Bioqumica Clnica 2015Trabajo Prctico N 1: Verificacin de calibracin de micropipetas.A) Objetivo:En esta actividad el estudiante deber verificar el estado de calibracin de las micropipetas que usar en los trabajos prcticos posteriores mediante el mtodo gravimtrico. Deber determinar la exactitud y la precisin en la dispensacin de volmenes de lquidos con dos modelos de micropipetas: P200 y P1000. En un informe tcnico deber documentar los resultados obtenidos y evaluar el errorsistemtico y aleatorio durante el uso de estos instrumentos y el efecto de ellos sobre la confiabilidad de los resultados en pruebas de laboratorio clnico.B) Informacin Tcnica:Las micropipetas o pipetas de precisin son instrumentos que permiten la transferencia de pequeos volmenes de lquidos.Existen de diferentes tipos (manuales y automticas) y que usan diferente tecnologa (desplazamiento de aire o desplazamiento positivo) de volumen fijo o volumen ajustable, de un canal o multicanal.La informacin que se presenta a continuacin ha sido extrada del documento Gilson Guide to Pipetting: Second Edition.

Pipetman: air-displacement pipette Microman: positive-displacement pipetteTenga en cuenta las propiedades fsicas de la muestra

Muestras acuosas: operados y mantenidos correctamente, pipetas Pipetman darn resultados precisos con la mayora de los lquidos que se encuentran comnmente en el laboratorio. Si usted tiene un gran nmero de fracciones para dispensar, utilice una pipeta repetitiva Distriman . Muestras viscosas: Puede que le resulte ms fcil utilizar una pipeta Gilson Microman. Microman da resultados reproducibles con muestras altamente viscosas como el glicerol, el detergente y la miel. Microman tambin se recomienda para alta volatilidad (cloroformo) o lquidos densos (mercurio) que a menudo son difciles de aspirar. Radiactivas y corrosivos muestras: pipetas Microman estn especialmente diseados para manejar lquidos agresivos y sin peligro para el usuario o daos al instrumento. ADN, ARN, las muestras biolgicas: La eleccin es suya. Puede utilizar un Pipetman con Diamond puntas con filtro autoclave (0,1 l - 1 ml) o un Microman autoclavable (Modelo M10 y M100) con capilares y pistones esterilizados. Si se usa adecuadamente, estos instrumentos asegurarn, resultados precisos libres de contaminacin.Para la dispensacin mltiple, optar por una pipeta repetitiva Distriman con una jeringa esterilizada micro-gamma DistriTip .

cules son las pipetas por desplazamiento de aire?1. Recomendado para muestras acuosas y para el trabajo general de laboratorio.2. Siempre tienen un cojn de aire (volumen muerto) entre el pistn de la pipeta y la muestra de lquido.3. El pistn es una parte permanente de la pipeta.

cules son las pipetas de desplazamiento positivo?1. Recomendado para muestras problema (viscoso, denso, voltil, radiactivo, corrosivo)2. El contacto directo del pistn con la muestra (sin cojn de aire).3. pistn desechable (no es una parte permanente de la pipeta)

IMPORTANTE:Pistn perfecta: Cuando se establece el volumen en una pipeta por desplazamiento de aire, el pistn regula el volumen del colchn de aire, lo que, a su vez, determina el volumen de lquido que ha de ser aspirado. El pistn tiene que ser perfecto si el volumen de muestra es para que se corresponda exactamente con el volumen seleccionado. Desde el pistn es una parte permanente de pipetas Pipetman, un pistn perfecto significa medicin perfecto todas las veces.Cmo funcionan las pipetas por desplazamiento de aire?Cuando se presiona el pulsador situado en una pipeta por desplazamiento de aire, el pistn en el interior del instrumento se mueve hacia abajo para que el aire quede fuera. El aire es desplazado por el pistn. El volumen de aire desplazado es equivalente al volumen de lquido aspirado.1. Ajuste el volumenEl volumen requerido se establece. El pistn se mueve a la posicin apropiada.2. Preprese para la aspiracinSe presiona el pulsador antes de la aspiracin de la muestra. El pistn desciende y expulsa un volumen de aire igual al volumen de lquido que seleccionada3. Aspirar la muestraAl soltar el pulsador, se crea un vaco parcial dentro de la punta. La presin atmosfrica ambiente obliga al volumen deseado de lquido a travs del orificio en la punta.4. Vierta la muestraSe vuelve a pulsar el pulsador. Aumenta la presin de aire dentro del eje y la punta. El aire comprimido empuja el lquido fuera de la punta.Cmo funcionan las pipetas de desplazamiento positivo?Pipetas de desplazamiento positivo funcionan como una jeringa. No hay cojn de aire entre el pistn desechable y la muestra. Sin colchn de aire elstica para expandirse o contraerse, la fuerza de aspiracin se mantiene constante, no afectado por las propiedades fsicas de la muestra.Esto permite al operador Microman para pipetear muestras de densidad muy viscosos o altas, como el mercurio o pasta de dientes.

1. Coloque el volumenEl volumen requerido se establece. El pistn se mueve hacia abajo a la posicin de inicio adecuada.2. Preprese para la aspiracinSe presiona el pulsador antes de la aspiracin de la muestra. El pistn desciende hasta el extremo del capilar.3. Aspirar la muestraEl orificio se sumerge por debajo de la superficie del lquido. Como se suelta el pulsador, el pistn se mueve hacia arriba y la presin ambiente obliga al volumen deseado de lquido a travs del orificio en el capilar.4. Vierta la muestraSe vuelve a pulsar el pulsador. El pistn se mueve hacia abajo y expulsa el lquido fuera de los capilares.

Considere el volumen de lquido que desea transferirLos ocho modelos de la Gilson Pipetman y Pipetman Ultra estn diseados para transferir volmenes precisos de 0,1 l a 10 ml. Pipetman tambin est disponible en volmenes fijos de 2 l de 1 ml.

* Con una P2 tcnica de pipeteado preciso y U2 puede ser utilizado para volmenes de aspirado de hasta 0,1l, P10 y U10 en 0,5 l, y p200 en 30 l.

Ejemplos de ajustes de volumen para el PipetmanEl volumen se muestra como tres dgitos que se leen de arriba a abajo. La figura de la izquierda muestra el mnimo (MIN) y mximo (MAX) ajustes de volumen. Tambin se muestran ejemplos de configuraciones de volumen intermedio (INT.). Los nmeros en rojo representan dcimas de microlitros (l) en el P20 y mililitros (ml) en el P1000. Para la correspondencia correcta en los otros modelos, consulte el manual de instrucciones.

Organice su puesto de trabajoSe debe prestar especial atencin a suavizar pipeteo Favorecer el tiempo uniforme y el movimiento, tiene todos los objetos necesarios al alcance fcil de la mano Coloque los objetos de uso ms frecuente en frente de usted. Los artculos ms raramente utilizado se pueden colocar un poco ms lejos de ti La apertura del receptor para las extremidades usadas deben estar a la misma altura que el extremo de la pipeta.Coloque una punta de pipeta desechablePara montar una punta desechable en un Pipetman, mantenga la micropipeta en una mano y usar un ligero movimiento de torsin para asentar firmemente la punta en el eje de la micropipeta y asegurar un sellado hermtico.

El montaje de una punta desechable en Pipetman

1.Presione hacia abajo con el movimiento de rotacin

2. Evite apualar la punta como si la pipeta fuera un cuchillo

1 2Ajustar la configuracin de volumen

Para ajustar el volumen: Sujete el cuerpo de la micropipeta en una mano y con la otra mano para girar la rueda selectora - o el pulsador. Con el pulsador, el volumen se puede ajustar fcilmente con una mano. Pulsador de ajuste de volumen est disponible en todas las pipetas Microman y en pipetas Pipetman fabricados despus de abril de 1995.Un consejo til para mejorar la reproducibilidadSiempre finalizar la configuracin de las agujas del reloj. De esta manera, si ocurre cualquier juego mecnico, que ser siempre en la misma posicin. As es como para obtener un ajuste de volumen en sentido horario: al disminuir el nivel de volumen, gire la rueda lentamente hasta que aparezca el ajuste deseado. No rebasar la posicin deseada,

PulsadorRueda de ajuste cuando se aumenta el nivel de volumen, gire la rueda selectora aproximadamente 1/3 de vuelta por encima de la configuracin deseada, y luego girar lentamente a bajar el volumen hasta legar a la posicin deseada.

Un consejo til para mejorar la precisin

Para evitar errores de paralaje, asegrese de que el indicador de volumen y el volumen marcado seleccionados estn en su lnea de visin directa. A corta distancia, puede que le resulte til para cerrar un ojo.

ImportantePara evitar daos en el interior de la pipeta, nunca intente forzar el ajuste de volumen ms all de los lmites indicados en las tablas de la pgina 14.

Siga las instrucciones para el avance o retroceso modo de pipeteoLa eleccin del modo de funcionamiento puede afectar significativamente a los resultados de un anlisis.Pipetas Gilson se calibran para pipetear modo de avance. Los fabricantes deben enumerar todos los modos pertinentes de operacin y especificar para qu modo se calibra el instrumento.El modo de avanzar es la forma habitual de pipeteo con una pipeta por desplazamiento de aire como Pipetman.El modo de avance para pipetas de desplazamiento positivo como Microman elimina el trazo de purga.El modo de inversin slo es posible con pipetas por desplazamiento de aire. Se utiliza para disolventes o lquidos poco viscosos.

Modo de desplazamiento de aire En general, la precisin del modo de avance se basa en el drenaje precisa por la presin de aire (pipetas de desplazamiento de aire) o de limpieza interna del cilindro de la pipeta (pipetas de desplazamiento positivo).

1. PreparacinMantenga el instrumento en una posicin casi vertical. Presionar el mbolo suavemente la primera posicin de parada.

2. Aspiracin Sumergir la punta de la pipeta en el lquido *. Permitir que el mbolo se mueva hacia arriba suavemente a la posicin de reposo. Espere un segundo, hasta que todo el lquido tiene tiempo para moverse hacia arriba en la punta.

*La profundidad de inmersin de la punta puede tener un efecto significativo en los resultados. Si la punta se sumerge demasiado profundamente, las gotas se forman en el exterior de la punta y sern depositados junto con su muestra. Si la punta no est sumergido profundamente suficiente, vrtex ocurrir y la pipeta no aspirar el volumen seleccionado.

3. DistribucinColoque la punta de la pipeta en un ngulo (10 a 45 ) contra la pared interior del recipiente de recepcin. Presionar el mbolo suavemente a la primera posicin de parada.4. purgaEspere un segundo, luego presione el mbolo hasta la segunda posicin de parada. Este golpe "soplar (hacia afuera)" elimina cualquier resto de la muestra de la punta. Retire el extremo de la punta de la pipeta deslizndola por la pared.5.HomeDeje que el mbolo se mueva hasta la posicin de reposo.(3-4-5)

Desplazamiento de aire / modo inversoEn pipeteado en modo inverso, la carrera de purga se utiliza durante la preparacin. Durante la aspiracin, se aade una cantidad de lquido igual a la cantidad de aire purgado. Esta cantidad compensa el lquido que queda en una pelcula dentro de la punta durante la dispensacin.1. PreparacinMantenga el instrumento en una posicin casi vertical. Presionar el mbolo suavemente hasta la segunda posicin de parada.2. AspiracinSumerja la punta de la pipeta en el lquido*. Permitir que el mbolo se mueva hacia arriba suavemente a la posicin de reposo. Esperar un segundo, hasta que todo el lquido tenga tiempo para desplazarse hacia arriba en la punta.(1-2)

3. DistribucinColoque la punta de la pipeta en un ngulo (10 a 45 ) contra la pared interior del recipiente de recepcin. Presionar el mbolo suavemente a la primera posicin de parada. Espere un segundo.4.Re-aspiracinSi la punta de la pipeta es para ser reutilizada para la misma muestra, mantener el mbolo en la posicin intermedia para la posterior inmersin para el siguiente ciclo de pipeteado y reiniciar la operacin 2.5. Completar purgaEspere un segundo y purgue. Si es que no se puede volver a utilizar la punta de la pipeta, presione el mbolo a la posicin para purgar sobre un contenedor de residuos adecuado y luego expulsar la punta.(3-4-5)

LimpiandoSi es necesario (lquidos viscosos tales como crema), limpie el exterior de la punta o del capilar con un pauelo mdico limpio. No toque el orificio. Elegir un pauelo que sea resistente, que no suelte pelusa, e inerte a los cidos y disolventes.Desechar el pauelo de una manera segura e higinica.ImportanteCuando se trabaja con muestras de alto riesgo, no limpie la parte desechable. Asegrese de que la profundidad de penetracin de lquido no supere los 3 mm. A continuacin, toque fuera de la pared lateral del recipiente.Pre-enjuague:Una mayor uniformidad y precisin de dispensacin se obtienen generalmente proporcionando superficies de contacto idnticas para todas las alcuotas. Esto se consigue mediante un pre-lavado con el mismo lquido que se est dispensando.Para el pre-enjuague, aspirado con la punta y luego regresar de vuelta al depsito original o a los residuos.Cundo debo realizar pre-enjuague a la punta?El pre-enjuague debe realizarse: Cada vez que cambie la punta cada vez que aumente el volumen puesto (ajustado)Expulsar la punta utilizada y almacenar la pipeta en posicin vertical:Para evitar tocar puntas contaminados, mantenga la pipeta sobre la papelera y pulse el pulsador expulsor de puntas.Evaluar las funciones de pipeteadoIr a travs de todo el rango de volumen con el botn de la perilla de ajuste.- La rueda debe moverse suavemente.- El ajuste mnimo y mximo debe corresponder al rango de volumen normal de pipetas como se indica en el manual de instrucciones.- Comprobar la alineacin y el movimiento del visualizador del volmetro.Ajuste el volmetro al valor mximo y oprima el pulsador lentamente.El movimiento debe ser suave. "Tirones" en el movimiento o variaciones en la friccin pueden deberse a un rasguo o corrosin en el pistn (mbolo), o a una varilla de operacin doblada.Escuche un ruido del resorte lo que indicara la posicin incorrecta del resorte dentro de la Pipetman.Coloque una punta de Gilson y presione el eyector de la punta para verificar su correcto funcionamiento.Prueba de fugasPara pipetas Pipetman P1000 a P10mlPara pipetas Pipetman P2 a P200

- Seleccione el volumen mximo de ajuste y llene la punta con agua.- Estabilizar durante 20 segundos.Si aparece una gota en el extremo de la punta, hay una fuga.- Seleccione el volumen mximo de ajuste y llenar la punta.- Estabilizar durante 20 segundos.Si aparece una gota en el extremo de la punta, hay una fuga. Si no aparece una gota, se vuelva a sumergir la punta en el lquido de ensayo.- Mientras est sumergido, el nivel del lquido en la punta debe permanecer constante.Si el nivel de la punta cae, hay una fuga.

Tipos de contaminacin y cmo prevenirlosPipeta para tomar muestrasPuntas contaminadas o una pipeta contaminada, a su vez, puede contaminar las muestras.Prevencin-Utilice Puntas esterilizados y limpia o autoclave las partes de su pipeta que estn en contacto con la muestra (ver pginas 36-37).-Cambiar la punta despus de cada muestra.Muestra para pipetaLa contaminacin puede ocurrir si la muestra o aerosoles de la muestra se les permite entrar en el cuerpo de la pipeta.Prevencin-Para Evitar el derramamiento de lquidos en el cuerpo de la pipeta, evite inclinar la pipeta en exceso y siempre guarde el instrumento en posicin vertical.-Soltar el pulsador lentamente.-Para Evitar la contaminacin de aerosoles, utilizar Pipetman con puntas con filtro o elegir un pipeta microman de desplazamiento positivo con una funcin en la barrera de aerosol.

Riesgo de contaminacin de aerosolesNo hay riesgo de contaminacin por aerosolUna muestra a otra (tambin conocido como traslado de muestra)Una porcin de la muestra A se puede adherir a la pared interior de la punta despus de la entrega de la muestra. La parte sobrante de la muestra A se puede mezclar con la siguiente muestra (B) y puede causar un resultado falso de la prueba.PrevencinCambie la punta despus de cada muestra.

C) Esquema de Trabajo1: ubique una balanza analtica y las micropipetas a usar2: registre los datos de identificacin de la balanza y de las micropipetas3: registre la temperatura ambiente4: acerque al lugar de trabajo un vaso precipitado con suficiente agua destilada y papel absorbente5: coloque un vaso plstico liviano en la balanza analtica6: reconozca las puntas apropiadas para cada micropipeta7: tare la balanza8: con la micropipeta P200 mida un volumen de 100 microlitros de agua destilada, transfiera estevolumen hacia el vaso que est en la balanza, pese y registre el peso9: repita los puntos 7 y 8 hasta tener 10 datos registrados10: repita el procedimiento con la P1000, con un volumen de 500 microlitros.11: entregue una copia del informe preliminar antes de abandonar el laboratorio

D) InformePrepare un informe tcnico redactado en lenguaje apropiado respetando las siguientesespecificaciones:Fecha de entrega: viernes 20 de marzo antes de las 20:00 hrsPresentacin: papel tamao carta escrita por una sola plana.Extensin mxima: 1 hoja.Tipografa: arial 11 interlineado simpleEstructura y ponderacin: