 4. Productos obtenidos mediante qPCR de algunos individuos. Cada pareja de colores corresponde a ambos productos génicos obtenidos de la amplificación de la misma muestra. Las amplificaciones correspondientes a los telómeros despegan en ciclos tempranos, mientras que las correspondientes al gen de copia única lo hacen en ciclos tardíos, constantes y de baja variabilidad.
En el caso de la amplificación del gen de copia única (IL-2), el 80% de las
muestras variaron entre los ciclos 19 y 23. Esta variabilidad, aunque pequeña,
se debió a que el método de extracción empleado no persiguió la purificación
del DNA, sino sólo su liberación mediante la desnaturalización de las proteínas.
No se cuantificó el DNA presente en cada muestra y, por tanto, la cantidad de
material genético en cada qPCR fue diferente. Los productos obtenidos en la
amplificación de cada muestra se organizaron en dos grupos diferenciados, tal
13
como se observa en la Figura 4. Las secuencias de los telómeros se
amplificaron antes que las secuencias del gen de copia única.
Los productos obtenidos en la qPCR se separaron según su peso
molecular mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 5). El gen de
copia única (IL-2) se manifestó como una banda única de peso molecular
constante (215 pares de bases), mientras que los telómeros, dado que se
amplificaron como fragmentos de diferentes longitudes, se observaron como
una mancha. El agua se usó como control negativo sin muestra para poner de
manifiesto la formación de dímeros entre los cebadores, representados como
una banda en torno a 70 pares de bases.
1 2 3 4 5 6 7 8
706
606
406
269 215 115
70
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación de la secuencia de los telómeros (líneas 1, 3 y 6), gen de copia única (líneas 2, 4 y 7) y agua (línea 8). Marcador de pesos moleculares para el rango de 70-706 pares de bases (línea 5).
El análisis de la reproducibilidad reveló linealidad significativa entre las
medidas de Cq obtenidas en los dos diferentes días (R = 0,90 y 0,83, p= 0,00 y
14
p= 0,00, para telómeros e IL-2, respectivamente). El coeficiente de variación
medio en las medidas repetidas fue de 1,52 % y 2,07 %, respectivamente.
Los productos resultantes de la amplificación de cada muestra se
organizaron en función de su ciclo de cuantificación, y se obtuvo la longitud
relativa de los telómeros de cada individuo a través del cálculo de las variables
de respuesta, Dif Cq y el T/S ratio. Los valores obtenidos se organizaron según
los grupos definidos por los factores de estudio (edad, raza y sexo).
En la Tabla 2 se muestran las medias y desviaciones típicas de la
variable Dif Cq en cada grupo. Globalmente, las medias varían entre 8,57 y
10,18. El rango de variación es de 0,35 ciclos (9,42–9,79) entre razas y sexos,
y de 0,83 ciclos entre grupos de edad.
Tabla 2. Descripción estadística de la variable Dif Cq (media ± desviación típica). Raza Sexo <1 año 9 años 21-28 años Media
PRE
Hembra Macho
9,83 (±1,27) 9,54 (±1,26)
9,96 (±0,83) 0,50 (±0,65)
8,59 (±1,87) 8,57 (±2,22)
9,46 (±0,76) 9,54 (±0,97)
PRá Hembra Macho
10,14 (±1,21) 9,58 (±1,61)
9,84 (±1,04) 9,34 (±1,55)
9,41 (±1,30) 9,41 (±1,30)
9,79 (±0,37) 9,44 (±0,12)
PSI Hembra Macho
9,88 (±1,56) 10,18 (±1,96)
9,76 (±1,01) 9,28 (±1,03)
9,41 (±1,30) 8,80 (±0,00)
9,68 (±0,24) 9,42 (±0,70)
Total - 9,86 (±0,27) 9,78 (±0,45) 9,03 (±0,42) PRE: Pura Raza Español; PRá: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés
En la Tabla 3 se muestran las medias obtenidas para la variable ratioT/S
ratio. Al igual que ocurre con la variable Dif Cq, los grupos de edad manifiestan
cierta tendencia respecto al acortamiento de los de los telómeros.
Se determinó si los valores de las variables Dif Cq y ratioT/S ratio se
ajustaron a una distribución normal mediante el Test de Shapiro. Mientras que
la variable Dif Cq mostró buen ajuste (W=0,98, p=0,86), la variable ratioT/S
ratio no se ajustó a una distribución normal (W=0,42, p=0,00).
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Tabla 3. Descripción estadística de la variable ratioT/S ratio (media ± desviación típica). Raza Sexo <1 año 9 años 21-28 años Media
PRE Hembra Macho
1234,93 (±888,12) 1049,92
(±1044,99)
1133,61 (±541,73)
1570,7 (±613,73)
768,34 (±943,42)
1455 (±3252,22)
1045,63 (±245,42) 1358,56
(±273,49)
PRá Hembra Macho
1609,93 (±1782,61)
1288,79 (±1461,64)
1112,82 (±628,793)
1059,1 (±1192,35)
923,94 (±663,35)
543,33 (±338,82)
1215,56 (±354,34)
963,74 (±381.77)
PSI Hembra Macho
1597,35 (±1797,21)
3516,75 (±7543,92)
1081,04 (±772,379)
758,71 (±437,91)
629,33 (±578,14)
445,72 (±0)
1102,57
(±484,37) 1573,73
(±1689,97)
Total 1716,28 (±908,364)
1119,34 (±260,44)
794,27 (±364,89)
PRE: Pura Raza Español; PRá: Pura Raza Árabe; PSI: Pura Sangre Inglés
Para cuantificar el efecto de la edad, la raza y el sexo sobre la variable Dif
Cq se utilizó un modelo de Análisis de Varianza Factorial. Previamente, se
contrastó la igualdad de varianzas mediante el contraste C de Cochran
(C=0,42, p=0,16). Los resultados del Análisis de Varianza Factorial se
muestran en la Tabla 4.
El análisis de varianza mostró que sólo la edad afectó significativamente a
la longitud de los telómeros, medida a través de la variable Dif Cq (F= 5,24;
p<0,05). Se utilizó el test de Student–Newman–Keuls (SNK) para determinar la
existencia de diferencias significativas entre los grupos de edad (Figura 6). El
test SNK indicó que los grupos 1 (< 1 año) y 2 (9 años) fueron homogéneos y
significativamente superiores (p<0,05) al grupo 3 (21 a 28 años).
16
Tabla 4. Análisis de Varianza Factorial: efecto de la raza, sexo y edad sobre la variable Dif Cq. Suma de
cuadrados gl Cuadrado
Medio Cociente-F P-value
Efectos principales
A: edad 20,60 2 10,30 5,24 0,01
B: raza 0,12 2 0,06 0,03 0,96
C: sexo 0,86 1 0,86 0,44 0,50
Interacciones
AB 9,60 4 10,30 5,24 0,30
AC 0,12 2 0,06 0,03 0,99
BC 3,16 2 1,58 0,81 0,44
ABC 3,29 4 0,82 0,42 0,79
gl: grados de libertad
Figura 6. Intervalos de confianza para las medias de la variable Dif Cq en los tres grupos de edad evaluados (Abreviaturas de Código edad; 1: < 1 año; 2: 9 años; 3: 21-28 años).
Código edad
Dife
renc
ia d
e C
q
1 2 38,48,7
99,39,69,9
10,210,5
Se realizaron análisis homólogos no paramétricos para determinar el
efecto de la raza, sexo y edad sobre la variable ratioT/S ratio, dado que los
valores obtenidos no se ajustaron a una distribución normal. El test de Kruskal-
17
Wallis reveló que sólo la edad afecta de modo significativo al ratioT/S ratio
(p<0,05). Para establecer niveles de homogeneidad, se compararon las medias
dos a dos mediante el test no paramétrico de Mann-Whitney. Los resultados se
muestran en la Figura 7. La longitud de los telómeros medida mediante el
ratioT/S ratio es similar y significativamente inferior (p<0,05) en los grupos 2 (9
años) y 3 (21 a 28 años).
Código edad
Rat
io T
/S
1 2 30
400
800
1200
1600
2000
2400
Figura 7. Intervalos de confianza para las medias de la variable ratioT/S ratio en los tres grupos de edad evaluados (Abreviaturas de Código edad; 1: < 1 año; 2: 9 años; 3: 21-28 años).
Los resultados mostraron que la edad es el único factor con efecto
significativo sobre ambos indicadores de la longitud de los telómeros. Para
conocer la relación existente entre la edad, medida como variable métrica, y
ambos indicadores de la longitud de los telómeros, se obtuvieron los
coeficientes de correlación de Pearson. Asimismo, se utilizaron diferentes
modelos de regresión simple para estudiar si es posible predecir la longitud de
los telómeros a partir de la edad.
La correlación entre ambos indicadores, Dif Cq y ratioT/S ratio, fue de
0,64 (p=0,00), mientras que la correlación entre la edad y la Dif Cq y el ratioT/S
ratio fue de -0,31 (p=0,00) y -0,16, (p=0,00), respectivamente. Finalmente, para
determinar modelos que expliquen la relación entre la edad y ambos
18
indicadores se probaron los modelos de regresión simple que se indican en las
Tablas 5 y 6.
La relación entre la edad y la Dif Cq, no mostraron buen ajuste en ninguno
de los modelos alternativos. El mayor coeficiente de determinación
corresponde al modelo inverso, aunque sólo es de 0,11.
Tabla 5. Correlaciones y coeficientes de determinación (R2) de diferentes modelos de regresión simple entre la edad a partir de la Dif Cq..
Modelo Coeficiente de correlación
Coeficiente de determinación
Inverso-Y: Y = 1/(a + b*X) 0,33 0,11
Exponencial: Y = exp(a + b*X) -0,32 0,10
Raíz Cuadrada-Y: Y = (a + b*X)^2 -0,32 0,10
Lineal Y = a + b*X -0,31 0,09
Raíz Cuadrada-X: Y = a +b*sqrt(X) -0,27 0,07
En la Tabla 6 se indican los modelos alternativos para explicar la relación
entre la edad y el ratioT/S ratio. De modo análogo a la variable Dif Cq, ningún
modelo mostró un coeficiente de determinación aceptable. El mayor coeficiente
de determinación corresponde a los modelos inverso y exponencial, aunque
sólo de 0,09.
Tabla 6. Correlaciones y coeficientes de determinación (R2) de diferentes modelos de regresión simple entre la edad a partir del ratioT/S ratio.
Modelo Coeficiente de correlación
Coeficiente de determinación
Inverso-Y: Y = 1/(a + b*X) 0,30 0,09
Exponencial: Y = exp(a + b*X) -0,31 0,09
Raiz Cuadrada-Y: Y = (a + b*X)^2 -0,25 0,06
Lineal Y = a + b*X -0,16 0,03
Raiz Cuadrada-X: Y = a +b*sqrt(X) -0,17 0,03
19
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se han mostrado evidencias de que los telómeros
de las células sanguíneas de la serie blanca de caballos (Equus caballus), se
acortan con la edad, efecto que se ha podido revelar mediante la técnica
qPCR. Asimismo, también se ha estudiado la variación de la longitud relativa
de los telómeros en tres razas equinas y en ambos sexos, aunque sin
encontrar efectos significativos.
Las ventajas que presenta el uso de la técnica de PCR en tiempo real
para la medida de la longitud absoluta de los telómeros, así como el cálculo del
ratioT/S ratio mediante qPCR han sido expuestas en algunos trabajos (19-21).
La qPCR simplifica enormemente el cálculo relativo de la longitud de los
telómeros. Cawton y col. (19) encontraron una correlación significativa entre la
longitud relativa obtenida con la qPCR y la longitud calculada mediante
técnicas de hibridación (19). Es por ello que se ha utilizado este cálculo para la
estimación de la longitud relativa y la asociación con la edad. Sin embargo, se
hace necesario profundizar aún más en el cálculo de la longitud mediante esta
técnica, ya que si bien las pruebas de reproducibilidad fueron satisfactorias, se
ha observado que pequeñas variaciones en el ciclo de cuantificación (Cq) se
magnifican cuando se usan las variables definidas como la Dif Cq o el ratioT/S
ratio para el cálculo de la longitud.
En este estudio se han utilizado dos variables que indican la longitud
relativa de los telómeros. La comparación de las mismas ha mostrado que,
aunque la variable ratioT/S ratio sea un indicador directo de la longitud relativa,
no es un buen estimador del acortamiento relacionado con la edad. Además, la
determinación de la variable ratioT/S ratio requiere calcular previamente la Dif
Cq, y ambas variables están positivamente correlacionadas. Por otra parte, la
variable Dif Cq presenta una asociación más fuerte con la edad que la variable
ratioT/S ratio. Estos resultados están en línea de O’Callaghan y Fenech (21),
quienes obtuvieron mejores estimaciones mediante la técnica de PCR frente al
ratioT/S ratio propuesto por Cawton y col. (19). De esta forma, no parece
necesario convertir la Dif Cq en la variable ratioT/S ratio, para abordar estudios
de asociación con variables como la raza, sexo u otras.
20
Por otra parte, aunque se haya encontrado una asociación negativa más
fuerte entre la longitud y edad en équidos (22), en el presente trabajo se han
analizado muestras procedentes de un gran número de animales distribuidos
en tres grupos de edad muy concretos, pudiéndose establecer diferencias
significativas entre los grupos de edad 1 (<1 año) y 3 (21-28 años), en todas las
razas estudiadas y ambos sexos, y coincidentes cuando se usan las variables
la Dif Cq o longitud relativa como estimadores de longitud. Además, ha sido
posible mostrar con ambas medidas, que las diferencias de longitud se
estabilizan en los individuos de mediana edad. Estos hallazgos están en la
misma línea que los mostrados por Aubert et al. (3).
El estudio de la longitud de los telómeros en células del sistema inmune,
como los leucocitos de sangre periférica, ha sido usado para inferir
directamente sobre la longitud en células madres hematopoyéticas (3). Sin
embargo, las diversas poblaciones de glóbulos blancos no mantienen el mismo
ritmo de replicaciones a lo largo de la vida del individuo. Prueba de ello es que
el número de replicaciones que separan las células madre de los granulocitos
es relativamente constante, mientras que en las poblaciones de linfocitos el
número de divisiones es más variable y aumenta con la edad. Consecuencia de
cada ciclo replicativo se produce acortamiento de los telómeros (3). En el
presente estudio se han utilizado muestras de sangre congelada como fuente
de DNA, por lo que no ha sido posible determinar el recuento leucocitario, ni la
fórmula leucocitaria, ni las características implícitas (grado de maduración,
formas anómalas...etc.), ni la idiosincrasia individual (status sanitario,
enfermedades concomitantes…etc.). Estos factores junto con la alta
variabilidad en la longitud de los telómeros a una edad dada podrían ser
considerados atenuantes en la fuerza de la correlación entre la edad y la
longitud, lo que explicaría parcialmente los resultados obtenidos.
Desde que estudios previos en humanos y animales salvajes han
sugerido que el mantenimiento de la estructura de los telómeros se asocia con
la mortalidad tardía, ésto podría constituir un biomarcador de supervivencia
informativo de la mayor mortalidad en individuos jóvenes y de mediana edad.
Por tanto, es razonable pensar que la longitud de los telómeros puede ser
relacionado con la longevidad en el ganado equino y entre sus diversas razas
21
(23). En este intento de conocer la longitud de los telómeros en las tres
principales razas de Cría Caballar, no se han encontrado diferencias
significativas. Podría ser que la baja variabilidad genética descrita entre las
diferentes razas de caballos (24-26), sumada a la amplia variabilidad detectada
en la longitud relativa de los telómeros en los leucocitos, dificulte el uso de este
tipo de células para encontrar diferencias entre razas en base a la longitud de
los telómeros.
Por otra parte, la longitud de los telómeros se ha estudiado en una gran
población humana no encontrándose diferencias significativas entre hombres y
mujeres (25). Si bien en el presente trabajo se pretendió buscar si existían
diferencias entre sexos en la especie equina, tampoco se han podido
establecer diferencias significativas.
22
CONCLUSIONES
La edad se correlaciona negativamente con la longitud de los telómeros
de las células sanguíneas de la serie blanca de la especie equina, mientras que
no se han encontrado efectos significativos ni con el el sexo ni con la raza
empleando la técnica de qPCR.
La Dif Cq es mejor indicador de la longitud de los telómeros que laT/S
ratio debido a que su cálculo es más simple y se correlaciona mejor con la
edad.
Para estudios futuros es necesario emplear líneas celulares o tejidos más
homogéneos que los leucocitos para reducir la variabilidad dentro de la
muestra. También es necesario mejorar la puesta a punto de la técnica de
qPCR para que los resultados sean más reproducibles y fiables.
23
AGRADECIMIENTOS
Al equipo del Laboratorio de Investigación Aplicada de Cría Caballar por
su excelente profesionalidad.
Al Prof. Dr. D. José Manuel Perea Muñoz por su colaboración en la
elaboración del diseño y obtención de los resultados de los análisis
estadísticos.
24
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