Evaluación de metodologías de detección de elementos transgénicos en campo: selección y validación de una técnica sensible, específica y de bajo costo.

Responsable Técnico: Dra. Gracia Alicia Gómez Anduro

Informe final: CIBIOGEM-CONACyT 234606

Monto solicitado: 1, 183,000

Monto ejercido: 1, 170, 625

Resumen gráfico de resultados:

Compromiso por etapa:

Nombre de la etapa

Descripción de la etapa

Descripción de la meta

Actividades Productos

comprometidos

Productos cumplidos

Costo de la etapa

¿Surgió algún cambio?

Justificación

Etapa 001:

Extracción de ADN

Se obtendrá el ADN que se requiere para los análisis de la siguiente etapa

Extraer el material de ADN para la búsqueda de elementos transgénicos con las 5 herramientas propuestas en éste proyecto (ELISA, inmunodetección en tiras, PCR, microarreglos y LAMP)

- Muestreos de campo en Sonora y Yucatanpara la recolección de material

- Muestreo de productos procesados de maíz, de comercios locales

-Extracción de ADN por método casero y kit

-Evaluación de la integridad del ADN

-Cuantificación

- Base de datos del análisis de los principales elementos transgénicos encontrados en México

-colección de material genético de muestras ciegas de hojas, semillas y productos procesados de maíz

-material genético controles

-Base de datos en programa CIB_GM

Scanner 1.1 que facilitaran la búsqueda de información

-Colección de ADN de productos

procesados, de semillas de

Guanajuato y B.C.S, Sonora y

Yucatan

-Material control de SENASICA

Gasto inversión:$200,000

congelador de -20 vertical:20,000

Fotodocumentador: 180,000

Gasto corriente: $343,000

pago de paquetería DHL para envío de

muestras de los estados de Sonora y Yucatán ($1000)

Pago de honorarios: 40,000

Insumos de laboratorio:300,000

Salidas de campo: 2000

Cambios en gasto de inversión: No se compró el

fotodocumentador puesto que se adquirió con otro proyecto, pero

se solicitaron otros equipos de uso exclusivo para OGM para

evitar contaminación de controles negativos puesto que la técnica

LAMP es muy sensible congelador de -20 vertical:20,000

Rotor de centrifuga $10,000

2 cámaras de electroforesis $5300 c/u=10,600

Juego de micropipetas 23149.13

Se analizaran los ADN de la etapa 1 para detectar elementos

Contar con las técnicas de ELISA, inmunodetecciónen tiras, PCR,

-Se montaran las técnicas de ELISA, inmunodetección en tiras, PCR, microarreglos y LAMP

-Se evaluará

-Técnicas estandarizadas para evaluación de OGMs

-Set de primers para PCR convencional y

* Técnica de PCR, microarreglo, tiras reactivas y LAMP estandarizadas.

* 40 juegos de primers para PCR

*12 juegos de

Gasto corriente: $470,000

Pago de honorarios ejercido: $320,000

Contratos: Carolina Garciglia, Héctor Garza, Elias Silva y

-Se solicitó prórroga del proyecto por 3 meses, por la pérdida de un contacto importante para cumplimiento de uno de los objetivos del proyecto.se buscó la colaboración con el Dr. Nava al respecto. - Se adelantó el taller de transferencia de tecnología

Etapa 002:

Detección de OGMs y comparación de técnicas

transgénicos, comparar las técnicas y validar LAMP

microarreglos estandarizadas para la evaluación de OGMs y la técnica de LAMP validada

sensibilidad, especificidad, rapidez, confiabilidad, costo, sencillez de cada una de las técnicas

-Se analizaran los ADN de la etapa 1 para la detección de elementos transgénicos

LAMP

-Anticuerpos para ensayos de inmunodetección

-controles de ADN positivos y negativos que se propondrán para el kit final de la propuesta

-Propuesta de kit de evaluación en campo

primers LAMP * No se

produjeron anticuerpos, se

utilizaron reactivos

comerciales, se justifica en in

extenso

Se cuenta con: Control NOS, 35S

Se cuenta con un kit funcional con manual de uso,

probado, validado y en proceso de

patente.

Claudia Contreras.

Insumos de laboratorio:

$150,000

programado para la tercera etapa -Se solicitaron cambios de equipo

Cambios en gasto de inversión: $91,861.52

Se solicitó cambio de equipo: Thermomixer:

$60,242.63 Balanza:

31,618.89 Regulador para el termociclador

comprado en éste proyecto Gasto corriente: $343,000

Pago de honorarios ejercido: $320,000Contratos: Carolina

Garciglia, Héctor Garza, Elias Silva y Claudia Contreras.Insumos de

laboratorio: $150,000

Etapa 003:

Manuales y transferencia

Se entregará un manual de las metodologías de detección en campo evaluadas en éste proyecto y se transferirá la tecnología mediante un taller de capacitación

Transferir de manera clara y sencilla el conocimiento de la tecnología generada en el presente proyecto

-Elaboración de manual para CIBIOGEM con información comparativa de sensibilidad, especificidad, sencillez de las diferentes técnicas evaluadas

-Elaboración de manuales para inspectores con la técnica selecta para detección de OGMs en campo

-Capacitar personal en el uso de la tecnología selecta mediante la organización de un taller

-Manual para CIBIOGEM

-Manual para inspéctores de campo

-Taller de capacitación y transferencia de la tecnología

Manual de guía para análisis de

OGMs en México

Manual técnico de detección de

OGMs

Taller de capacitación y

transferencia de tecnología

Otro mecanismo de transferencia a

través de licenciamiento a

empresa (en proceso)

Gasto corriente:

$100,000

Impresión de manuales

$10,000

Organización taller de transferencia 2

días:

Viáticos 3 personas:

$ 5,000

Boletos de avión:

$20,000

Material para taller:

$65,000

Se ejercieron:

100,000 de gasto corriente, acorde al informe financiero

adjunto.

Se regresaron:

8,670 de beca posdoctoral

3,705 de equipo

OTROS PRODUCTOS DE LA ETAPA

1 Tesis de maestría: M. en C. Carolina Garciglia Mercado

2 patentes en proceso: Microarreglo para la detección de elementos transgénicos (Microarreglo ADN chip) y kit de detección de elementos transgénicos (TransGenic-CIBscreen)

1 Prototipo electrónico para control de temperatura del kit de TransGenic-CIBscreen

Laboratorio con técnicas estandarizadas para la detección de OGMs

2 Manuales: metodología del kit TransGenic-CIBscreen, Manual de guía para análisis de OGMs en México

Programa CIBscanner 1.2 para la demanda: Base de datos del análisis de los principales elementos transgénicos encontrados en México

Empresa para la distribución y venta de kits con 2 de los estudiantes formados y apoyados en el presente proyecto.

Divulgación

Presentación en Congreso SMB 2015

Premios 1er. lugar concurso de Google innovadores 2015

Artículo publicado: Gómez Anduro et al. 2016. Recursos Naturales y Sociedad, Vol. 2 (1): 10-21.

Seminario de Biotecnología y bioseguridad de los OGMs- CIBIOGEM, 3 de Marzo del 2016

2do. Foro Nacional de Organismos Genéticamente Modificados 2016

Taller de transferencia de Tecnología SAGARPA y SENASICA-2016

Artículo de revisión en proceso. Monitoring methods for GMO: A worldwide comparison.

1. INTRODUCCIÓN

La detección y monitoreo de OGMs en México se realiza en seguimiento a la Ley de Bioseguridad de OGMs. El presente proyecto, tuvo como finalidad proponer una técnica sencilla y de bajo costo para la detección de transgénicos en campo. Para seleccionar los elementos transgénicos a utilizar para el diseño del kit, se diseñó una aplicación (CIB_GM scanner 1.0) que permite automatizar el proceso de búsqueda de elementos transgénicos a partir de bases de datos de OGMs disponibles en biosafetyscanner.org permitiendo hacer consultas mucho más rápidas. Éste programa facilita la búsqueda de elementos transgénicos y eventos permitidos por estado, hectáreas sembradas, experimentales, datos por año de nuestro país consultando bases de datos de SENASICA y SAGARPA y generando un archivo de Excel para análisis. Utilizando éste programa se determinó que los elementos 35S y NOS detectan el 85% de los OGMs permitidos en México a excepción de la alfalfa KK179 x J101 que se encontraba con solicitud de siembra experimental en 2015.

Por otro lado se obtuvieron datos experimentales a partir del diseño de un microarreglo de elementos transgénicos (Microarreglo ADN chip) a partir de muestras procesadas y semillas de comercios locales, para conocer los elementos transgénicos más comunes y con ello proponer el kit de detección de elementos transgénicos en campo. Con ésta información se diseñó el kit de detección en campo TransGenic-CIBscreen basado en la detección de 35S y NOS a partir de amplificación isotermal. Dada la necesidad de que el kit pudiera utilizarse en campo, se desarrolló un prototipo computarizado de bajo costo (costo aproximado $5,000), fácil de transportar y a base de batería que provee la temperatura necesaria y estable de amplificación en campo.

La idea es transferir la tecnología a SENASICA para acelerar el trabajo del personal de monitoreo de campo y disminuir el número de muestras que tienen que enviarse al Laboratorio Nacional de Referencia por lo que se realizó un curso de transferencia de tecnología dirigido a personal de monitoreo de SAGARPA y SEMARNAT (7 y 8 de Julio del 2016). A la par se realizó un Foro Nacional de discusión de OGMs, en CIBNOR, La Paz, B.C.S. con un total de 73 conexiones on line (32 el día 7 de Julio y 41 el 8 de Julio), 57 asistentes presenciales, 7 ponentes invitados, invitados de difusión y divulgación científica, prensa y medios de comunicación. Y nos encontramos trabajando en la transferencia de la tecnología a una empresa de base biotecnológica (BioEra®) formada con parte de los estudiantes apoyados con el presente proyecto.

2. JUSTIFICACIÓN

La cantidad y tipo de elementos que conforman un organismo genéticamente modificado (OGM) sigue aumentando. Las pruebas de detección de ADN que identifican el promotor del virus del mosaico de la coliflor(CaMV35S) y el terminador de la NopalinaSintetasa (NOS)detectan el 72% de los transgénicos comercializados actualmente. El costo de las pruebas de identificación de OGMs basadas en la detección de ADN generalmente es alto debido al uso de equipo sofisticado como es el termociclador para la PCR, el uso de enzimas especiales para la reacción y reactivos para la visualización del resultado, así como la necesidad de personal capacitado. Por lo que se desarrolló un microarreglo de ADN con capacidad de identificar 35 elementos transgénicos, así como una herramienta de bajo costo para la identificación de ADN transgénico en campo los cuales se encuentran en proceso de protección intelectual con la idea de ser transferidos mediante licenciamiento.

3. MÉTODOS Y RESULTADOS

La metodología y desarrollo del proyecto se llevó a cabo de manera general como se describe en la figura 1. Los detalles de las etapas 1 y 2 se describieron en los informes respectivos, mientras que la etapa 3 básicamente constó de la comparación del kit de detección de transgénicos Vs tiras reactivas en muestras de algodón transgénico, pruebas de vida de anaquel, efecto de la transportación a 4°C. Además se probó en campo el prototipo automatizado para control de temperatura, con lo que se controlar la especificidad de los kits en campo.

Figura 1. Diagrama de flujo de los métodos desarrollados por etapa del proyecto.

Evaluación de la vida de anaquel. Se hicieron 12 kits conteniendo controles negativos y positivos y se almacenaron con todos los componentes a 4°C. Se realizaron pruebas de detección con ADN control cada 15 días tomando 3 kits durante 2 meses.

Resultados: Los kits mantuvieron la especificidad y sensibilidad durante 2 meses, sin embargo observamos que los primers stock para el gen 35S empezaron a causar problemas después de un año del diseño, por lo que se solicitaron primers nuevos. También observamos que las condiciones de amplificación varían acorde al lugar en el que se diseñen los primers, por lo que se vuelve crítica la estandarización de condiciones por lote de producto.

Evaluación del efecto del transporte a 4°C. A 3 kits que incluían control negativo y positivo se les preparó para envío a Sonora vía DHL en una hielera de unicel con geles congelados con un total de 24 h de recorrido. Los kits se recibieron con los geles descongelados sin embargo se mantuvo su actividad y especificidad. Se está trabajando en la posibilidad de liofilizar con la finalidad de eliminar la cadena de frío.

Prototipo para control de temperatura. Se adecuó el prototipo de control de temperatura para reacciones isotermales de 65°C. Consta de una base para 8 muestras independientes y 2 controles (positivo y negativo del kit), una pantalla para indicar la temperatura alcanzada, un botón de inicio y uno de alarma de apagado. El diseño para uso en campo tiene una batería recargable que le permite realizar 4 corridas independientes y está protegido por una caja de uso rudo que facilita el transporte, protege los circuitos y permite el mejor control de temperatura del sistema (Figura 2).

Figura 2. Prototipo de control de temperatura en campo para la detección de transgénicos.

Formación de la empresa BioEra. En Junio del 2017, se consolidó la empresa BioEra con 3 estudiantes del programa de Doctorado del CIBNOR, 2 de ellos apoyados por el presente proyecto (Figura 3). La misión: Ser la 1ª fábrica en México de diseño, producción y venta de kits para la detección de transgénicos y enfermedades, a través de técnicas de reconocimiento de ADN. Actualmente la empresa se encuentra en proceso de renta de local y compra de robots para la maquila de los kits de diagnóstico, así como el cierre de contratos de compra-venta de kits a empresas agrícolas.

Figura 3. Acta constitutiva de la formación legal de la empresa de base Biotecnológica

BioEra y estudiantes involucrados.

Perspectivas: Probar drones para atrapar polen que facilite el monitoreo de OGMs y

probar que el kit funciona para la detección a partir de polen. Tenemos evidencias de que

el kit de extracción de ADN en campo funciona en polen (figura 4).

Figura 4. Propuesta de monitoreo de cultivo OGM utilizando drones para la captación de

polen (ésta idea fue propuesta por el Dr. Ariel Álvarez en comunicación personal).

Proponemos además como perspectiva, trabajar en una versión tipo prueba de embarazo

de detección de ADN transgénico (Figura 5).

Figura 5. Propuesta de diseño tipo prueba de embarazo para la detección de ADN

transgénico.

4. CONCLUSIÓN

El presente proyecto permitió la formación de estudiantes de posgrado con visión de generación y aplicación de ciencia para resolver problemáticas reales, así, se diseñaron dos herramientas nuevas para la detección de OGMs (microarreglo de ADN y kit para detección de ADN en campo ambas en proceso de patente) y se formaron las instancias legales correspondientes para el uso de las mismas.