funcionamiento y uso de micropipetas

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Micropipetas

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  • PIPETAS AUTOMTICAS

    Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por

    carecer de depsito y que se utilizan para medir o transvasar

    pequeos volmenes de lquido de un recipiente a otro con gran

    exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en da

    existen una gran variedad de opciones. Podramos hacer una

    primera divisin en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen

    variable. Las de volumen fijo son ms precisas que las de

    volumen variable, aunque cuando en un anlisis se usa una de

    volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin

    variarlo ms, su precisin es comparable a la de una pipeta de

    vidrio graduada de clase A.

    Tambin podramos dividirlas en pipetas manuales y

    electrnicas, aunque estas ltimas son mucho menos abundantes

    debido fundamentalmente a su precio mucho ms elevado, por lo

    que nos centraremos en las manuales. A su vez tambin

    podramos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.

  • La pipeta mecnica o de pistn funciona generalmente

    transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce

    sobre un mbolo que se encuentra unido a un pistn mediante un

    eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija,

    forzando un volumen predefinido de lquido fuera de la pipeta.

    Las pipetas a pistn son en general de dos tipos como

    hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen

    predeterminado de lquido, el cual es conocido como volumen

    nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el

    volumen dispensado dentro de un rango determinado en las

    especificaciones de la pipeta. La variacin en el volumen se logra

    modificando la longitud de la carrera del pistn dentro del mbolo

    mediante un micrmetro. En estas de volumen variable el

    volumen nominal es el lmite superior del rango de volumen de la

    pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el

    fabricante.

    Cada uno de los tipos mencionados se pueden

    subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se

    denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumticas,

    debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistn

    y el lquido en el cilindro (este es el tipo ms corriente). A las

    pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento

    positivo o de desplazamiento directo porque el pistn se

    encuentra en contacto directo con el lquido.

  • Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan

    para lquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presin de

    vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son

    mucho ms caras puesto que cada punta lleva su pistn

    incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta

    caracterstica que tambin evitan contaminaciones cruzadas

    provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas

    neumticas usan puntas mucho ms baratas pero no son tan

    exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja

    con volmenes muy pequeos de lquido debido a la

    compresibilidad del aire.

    Todas las pipetas de pistn disponen de puntas

    desechables para minimizar los riesgos de contaminacin. Para

    facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han

    adoptado un cdigo de color segn el volumen a dispensar y que

    en las de uso ms general coincide con el color de las puntas

    utilizadas.

  • Instrucciones para el manejo de una pipeta automtica

    Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado.

    Colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de la

    pipeta haciendo una leve presin para lograr un buen ajuste.

    1. Oprimir el botn pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir

    verticalmente la pipeta, hasta que la punta se

    sumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido.

    2. Liberar lentamente la presin sobre el botn. Despus de 23 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del lquido deslizando la

    punta contra la pared del recipiente.

  • 3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el lquido, presionar

    lentamente el botn pulsador hasta el primer

    tope. Despus de un segundo, y sin soltar el

    botn pulsador, terminar de vaciar la pipeta

    presionando hasta el segundo tope.

    4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.

    RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR

    El empleo de una buena tcnica al utilizar las pipetas puede

    incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos

    instrumentales y de condiciones ambientales como de tcnica de

    manejo de la pipeta.

    EN LA TCNICA EMPLEADA

    + PROFUNDIDAD DE INMERSIN DE LA PUNTA

    La profundidad de inmersin de la punta es especialmente

    importante en el uso de volmenes pequeos. Si la punta se

    sumerge demasiado, se aspirar ms lquido debido al aumento de

    la presin. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo

    suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y

  • volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad

    adecuada puede mejorar la precisin hasta un 5%.

    + UNIFORMIDAD AL PIPETEAR

    Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y tcnica

    adecuada al mover el mbolo. Una aspiracin demasiado rpida e

    incontrolada puede llevar a la formacin de aerosoles,

    salpicaduras y posible contaminacin del eje y del pistn,

    pudindose producir incluso prdida de volumen de la muestra.

    Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisin

    tambin hasta un 5%.

  • + ANGULO DE INMERSION VERTICAL

    Se ha de procurar mantener el ngulo de inmersin de la

    pipeta lo ms cercano a la vertical posible. De otra forma, la

    columna vertical de lquido ser ms pequea y se aspirar

    demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el lquido, la

    punta se ha de mantener en un ligero ngulo frente a la pared del

    vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de

    forma vertical o como mximo dentro de un ngulo menor de 20

    de sta, puede mejorar la precisin hasta en un 2,5%.

    + TCNICA DE DISPENSACIN

    Para la mayora de aplicaciones se recomienda dispensar

    con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.

    As se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra

    en el interior de la punta despus de acabar la dispensacin.

    Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba

    por la pared lateral para liberar cualquier gotcula restante en el

    orificio de la punta. Esta tcnica puede mejorar la precisin hasta

    en un 1%.

    Otra tcnica consiste en dosificar directamente en la

    superficie del lquido. Es crucial usar una punta de pared fina para

    que no quede ninguna gotcula en el interior de la punta. Si se

    dispensa directamente dentro del lquido tendremos que sacar la

  • pipeta mantenindola en el segundo tope para evitar una toma de

    muestra despus de la dispensacin.

    + ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS

    Se recomienda enjuagar previamente las puntas como

    mnimo dos veces con el lquido a pipetear para compensar la

    pelcula de lquido en el interior de la punta. El enjuage previo

    tambin tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de

    capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior

    de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.

    Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la

    precisin.(No es necesaria en pipetas a pistn de desplazamiento

    positivo).

  • OTROS FACTORES QUE TAMBIN AFECTAN A LOS

    RESULTADOS DEL PIPETEO

    + TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE

    TEMPERATURA

    Procurad pipetear a una temperatura constante. La

    temperatura ptima sera: que como veremos despus

    sera tambin adecuada para calibrarlas. Debemos evitar

    repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del

    interior de la pipeta no se puede adaptar rpidamente y esto puede

    afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede

    mejorar la precisin hasta en un 5%. Es por este motivo que

    cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede

    calentar el aire del interior de la pipeta, expandindose y pudiendo

    reducir la precisin hasta en un 1%. Es por esta razn que se

    recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y

    entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.

    +UTILIZACIN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL

    VOLUMEN QUE SE ASPIRA

    La aspiracin al 50% del volumen nominal de las puntas

    consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35%

    y el 100% del volumen mximo de la pipeta. Seguir este consejo

  • puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%.

    Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10%

    del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.

    + AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR

    LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA

    Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro

    inferior simplemente hay que girar la rueda del micrmetro hacia

    abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando

    incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda

    ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla

    hasta el deseado. Esto evitar el juego mecnico de las piezas y

    contribuir a una mejora del 0,5% en la precisin.

    + FACTORES ERGONMICOS

    Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la

    mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas

    especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental

    que las manos estn lo ms descansadas posibles. Normalmente

    cada fabricante importante tiene en su gama algn modelo de este

    tipo.

  • PARTE PRCTICA.

    Nos centraremos en los dos tipos ms comunes de

    pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son

    pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus

    particularidades, pero el procedimiento de calibracin es el mismo

    para ambas.

    Partes especificadas:

    A.- Botn de control

    B.- Tuerca de conexin

    C.- Junta de tefln

    D.- Anillo de goma (O-ring)

    E.- Caa

    F.- Expulsor de la punta

    Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el

    pistn de acero inoxidable, una junta de tefln (C) y un anillo de

    goma (D) que son los que garantizan el sello hermtico. En las de

    tipo Eppendorf, el mbolo es de un polmero orgnico (Fortron)

    altamente resistente al calor, cidos y bases, envejecimiento y

    abrasin, y no lleva ni junta de tefln ni anillo de goma. Es una

    ligera capa de silicona de vaco alrededor del mbolo la que

    asegura la estanqueidad en este caso.

    Para el caso en que pipeteemos cidos es mejor usar una

    de tipo Eppendorf puesto que slo se nos deteriora con el tiempo

    la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyndose el

    mbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que

    sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible

  • este efecto de los cidos, Gilson ha sacado un kit de proteccin

    anticorrosin para la P 1000 que consiste en una caa especial que

    lleva acoplado un filtro anticidos, siendo ste intercambiable (al

    igual que el filtro de proteccin anti-salpicaduras de las P 5000).

    Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez

    despus de haber usado la pipeta con lquidos cidos o corrosivos

    que emitan vapores, desmontar la caa y lavar el pistn, el anillo

    de goma y la junta de tefln con agua destilada y una vez

    completamente secas montar y comprobar funcionamiento.

    Por calibracin de pipetas se entiende la comparacin entre

    el volumen real y el volumen terico. El volumen real se

    determina por va gravimtrica por lo que necesitaremos agua

    destilada o desionizada y una balanza adecuada.

    Para realizar la calibracin de una pipeta seguiremos las

    directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumtricos

    operados por pistn). Los premisas pricipales de dicha norma se

    centran en 3 puntos fundamentales:

    1.- Condiciones ambientales

    2.- Utilizar una balanza adecuada

    3.-Minimizar el efecto de la evaporacin en volmenes inferiores

    a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.

  • - CONDICIONES AMBIENTALES

    Las calibraciones se deben realizar en una sala sin

    corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20C

    y 25C sin variar ms de C5,0 mientras dure el ensayo.

    Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con

    anterioridad a la calibracin se deber dejar al menos 2 horas todo

    el material a emplear para que alcance un equilibrio trmico con

    la temperatura de la sala. Nunca deber estar expuesto al sol

    directamente. Necesitaremos disponer de un termmetro y

    tambin un barmetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y

    debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporacin.

    - UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA

    Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o

    inferiores habr de emplearse una balanza analtica de 5

    decimales. Para pipetas de volmenes ms grandes es suficiente

    utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos

    de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostticas,

    ms importantes cuanto ms pequeos son los volmenes que

    estamos midiendo.

    - MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIN

    Para volmenes pequeos (menores de 50 l ) podemos

    usar algn recipiente especfico de vidrio con tapa o situar un

    vaso de precipitados pequeo con 10 ml de agua en el interior de

    la balanza para inhibir la evaporacin. Es ms cmodo emplear el

    recipiente especial porque nos simplificar los clculos despus.

    Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes

    para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.

  • PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN

    Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta

    de tefln y el anillo de goma (Gilson). Si stos presentan juego,

    los sustituiremos. Tambin verificaremos que la caa no est

    doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, tambin la

    cambiaremos.

    Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja

    del pistn y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo

    (es importante no poner demasiada).

    Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con

    agua destilada, haremos un chequeo rpido con 3 medidas del

    volumen nominal que nos darn una primera aproximacin del

    volumen que dispensa la pipeta. Si ste se desva bastante del

    esperado, procederemos al ajuste del micrmetro con la

    herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf

    se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que

    adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta

    que stas ya sean ms cercanas a lo esperado. Posteriormente y

    despus del cambio de punta y enjuages previos de sta al menos

    dos veces, realizaremos ya la calibracin propiamente dicha con

    tandas de 10 medidas (4 mediciones sera el nmero mnimo

    necesario para calcular la exactitud y precisin de una pipeta) de

    las siguientes series de volmenes:

    + volumen nominal (mximo admitido por la pipeta)

    + volumen inferior (mnimo o 10% del nominal segn especificaciones del fabricante)

    + volumen medio (del 50% del valor nominal)

    Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a

    calcular el error sistemtico que nos dar la Exactitud

  • (proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio,

    que nos expresar la Precisin (grado de reproducibilidad de las

    medidas) de la pipeta.

    Exactitud

    Es posible tener datos muy consistentes aunque estn

    consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia

    numrica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor

    real. Una elevada exactitud (o pequea inexactitud) significara

    que existiera poqusima diferencia entre el valor medio y el real.

    La exactitud se consigue con una cuidadosa calibracin de un

    instrumento preciso.

    Precisin

    La precisin consistira en la existencia de un buen

    grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisin

    no tiene un valor numrico, se cuantifica por la imprecisin. As

    una alta precisin (o pequea imprecisin) significara que

    existiese muy poca variacin entre medidas repetidas de la misma

    muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una

    buena tcnica de manejo.

    Exacto Preciso Exacto Impreciso

    Preciso Inexacto Impreciso Inexacto

  • - Clculo del Error Sistemtico ( Exactitud )

    Para el caso en que trabajemos con volmenes inferiores a

    50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporacin

    sustituyendo en las anteriores frmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es

    un factor de correccin dependiente de la temperatura y la presin

    y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente

    pgina ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ).

    Para poder comparar adecuadamente con los datos

    facilitados por el fabricante debemos expresar los valores

    obtenidos en la balanza en microlitros.

  • - Clculo del Error Aleatorio ( Precisin )

    Comparando los datos obtenidos con los errores

    tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras

    pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por

    el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisin y por tanto siguen

    siendo perfectamente utilizables . Lo ms conveniente es llevar

    una anotacin de las calibraciones efectuadas y ponerle algn

    adhesivo pequeo a la pipeta que nos indique la fecha de su

    ltima revisin o calibracin.

  • Podemos ajustar una pipeta para un lquido diferente al

    agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable

    y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibracin y

    solamente vlida para ese lquido, por lo que si se realiza, hay que

    marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan

    confusiones. Este procedimiento no es vlido para lquidos con

    presin de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha

    indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de

    desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto

    no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido

    si usamos una pipeta neumtica, se recomienda saturar la cmara

    de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el

    solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rpidamente

    porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con

    soluciones acuosas s que es muy fcil que lo haga si trabajamos

    con un lquido de menor densidad que sta.

    Actualmente lo ms avanzado en el tema de las

    calibraciones es el sistema de identificacin por radiofrecuencia

    que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se

    puede seguir toda la vida de cada pipeta como n de serie, fecha

    de calibracin, usuario al que pertenece, para qu se utiliza o

    cualquier dato que queramos incluir.

  • Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en

    sus gamas de balanzas analticas alguna especialmente adaptada

    para la calibracin de micropipetas como es el caso de la

    mostrada a continuacin que sirve para pipetas de hasta 1 l (tara:

    22g, resolucin 1 g), tiene apertura motorizada mediante clula

    fotoelctrica y presenta colector de evaporacin integrado y

    recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de

    forma rpida y sin interrupciones.