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EVALUACIÓN DE EXTRACTOS MICROBIANOS FRENTE A PUDRICIONES RADICULARES EN AGUACATE

GENERADAS POR Phytophthora cinnamomi

Sara Ramírez Restrepo

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Biociencias

Medellín, Colombia

2016

II Evaluación de extractos microbianos frente a pudriciones radiculares en aguacate

generadas por Phytophthora cinnamomi

EVALUACIÓN DE EXTRACTOS MICROBIANOS FRENTE A PUDRICIONES RADICULARES EN AGUACATE

GENERADAS POR Phytophthora cinnamomi

Sara Ramírez Restrepo Biotecnóloga

Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Biotecnología

Director:

Sinar David Granada García, MSc. en Ciencias Químicas, Químico.

Codirector:

Rodrigo Alberto Hoyos Sánchez, Ph.D., MSc. en Ciencias de Cultivos y Suelos, Biólogo Genetista.

Línea de Investigación:

Control Microbiológico

Grupo de Investigación:

Fitosanidad y Control Biológico

Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Biociencias

Medellín, Colombia

2016

A mi madre

Por siempre haber creído en mí. Por todo su

esfuerzo, dedicación y paciencia.

Agradecimientos V

Agradecimientos

A Dios por ser esa luz que necesitaba para continuar cuando pensaba que ya no tenía

fuerzas para seguir.

A mi madre Luz Marina, a mi Hermano Alejandro y a mi novio Juan Carlos por su apoyo

incondicional, su comprensión y por su inmenso amor en todo este proceso.

A mis tutores Sinar David Granada y Rodrigo Alberto Hoyos por lo aprendido, su

paciencia y su amor para conmigo en cada uno de sus concejos para guiarme en esta

formación que apenas comienza.

Al profesor Juan Carlos Pérez y al Dr. Salvador Ochoa Asencio por su asesoría, apoyo y

concejos mientras realicé la maestría.

A todos mis compañeros del laboratorio de Fitosanidad y Control Biológico de la

Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) porque sin su ayuda esto no hubiese

sido posible.

A Gloria Rivas del Área Curricular en Biotecnología por todo su apoyo para que todo mi

trabajo se vea recompensado.

A la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB), a la Institución Universitaria

Colegio Mayor de Antioquia (IUCMA) y al Sistema General de Regalías Antioquia por los

recursos para desarrollar este trabajo de investigación y el apoyo incondicional con sus

instalaciones.

A Colciencias, especialmente al Programa Jóvenes Investigadores e Innovadores.

VI Evaluación de extractos microbianos frente a pudriciones radiculares en aguacate

generadas por Phytophthora cinnamomi

Resumen

La demanda mundial de aguacate supera su oferta en más de un 50% y existe la

necesidad de buscar alternativas que permitan incrementar su producción. Sin embargo,

la productividad de este cultivo es seriamente afectada por problemas fitosanitarios como

la pudrición radicular causada por Phytophthora cinnamomi Rands. En este trabajo se

evaluó la producción y actividad biológica frente a P. cinnamomi, de metabolitos

extracelulares obtenidos a partir de aislamientos bacterianos asociados a plantas de

aguacate en campo. Inicialmente se demostró la capacidad infectiva de aislamientos de

P. cinnamomi. A través de pruebas de antagonismo in vitro se seleccionaron las

bacterias AED38 y AED56 con base en su halo de inhibición. Posteriormente, los

extractos metabólicos bacterianos fueron evaluados in vitro e in vivo para verificar su

capacidad de protección de plantas de aguacate frente a infecciones radiculares

causadas por P. cinnamomi. El extracto AED38 demostró ser efectivo a una

concentración de 60 mg/L, igualando el efecto de un fungicida sintético comercial a 0,5

mg/L.

Palabras clave: microbioma, rizósfera, control biológico, Serratia sp., metabolitos

secundarios.

Resumen y Abstrac VII

Abstract

The global avocado demand exceeds its supply by more than 50%. New alternatives to

increase avocado fruit production are necessary. However, the productivity of this crop is

seriously affected by diseases such as root rot caused by Phytophthora cinnamomi

Rands. In this study, the biological activity of extracellular metabolites from antagonistic

bacteria against P. cinnamomi was evaluated. The bacterial isolates were obtained from

healthy avocado trees in field. In the first place, the infectivity of several P. cinnamomi

isolates was demonstrated. AED38 and AED56 were selected through antagonism

assays, due to their highest inhibition halo. Metabolic extracts from promising bacteria

were evaluated in vitro and in vivo to validate their capacity to protect avocado plantlets

against rot root caused by P cinnamomi. The extract showed to be effective at a

concentration of 60 mg/L. The effect of the metabolic extract was not different to that of a

commercial synthetic product at 0.5 mg/L.

Keywords: microbiome, rhizosphere, Serratia sp., secundary metabolics.

Contenido IX

Contenido

Pág.

Resumen ................................................................................................................ VI

Lista de figuras ...................................................................................................... XI

Lista de tablas ...................................................................................................... XII

Lista de abreviaturas ............................................................................................. 1

Introducción ........................................................................................................... 2

1. Capítulo 1. Patogenicidad de aislamientos de P. cinnamomi frente a raíces desprendidas de aguacate ................................................................ 7

1.1 Antecedentes ................................................................................................... 7 1.2 Materiales y métodos ....................................................................................... 8

1.2.1 Medios de cultivo y reactivos ................................................................. 8 1.2.2 Microorganismos ................................................................................... 9 1.2.3 Pruebas de virulencia ............................................................................ 9 1.2.4 Análisis estadístico .............................................................................. 10

1.3 Resultados y discusión .................................................................................. 10 1.3.1 Pruebas de virulencia .......................................................................... 10

2. Capítulo 2. Capacidad antagónica frente a P. cinnamomi de bacterias asociadas al microbioma rizosférico de plantas de aguacate ................. 15

2.1 Antecedentes ................................................................................................. 15 2.2 Materiales y métodos ..................................................................................... 17

2.2.1 Microorganismos y medios de cultivo .................................................. 17 2.2.2 Aislamiento de Microorganismos ......................................................... 17 2.2.3 Ensayos de antagonismo in vitro ......................................................... 18 2.2.4 Cinética de producción de metabolitos extracelulares con capacidad antagónica ........................................................................................................ 18 2.2.5 Extracción de los metabolitos extracelulares ....................................... 19 2.2.6 Ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos metabólicos ..... 19 2.2.7 Caracterización molecular de los microorganismos con mayor potencial20

2.3 Resultados y discusión .................................................................................. 20 2.3.1 Ensayos de antagonismo in vitro ......................................................... 20 2.3.2 Ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos metabólicos ..... 21

X Evaluación de extractos microbianos frente a pudriciones radiculares en

aguacate generadas por Phytophthora cinnamomi

3. Capítulo 3. Evaluación de la efectividad de los extractos extracelulares

en la protección de plántulas de aguacate frente a la pudrición de raíz generada por P. cinnamomi ........................................................................27

3.1 Antecedentes .................................................................................................27 3.2 Materiales y métodos .....................................................................................28

3.2.1 Microorganismos y medios de cultivo ..................................................28 3.2.2 Obtención y extracción de los extractos microbianos de AED38 y AED56. ………………………………………………………………………………..28 3.2.3 Ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos metabólicos ......29 3.2.4 Pruebas de toxicidad de los extractos microbianos producidos en PDA sobre un modelo de Rábano (Raphanus sativus)...............................................29 3.2.5 Efectividad de los extractos extracelulares in vivo ...............................30

3.3 Resultados y discusión ...................................................................................32 3.3.1 Ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos metabólicos ......32 3.3.2 Pruebas de toxicidad de los extractos microbianos ..............................33 3.3.3 Efectividad de los extractos extracelulares in vivo ...............................34

4. Conclusiones y recomendaciones .............................................................39 4.1 Conclusiones ..................................................................................................39 4.2 Recomendaciones ..........................................................................................40

A. Anexo A: Preparación medio PDA PARBH o PDA con antibióticos .........41

B. Anexo B: Preparación medio VK ................................................................43

Referencias ...........................................................................................................45

Contenido XI

Lista de figuras

Pág. Figura 1-1. Pruebas de virulencia de aislamientos de Phytophthora cinnamomi y

crecimiento de bacterias y hongos en muestras de raíz desprendida. Las letras

corresponden a la prueba de comparación de medias de Tukey. Letras diferentes indican

diferencias estadísticamente significativas con un porcentaje de confiabilidad del 95%. 11

Figura 2-1. Ensayos de antagonismo por cultivo dual (tres réplicas por ensayo). A.

Control de P. cinnamomi B. Inhibición de P. cinnamomi frente a cuatro aislamientos

bacterianos diferentes C. Control de Colletotrichum sp. D. Inhibición de Colletotrichum sp.

frente a cuatro aislamientos bacterianos diferentes. E. Control de Phomopsis sp. F.

inhibición de Phomopsis sp. frente a cuatro aislamientos bacterianos diferentes. .......... 20

Figura 3-1: Concentración mínima inhibitoria de Serratia sp. AED38 y Serratia sp.

AED56 frente a P. cinnamomi. ....................................................................................... 32

Figura 3-2. Fitotoxicidad de los extractos de Serratia sp. AED38 sobre rábano (Raphanus

sativus). A. Porcentaje de germinación. B. Peso fresco de las semillas germinadas a los

5 días del ensayo. .......................................................................................................... 33

Figura 3-3. Imágenes de la fitotoxicidad del extracto Serratia sp. AED38 en semillas de

rábano (Raphanus sativus). A. Control. B. 62,5 mg/L. C. 125 mg/L. D. 250 mg/L. . ¡Error!

Marcador no definido.

Figura 3-4. Área bajo la curva del progreso de la infección de P. cinnamomi en plántulas

de aguacate. Escala utilizada: 1. decaimiento de las hojas; 2. enrollamiento de las hojas

en el tercio superior; 3. enrollamiento de las hojas en el tercio medio, cuarto; 4.

enrollamiento de las hojas en el tercio inferior; 5. marchitez de la planta. Letras diferentes

indican diferencias estadísticamente significativas con un nivel de significancia del 95%.

....................................................................................................................................... 35

Figura 3-5. Plantas de aguacate al finalizar el experimento de actividad in vivo. A.

Control Absoluto: plantas sin infectar con P35. B. Control de infección: plantas inoculadas

con P35. C. Control Fungicida: plantas inoculadas con P35 + fungicida comercial

(concentración final 0,5 mg/L). D. Tratamiento extracto AED38 (180 mg/L). E.

Tratamiento extracto AED38 (120 mg/L). F. Tratamiento extracto AED38 (60mg/L). ...... 36

Contenido XII

Lista de tablas

Pág. Tabla 1-1. Aislamientos de P. cinnamomi empleados en el estudio. ................................. 9

Tabla 2-1. Rango de inhibición en ensayos de antagonismo de cada uno de los

aislamientos obtenidos en los muestreos en el Municipio de Anserma, departamento de

Caldas y el Oriente Antioqueño, Colombia. ..................................................................... 22

Tabla 2-2. Concentración mínima inhibitoria (CMI) en mg/L frente a P. cinnamomi P35 de

los extractos obtenidos a partir de AED38 y AED56........................................................ 23

Lista de ecuaciones

Ecuación 3.1. Cálculo del área bajo la curva del progreso de la

enfermedad.……………………………………………………………………………………...29

Lista de abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

P. cinnamomi Phytophthora cinnamomi Msnm Metros sobre el nivel del mar mm Milímetros

mL Mililitros

cm Centímetros

min Minutos

nm Nanómetros

µL Microlitros

mg/L Miligramos por mililitro

ppm Partes por millón

% Porcentaje

PDA Agar Papa Dextrosa

PDA - PARBH Agar PDA con PCNB, ampicilina, rifampicina, benomil e himexazol

TSA Agar Tripticasa de Soya

PCNB Pentacloronitrobenceno

AED Aislado Endófito

ARP Aislado de rizoplano

CMI Concentración mínima inhibitoria

PGPR Bacterias promotoras de crecimiento

ABCPE Área bajo la curva del progreso de la enfermedad

2 Introducción

Introducción

El aguacate es un fruta tropical que por sus propiedades nutritivas y características

fisicoquímicas es altamente demandado por la industria debido a su gran potencial

exportador, su alto valor nutritivo, sabor agradable, versatilidad, fácil preparación y

amplias posibilidades de uso, tanto en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica.

Dada su importancia en términos económicos y alimenticios hoy se cultiva en más de 59

países como: México, Colombia, Chile, Estados Unidos, Sud África, Israel, Perú,

Australia, España, Kenia, entre otros, dando lugar a unas 400.000 hectáreas de cultivo

distribuidas en diferentes regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo

(Bernal, Diez, Tamayo, Cordoba, & Londoño, 2008; Mejía, 2010; Yabrudy, 2012).

En Colombia el cultivo del aguacate ha venido creciendo durante los últimos años,

permitiendo al país ubicarse entre los principales productores a nivel mundial - quinta

posición - con 13% del área total cultivada en el mundo (Páez, Salazar, Acosta, & López,

2016; G. J. G. Ramírez, Castañeda, & Morales, 2014; Yabrudy, 2012). En la actualidad,

gracias a la ayuda del Ministerio de Agricultura, se fomenta el desarrollo del cultivo y su

participación en el mercado internacional a través del apoyo en investigación y a

pequeños productores, tanto en el proceso de siembra como en el manejo poscosecha,

buscando así garantizar la calidad del producto final (Cañas, Galindo, Arango, &

Saldamando, 2015; Mejía, 2010). Sin embargo, a pesar del rápido crecimiento y las

postuladas ventajas agroclimáticas que tiene Colombia para la producción de aguacate,

aún no se logra satisfacer su demanda interna.

Para responder al reto de competitividad y las exigencias del mercado con respecto a los

demás países productores existe una necesidad creciente de incrementar los

rendimientos en la producción de aguacate, aumentar el área cultivada y resolver

algunos problemas fitosanitarios que limitan su producción y disminuyen la calidad del

fruto (Ríos & Tafur, 2003). En este sentido, la pudrición de raíz generada por el oomycete

Phytophthora cinnamomi Rands sobresale como la enfermedad más limitante y de mayor

incidencia a nivel mundial (Damm et al., 2010; Fierro Corrales, 2011; Horta, Sousa,

Coelho, Neves, & Cravador, 2008; Rookes, Wright, & Cahill, 2008). P. cinnamomi puede

afectar cualquier variedad de aguacate, siendo la variedad Hass – el 95% de los frutos de

Introducción 3

aguacate que se comercializan a nivel mundial son de esta variedad – altamente

susceptible generando pérdidas hasta en un 90% del cultivo (Pérez-Jiménez, 2008).

P. cinnamomi se encuentra entre los fitopatógenos más destructivos en el mundo. Es

capaz de atacar plantas de todas las edades, ocasiona pudrición en las raíces pivotantes

y laterales y se extiende hasta el tronco disminuyendo la vigorosidad, productividad e

incluso causando la muerte del árbol (Bernal et al., 2008; Ciro, Rendon, & Navarro, 2006;

Pérez-Jiménez, 2008). Entre las raíces más afectadas se encuentran las más finas, las

cuales son deterioradas generando un retraso en la toma de nutrientes, en el desarrollo

normal del material vegetal y causando la muerte de la planta en un periodo que puede

tardar desde unos pocos meses hasta 2 o 3 años aproximadamente (Ramírez Gil,

Castañeda Sánchez , & G., 2014; Tamayo, 2007).

La clasificación taxonómica actual de P. cinnamomi está definida de la siguiente manera:

Reino: Protista Filo: Oomycota

Clase: Oomycetes Orden: Pythiales

Familia: Pythiaceae Género: Phytophthora

Especie: P. cinnamomi.

Phytophthora es considerado el género más importante de los patógenos oomycetes,

puesto que es el agente causal que más pérdidas genera en la producción agrícola y

hortícola en el mundo (Drenth et al., 2006; Pegg, Whiley, Saranah, & Glass, 1985;

Zentmeyer, 1980). Su importancia radica en la cantidad de plantas hospederas que tiene

para sobrevivir como canelo, eucaliptos, roble, pino, piña, alfalfa, crucíferas, tomate,

zanahoria y fresa, entre las más conocidas. Se han descubierto 117 especies, la mayoría

invasoras de tejidos vegetales en una amplia gama de cultivos vegetales y plantas

ambientales (Del Castillo et al., 2013). A nivel mundial, ha sido reportado como el

causante de miles de millones de dólares en pérdidas de cultivos de aguacate en países

como México, Perú, Costa rica y Honduras (Tamayo, 2007). En Colombia P. cinnamomi

se ha reportado como la especie causante de la pudrición radicular en árboles en etapa

de vivero y durante los dos primeros años de vida, disminuyendo los rendimientos hasta

en un 50% (Tamayo, 2007).

4 Introducción

Por tales motivos, existe la necesidad de controlar la diseminación y disminuir la

incidencia de este fitopatógeno. La utilización de agroquímicos continúa siendo el método

de control más utilizado. Este hecho, además de crear una dependencia creciente del

sector productivo hacia las compañías abastecedoras de productos químicos, ha

favorecido la selección de patógenos cada vez más resistentes. Adicionalmente, el

deterioro del medio ambiente y los riesgos asociados a la salud humana generados por la

aplicación de estos productos ha convertido el problema fitosanitario en una amenaza

crónica. Lo anterior ha promovido la búsqueda de alternativas viables que permitan la

disminución progresiva del uso de fungicidas y pesticidas de síntesis química, buscando

generar un menor impacto ambiental (Chalfoun, 2010; Godinho et al., 2015; María

Teresa, Rosaura, Elda, & Ernesto, 2014; Morales, 2009).

Una alternativa viable para el control de P. cinnamomi, y con menores impactos

ambientales, es el uso de compuestos provenientes de fuentes naturales como

microorganismos y plantas. Los metabolitos de origen microbiano sobresalen como las

moléculas de mayor potencial de actividades biológicas (Berdy, 2005; Subramani &

Aalbersberg, 2012). De éstos, más del 46% de los reportados hasta ahora exhiben algún

tipo de actividad inhibitoria ya sea como fármacos, antibióticos o para uso agrícola

(Chalfoun, 2010; Godinho et al., 2015). Con base en estas observaciones se ha

planteado como objetivo de este trabajo evaluar la producción de metabolitos

extracelulares obtenidos a partir de bacterias antagonistas asociadas a plantas de

aguacate, y su capacidad protectante frente a P. cinnamomi.

Para tal fin, el presente trabajo estuvo enmarcado en los siguientes objetivos:

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la producción y actividad biológica frente a Phytophthora cinnamomi, de

metabolitos extracelulares obtenidos a partir de bacterias antagonistas asociadas a

plantas de aguacate (Persea americana Mill.).

Introducción 5

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la virulencia de aislamientos de P. cinnamomi pertenecientes a la

Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB).

Determinar la capacidad antagónica de bacterias asociadas al microbioma

rizosférico de plantas de aguacate frente a aislamientos de Phytophthora

cinnamomi de mayor virulencia resultado de la evaluación anterior.

Evaluar la eficacia de los extractos extracelulares en la protección frente a la

pudrición de raíz generada por P. cinnamomi en plántulas de aguacate.

1. Capítulo 1. Patogenicidad de aislamientos de P. cinnamomi frente a raíces

desprendidas de aguacate

1.1 Antecedentes

Los oomycetes son un grupo de microorganismos entre los que se incluyen los

fitopatógenos más devastadores a nivel mundial. En los últimos años el género de

Phytophthora ha recibido gran atención debido a las innumerables pérdidas que genera

en la producción agrícola y hortícola (Drenth et al., 2006). Phytophthora cinnamomi

Rands se encuentra entre los géneros más importantes de patógenos oomycetes. Ataca

plantas de todas las edades y cuenta con una gran cantidad de hospederas para poder

sobrevivir (Hoyos et al., 2015; Zentmeyer, 1980). Su principal síntoma es la pudrición

radicular; sin embargo, puede causar síntomas secundarios como decoloración y

marchitamiento en las hojas viejas, enrollamiento de las hojas nuevas, sobreproducción

de frutos pequeños y de mala calidad, entre otros (Lopez, 2004; Tamayo, 2007).

P. cinnamomi en su estado vegetativo puede desarrollar un crecimiento micelial y es

capaz de producir tres tipos de esporas asexuales: esporangios, zoosporas y

clamidosporas; todas con capacidad de infectar un gran número de plantas (O'Gara,

Howard, McComb, Colquhoun, & Hardy, 2015). Este oomycete ataca las raíces de las

plantas generalmente mediante unidades infectivas llamadas zoosporas que son

liberadas a partir de los esporangios. Las zoosporas son células sencillas carentes de

pared celular, biflageladas, motiles, que se encuentran inmersas en películas de agua en

el suelo, arroyos y estanques, lo que les permite desplazarse con facilidad y nadar hacia

las raíces jóvenes y tejidos de tallo de plantas vivientes (Serrano, de Vita, Rebollo, &

Sánchez, 2011). Teniendo en cuenta lo anterior, P. cinnamomi puede convertirse en un

8 Evaluación de extractos microbianos frente a pudriciones radiculares en aguacate generadas por Phytophthora cinnamomi

patógeno devastador, debido a que las precipitaciones y el agua de riego se tornan en un

factor clave para la distribución de éste en casi cualquier tipo de geología (Morgan &

Shearer, 2013).

No obstante, a pesar de las grandes pérdidas ecológicas y económicas que genera en

diferentes cultivares, las investigaciones en esta última década se han centrado más en

estudios de origen molecular y filogenético que en estudios que permitan su control

(Drenth et al., 2006; Garnica et al., 2006). Por tanto, el desarrollo de proyectos en el área

de control biológico que ayuden a disminuir o erradicar los efectos por P. cinnamomi se

hace cada vez más evidente y necesario. En este sentido, el uso de microorganismos

antagonistas presentes en el suelo es considerada una fuente importante de productos

naturales con capacidad de inhibir el crecimiento de diferentes patógenos de interés. Se

sabe que las plantas sanas en agroecosistemas se asocian frecuentemente a

microorganismos que le dan la posibilidad a la planta hospedera de defenderse de un

ataque por patógenos o estreses abióticos. Estos microorganismos han mostrado gran

potencial para la producción de compuestos activos (Firáková, Šturdíková, & Múčková,

2007; Ludwig-Müller, 2015).

Por todo lo anterior, el desarrollo de este trabajo tuvo como objetivo evaluar la virulencia

de diferentes aislamientos de Phytophthora cinnamomi pertenecientes a la Corporación

para Investigaciones Biológicas (CIB) en raíces desprendidas de aguacate.

Posteriormente, el aislamiento más virulento o agresivo será utilizado para seleccionar

microorganismos antagonistas con potencial para control de P. cinnamomi.

1.2 Materiales y métodos

1.2.1 Medios de cultivo y reactivos

Para el crecimiento de los microorganismos se empleó Agar Papa-Dextrosa (PDA) y agar

granulado marca Merck®, ampicilina a una concentración de 5mg/L, rifampicina a 0,3

mg/L, benomil a 0,4 mg/L e himexazol a 25 mg/L y pentacloronitrobenceno a 20 mg/L.

Capítulo 1 9

1.2.2 Microorganismos

Los aislamientos de Phytophthora cinnamomi empleados fueron aislados de diferentes

regiones donde se cultiva aguacate en el Departamento de Antioquia, Colombia y

pertenecen al banco de fitopatógenos de la Corporación para Investigaciones Biológicas

(CIB) (ver Tabla 1-1). Los aislamientos fueron mantenidos en agar PDA a 21°C

comprobando su pureza antes de usarlos través de técnicas de microscopía.

Tabla 1-1. Aislamientos de P. cinnamomi empleados en el estudio.

Código del aislamiento

Subregión Municipios

89 Oriente Antioqueño San Vicente de Ferrer

FG10 Oriente Antioqueño El Retiro

ANSS07 Oriente Antioqueño Sonsón

P35 Suroeste Antioqueño Caramanta

JBVF1 Suroeste Antioqueño Jardín

1.2.3 Pruebas de virulencia

Se empleó la metodología de Botha (1989) con algunas modificaciones. Se obtuvieron

plántulas de aguacate nativo de 5 meses de edad a partir de un patrón previamente.

Posteriormente se seleccionaron raíces nutricionales teniendo en cuenta el buen estado

de su ápice. Las raíces fueron cortadas en segmentos de 3 cm de largo, sumergidas en

20 mL de agua de grifo contenida en tubos plásticos y agitadas durante 15 min para

remover el exceso de suelo. Luego, se dispusieron en un baño sonicador por 2 min, el

agua fue descartada y se sumergieron en solución de hipoclorito de sodio al 1% durante

1 min. Finalmente, las raíces fueron lavadas con agua estéril y etanol al 70% durante 1

min, respectivamente. Por último se realizaron tres lavados adicionales con agua estéril.

En el centro de una caja de petri que contenía agar agua (agar-agar 2%) se sembró un

fragmento circular de micelio de P. cinnamomi de 2 mm. El fragmento fue tomado a partir

de un cultivo crecido por 10 días en medio de cultivo PDA. Los ápices de las raíces

fueron colocados en contacto con el micelio e incubados a 25°C bajo condiciones de

oscuridad. Se utilizaron cinco raíces por placa y se realizaron tres repeticiones por


tratamiento. Cada caja de petri fue considerada como una unidad experimental. El

porcentaje de avance de la infección de los aislamientos de P. cinnamomi se midió a las

48 horas. Para esto, se tomaron todas las raíces, se desinfectaron con etanol al 70% por

5 segundos y se lavaron con agua estéril. Posteriormente, cada raíz se cortó en

segmentos de 3 mm y sus fragmentos fueron sembrados en orden de corte desde el

extremo final hasta el ápice en medio PDA PARBH (Preparación en el anexo 1), para

favorecer en primera medida el desarrollo de P. cinnamomi. Una vez observada la

formación de micelio en cada uno se los fragmentos de raíz se contaron y se expresaron

como segmentos con crecimiento de P. cinnamomi por raíz. Posteriormente se tomó nota

de la presencia o ausencia de las bacterias y hongos que aparecieron en los segmentos

donde no creció P. cinnamomi con el propósito de identificar si estos afectaban o no la

colonización por parte del oomycete. (Botha, Wehner, & Kotze, 1989).

Para cada fragmento de raíz, el porcentaje de infección fue calculado a partir de la

estimación del número de segmentos infectados respecto el número total de segmentos

en la muestra. Posteriormente, se estimó la media por unidad experimental, y finalmente

la media por tratamiento. Todas las muestras contenían la misma cantidad de

segmentos. Este experimento se repitió en el tiempo para corroborar la capacidad

infectiva de los aislamientos evaluados.

1.2.4 Análisis estadístico

El diseño estadístico empleado fue un diseño completamente al azar. La variable

respuestas evaluada correspondió a la aparición de micelio de P. cinnamomi en medio

PDA – PARBH, bacterias y hongos. Posteriormente se realizó un análisis de varianza y

una prueba de comparación de medias entre los porcentajes de infección de los

aislamientos.

1.3 Resultados y discusión

1.3.1 Pruebas de virulencia

En los análisis realizados para evaluar la capacidad infectiva de los diferentes

aislamientos de P. cinnamomi se evidenció crecimiento tanto de hongos como de

bacterias (Figura 1-1). En el caso de las bacterias fue superior al 50% en todos los

Capítulo 1 11

tratamientos. La explicación a esta observación puede relacionarse con las condiciones

de mantenimiento del material vegetal bajo condiciones de invernadero. El sustrato

utilizado para el desarrollo y crecimiento de las plantas de aguacate no era estéril, y

probablemente contenía una elevada carga microbiana en contacto con las raíces que no

pudo ser removida completamente con el proceso de desinfección empleado.

El crecimiento micelial de P. cinnamomi fue evidenciado en la superficie de las raíces

después de 48 horas de contacto. Sin embargo, los porcentajes de colonización fueron

inferiores al 50% para cada uno de los aislamientos evaluados (Figura 1-1). Teniendo en

cuenta que durante el experimento fueron proporcionadas condiciones para favorecer la

infección, los bajos porcentajes obtenidos podrían atribuirse a un tiempo de contacto

insuficiente entra la raíz y el patógeno. Igualmente, a la presencia de otros

microorganismos que podrían haber exhibido algún tipo de antagonismo natural contra P.

cinnamomi (Botha et al., 1989; Clarke et al., 2006; Hakizimana, Gryzenhout, Coutinho, &

van den Berg, 2011).

Figura 1-1. Pruebas de virulencia de aislamientos de Phytophthora cinnamomi y

crecimiento de bacterias y hongos en muestras de raíz desprendida. Las letras

corresponden a la prueba de comparación de medias de Tukey. Letras diferentes indican

diferencias estadísticamente significativas con un porcentaje de confiabilidad del 95%.


Los datos del porcentaje de infección fueron utilizados para realizar las pruebas de

normalidad de los residuales y homogeneidad de varianza a través de las pruebas de

Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Los resultados indicaron que la prueba de

virulencia cumplió con los supuestos. Los aislamientos ANSS07, P35 y 89 mostraron un

mayor porcentaje de colonización y por tanto una mayor virulencia (Figura 1-1). Respecto

al crecimiento de bacterias y hongos no se evidenció ninguna diferencia estadística

significativa entre los tratamientos; sin embargo, de acuerdo a los resultados obtenidos

hubo una mayor proliferación de bacterias que de hongos en las muestras evaluadas. El

crecimiento de las bacterias superó en 20% el crecimiento de los aislamientos de P.

cinnamomi y en un 50% el crecimiento de los hongos.

Los resultados permitieron confirmar que todos los aislamientos de P. cinnamomi

pertenecientes a la CIB son patogénicos. Es decir, todos fueron capaces de producir la

infección en raíces de aguacate usando la metodología de raíz desprendida. En términos

estadísticos, los aislamientos ANSS07 y P35 exhibieron los mayores grados de

virulencia, ya que obtuvieron los mayores porcentajes de infección. Estos aislamientos

son los más adecuados para realizar pruebas in vitro e in vivo que permitan evaluar el

a

b b bc bc

c

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Control ANSS07 P35 89 JBVF1 FG10

Co

lon

izació

n (

%)

P. cinnamomi Bacterias Hongos

Capítulo 1 13

potencial de usar extractos microbianos para su control. Sin embargo, para desarrollar

estudios de este tipo se debe realizar primero un tamizaje de la actividad y

comportamiento de diferentes bacterias antagonistas a nivel in vitro frente al patógeno de

interés (Köhl, Postma, Nicot, Ruocco, & Blum, 2011).

El desarrollo de metodologías como la prueba de virulencia aplicada en este estudio son

indispensables, ya que permiten conocer la susceptibilidad y resistencia vertical en el

hospedante, así como la capacidad infectiva del patógeno para generar la enfermedad.

Además, es una prueba sencilla para hacer un tamizaje inicial con el fin de descifrar la

tolerancia de diferentes patrones empleados en campo frente a P. cinnamomi. No

obstante, estos deben ser evaluados posteriormente a nivel de invernadero y campo

antes de ser seleccionados como material vegetal promisorio (Botha et al., 1989).

2. Capítulo 2. Capacidad antagónica frente a P. cinnamomi de bacterias asociadas al microbioma rizosférico de plantas de

aguacate

2.1 Antecedentes

El uso indiscriminado de agroquímicos no solo ha generado deterioro en la salud humana

y el ambiente, sino que también ha acelerado la selección de patógenos cada vez más

resistentes, convirtiendo el problema fitosanitario en una amenaza crónica (Sierra,

Romero, & Orduz, 2012). Esto ha promovido la búsqueda de alternativas viables en la

búsqueda de una disminución progresiva del uso de fungicidas y plaguicidas de origen

químico. (María Teresa et al., 2014; Morales, 2009). En los últimos años se ha venido

generando un alto interés en la implementación de técnicas biotecnológicas para el

control biológico de enfermedades transmitidas por el suelo a diferentes variedades de

plantas (Bosmans, De Bruijn, De Mot, Rediers, & Lievens, 2016),

Tradicionalmente, las plantas han sido la principal fuente de compuestos naturales

(metabolitos secundarios) con aproximadamente 700.000 estructuras reportadas hasta el

momento. De estos compuestos el 20% presentan algún tipo de actividad biológica

(Berdy, 2005; Calo, Crandall, O'Bryan, & Ricke, 2015). Sin embargo, la obtención de

grandes cantidades de estos metabolitos está limitada normalmente por la baja

disponibilidad de material vegetal (existe la necesidad de mayores áreas cultivadas para

incrementar producción), y por condiciones geográficas y climatológicas específicas para

su cultivo. Estas limitaciones impiden alcanzar altos volúmenes de producción de los

metabolitos de interés en algunos casos, como lo es la obtención de aceites esenciales

(Zabka & Pavela, 2013).


Ante esta problemática, el desarrollo de nuevos productos basados en metabolitos

microbianos producidos por bacterias antagonistas se ha convertido en una alternativa

potencial. Las bacterias antagonistas son aquellas capaces de interactuar con otros

microorganismos, ya sea de la misma o diferente especie, inhibiendo su crecimiento

parcial o totalmente o incluso matándolo (Köhl et al., 2011; Sharma, Singh, & Singh,

2009). Los metabolitos microbianos pueden ser igual o más efectivos que un producto

natural extraído de plantas pero con mayor facilidad de producción a gran escala

(Subramani & Aalbersberg, 2012). Además, comparados con productos sintetizados

químicamente suelen ser mucho más específicos y generalmente menos peligrosos para

otros organismos (Bosmans et al., 2016; Sierra et al., 2012).

En la mayoría de los casos el modo de acción mediante el cual un antagonista actúa en

un determinado ecosistema no es totalmente claro. Sin embargo, se sabe que uno de los

mecanismos determinantes en las relaciones antagónicas es la producción de

compuestos activos o antibiosis (Bertrand et al., 2014). Muchos de estos compuestos

son producidos a partir del metabolismo secundario de los microorganismos y son

considerados de gran interés para el ser humano por poseer propiedades

antibacterianas, antifúngicas, antitumorales, inmunosupresoras, antiparasitarias,

herbicidas e insecticidas, entre otras (Bertrand et al., 2014; Sierra et al., 2012).

El 12% de los metabolitos microbianos reportados son utilizados en el control de

enfermedades causadas por bacterias y hongos (Bertrand et al., 2014). Entre los

diferentes grupos de microorganismos, las bacterias antagonistas son consideradas

ideales para atacar patógenos de suelo debido a su rápido crecimiento, fácil manejo y

rápida colonización de la rizósfera (Bosmans et al., 2016; Sharma et al., 2009). No

obstante, en el proceso de selección de una cepa con potencial para el control biológico

de fitopatógenos, como P. cinnamomi Rands, debe ser realizado a través de un tamizaje

inicial de actividad a nivel in vitro (Köhl et al., 2011).

Un tamizaje antimicrobiano permite medir la susceptibilidad de microorganismos frente a

compuestos bioactivos (Rojas, García, & López, 2005). Igualmente, permite la

clasificación de estos microorganismos como resistentes, intermedios o susceptibles

(Kalemba & Kunicka, 2003). Entre los métodos de tamizaje más empleados se

encuentran difusión en agar, inhibición del crecimiento micelial y microdilución en caldo.

Capítulo 2 17

La de difusión en agar es el más utilizado por su sencillez y rapidez (Bauer, Kirby,

Sherris, & Turck, 1966; Rojas et al., 2005), permite estimar el grado de inhibición sobre el

crecimiento del microorganismo mediante la formación de halos de inhibición en agar. La

microdilución en caldo utiliza una suspensión de células bacterianas normalizadas en

medios líquidos estandarizados que contiene diferentes concentraciones del extracto

evaluado. Por su parte, el método de inhibición del crecimiento micelial emplea la

microdilución en agar como una medida de acercamiento para encontrar la concentración

mínima inhibitoria (CMI) frente a los patógenos del ensayo (Cos, Vlietinck, Berghe, &

Maes, 2006).

Por lo anterior, el objetivo de este capítulo fue determinar la capacidad antagónica de

bacterias asociadas al microbioma rizosférico de plantas de aguacate frente al

aislamiento de P. cinnamomi P35.


2.2.1 Microorganismos y medios de cultivo

Los medios de cultivo utilizados para el crecimiento de microorganismos fueron agar

Tripticasa de Soya (TSA), Agar Papa-Dextrosa (PDA), Caldo TSB y Caldo Sabouraud.

Todos marca Merck®. Se seleccionó el aislamiento de P. cinnamomi P35 para los

ensayos subsecuentes, ya que presentó una capacidad infectiva adecuada. Aunque este

aislamiento no tuvo diferencia estadística significativa en términos de virulencia con el

aislamiento ANSS07, P35 era de mayor interés para el grupo de investigación por haber

sido objeto de estudio en trabajos anteriores (S. Ramírez et al., 2015). Los aislamientos

fueron mantenidos en agar PDA a 21°C comprobando su pureza través de microscopía

antes de ser usados.

2.2.2 Aislamiento de Microorganismos

Para la obtención de los microorganismos antagonistas se realizaron muestreos en fincas

aguacateras ubicadas en el Municipio de Anserma, departamento de Caldas y en el

Oriente Antioqueño, Colombia. Se tomaron raíces nutricionales y suelo a partir de árboles

de aguacate aparentemente sanos. De cada finca, y en forma de zig-zag, se muestrearon

entre cinco y ocho árboles. Las muestras fueron colocadas y trasportadas en bolsas


plásticas debidamente rotuladas y almacenadas a 4°C hasta su procesamiento en el

laboratorio. Las raíces se lavaron con agua destilada estéril para luego ser cortadas en

fragmentos de 0,5 cm. Los fragmentos obtenidos fueron colocados en Agar TSA y PDA

por duplicado. Las condiciones de incubación fueron 21°C durante 24 a 48 horas.

Transcurrido el tiempo de incubación se tomaron las colonias bacterianas que crecieron

sobre la superficie del medio de cultivo y se subcultivaron en un medio nuevo empleando

la siembra por agotamiento en TSA. Cada aislamiento fue codificado con la sigla “AED”

en el caso de los endófitos y “ARP” en el caso de los microorganismos del rizoplano. Los

aislamientos fueron mantenidos en agar blando a 4°C monitoreándolos constantemente y

comprobando su pureza a través de técnicas de tinción y microscopía antes de usarlos.

2.2.3 Ensayos de antagonismo in vitro

Los ensayos de antagonismo se realizaron mediante la técnica de cultivos duales en caja

de petri (Cundom, de Gaiad, de Castañón, de Arriola, & Coutinho, 1999), enfrentando a

P. cinnamomi P35 con los aislamientos bacterianos obtenidos previamente (numeral

2.2.2). Para determinar el efecto inhibitorio de los aislamientos sobre el fitopatógeno se

tomaron cajas de petri que contenían medio de cultivo PDA. Cada caja se dividió en

cuatro cuadrantes, en cada uno de ellos se ubicó un potencial antagonista a 1 cm del

borde de la caja y en el centro se ubicó un fragmento de agar de 5 mm con el

fitopatógeno crecido por 8 días. Adicionalmente se empleó un control de crecimiento de

cada uno de los fitopatógenos sin antagonistas. Se midió el halo de inhibición alrededor

de los potenciales antagonistas cada 24 h durante 8 días. El grado de inhibición fue

cuantificado en escala de 0 a 3 (0 = sin halo de inhibición, 1= halo de 0.1 a 1 cm, 2= halo

de 1 a 2 cm, 3=halo de 2 a 4 cm). Todos los procedimientos se realizaron por triplicado y

con una repetición en el tiempo.

2.2.4 Cinética de producción de metabolitos extracelulares con capacidad antagónica

Se preparó un inóculo de 100 mL en caldo TSB de la bacteria a ser crecida y se incubó

durante 24 h a 26°C y 200 rpm. Posteriormente, se tomaron 200 µL y se agregaron a

cajas petri que contenían agar PDA y agar TSA y fueron esparcidos por toda la superficie

con un asa de digrasky estéril. Estas se rotularon debidamente y se incubaron a 26°C.

Posteriormente se tomaron muestras a las 0, 12, 24, 48, 72, y 96 horas de cultivo, por

Capítulo 2 19

aislamiento y medio de cultivo. Todos los procedimientos se realizaron por duplicado

(Bosmans et al., 2016).

2.2.5 Extracción de los metabolitos extracelulares

Las cajas petri a los diferentes tiempos de crecimiento fueron extraídas empleando

acetato de etilo según la técnica de Garbeva con algunas modificaciones (Garbeva, Silby,

Raaijmakers, Levy, & de Boer, 2011). El agar fue cortado en fragmentos más pequeños y

se realizaron dos extracciones con el solvente en una proporción 2:1 solvente y agar

respectivamente. Posteriormente se recuperó la fase orgánica y se eliminó el solvente en

un evaporador rotativo asistido por vacío para obtener los respectivos extractos. Los

extractos obtenidos fueron almacenados a -70°C hasta su evaluación.

2.2.6 Ensayos de actividad antimicrobiana de los extractos metabólicos

La evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos frente a P.

cinnamomi se realizó por medidas de densidad óptica a 595 nm, empleando microplacas

estériles de 96 pozos (Granada, Rueda, & Peláez, 2014; S. Ramírez et al., 2015) y un

lector de microplacas BioRad modelo 680XR. Para esto se preparó una suspensión de

fragmentos de micelio de P. cinnamomi en tubos plásticos de 50 mL con 20 mL de medio

Sabouraud y perlas de vidrio. La suspensión se ajustó a una concentración de 1x104

fragmentos/mL por conteo en cámara de Neubauer. En cada pozo de la microplaca se

adicionaron 140 µL de medio de cultivo Sabouraud, 10 µL del extracto y 50 µL de inóculo

para un volumen total de 200 µL. Se realizaron 8 diluciones sucesivas de 1 en 2 hasta

evaluar 8 diluciones del extracto.

Los extractos se evaluaron por cuadriplicado en cada uno de los ensayos, incluyendo su

réplica y sus respectivos controles. Las microplacas fueron incubadas durante 7 días a

21°C y su lectura se realizó al inicio y final del experimento con el propósito de obtener

un delta de la densidad óptica de cada pozo. La concentración mínima inhibitoria (CMI)

se definió como la concentración más baja a la cual no hubo crecimiento significativo de

P. cinnamomi.


2.2.7 Caracterización molecular de los microorganismos con mayor potencial

Los bacterias cuyos extractos presentaron las CMI más bajas frente a P. cinnamomi

fueron identificadas en género. Para ello se obtuvo DNA a partir de cultivos axénicos y se

amplificó la región 16s del DNA ribosomal. Los amplicones fueron secuenciados y se

realizó un BLAST en GenBank.


2.3.1 Ensayos de antagonismo in vitro

Se obtuvieron 63 aislamientos bacterianos a partir de raíces nutricionales de árboles de

aguacate aparentemente sanos. Los 63 aislamientos bacterianos fueron utilizados para

realizar ensayos de antagonismo frente a P. cinnamomi (Tabla 2-1). El 40% de los

aislamientos presentó algún tipo de inhibición frente a P. cinnamomi (25 aislamientos), de

los cuales el 11% (7 aislamientos) correspondía a los aislamientos que mostraron el

mayor grado de inhibición frente a este patógeno.

Estos resultados corroboran la afirmación de que en el suelo y la rizósfera se encuentran

una gran variedad de microorganismos antagonistas capaces de inhibir el crecimiento de

patógenos. La producción de metabolitos secundarios (incluyendo antibióticos y

compuestos volátiles) se encuentran entre los mecanismos de inhibición más utilizados

por bacterias antagonistas (Compant, Duffy, Nowak, Clément, & Barka, 2005). Algunos

autores sugieren que el antagonismo también está mediado por la competencia de

nutrientes entre el antagonista y el agente patogénico, (Ahemad & Kibret, 2014; Compant

et al., 2005; Garbeva et al., 2011; Saharan & Nehra, 2011). No obstante, los mecanismos

involucrados en la producción son complejos y dependen en gran medida de la presión

natural a la que es sometido un aislamiento en particular (Alippi & Reynaldi, 2006; Wulff

et al., 2002).

Figura 2-1. Ensayos de antagonismo por cultivo dual (tres repeticiones por ensayo). A.

Control de P. cinnamomi B. Inhibición de P. cinnamomi frente a cuatro aislamientos

bacterianos diferentes.

Capítulo 2 21


Los aislamientos AED34, AED38, AED45, AED56 y AED57 mostraron grado de inhibición

tres (3) para P. cinnamomi al igual que para otros patógenos de interés comercial para el

aguacate como Colletotrichum sp. y Phomopsis sp. (estos datos no se muestran).

Adicionalmente, en los ensayos in vitro, AED38 y AED56 mostraron los menores valores

de CMI pasadas las 12 horas de cultivo (281 y 163 mg/L, respectivamente). La cinética

de producción de metabolitos en PDA y TSA de los aislamientos AED38 y AED56 fue

evaluada. Su selección se realizó con base en su alta capacidad para inhibir P.

cinnamomi in vitro y su rapidez para proliferar en el agar. Adicionalmente, su morfología

fue diferente a los aislamientos AED34, AED45 y AED57. Los extractos de AED38 y

AED56 se obtuvieron a las 0, 12, 24, 48, 72, y 96 horas de cultivo y se evaluó la

concentración mínima inhibitoria de cada extracto frente a P35 en microplacas de 96

pozos.


Tabla 2-1. Rango de inhibición en ensayos de antagonismo de cada uno de los

aislamientos obtenidos en los muestreos en el Municipio de Anserma, departamento de

Caldas y el Oriente Antioqueño, Colombia.

Nivel de inhibición de bacterias frente a P. cinnamomi

de aguacate por ensayos de cultivo dual

Aislamiento Bacteriano Phytophthora cinnamomi.

ARP 25 0

ARP 26.2 0

ARP 27 0

ARP 28 2

ARP 28.1 0

ARP 29 0

ARP 30 0

ARP 30.1 1

ARP 30.2 0

ARP 31 0

AED 11 3

AED 12 1

AED 13 0

AED 14 0

AED 15 0

AED 15.1 2

AED 15.2 2

AED 15.3 1

AED 16 0

AED 16.1 2

AED 17 0

AED 18 0

AED 19 0

AED 20 0

AED 21 0

AED 21.1 1

AED 21.2 0

AED 22 1

AED 23 0

Capítulo 2 23

Tabla 2-2. Evaluación de cinéticas de producción y concentraciones mínimas inhibitorias frente a P. cinnamomi P35 de los extractos obtenidos a partir de AED38 y AED56.

AED 24 0

AED 25 0

AED 26 0

AED 27 0

AED 28 0

AED 29 0

AED 30 0

AED 30.1 0

AED 31 0

AED 31.1 1

AED 32 0

AED 33 2

AED 34 3

AED 35 1

AED 36 0

AED 37 0

AED 38 3

AED 39 3

AED 40 0

AED 41 1

AED 42 1

AED 43 0

AED 44 1

AED 45 3

AED 46 2

AED 47 0

AED 48 0

AED 50 0

AED 52 0

AED 53 0

AED 54 1

AED 55 0

AED 56 3

AED 57 3


AED38 AED56

Tiempo

(horas)

CMI (µg/mL) CMI (µg/mL)

TSA PDA TSA PDA

0 Sin inhibición Sin inhibición Sin inhibición Sin inhibición

12 Sin inhibición 281,1 Sin inhibición 163,9

18 Sin inhibición 316,7 Sin inhibición 356,7

24 208,3 432,4 Sin inhibición 667,6

48 403,3 477,8 Sin inhibición 687,5

72 290,2 416,7 266,7 423,6

96 336,8 387,5 245,0 252,8

Para ambos aislamientos la producción de compuestos activos capaces de inhibir el

crecimiento P. cinnamomi fue favorecida en medio PDA. En este medio se registró

inhibición del patógeno pasadas 12 h de cultivo, con una CMI menor respecto a las

demás horas evaluadas. En el caso de TSA la actividad fue evidente después de 24 h o

72 h de cultivo para AED38 y AED56, respectivamente. Lo anterior, pudo haberse dado

ya que, a menudo en la literatura hay reportes de que la producción de metabolitos

secundarios por bacterias es activada cuando el crecimiento es limitado por la cantidad

de carbono, nitrógeno, fosfatos y otras fuentes clave de nutrientes (Tyc, Song, Dickschat,

Vos, & Garbeva, 2016). Para este trabajo el medio de cultivo PDA era quien contenía

menos fuentes de carbono y nitrógeno para el crecimiento de ambos aislamientos

bacterianos. Además, en la literatura también se encuentran reportes donde confirman

que la composición y la concentración de nutrientes pueden afectar una gran cantidad de

mecanismos complejos en la regulación genética de muchas bacterias, desencadenando

así la producción de diferentes metabolitos secundarios activos en la naturaleza (Tyc et

al., 2016). Sin embargo, no hay que descartar que factores ambientales tales como la

temperatura, pH, humedad y luz pueden ser clave a la hora de producir compuestos con

actividad inhibitoria frente a diferentes patógenos (Tyc et al., 2016).

Los aislamientos antagonistas AED38 y AED56 fueron identificados como Serratia sp.

mediante ADN ribosomal 16s después de conocer su actividad frente a P. cinnamomi. El

género Serratia sp. ha sido caracterizado como productor de sustancias de interés

biotecnológico (Khoa, Giàu, & Tuấn, 2016). Muchos de sus miembros se han distinguido

Capítulo 2 25

como bacterias promotoras de crecimiento (PGPR), controladores de hongos

fitopatógenos, y otros han mostrado potencial de acción antibacteriana (Khoa et al.,

2016). Esto ha despertado el interés en implementar el género Serratia como agentes de

biocontrol para diferentes enfermedades en plantas (Cheol, 2013). Sin embargo, las

condiciones de producción de compuestos bioactivos deben ser esclarecidas para lograr

rendimientos de producción adecuados.

Los resultados obtenidos en este trabajo evidencian que los microorganismos

antagonistas aislados de la rizósfera de plantas de aguacate tienen un alto potencial para

ser explotados como controladores biológicos. Sin embargo, es necesario realizar una

futura identificación de los aislamientos Serratia sp. (AED38) y Serratia sp. (AED56) a

nivel de especie y la caracterización de sus metabolitos, con el propósito de confirmar si

la producción de estos compuestos activos, con capacidad antioomycete frente a P.

cinnamomi, está relacionada con la especie o dependen más de las condiciones

medioambientales a las que se encontraban expuestos.

3. Capítulo 3. Evaluación de la efectividad de los extractos extracelulares en la

protección de plántulas de aguacate frente a la pudrición de raíz generada por P.

cinnamomi

3.1 Antecedentes

En Colombia el cultivo de aguacate ha venido creciendo de forma exponencial durante la

última década, permitiendo al país ubicarse entre los principales productores a nivel

mundial (Yabrudy, 2012). Sin embargo, este crecimiento y desarrollo progresivo del

cultivo se ve amenazado por diferentes enfermedades que limitan su producción. Entre

estas, la pudrición de la raíz generada por el oomycete Phytophthora cinnamomi Rands

se encuentra entra las más importantes. (Damm et al., 2010; Fierro Corrales, 2011; Horta

et al., 2008; Rookes et al., 2008). Su incidencia puede ser devastadora, infectando hasta

el 90% de la plantas en los cultivos de aguacate (Bernal et al., 2008; Ciro et al., 2006).

A nivel mundial, el control de P. cinnamomi se ha basado en la aplicación de

agroquímicos como sales de fosfitos, fosetil aluminio y metalaxil lo que ha favorecido la

selección de patógenos resistentes y la degradación del ambiente (Akinsanmi & Drenth,

2013; Scott, Barber, & Hardy, 2015). Sin embargo, el uso de compuestos provenientes de

fuentes naturales representa una alternativa para disminuir progresivamente su uso. En

este sentido, los extractos microbianos provenientes de microorganismos antagonistas

demuestran un gran potencial de actividades biológicas. Muchos de los microorganismos

antagonistas se encuentran asociados como endófitos a plantas sanas, lo que otorga


ciertas características de interés que le dan la posibilidad a la planta hospedera de

defenderse de posibles ataques por patógenos o estreses abióticos (María Teresa et al.,

2014; Morales, 2009).

La investigación sobre las propiedades de control biológico de bacterias antagonistas se

ha centrado principalmente en el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno y PGPR.

No obstante, poco se sabe sobre la actividad de bacterias antagonistas aisladas de

diferentes partes de la planta y su papel ecológico en las interacciones que forman. Este

desconocimiento representa una oportunidad para la búsqueda de aislamientos con

potencial en el control biológico de enfermedades (Tokpah et al., 2016). Es por eso que

este estudio tuvo como propósito evaluar la efectividad de los extractos extracelulares

obtenidos a partir de bacterias antagonistas en la protección frente a la pudrición de raíz

generada por P. cinnamomi en plántulas de aguacate.


3.2.1 Microorganismos y medios de cultivo

Para los experimentos in vitro e in vivo se usó el aislamiento de P. cinnamomi codificado

como P35 debido a los resultados obtenidos en el capítulo 1. Los aislamientos

bacterianos empleados fueron Serratia sp. (AED38) y Serratia sp. (AED56) debido a la

capacidad inhibitoria obtenida frente a P. cinnamomi (62,5 mg/L en ambos casos) y otros

patógenos de aguacate en los ensayos in vitro (Rango de inhibición 3). El aislamiento

P35 fue mantenido en agar PDA a 21°C y los aislamientos Serratia sp. (AED38) y

Serratia sp. (AED56) en agar blando a 4°C. Los medios de cultivo utilizados para el

crecimiento de microorganismos fueron agar Tripticasa de Soya (TSA), Agar Papa-

Dextrosa (PDA), Caldo TSB, Caldo Sabouraud y Caldo VK. Todos marca Merck®.

3.2.2 Obtención y extracción de los extractos microbianos de AED38 y AED56.

Para cada uno de los aislamientos se preparó un inóculo de 100 mL en caldo TSB y se

incubó durante 24 h a 26°C y 200 rpm. Posteriormente, se tomaron 200 µL y se

agregaron a cajas petri que contenían 20 mL de agar PDA y fueron esparcidos por toda

Capítulo 3 29

la superficie con un asa de digrasky estéril. Las cajas de petri se rotularon debidamente y

se incubaron a 26°C durante 24 h, ya que había mayor rendimiento en producción del

extracto por mililitro que a las 12 h. Posteriormente, el agar fue cortado en fragmentos

más pequeños y se realizaron dos extracciones con acetato de etilo en una proporción

2:1 según la técnica de Garbeva con algunas modificaciones (Garbeva et al., 2011).

Finalmente, se recuperó la fase orgánica y el solvente fue eliminado por rotavaporación.

Los extractos obtenidos fueron almacenados a -70°C hasta su evaluación.


La evaluación de la actividad antimicrobiana frente a P. cinnamomi de los extractos

obtenidos se realizó por medidas de densidad óptica a 595 nm, empleando microplacas

estériles de 96 pozos (Granada et al., 2014; S. Ramírez et al., 2015) y un lector de

microplacas BioRad modelo 680XR. Para esto se preparó una suspensión de

fragmentos de micelio de P. cinnamomi en tubos plásticos de 50 mL con 20 mL de medio

Sabouraud y perlas de vidrio. La suspensión se ajustó a una concentración de 1x104

fragmentos/mL por conteo en cámara de Neubauer. En cada pozo de la microplaca se

adicionaron 140 µL de medio de cultivo Sabouraud, 10 µL del extracto y 50 µL de inóculo

para un volumen total de 200 µL. Se realizaron diluciones sucesivas de 1 en 2 hasta

evaluar 12 concentraciones del extracto.

Los extractos se evaluaron por cuadriplicado en cada uno de los ensayos, incluyendo su

réplica y sus respectivos controles. Las microplacas fueron incubadas durante 7 días a

21°C y su lectura se realizó al inicio y final del experimento con el propósito de obtener

un delta de la densidad óptica de cada pozo.

3.2.4 Pruebas de toxicidad de los extractos microbianos producidos en PDA sobre un modelo de Rábano (Raphanus sativus)

Se empleó la metodología de Ticona (1998) con algunas modificaciones. Se tomaron

semillas de rábano (Raphanus sativus), se lavaron con agua de grifo y se desinfectaron

con hipoclorito al 1% y alcohol al 70% por 1 min. Luego se lavaron tres veces con agua

estéril. Seguidamente se prepararon las diferentes concentraciones del extracto


microbiano a probar: 250, 125, 62.5, 31.25, 15.62, y 7.81 mg/L. Posteriormente se

tomaron cajas petri que contenían papel filtro estéril y a cada una de ellas se le

adicionaron 20 semillas junto con 2 mL de agua estéril y 10 % de metanol para el caso

del control y 2 mL para los tratamientos con diferentes concentraciones del extracto

microbiano. Cada tratamiento estaba compuesto por cuatro repeticiones cada una con 20

semillas. Todas las cajas fueron selladas para evitar la pérdida de humedad. Por último

se incubaron a 26°C bajo condiciones de oscuridad. Pasados 2 días de incubación del

montaje se tomó nota de la germinación de semillas por tratamiento y pasados 5 días se

midió el peso fresco de cada una de las repeticiones en una balanza analítica. Con los

datos obtenidos se realizó un análisis de varianza y una prueba de comparación de

medias de Tukey para determinar la toxicidad del extracto microbiano (Ticona, Nieta,

Irahola, & Gimenez, 1998).

3.2.5 Efectividad de los extractos extracelulares in vivo

El aislamiento P. cinnamomi P35 fue seleccionado para realizar pruebas in vivo (capitulo

1). Como antagonista se utilizó el aislamiento microbiano Serratia sp. (AED38), el cual

exhibió una CMI (62,5 mg/L) frente a P. cinnamomi en ensayos in vitro (numeral 2.2.6).

Las plantas de aguacate se obtuvieron a partir de semillas de un solo árbol

tradicionalmente usado como portainjertos. Las semillas se hicieron crecer en bolsas

plásticas conteniendo 2 kg de sustrato no estéril (suelo y cascarilla de arroz en

proporción 5:1, enmienda 25 g, fertilizante triple15 25g) y se mantuvieron en invernadero

hasta su uso (5 meses). Posteriormente, se les retiro el suelo y fueron lavadas con agua

de grifo con el objetivo de eliminar los residuos de suelo adheridos a las raíces. Las

plantas se introdujeron en frascos de vidrio de 400 mL.

La efectividad de los extractos fue evaluada a través de un arreglo factorial

completamente aleatorizado. Se evaluaron tres tratamientos (extracto de AED38 a tres

concentraciones diferentes), un control absoluto, un control de infección, un control

positivo que consistió en un producto comercial a base de Fosetil aluminio. Tanto los

controles como los tratamientos consistieron de tres unidades experimentales con cinco

plántulas cada una para un total de 90 plantas (6x3x5=90).

Capítulo 3 31

Cada tratamiento consistió de una solución conformada por 350 mL de agua de grifo

reposada, 10 mL de suspensión del patógeno (4,5 mg peso seco/mL) y 500 µL del

extracto microbiano para alcanzar concentraciones de 60 mg/L (1xCMI); 120 mg/L

(2xCMI) y 180 mg/L (3xCMI). En el control absoluto se adicionaron 360 mL de agua de

grifo reposada. El control de infección consistió en 350 mL de agua y 10 mL de una

suspensión micelial de P. cinnamomi P35 (4,5 mg peso seco/mL) crecido en medio VK y

fragmentado con ayuda de un ultraturrax. Para el control positivo se adicionaron 350 mL

de agua de grifo reposada, 10 mL de la suspensión del P. cinnamomi P35 y 500 µL del

fungicida comercial para alcanzar una concentración de 0,5 mg/L (Zilberstein & Pinkas,

1987).

Finalmente, las plantas fueron mantenidas bajo observación durante diez (10) días hasta

la aparición de los primeros síntomas. El daño se evaluó de acuerdo a una escala

reportada por Horsfall y Barratt con modificaciones (Horsfall, J. G., and Barratt, R. W.

1945): donde cero (0) indica que no se evidenció ningún síntoma; uno (1), decaimiento

de las hojas; dos (2), enrollamiento de las hojas en el tercio superior; tres (3),

enrollamiento de las hojas en el tercio medio, cuarto (4), enrollamiento de las hojas en el

tercio inferior, y quinto (5), marchitez de la planta. Posteriormente se midió el área bajo la

curva del progreso de la enfermedad (ver Ecuación 3.1)., para determinar el grado de

afectación causada por P. cinnamomi (Fernández-Aguilar, Oyervides-García, &

Espinoza-Velázquez, 2012; Shaner & Finney, 1977). Por último, se realizó una ANOVA y

una prueba de comparación de medias de Tukey.

𝐴𝐵𝐶𝑃𝐸 = ∑𝑌𝑖+𝑌𝑖+1

2

𝑛𝑖=1 𝑥 (𝑡1+𝑖 − 𝑡𝑖) (3.1)

Donde: Yi es la proporción de la enfermedad en la i-ésima observación; (t(i+1)- ti) es el

tiempo entre dos lecturas; i es el número de observaciones, y n es el número de

evaluaciones.

Finalmente, se realizó un proceso de reaislamiento del patógeno en cada una de las

plantas tratadas (Koch, 1876) con el propósito de determinar si el marchitamiento estaba

asociado a la infección generada por P. cinnamomi. Las raíces fueron sumergidas en

solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 min, lavadas con agua estéril y


posteriormente sumergidas en etanol al 70% durante 1 min. Por último se realizaron tres

lavados adicionales con agua estéril. Cada raíz se cortó en segmentos de 3 mm y sus

fragmentos fueron sembrados en PDA PARBH (Preparación en el anexo 1), para

favorecer el desarrollo de P. cinnamomi.



La CMI frente a P. cinnamomi fue de 62,5 mg/L tanto para el aislamiento AED56 como

para AED38 (Figura 3-1). Sin embargo, AED38 mostró mayor velocidad de crecimiento y

productividad de extracto por volumen de medio, por lo que fue seleccionado para la

realización de pruebas posteriores.

Figura 3-1: Concentración mínima inhibitoria de Serratia sp. AED38 y Serratia sp.

AED56 frente a P. cinnamomi.

Capítulo 3 33

0

20

40

60

80

100

Control 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81

Ge

rmin

ac

ión

(%

)

3.3.2 Pruebas de toxicidad de los extractos microbianos

Estas evaluaciones se realizaron con el propósito de encontrar una concentración

adecuada del extracto microbiano para los ensayos sobre plántulas de aguacate. Para

esto se empleó un modelo de semillas de rábano (Raphanus sativus). El porcentaje de

germinación y el peso fresco en las semillas de rábano no mostraron diferencias

estadísticamente significativas (Figura 3-2). Este resultado sugiere que el extracto

producido por Serratia sp. (AED38) no es fitotóxico para este modelo en las

concentraciones evaluadas. Sin embargo, se observó un ligero necrosamiento en las

raicillas a concentraciones de 250, 125 y 62.5 mg/L (Figura 3-3).

Figura 3-2. Fitotoxicidad de los extractos de Serratia sp. AED38 sobre rábano (Raphanus

sativus). A. Porcentaje de germinación. B. Peso fresco de las semillas germinadas a los

5 días del ensayo. El ensayo no mostro diferencias estadísticamente significativas.

A.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Control 250 125 62.5 31.25 15.62 7.81

Pe

so

fre

sc

o (

g)

Concentraciones del extracto (mg/L)

B.


Figura 3-3. Imágenes de la fitotoxicidad del extracto Serratia sp. (AED38) en semillas de

rábano (Raphanus sativus). A. Control. B. 62,5 mg/L. C. 125 mg/L. D. 250 mg/L.

3.3.3 Efectividad de los extractos extracelulares in vivo

En la Figura 3-4 se muestran los resultados obtenidos en la determinación del ABCPE a

los diez (10) días de seguimiento. El control absoluto y las plantas de aguacate tratadas

con el extracto de AED38 (60 mg/L) correspondieron al menor valor de ABCPE

alcanzado en el experimento, mostrando que no hay diferencia estadísticamente

significativa entre ellas. Estos resultados concuerdan con lo observado in vitro, donde el

extracto mostró una CMI alrededor de 60 mg/L. Adicionalmente, a esta concentración no

hubo necrosamiento de raíz (Figura 3-3).

El ABCPE evidenció que el extracto producido por AED38 es capaz de proteger las

plantas de aguacate frente a la infección de P. cinnamomi (Figura 3-4). Cinco días

después de inoculadas las plantas comenzaron a exhibir síntomas de la enfermedad

(Figura 3-5). Los síntomas foliares fueron evidentes en todos los tratamientos evaluados

excepto el control absoluto, el control positivo y las plantas tratadas con el extracto a una

concentración de 60 mg/L. El decaimiento de las hojas del tercio superior evidenciado en

plantas tratadas en concentraciones de 180 y 120 mg/L pudo estar relacionado con

toxicidad del extracto (Figura 3-4). Después de realizar el reaislamiento del patógeno,

Capítulo 3 35

para cumplir con los postulados de Koch, P. cinnamomi fue aislado solo a partir del

control de infección confirmando una posible toxicidad del extracto a concentraciones

superiores a 60 mg/L. Estos resultados podrían sugerir que el necrosamiento observado

en las raicillas de rábano en concentraciones de 180 y 250 mg/L pudo estar asociado a

una toxicidad leve generada por extracto.

Figura 3-4. Área bajo la curva del progreso de la infección de P. cinnamomi en plántulas

de aguacate. Escala utilizada: 1. decaimiento de las hojas; 2. enrollamiento de las hojas

en el tercio superior; 3. enrollamiento de las hojas en el tercio medio, 4. enrollamiento de

las hojas en el tercio inferior; 5. marchitez de la planta. Letras diferentes indican

diferencias estadísticamente significativas con un nivel de significancia del 95%.

De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, la aplicación de extractos

extracelulares utilizados para prevenir o disminuir efectos de enfermedades en plantas de

interés comercial es eficaz, ya que se logra ver una disminución de los efectos físicos

causados por el patógeno. Hasta este punto de la investigación, estos resultados pueden

considerarse positivos porque a futuro este tipo de extractos podría representar una

alternativa más amigable con el ambiente que el uso de agroquímicos comerciales para

el control de enfermedades. Los agroquímicos han sido utilizados por décadas en el

control de patógenos como P. cinnamomi y, aunque han sido efectivos en el control de

a

b a,b

a,b

b

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

Controlinfección

Controlfungicidacomercial

ExtractoAED38 - 180

mg/L

ExtractoAED38 - 120

mg/L

ExtractoAED38 - 60

mg/L

AB

CP

E


enfermedades, han favorecido el deterioro de suelos, la microbiota natural y el desarrollo

de resistencia microbiana (María Teresa et al., 2014; Morales, 2009).

Figura 3-5. Plantas de aguacate al finalizar el experimento de actividad in vivo. A.

Control Absoluto: plantas sin infectar con P35. B. Control de infección: plantas inoculadas

con P35. C. Control positivo: plantas inoculadas con P35 + fungicida comercial

(concentración final 0,5 mg/L). D. Tratamiento extracto AED38 (180 mg/L). E.

Tratamiento extracto AED38 (120 mg/L). F. Tratamiento extracto AED38 (60 mg/L).

Es por lo anterior que el uso de sustancias activas en la última década ha sido de interés

para algunos investigadores. Sin embargo, ha sido difícil encontrar metabolitos

microbianos que tengan un amplio espectro de actividad frente a los principales

patógenos de interés comercial en el aguacate. Es por esto, que se hace necesario

implementar una búsqueda de microorganismos antagonistas que produzcan metabolitos

secundarios con actividad antimicrobiana (Sharma et al., 2009).

Los resultados obtenidos en este estudio demuestran la efectividad de los metabolitos

secundarios producidos por bacterias antagonistas en medio sólido, al igual que ha sido

reportado por otros investigadores. Garbeva y colaboradores obtuvieron extractos a

través de enfrentamientos duales con diferentes bacterias y demostraron la capacidad

inhibitoria de Pseudomonas fluorescens frente a Rhizoctonia solani, Mucor hiemalis y

Trichoderma harzianum (Garbeva et al., 2011); Sierra-García y colaboradores

demostraron, a través de ensayos de difusión en agar, el potencial de bacterias del

Capítulo 3 37

género Bacillus para producir compuestos con actividad antibacterial, antifúngica e

insecticida (Sierra et al., 2012); Khoa y colaboradores utilizaron Serratia nematodiphila

para la obtención de extractos metabólicos capaces de inhibir Xanthomonas oryzae pv.

Oryzae, adicionalmente demostraron que estos extractos no eran tóxicos para las plantas

de arroz en las concentraciones utilizadas (Khoa et al., 2016).

No obstante, aunque se ha descubierto una parte importante de los metabolitos

secundarios bacterianos y su actividad biológica frente a otros microorganismos, todavía

hay mucho por develar en términos de por qué, cuándo y dónde las bacterias de la

rizósfera producen estos metabolitos secundarios (Tyc et al., 2016). De igual manera, es

difícil imitar las condiciones ambientales tan diversas y cambiantes que probablemente

ayudarían a la producción de estos metabolitos activos a nivel de laboratorio (Garbeva &

De Boer, 2009). Es por esto que la ejecución de estudios para potencializar el uso de

metabolitos bacterianos capaces de inhibir el desarrollo de microorganismos patogénicos

es cada vez más pertinente. Igualmente, deben buscarse alternativas que permitan la

producción de estos compuestos a gran escala para incrementar la eficiencia y

rentabilidad del proceso con el objetivo de hacerlos cada vez más atractivos en términos

comerciales (Berdy, 2005; Subramani & Aalbersberg, 2012).

4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones

Los resultados de este trabajo permiten concluir que la metodología de raíces

desprendidas es eficaz para evaluar la capacidad infectiva de aislamientos de P.

cinnamomi. De los aislamientos evaluados, los codificados como ANSS07 y P35,

correspondientes al oriente y suroeste Antiqueño, respectivamente, presentaron los

mayores porcentajes de infección. La técnica de raíces desprendida podría ser efectiva

para evaluar otro tipo de características, como resistencia o tolerancia en el hospedero,

ya sea frente a P. cinnamomi o frente a otros patógenos de interés.

En este estudio se observó que los microorganismos antagonistas aislados de la

rizósfera de plantas de aguacate tienen un alto potencial para ser explotados como

controladores biológicos. Como los aislamientos Serratia sp. (AED38) y Serratia sp.

(AED56) que mostraron tener la capacidad para inhibir el crecimiento de P. cinnamomi

P35, según los resultados obtenidos a nivel in vitro. No obstante, es necesario realizar

una futura identificación de estos aislamientos a nivel de especie y la caracterización de

sus metabolitos con el propósito de confirmar si la producción de estos compuestos

activos con capacidad antioomycete frente a P. cinnamomi está relacionada con la

especie o dependen más de las condiciones medioambientales a las que se encontraban

expuestos. De igual manera, cabe mencionar que el medio de cultivo que se emplea para

la producción de estos compuestos con actividad también ejerce una presión sobre ellos.

El aislamiento antagonista Serratia sp. (AED38) fue capaz de producir metabolitos lo

suficientemente activos para inhibir el crecimiento de P. cinnamomi P35 en plántulas de

aguacate. Estos resultados fueron comparables a los de un fungicida sintético comercial,

lo que convierte a este extracto en candidato potencial para el desarrollo de nuevos

biopesticidas como agente de control biológico.

40 Evaluación de extractos microbianos frente a pudriciones radiculares en


Título de la tesis o trabajo de investigación

4.2 Recomendaciones

La mayoría de especies que se reportan del genero Serratia sp. son conocidas como

patógenos humanos. Para futuros estudios se recomienda evaluar la toxicidad de los

extractos producidos por Serratia sp. AED38 en líneas celulares con el propósito de

investigar más a fondo sus efectos en la salud humana y animal.

Como una alternativa sostenible para el uso de estos extractos como futuros

controladores biológicos, sería apropiado realizar estudios que permitan incrementar la

producción de los compuestos activos. Este tipo de estudios permitirían la evaluación de

rendimientos y rentabilidades de implementar procesos de producción en mayor escala.

Adicionalmente, deben implementarse procesos de semipurificación y purificación que

permitan identificar los compuestos activos.

Anexo A. Preparación medio PDA PARBH o PDA con antibióticos 41

A. Anexo A: Preparación medio PDA PARBH o PDA con antibióticos

1. Pesar 39 g de PDA marca merck y disolver en un erlenmeyer con 1 litro de agua

destilada.

2. Autoclavar y dejar a temperar por unos minutos sin dejar solidificarse.

3. Agregar los antibióticos y fungicidas preparados de la siguiente forma.

Reactivo Concentración Cantidad Solvente Cantidad de

solvente

PCNB 4 mg/L 4 mg Acetona 20 mL

Ampicilina 5 mg/L 5 mg Agua 20 mL

Rifampicina 0.2 mg/L 0.2 mg Agua 20 mL

Benomil 0.4 mg/L 0.4 mg Agua 20 mL

Hymexazol 25 mg/L 70 µL Agua -

4. Mezclar bien y servir en cajas petri.

5. Dejar gelificar y guardar en nevera a 4°C hasta su posterior uso en el laboratorio.

B. Anexo B: Preparación medio VK

Reactivo Concentración

para 1000 mL

Concentración

para 200 mL

Glicerol 5 g 1 g

Extracto de levadura 10 g 2 g

Corn Starch 10 g 2 g

Corn Steep Solids (Maisquellwasser) 10 g 2 g

CaCO3 10 g 2 g

dH2O 1000 mL 200 mL

Antes de autoclavar el medio de cultivo ajustar pH a 6.5

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