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ESTUDIOS DE I+D+I

Número 7

Desarrollo de una nueva terapia celular para la enfermedad de Alzheimer

Autor: Marín Parra, Óscar Filiación: Contacto: Convocatoria: 2003 Para citar este documento: MARÍN PARRA, Óscar (2003). “Desarrollo de una nueva terapia celular para la enfermedad de Alzheimer”. Madrid, IMSERSO, Estudios I+D+I, nº 7. [Fecha de publicación: 18/05/2005]. <http://www.imsersomayores.csic.es/documentos/documentos/imserso-estudiosidi-07.pdf >

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Resumen La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por una profunda degeneración del sistema colinérgico, que está asociada con un deterioro de la capacidad cognitiva de los pacientes. Por esta razón la recuperación de la inervación colinérgica de la corteza cerebral constituye sin duda uno de los objetivos terapéuticos en la lucha contra la enfermedad. Este trabajo plantea la hipótesis de que el trasplante de interneuronas embrionarias colinérgicas en una corteza cerebral con un déficit de inervación colinérgica puede ser capaz de generar una nueva red local de inervación colinérgica que permitirá la recuperación funcional de la corteza cerebral. Por ello en esta investigación se generaron neuronas colinérgicas embrionarias in vitro a partir de células progenitoras de la eminencia ganglionar medial del ratón, y se optimizaron los métodos de trasplante de las neuronas colinérgicas embrionarias en la corteza cerebral adulta del ratón. Los experimentos descritos en esta memoria sugieren que el telencéfalo basal es una fuente posible de neuronas colinérgicas que pueden ser transplantadas en la corteza cerebral de cerebros control. Resta por comprobar el periodo de supervivencia de estas células así como el porcentaje de las células transplantadas que se diferencian en neuronas colinérgicas en la corteza.

IMSERSO, Ayudas a la Investigación 2003 MEMORIA CIENTÍFICA, Oscar Marín (CSIC-UMH)

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TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN: Desarrollo de una nueva terapia celular parala enfermedad de Alzheimer

ACRÓNIMO: Terapia celular

COORDINADOR DEL GRUPO INVESTIGADOR: Dr. Oscar Marín Parra

PERIODO DE JUSTIFICACIÓN DE LA AYUDA: 2003

Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo progresivo en elque las regiones cerebrales asociadas con las funciones mentales superiores, principalmentela corteza cerebral y el hipocampo, son las más afectadas. Las características patológicas dela enfermedad incluyen la formación de depósitos extracelulares de proteína beta-amiloideen placas seniles, el desarrollo de ovillos neurofibrilares intracelulares, y la pérdida desinapsis y neuronas piramidales. Estas alteraciones morfológicas parecen ser responsables delos síntomas típicos de la enfermedad, que incluyen la pérdida progresiva de la capacidadcognitiva y, en algunos casos, incremento de la agresividad, depresión, etc. La EA es una delas principales causas de deterioro cognitivo asociado al envejecimiento, siendo responsablede más del 50% de los casos de demencia existentes en personas mayores de 65 años deedad. En la actualidad la EA afecta a más de cuatrocientas mil personas en España, y con elenvejecimiento progresivo de nuestra sociedad el impacto económico y social que estáenfermedad tendrá en las próximas décadas será todavía mayor.

Además de las características histopatológicas antes mencionadas, se ha demostrado queexiste una asociación entre el deterioro de la capacidad cognitiva en pacientes con EA y ladegeneración del sistema de neurotransmisión colinérgico (las neuronas que sintetizanacetilcolina como neurotransmisor se denominan colinérgicas) en la corteza cerebral y elhipocampo (Bierer et al. 1995). Aunque la degeneración de la inervación colinérgica de lacorteza cerebral no parece ser la causa inicial de la EA, si parece claro que este fenómenotiene un gran impacto en el desarrollo de los principales síntomas de la enfermedad (Everitt& Robbins 1997, Francis et al. 1999, Perry et al. 1999). En la EA, la pérdida de fibrascolinérgicas en la corteza cerebral y el hipocampo se debe a la degeneración de las neuronascolinérgicas del complejo colinérgico basal (Whitehouse et al. 1982).

Una prueba reciente de la relación existente entre la inervación colinérgica de la cortezacerebral y del hipocampo con la memoria y el aprendizaje procede de nuestro análisis deratones mutantes para Lhx8, un factor de transcripción de la familia de los LIM-homeobox.En esta línea de ratones mutantes no se desarrollan la mayor parte de las neuronascolinérgicas del complejo colinérgico basal, y como consecuencia de esta alteración lainervación colinérgica de la corteza está muy reducida (Zhao et al. 2003). Los ratonesmutantes para Lhx8 sobreviven y son capaces de reproducirse, aunque presentan un clarodéficit de memoria y aprendizaje espacial cuando son comparados con ratones controles (Y.Zhao & H. Westphal, comunicación personal).


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Hipótesis

La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por una profunda degeneración del sistemacolinérgico, que está asociada con una deterioro de la capacidad cognitiva de los pacientes.Por esta razón la recuperación de la inervación colinérgica de la corteza cerebral constituyesin duda uno de los objetivos terapéuticos en la lucha contra la enfermedad. Nuestrahipótesis de trabajo es que el trasplante de interneuronas embrionarias colinérgicas enuna corteza cerebral con un déficit de inervación colinérgica puede ser capaz degenerar una nueva red local de inervación colinérgica que permitirá la recuperaciónfuncional de la corteza cerebral.

Objetivos

En el marco temporal de la Acción estratégica sobre Envejecimiento (2003), y teniendo encuenta la hipótesis de trabajo de nuestro grupo, nuestra investigación ha tratado de cubrir dosobjetivos principales:

1. Generar neuronas colinérgicas embrionarias in vitro a partir de células progenitorasde la eminencia ganglionar medial del ratón.

2. Optimizar los métodos de transplante de las neuronas colinérgicas embrionarias en lacorteza cerebral adulta del ratón.

Resultados

1. Generación de neuronas colinérgicasembrionarias in vitro.

El primer objetivo de nuestra investigaciónha sido el de identificar el origen embrionariode las neuronas colinérgicas que inervan en elcerebro adulto la corteza cerebral. Datosprevios de nuestro grupo han demostrado queestas células se originan en el telencéfalo basal,y que su desarrollo depende de la función de almenos dos factores de transcripción, Nkx2-1 yLhx8 (Sussel et al., 1999; Zhao et al., 2003).Así, los ratones mutantes para Nkx2-1 carecenpor completo de neuronas colinérgicas en eltelencéfalo basal, mientras que los mutantespara Lhx8 presentan una gran reducción en elnúmero de neuronas colinérgicas (Figura 1).


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A pesar de los genes Nkx2-1 y Lhx8 son fundamentales para el desarrollo de lasneuronas colinérgicas del telencéfalo basal, estos genes se expresan también en neuronasque van a adquirir un fenotipo diferente, como por ejemplo las neuronas GABAérgicas. Poreste motivo, la región de expresión de estos dos genes no sirve como un indicador de losprogenitores que dan lugar a las neuronas colinérgicas, sino que simplemente delimita laregión del telencéfalo en el que parece probable que se originen estas células.

En una primera serie de experimentos hemos examinado laexpresión de genes relacionados con la generación de neuronascolinérgicas en otras zonas del cerebro, con el objetivo dedelimitar la región progenitora origen de las neuronascolinérgicas en el telencéfalo. En la médula espinal , porejemplo, las motoneuronas colinérgicas se originaninmediatamente adyacentes a la placa del suelo, que expresa deforma específica Shh. En el telencéfalo, la zona más ventraldel telencéfalo basal también expresa Shh (Figura 2), por loque parece probable pensar que las neuronas colinérgicas sepueden generar en una zona inmediatamente dorsal a estaregión.

En una segunda serie de experimentos hemos realizadocultivos de células disociadas procedentes de la región deltelencéfalo basal inmediatamente dorsal a la zona que expresaShh. Para realizar estos cultivos diseccionamos el cerebro deembriones de ratón a diferentes edades embrionarias (entre E11.5-E13.5, coincidiendo conel nacimiento de las neuronas colinérgicas en el telencéfalo) en tampón Krebs a 4°C ypreparamos rodajas de 250 µm siguiendo un protocolo descrito en detalle en trabajosprevios de nuestro grupo (Marín et al., 2001). A partir de estas rodajas aislamos la zonainmediatamente dorsal al dominio de expresión de Shh (Figura 3) y partimos este tejido enpequeños trozos (0.5 mm3 aprox). A continuación tripsinizamos el tejido (tripsina 0.05% a37ºC 15 min) y resuspendimos en medio Neurobasal suplementado con B27, disgregando eltejido mecánicamente con una pipeta de vidrio. Después de este paso, filtramos las célulaspor un tamiz para eliminar restos de tejido sin disgregar, centrifugamos, y resuspendimos enmedio DMEN suplementado con un 10% de FBS.Finalmente, plaqueamos aproximadamente 200.000células por pocillo (1.000.000/ml), en portaspreviamente tratados con una mezcla de poli-lisinay laminina.

Los cultivos realizados de esta manera fueronmantenidos en medio Neurobasal suplementado conB27 y con 10 ng/ml FGF2 a partir de 2 DIV. Esteprocedimiento permite el pico de gliogénesis que seproduce de forma natural en el neonato pero reducerápidamente el suero para evitar sobrecrecimiento.Los cultivos fueron finalmente fijados con 4% PFAa distintos tiempos (7, 10, 14, 21 DIV) y el


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porcentaje de diferenciación de células colinérgicos establecido medianteinmunohistoquímica con anticuerpos contra ChAT. Los resultados de estos experimentosdemuestran que la zona inmediatamente dorsal al área preóptica del telencéfalo basal es unazona productora de neuronas colinérgicas.

2. Optimización de los métodos de transplante.

Una vez demostrado que la región inmediatamente dorsal al área preóptica contieneprogenitores de neuronas colinérgicas, realizamos una serie de experimentos destinados aoptimizar los métodos de transplante de estas células en la corteza adulta de ratones control.En primer lugar realizamos experimentos in vitro para mostrar que las células obtenidas deesta región mantienen sus propiedades migratorias cuando son transplantadas a una matriztridimensional artificial de matrigel (Figura 4),

A continuación realizamos transplantes de células deesta región en la corteza de ratones control de 8 semanas deedad. Para estos experimentos realizamos rodajas deltelencéfalo embrionario y aislamos la regióninmediatamente dorsal al área preóptica. Estas célulasfueron disociadas de la forma descrita con anterioridad yresuspendidas en Krebs. A continuación las células fueroninyectadas a presión con la ayuda de un aparato deestereotaxis en la corteza medial de ratones de 8 semanasde edad. Estos experimentos piloto se han repetido en 4animales. Todos los procedimientos quirúrgicos serealizaron de acuerdo con la normativa de experimentaciónanimal existente en la Universidad Miguel Hernández.Después de una periodo de 2 semanas, los animales fueronanestesiados y perfundidos con 4% PFA. Los cerebros fueron aislados y procesados parainmunohistoquímica para ChAT. En los 4 cerebros procesados se encontraron célulasChAT+, cuyo origen se encuentra en las células transplantadas procedentes del telencéfalobasal.

Direcciones futuras

Los experimentos descritos en esta memoria sugieren que el telencéfalo basal es unafuente posible de neuronas colinérgicas que pueden ser transplantadas en la corteza cerebralde cerebros control. Resta por comprobar el periodo de supervivencia de estas células asícomo el porcentaje de las células transplantadas que se diferencian en neuronas colinérgicasen la corteza.

En una siguiente fase, y para probar nuestra hipótesis inicial, produciremos neuronascolinérgicas de ratón in vitro y las transplantaremos en la corteza cerebral de un modeloanimal de la enfermedad. Esta línea de ratones mutantes para el factor de transcripción Lhx8se caracteriza por la ausencia de inervación colinérgica en la corteza cerebral y por la pérdidade memoria y capacidad de aprendizaje, por lo que nos permitirá evaluar la eficacia denuestra terapia celular tanto desde un punto de vista morfológico (inervación colinérgicacortical) como funcional (memoria y aprendizaje).


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Referencias

Bierer LM, Haroutunian V, Gabriel S, Knott PJ, Carlin LS, et al. 1995. Neurochemical correlatesof dementia severity in Alzheimer's disease: relative importance of the cholinergic deficits. JNeurochem 64: 749-60.

Everitt BJ, Robbins TW. 1997. Central cholinergic systems and cognition. Annu Rev Psychol 48:649-84.

Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK. 1999. The cholinergic hypothesis of Alzheimer'sdisease: a review of progress. J Neurol Neurosurg Psychiatry 66: 137-47.

Perry E, Walker M, Grace J, Perry R. 1999. Acetylcholine in mind: a neurotransmitter correlate ofconsciousness? Trends Neurosci 22: 273-80.

Marín O, Yaron A, Bagri A, Tessier-Lavigne M, Rubenstein JL. 2001. Sorting of striatal andcortical interneurons regulated by semaphorin/neuropilin interactions. Science 293: 872-5.

Sussel L, Marín O, Kimura S, Rubenstein JL. 1999. Loss of Nkx2.1 homeobox gene functionresults in a ventral to dorsal molecular respecification within the basal telencephalon: evidencefor a transformation of the pallidum into the striatum. Development 126: 3359-70.

Whitehouse PJ, Price DL, Struble RG, Clark AW, Coyle JT, Delon MR. 1982. Alzheimer's diseaseand senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain. Science 215: 1237-9.

Zhao Y, Marín O, Hermesz E, Powell A, Palkovits M, et al. 2003. The LIM-homeobox gene Lhx8is required for the development of cholinergic neurons in the mouse forebrain. Proc Natl AcadSci U S A 100: 9006-10.

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