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ESTUDIO PARA LA IMPLEMENTACION DEL ANALISIS DE

CAMPYLOBACTER SPP SEGÚN LA METODOLOGIA USDA/FSIS MLG

CAPITULO 6 1998 EN EL LABORATORIO LABSER DE RANCAGUA

CHILE

Vivian Arturo Canal Fabiola Silva Páez

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Rancagua (Chile)

Septiembre 14 2007




CHILE


TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

Microbióloga industrial Directora: Astrid Maldonado Illesca

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Rancagua (Chile)

Septiembre 14 2007

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la

verdad y la justicia”.




CHILE


APROBADO ________________________ ________________________ Astrid Maldonado, Tec. Alimentos Paulina Rojas, Mic. Industrial Director Asesor ________________________ ________________________ Fernando Fuentes, Ing. Civil Bioquímico Julio Gomez, Químico lab. Jurado Jurado




CHILE


APROBADO ________________________ ________________________ Angela Umaña Muñoz, M.Phil David Gomes Méndez, M. Sc Decano, Académico Director de carrera

- v -

TABLA DE CONTENIDOS

Pág.

LISTA DE TABLAS vii

RESUMEN viii

ABSTRACT ix

1. INTRODUCCION 1

2. MARCO TEORICO 3

2.1 Historia 3

2.2 Características microbiológicas Campylobacter spp 3

2.2.1 Taxonomia 4

2.2.2 Morfología y características fisiológicas 4

2.2.3 Especies importantes 6

2.2.3.1 Especies termofilas 6

2.3 Vías de transmisión y alimentos implicados 7

2.4 Enfermedades en humanos 10

2.4.1 Epidemiología 10

2.4.2 Patogenia 10

2.4.3 Presentación clínica 11

2.4.4 Diagnostico de laboratorio 14

2.5 Enfermedades en animales 14

2.5.1 Campilobacteriosis 14

2.5.1.1 Campilobacteriosis genital bovina 15

2.5.1.1.1 Manifestaciones clínicas 15

2.5.1.1.2 Diagnostico 16

2.5.1.1.3 Control 16

2.6 Medios de cultivo y pruebas bioquímicas 17

2.7 Laboratorio LABSER 18

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 20

3.1Formulación del problema 20

- vi -

3.2 Preguntas de investigación 20

3.3 Justificación de la investigación 20

4. OBJETIVOS 21

4.1 Objetivo general 21

4.2Objetivos específicos 21

5. MATERIALES Y METODOS 22

5.1 Materiales 22

5.1.1 Materiales para el aislamiento, identificación, y cuantificación

de Campylobacter jejuni/coli en productos de carne y aves. 22

5.1.1.1 Equipos 22

5.1.1.2Reactivos 23

5.1.1.3 Medios de cultivo 23

5.1.2 Métodos 24

5.1.2.1 Preparación de medios de cultivo 24

5.1.2.2 Aislamiento y cuantificación 28

5.1.2.3 Identificación de Campylobacter 30

5.1.2.3.1Pruebas bioquímicas 31

5.2 Métodos 33

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34

6.1 Cotizaciones 34

6.1.1 Equipos 34

6.1.2 Reactivos 37

6.1.3 Medios de cultivo 37

6.2 Costo por análisis 38

7. CONCLUCIONES 48

8. RECOMENDACIONES 49

9. REFERENCIAS 50

- vii -

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1.Cotización Equipos 35

Tabla 2.Cotización Reactivos 35

Tabla 3.Cotización Medios de cultivo 36

Tabla 4.NMP Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno

o esponja 39

Tabla 5. NMP Campylobacter spp en muestras de carne de carcasa

o carne de ave 41

Tabla 6. Aislamiento e identificación de Campylobacter spp en

muestras de vacuno o esponja 43

Tabla 7. Aislamiento e identificación de Campylobacter spp en

muestras de carcasa o carne de ave 45

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RESUMEN

En los laboratorios de alimentos es muy importante realizar un detallado análisis

de Campylobacter spp ya que este microorganismo es la principal causa de

infección entérica zoonótica en la mayor parte de países desarrollados, al igual

que en los países en vía de desarrollo. En el presente trabajo se realizó un estudio

económico – financiero en el laboratorio LABSER de Rancagua (Chile), con el

objetivo principal de evaluar la implementación del análisis de Campylobacter

spp según la metodología USDA/FSIS MLG- Capitulo 6, 1998.

A través de este trabajo de campo se logró determinar cuales eran los equipos,

reactivos y medios de cultivo necesarios para este análisis. Se realizaron

diferentes cotizaciones, escogiendo los precios más bajos y por último se

estableció cuál es el costo total del análisis que se ofrecerá a los clientes, basado

en los insumos, hora-hombre, gestión de calidad y costos indirectos. Con este

estudio se comprobó que la metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 es

muy costosa, y no es conveniente su implementación debido a la alta inversión en

los equipos y al reducido número de muestras que llegan al laboratorio.

- ix -

ABSTRACT

In the food laboratories is very important to make the analysis of Campylobacter

spp since this microorganism is the main cause of zoonótica enteric infection in

most of the developed countries like in those in way of development. In the

present work, an economic and financier study was made in laboratory LABSER

of Rancagua - Chile to see if the implementation of the analysis of Campylobacter

spp is possible according to methodology USDA/FSIS MLG Chapter 6 1998 used

The equipment, reagents and crops were identified for this analysis. Different

quotations were made, choosing the low prices to establish the cost of the analysis

that will be offered to the clients, based on inputs, hours per men, indirect

management of quality and costs. With this study, it was verified that the

methodology USDA/FSIS MLG Chapter 6 1998 is too expensive, and is not

advisable his implementation due to the high investment in the equipment and

because the number of samples that arrived at the laboratory are reduced.

- 1 -

1. INTRODUCCION

Campylobacter spp es la principal causa de infección entérica zoonótica en la

mayor parte de los países desarrollados como en los de desarrollo y su incidencia

reportada se ha incrementado marcadamente en los últimos 20 años. El reservorio

natural de Campylobacter spp es el tracto intestinal de animales de sangre

caliente.

El diagnóstico de Campylobacter indica que alrededor del 95% de las infecciones

por Campylobacter son causadas por Campylobacter jejuni o Campylobacter coli;

estas dos son responsables de la mayoría de enfermedades en humanos.

Las enteritis relacionadas a Campylobacter spp han emergido como una de las

formas de enfermedades diarreicas de mayor incremento en países desarrollados.

Con la aplicación técnicas mejoradas para su aislamiento se ha podido comprobar

que la incidencia de Campylobacter en estos países es superior a Salmonella.

Actualmente son considerados como la bacteria que más comúnmente causa

enteritis en el mundo siendo su incidencia mayor en niños y jóvenes, decreciendo

con la edad. El mecanismo de transmisión más frecuente es la ingestión de agua y

alimentos contaminados.

Por la importancia epidemiológica de este patógeno bacteriano, su aislamiento y

caracterización es muy importante en muestras de alimentos, principalmente en

productos carnicos.

El laboratorio LABSER cuenta con diversos análisis de gran importancia en el

área de microbiología, pero hace falta el análisis de Campylobacter spp que es un

microorganismo muy común en alimentos.

Por esta razón se quiere implementar este análisis en el laboratorio. Para llevar

acabo esta implementación es importante hacer un análisis de costos de lo que

esta implica y así determinar si es posible hacerla o no.

El estudio económico que se realizo en el presente trabajo esta basado en hacer

una comparación de precios de insumos que las diferentes casas comerciales de

productos microbiológicos proponen, además determinar cuales son los equipos

que se utilizan en este análisis con los que el laboratorio no cuenta y cual debe ser

- 2 -

su inversión para obtenerlos y por ultimo establecer el costo del análisis para los

clientes; basándose en insumos, horas/hombres, gestión de calidad, costos

indirectos etc.

- 3 -

2. MARCO TEORICO

2.1 Historia

Las primeras observaciones de bacterias semejantes a Campylobacter fueron

realizadas por Escherich en 1886 a partir de materia fecal de niños y de gatos con

diarrea. Aunque no pudo realizar los aislamientos, Escherich denominó Vibrio

felinus a las bacterias observadas sólo microscópicamente.

Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron

realizados en el área de microbiología veterinaria, en 1909 y 1913. Mac Fadyean y

Stockmann y posteriormente Smith en 1918 establecieron la participación de una

bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino y ovino, de morfología

similar a las especies del género Vibrio, por lo que se la denominó Vibrio fetus.

En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con disturbios intestinales un

“vibrión” microaerófilo, al que denominaron Vibrio jejuni. En 1944, Doyle

describió un “vibrión” aislado del intestino de cerdos con diarrea y lo denominó

Vibrio coli.

La primera asociación entre estas bacterias curvas y diarrea en el hombre fue

sugerida por Levy en 1946, el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritis

sobre 357 pacientes en dos establecimientos penales en Illinois, observando en

exámenes directos la presencia de formas bacterianas semejantes a Vibrio en el

20% de las muestras. En 1957, E. King, estudiando las características de estos

“vibrios” aislados de diferentes fuentes, estableció que no todos correspondían a

Vibrio fetus, determinando dos grupos con características serológicas y

bioquímicas diferentes. Mientras algunos eran capaces de crecer a 25 y 37°C,

otros lo hacían a 42°C. A estos últimos se los consideró como “Vibrios

relacionados” (related Vibrios) sugiriendo que eran agentes de diarrea aguda. En

1963, Sébald y Veron proponen la creación del género Campylobacter para incluir

estas bacterias. En la década del 70, Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson,

Blaser y Col, desarrollaron medios selectivos que permitieron aislar estos

microorganismos con relativa facilidad y establecer su participación en diferentes

cuadros infecciosos en el hombre.

- 4 -

En 1972 Dekeyser y Butzler aislaron los microorganismos de las heces de

pacientes con enteritis aguda usando una técnica de filtración que permitía el

pasaje de pequeños bastones curvos a través de una membrana, pero retenía

microorganismos fecales más grandes. Esta técnica se utiliza actualmente para el

aislamiento de otras especies del género, diferentes de C. jejuni o C. coli como

son, por ejemplo, C. upsaliensis, C. hyointestinalis y C. jejuni subsp. doylei.

(Fernández, 2003)

2.2 Características microbiológicas Campylobacter spp

2.2.1 Taxonomía:

Las primeras especies de este género fueron identificadas hace más de 90 años en

animales, pero no fue sino hasta 1970 cuando se reconoció como patógeno

humano. Inicialmente incluidos dentro del género Vibrio, Sin embargo, mas tarde,

debido a que presentan diferencias fundamentales con relación a la constitución

del DNA y por su incapacidad de fermentar los hidratos de carbono, fueron

agrupados en un nuevo género bacteriano denominado Campylobacter (campylo

= curvo) (bacter = bacteria). Actualmente se han incorporado nuevas especies y se

ha creado la familia Campylobacteriaceae, la cual está compuesta por dos

géneros: Campylobacter y Arcobacter; y un género de afiliación incierta

Helicobacter. Las diferencias fundamentales entre los géneros de Campylobacter

y Arcobacter son que Campylobacter no puede crecer a 15°C, es móvil por un

solo flagelo polar en uno o sus dos extremos y en cultivos viejos degeneran a

formas cocoides; Arcobacter tiene un solo flagelo, crece bien a bajas temperaturas

(17°C) pero mal a 37°C y 42°C, a 30°C pueden crecer aeróbicamente. (Ministerio

de Salud, 2001) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query.fcgi? CMD

=&DB=taxonomy)

2.2.2 Morfología y características fisiológicas:

El género Campylobacter pertenece a la familia Campylobacteriaceae. Estas

bacterias son patógenas o comensalistas agrupan bacilos Gram negativos

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pequeños (0.3-0.6 µm de diámetro, 0.5-5 µm de ancho), no formadores de esporas

curvos, espirilados o en forma de S que presenta un flagelo polar único en uno o

ambos extremos que les confiere motilidad. Son microaerofílicos capaces de

crecer en una atmósfera de 5% de oxígeno, 10% de dióxido de carbono y 85% de

nitrógeno. En cultivos de varios días (mas de tres) degeneran en formas esféricas

u ovoides que han perdido su viabilidad. La mayoría de estas bacterias crecen a

una temperatura de 37 °C, a excepción de Campylobacter jejuni que crece a 42,

por lo que es práctica habitual en el laboratorio la incubación a esta temperatura

con el fin de facilitar el aislamiento selectivo. Su velocidad de desarrollo es más

lenta que la de las bacterias de la flora normal entérica, por lo que para su

aislamiento a partir de materias fecales se requieren medios de cultivo selectivos

que inhiban esta flora. Los Campylobacter son organismos de lento crecimiento.

Las especies de Campylobacter (C. coli, C. concisus, C. curvus, C. fetus, C.

gracilis C. helveticus, C. hyointestinalis, C. jejuni, C. lari, C. mucosalis, C. rectus,

C. showae, C. sputorum y C. upsaliensis) han sido asociadas con múltiples

enfermedades en animales y humanos. Las dos bacterias de mayor importancia

clínica como agentes causales de la campilobacteriosis humana son C. jejuni y C.

coli. Por lo general se multiplican en forma lenta, en medios enriquecidos como

el de Skirrow, Butzler y Campy-Bap; los dos últimos contienen el antibiótico

cefalotina que inhibe el crecimiento de Campylobacter fetus. Para su

caracterización bioquímica se realizan las pruebas de catalasa, oxidasa y la

hidrólisis del hipurato. También puede ser diagnosticada con muestras frescas de

materia fecal observadas al microscopio con tinción de Gram. Campylobacter

puede ser diagnosticado utilizando Kits comerciales para una detección directa de

antígenos presentes en las heces, utilizando la técnica aglutinación en látex. La

técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) también se utiliza para

detectar diferentes campylobacterias, es rápida y se tienen los resultados el mismo

día, la desventaja que existe es que es costosa. (García, 2007)

(http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf ) (Malavez, 2005) (Ministerio

de Salud, 2001)

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2.2.3 Especies importantes

C. fetus ss. venerealis, C. fetus ss. fetus, C. jejuni, C. sputorum ss. sutorum,

bubulus y mucosalis, C. coli, C. concisus, C. hyointestinalis. Los diferentes

serotipos se definen con base en los antigénos somáticos y flagelares. (Velasco,

2002)

2.2.3.1 Especies termofilas

Son aquellas capaces de crecer a 42-43°C pero no a 25°C, comprende C. jejuni

(subespecies jejuni y doylei), C. coli, C. laridi (biovar ureasa + y -), y C.

upsaliensis. De este grupo, Campylobacter jejuni (subespecie jejuni) es agente

causal de diarreas, siendo considerado el más virulento por su mayor resistencia a

la fagocitosis; luego le sigue Campylobacter coli, pero se considera que la diarrea

que produce es más benigna. Ambos se encuentran como comensales en el tracto

gastrointestinal de un amplio grupo de animales a los cuales se ha adaptado

perfectamente, es por ello que su temperatura óptima de desarrollo es a 42-43°C.

Infecciones extraintestinales pueden ocurrir raramente en huéspedes normales; en

pacientes HIV positivos e inmunocomprometidos pueden producir bacteriemias,

bursitis, artritis, infecciones del tracto urinario, endocarditis, peritonitis, aborto y

sepsis neonatal. Campylobacter lari ha sido aislado de intestino de gaviotas, de

otros animales y también del hombre. Su rol patógeno para este último aún no está

definido. La diferencia con los otros dos enteropatógenos está en que es negativo

para la prueba de indoxyl acetato. Campylobacter upsaliensis raramente es aislado

de diarreas, produce bacteriemias en huéspedes inmunocomprometidos. Son más

resistentes al poder bactericida del suero que las otras especies termófilas, por lo

que puede sobrevivir en sangre. Si bien su fuente de infección no está bien

definida, se ha relacionado con animales, especialmente perros, alimentos como

leche no pasteurizada y sus derivados.

Campylobacter fetus (subsp. fetus y veneralis) son microorganismos de gran

importancia veterinaria producen aborto esporádico en el ganado bovino y ovino.

Para el humano C. fetus subsp. fetus es considerado un patógenos oportunista,

provocando infecciones sistémicas en pacientes debilitados o inmunosuprimidos,

se aísla de intestino de ovejas, vacas y cerdos. C. fetus subsp. veneralis se

- 7 -

encuentra frecuentemente en el aparato genital de vacas causando infertilidad. La

diferencia entre ambas subespecies es la capacidad de crecer en 1% de glicina de

C. fetus subsp. fetus. Campylobacter hyointestinalis se ha recuperado de

hisopados réctales de hombres homosexuales con proctitis. Anteriormente solo era

hallado en animales, sobre todo como causa de ileitis en cerdos. Presenta

reacciones bioquímicas similares a C. fetus subsp fetus, pero a diferencia de este

también puede crecer a 42°C y produce H2S en TSI.

Campylobacter consisus y Campylobacter rectus se aíslan de pacientes con

enfermedad periodontal, infecciones intestinales y bacteriemia.

Campylobacter sputorum biovar sputorum forma parte de la flora normal de la

boca e intestino humano, ha sido aislado de forúnculos perianales y abscesos

pulmonares.

Campylobacter sputorum biovar bubulus es un comensal de ovejas y vacas, se ha

aislado de forúnculos y abscesos en hígado, escroto, ingle y axilas humanas en

personas que trabajan en el campo.

Campylobacter showae es una especie recientemente descrita, aislada de

enfermedad periodontal, presenta la particularidad de tener múltiples flagelos.

(Ministerio de salud, 2001)

2.3 Vías de transmisión y alimentos implicados

Varias especies de Campylobacter se encuentran como comensales en el tracto

gastrointestinal de animales salvajes y domésticos. Los principales reservorios los

constituyen el ganado bovino, ovino y suino, roedores, perros y gatos. Otro

reservorio principal son las aves, donde está presente como saprofito y también

como patógeno entérico ocasional. El espectro de reservorios varía con la especie:

C.jejuni tiene un reservorio amplio, mientras que C.coli es más frecuentemente

aislado en suinos. La adquisición primaria del germen por los animales ocurre

generalmente temprano en la vida y puede ser causa de morbimortalidad en estos

animales, pero la mayoría de las veces la colonización conduce a un estado de

portador de por vida. (http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf)

(Canals, A).

- 8 -

La mayoría de las infecciones se originan por consumo de alimentos de origen

animal, sobretodo la carne de pollo y derivados de aves. Otros alimentos

implicados son las carnes rojas, despojos, moluscos, leche y quesos no

pasteurizados y aguas no cloradas. La transmisión de la enfermedad se produce

principalmente por contaminaciones cruzadas entre los alimentos, donde los

manipuladores de alimentos, con sus prácticas higiénicas, tienen una importancia

fundamental. La transmisión por los manipuladores (portadores), es poco

frecuente ya que en el hombre, el Campylobacter spp., es un huésped transitorio,

y por tanto, una fuente poco importante de infección. El microorganismo se

elimina por el tratamiento térmico (cocción). No sobrevive en las cocinas

domésticas ni los tratamientos culinarios tradicionales.

La dosis infectiva del Campylobacter spp. es baja si la comparamos con la de

Salmonella spp. Se ha demostrado experimentalmente, que entre 500-800 células

microbianas son suficientes para instaurar la enfermedad; y que por debajo de 100

células la enfermedad no se desarrolla. Estas diferencias se deben a variaciones

del pH del jugo gástrico del huésped y del tipo de alimento consumido. La leche y

alimentos grasos, permiten salvar la barrera ácida del estómago y producir la

infección de forma más fácil.

Está demostrado que la carne de pollo es sin duda la fuente de infección más

importante. Diferentes estudios epidemiológicos han establecido que entre el 50-

70 % de las infecciones esporádicas de origen alimentario por Campylobacter spp.

se deben al consumo o manipulación de la carne de pollo poco hecha (por

contaminación de estas carnes con otros alimentos, por contaminación con las

superficies de contacto o las superficies de corte utilizadas). Lo que no está del

todo claro es la fuente de infección principal. Se sabe que la mayoría de las

explotaciones avícolas de engorde están infectadas con C. jejuni. Las camas y

agua no clorada, han estado vinculadas como vehículos de introducción y

transmisión de la infección. Las jaulas, ropa, manos y calzado del personal de las

explotaciones avícolas, también pueden ser vías de entrada del microorganismo.

Otras fuentes podrían ser los animales domésticos o salvajes alrededor de la

explotación.

- 9 -

Una vez ha entrado en la explotación, el Campylobacter spp. se disemina y

coloniza el intestino de los pollos de engorde (entre 14 y 49 días de edad). Estos

pollos irán la mayoría al matadero para su sacrificio, y en este transporte de la

granja al matadero, por tener un contacto directo entre ellos, hace que se aumente

hasta 1000 veces el grado de contaminación superficial de estos animales,

sobretodo por las heces de los animales. En el matadero, en el proceso del

faenado, se contaminan la mayoría de los equipos y de las herramientas, así como

superficies de contacto, y maquinarias. Unos estudios, aparecidos en junio del

2001, por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de

Investigación Agraria, han desvelado que la superficie del huevo fértil en el

momento de la eclosión sería uno de los vehículos principales de transmisión del

Campylobacter spp., en las explotaciones avícolas. (Canals, A)

El agua contaminada puede ser la fuente de brotes de Campylobacteriosis, sobre

todo por el consumo de la misma y en vinculación con actividades recreacionales.

También, bajo condiciones que favorecen la replicación del germen, la

contaminación fecal del suelo puede ser origen de infección humana,

principalmente por el consumo de vegetales cosechados en ellas. En los países

industrializados el microorganismo se transmite principalmente a través de

alimentos de origen animal, mientras que en los países menos desarrollados

predominan la transmisión por alimentos y aguas contaminadas con excretas así

como el contacto directo con personas o animales enfermos. La transmisión de

C.jejuni se ve minimizada a temperatura ambiente o menor; además los alimentos

no constituyen un sustrato favorable para su desarrollo. Estos dos hechos sugieren

que la ocurrencia de ETA por este agente refleja condiciones muy inadecuadas en

el manejo de los alimentos (mala refrigeración, malas condiciones de higiene,

etc.). Por otra parte, en todas partes del mundo el número de casos aumenta en

verano y principios del otoño, coincidiendo con el aumento de la temperatura

ambiental. (http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf)

- 10 -

2.4 Enfermedades en humanos

2.4.1 Epidemiología

La campylobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial. Las especies

diarreogénicas de Campylobacter spp se encuentran habitualmente como

comensales del tracto gastrointestinal de una gran variedad de mamíferos y de

aves, tanto domésticos como de vida libre.

Muchos de los casos de enteritis humana han sido asociados al contacto con

animales, agua o alimentos de origen animal especialmente de aves contaminados

con estas bacterias.

En países industrializados, Campylobacter es el primer agente de diarrea. La

enfermedad es más frecuente en los meses de verano. Se considera que un alto

porcentaje de infecciones es provocado por consumo de carne de ave mal cocida o

por contaminación cruzada al momento de preparar alimentos.

En países en vías de desarrollo Campylobacter es el segundo o tercer agente de

diarrea, según sea el lugar geográfico. La enfermedad afecta a todas las edades

pero parece ser más frecuente en niños de corta edad, menores de 4 años y

adultos jóvenes de 15 a 44 años de edad. Los individuos con HIV (SIDA) tienen

un alto riesgo de adquirir la infección por Campylobacter, además de que ésta

puede ser invasiva.

C. jejuni y C. coli son causas importantes de diarreas agudas en viajeros que

visitan zonas en vías de desarrollo. No soportan durante mucho tiempo situaciones

de desecación o congelamiento, características que limitan su transmisión.

Sobreviven en la leche, otros alimentos o el agua a 4°C durante una semana. De la

misma forma que con otros patógenos entéricos, es importante tener presente,

para efectos de prevención, la transmisión fecal-oral de persona a persona sobre

todo en lactantes, que no controlan esfínteres. (Fernández, 2003) ( Kapperud,

1994)

2.4.2 Patogenia

El daño al huésped y las manifestaciones clínicas dependen principalmente de dos

factores: el inóculo ingerido y el estado inmunológico del huésped.

- 11 -

El principal mecanismo de patogenicidad es la invasión de la mucosa intestinal,

en forma similar a como lo hace Shigella. La invasión de la lámina propia se

observa tanto a nivel del intestino delgado como del colon, y el resultado es

generalmente una enterocolitis inespecífica, que puede incluir los siguientes

hallazgos: degeneración y atrofia glandular, pérdida de la producción de mucus,

abscesos de las criptas, y ulceración de la mucosa epitelial. En otros casos, las

características patológicas son similares a las observadas en infecciones por

Salmonella o Shigella. Parece evidente que el lipopolisacárido de la pared

bacteriana, con actividad endotóxica típica, desempeña un rol central en el daño

inflamatorio.

Aunque se han reconocido una toxina termo-lábil similar a la de Vibrio cholerae y

varias citotóxinas, la producción in vivo e in vitro de éstas parece de bajo nivel

por lo que se duda que tenga alguna significación en la patogenia.

Se cree que Campylobacter puede jugar un papel en el Síndrome de Guillain-

Barré (SGB) por un mecanismo que involucraría la similitud entre el ácido siálico

de algunos antígenos O y los gangliósidos humanos. (Blazer, 2000)

Las campilobacterias producen proteínas citotóxicas que pueden intervenir en el

desarrollo clínico de la enfermedad, además poseen toxinas extracelulares con

actividad citopática y enterotoxinas clásicas, parecidas a las de Escherichia coli.

(http://www.bvsops.org.uy/pdf/campylobacter.pdf) (Noordzij, 2002).Además se

ha demostrado la producción de citotóxinas sobre células CHO, HeLa y Vero,

entre las que destaca la cytolethal distending toxin que tiene la capacidad de

producir distensión y posterior muerte celular.

2.4.3 Presentación clínica

La gastroenteritis aguda causada por Campylobacter se caracteriza por una rápida

elevación de la temperatura, acompañada de malestar general, dolor abdominal,

calambres y retortijones. La infección gastrointestinal por lo general es

autolimitada. El periodo de incubación es de 2 a 5 días, pero puede extenderse

hasta los 10 días. Se ha observado que el 50% de los pacientes con diarrea es

precedida por un periodo febril, malestar generalizado, mialgia, dolor abdominal

y fiebre que puede llegar a los 40 °C. Es habitual que se presente un periodo

- 12 -

prodrómico con fiebre, cefalea, mialgia y malestar general entre 12 y 24 h, antes

del inicio de los síntomas. Al inicio de la infección la materia fecal es acuosa,

pero a medida que progresa la enfermedad ésta se torna sanguinolenta con

tenesmo, el cual es un síntoma común.

Las deposiciones, disgregadas o acuosas, pueden ser mucosanguinolentas, son

oscuras, con mayor olor, ligeramente verdosas. En el análisis de las heces al

microscopio se observa un exudado inflamatorio con infiltrado de leucocitos, así

como un gran número de campylobacterias, las cuales pueden reconocerse por sus

características morfológicas. Con frecuencia se ven células de inflamación y un

predominio de microorganismos de formas curvas y espirilares.

La presentación puede ser variable, desde una forma leve de corta duración a un

cuadro más severo y prolongado con características similares a Shigellosis o

Salmonelosis. Los casos mas leves no requieren de tratamiento antimicrobiano, la

presentación más grave o recidivante se trata; la droga de elección es la

eritromicina.

En los neonatos puede presentarse con una o más deposiciones sanguinolentas y

ningún otro síntoma. También se puede desarrollar solo una fiebre tan severa y

persistente que es necesario diferenciar de fiebre tifoidea.

En pacientes inmunosuprimidos puede presentarse colecistitis aguda, pancreatitis,

cistitis, artritis reactiva y otras complicaciones como síndrome urémico

hemolítico, nefritis intersticial, hepatitis y síndrome de Guillén-Barré.

Debido a la progresión de la enfermedad en adultos jóvenes, la infección por

Campylobacter jejuni, presenta un cuadro que se le puede confundir con colitis

ulcerosa o enfermedad de Crohn. En la materia fecal puede observarse sangre

fresca al tercer día. La diarrea puede oscilar en severidad desde materia fecal

blanda hasta líquida o sanguinolenta. Puede haber más de 10 evacuaciones en el

peor día de la enfermedad. El dolor abdominal puede ser de tipo cólico que

disminuye durante la defecación.

Es raro que se presente vómito. La diarrea puede continuar por 2 ó 3 días, así

como también pueden persistir el dolor abdominal y malestar aun cuando no haya

diarrea.

- 13 -

En una proporción significativa de pacientes infectados por Campylobacter jejuni

las heces pueden contener sangre fresca, pus o moco, sugiriendo una inflamación

colorrectal, lo cual no es raro. La sigmoidoscopia revela anormalidades de la

mucosa que van desde un edema o una congestión con o sin hemorragia petequial,

hasta una mucosa dañada severamente parecida a tejido carcinogénico.

El dolor abdominal severo puede llegar a confundirse con una peritonitis aguda.

Ocasionalmente estos pacientes, principalmente adolescentes y adultos jóvenes,

pueden desarrollar una peritonitis de una apendicitis aguda, pero en la mayoría de

éstos se observa una inflamación del íleon y el yeyuno con adenitis mesentérica.

Puede haber complicaciones locales como la colecistitis, pancreatitis y peritonitis.

La infección también puede manifestarse como una colitis aguda con síntomas de

fiebre, cólicos abdominales y diarrea sanguinolenta, que persiste durante una

semana o más.

Se ha documentado que personas deficientes en inmunoglobulinas (Igs), las

infecciones por campylobacterias pueden ser prolongadas, severas y recurrentes,

con frecuencia desarrollando bacteriemia y otras manifestaciones

extraintestinales, tales como lesiones cutáneas erisipeloides, osteomielitis.

Además, varias semanas después de la infección, puede aparecer artritis reactiva

en personas que portan los antígenos de histocompatibilidad HLA-B2.

Las infecciones extraintestinales por Campylobacter como meningitis,

osteomielitis y sepsis neonatal son raras, pero se han llegado a observar; se ha

reconocido Campylobacter jejuni asociada con pacientes que padecen síndrome

de Guillain-Barré. El síndrome de Guillain-Barré es una afección autoinmune del

sistema nervioso periférico que produce parálisis fláccida aguda. El síndrome se

ha llegado a correlacionar a una infección previa por Campilobacter jejuni hasta

en un 40% de los casos, demostrándose que este síndrome se produce como

consecuencia del ataque inmune debido al mimetismo molecular que existe entre

algunas moléculas del lipopolisacárido (LPS) de cepas de C. jejuni y los

gangliósidos del tejido nervioso humano, siendo los más severos y que requieren

de hospitalización rápida. Algunos serotipos de C. jejuni también están asociados

al SGB. (Ministerio de Salud, 2001) (García, 2007).

- 14 -

2.4.4 Diagnóstico de laboratorio.

El examen directo de las heces es una herramienta de utilidad en la investigación

inicial del paciente con enteritis. La microscopía de campo oscuro o de contraste

de fases, sobre todo en la fase aguda de la enfermedad, puede revelar la movilidad

característica de Campylobacter que aporta un diagnóstico presuntivo en forma

rápida. También pueden observarse frotis teñidos por técnica de Gram modificado

para observar bacilos-gramnegativos sugestivos del germen, pero la sensibilidad

de este método es de 50-75%. La microscopía directa también sirve para

demostrar hematíes y polimorfonucleares que están presentes en las heces de la

mayoría de los pacientes con enteritis por Campylobacter.

El diagnóstico se confirma mediante el aislamiento del germen en medios

especiales, según ya se describió. Se debe señalar que el cultivo cobra especial

importancia en el diagnóstico de enfermedad sistémica ya que es la única forma

de demostrar bacteriemia.

2.5 Enfermedades en animales:

C. fetus ss. fetus: aborto en ovinos.

C. fetus ss. venerealis: infertilidad, reabsorciones embrionarias y en algunas

ocasiones aborto.

C. sputorum ss. mucosalis y C. hyointestinalis: asociados a enteritis proliferativa

en cerdos.

2.5.1 Campilobacteriosis

Antiguamente conocida como vibriosis, esta enfermedad de ovejas y cabras es

causada por Campilobacter fetus var.fetus, que no es el agente causal de la

vibriosis bovina. La campilobacteriosis causa abortos tardíos en ovejas, pero

raramente afecta a cabras.

Las ovejas se enferman por ingestión de forrajes o agua contaminadas por

descargas vaginales o fecales de otras ovejas que hayan abortado. Esta es una

enfermedad que puede causar tormentas de abortos cuando ingresa por primera

- 15 -

vez a una majada no inmunizada, y Campilobacter generalmente es traído por

ovejas compradas o ingresadas por cualquier motivo.

La enfermedad deja una inmunidad sólida luego de provocar abortos o un

aumento en la mortalidad perinatal. Los abortos son tardíos, y las ovejas no se ven

enfermas, aunque alguna puede morir de peritonitis. Los fetos abortados aparecen

frecuentemente "ventrudos" por el agrandamiento del hígado, en el que se

encuentran focos necróticos blanquecinos del tamaño de una nuez y forma

redondeada. Además hay colectas líquidas en cavidad abdominal.

El diagnóstico se confirma por aislamiento o por microscopía de campo oscuro,

que permite identificar el agente causal en una muestra de contenido estomacal

del feto o de los fluidos vaginales de la oveja o de la placenta.

Se deben eliminar los restos orgánicos y fetos abortados para evitar la difusión de

la enfermedad, y toda la manada debería tratarse inmediatamente con tetraciclina

por vía oral, comenzando con 400 mg/oveja/día durante 3 días para luego

disminuir a la mitad hasta terminar los partos. También pueden tratarse por

inyección de tetraciclinas de larga acción.

(http://www.acampo.com.ar/espanol/ot_gan/ot_gan2.htm)

2.5.1.1 Campylobacteriosis genital bovina

La Campylobacteriosis Genital Bovina (CGB) es una enfermedad asociada a

infertilidad, repetición de celos y ocasionales abortos. Es de transmisión venérea y

afecta al ganado lechero y de carne. El agente etiológico es el Campylobacter

fetus (C.fetus) con 2 subespecies: venerealis y fetus. La subespecie venerealis, a

su vez, tiene 2 biotipos: intermedius y Dedié. La subespecie fetus incluye los tipos

1 (cepas intermediarias) y 2. Esta diferenciación se realiza por biotipificación.

2.5.1.1.1Manifestaciones clínicas

El toro es el portador asintomático de la enfermedad, no afectándose su capacidad

reproductiva. Campylobacter fetus habita en las criptas prepuciales del toro. En

los toros adultos estas criptas son mayores en número y en medida por lo que

- 16 -

contendrían un número importante de bacterias en su interior. El toro juega un rol

importante en la transmisión de la enfermedad asociado al factor etáreo.

En la hembra se manifiesta por ciclos estrales largos, repeticiones de celo,

disminución del porcentaje de preñez, debida a mortalidad embrionaria y abortos

que no suelen superar el 10 %.

Campylobacter fetus habita en la hembra en las mucosas del útero, cérvix y

vagina. La infertilidad en la hembra está relacionada con la restricción de O2 que

provoca el ingreso de C. fetus en el útero, la acción de la mucinasa que

despolimeriza el mucus vaginal y por la endometritis mucopurulenta subaguda.

2.5.1.1.2Diagnostico

El diagnóstico se realiza en los machos, en las hembras y en los fetos. En el toro

se efectúan 3 raspajes prepuciales con intervalo de 7 a 10 días para evitar falsos

negativos. También se puede analizar el semen ya sea fresco o congelado. En las

hembras el material de elección es el mucus vaginal o descargas uterinas de

animales abortados, utilizándose para su extracción la pipeta de inseminación. En

el caso de fetos, el líquido abomasal y el pulmón son los materiales de elección

para aislar Campylobacter fetus.

El aislamiento del microorganismo permite obtener la certeza del diagnóstico y la

biotipificación diferencia las subespecies venerealis y fetus y el biotipo

intermedius. Actualmente también se puede clasificar subespecies de C. fetus por

técnicas de biología molecular como el PCR.

También se utiliza para diagnóstico la técnica de Inmunofluorescencia Directa

como método de “screening”, tanto para machos como para hembras y fetos. Es

una técnica sensible y específica pero tiene el inconveniente de no diferenciar

subespecies de C. fetus.

2.5.1.1.3Control

El control de la enfermedad es posible siempre y cuando se adopten medidas de

manejo, tratamientos con antibióticos en machos y vacunaciones sistemáticas de

todos los bovinos que entren a servicio.

La mayoría de los establecimientos de cría no han adoptado tecnologías para

lograr un buen control reproductivo. Medidas simples como son el

- 17 -

estacionamiento del servicio, el uso de toros jóvenes y con certificado sanitario

que los acredite como libres de Campylobacter fetus, no rotar los toros durante el

servicio, el realizar por lo menos 3 muestreos a partir de los 30 días de retirados

los toros del servicio con intervalos de 7 a 10 días, son instrumentadas en muy

pocos establecimientos.

(http://www.produccionbovina.com/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/enferme

dades_reproduccion/08-enfermedades_afectan_reproduccion.htm.).

2.6 Medios de cultivo y pruebas bioquímicas

En este análisis se utilizan varios medios de cultivo y pruebas bioquímicas, entre

ellos están:

Caldo y agar Brucella:

Contiene los componentes mínimos requeridos para el crecimiento de

Campylobacter, como peptona, extracto de levadura, dextrosa, bisulfito de sodio,

etc.

Agar Brucella BBL:

Este medio de cultivo contiene sangre de caballo por la cual el microorganismo

presenta reacciones hemolíticas.

Suplemento FBP:

Este suplemento favorece el crecimiento y la aerotolerancia de Campylobacter.

(DIFCO)

Agar MCCDA:

El uso de este medio es específico por el ministerio de agricultura, pesqueras y

productos alimenticios, el suplemento CCDA inhibe el crecimiento de levaduras,

hongos y enterobacterias. (MERCK)

Oxidasa: La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e-

puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Es una

prueba que detecta la presencia del enzima citocromooxidasa. La enzima

- 18 -

citocromooxidasa, en presencia de oxígeno atmosférico, oxida el reactivo

fenilendiamina oxidasa para formar un compuesto coloreado: indofenol.

Catalasa: La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de

hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Se basa en la capacidad del

enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno añadido, formándose

agua y O2, el cual se libera en forma de burbujas. Excluyendo los estreptococos,

la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad

catalasa. (http://chopo.cnice.mecd.es/~gdiaz3/apuntes/UT162.pdf)

Fermentación de la glucosa: Mediante esta prueba se puede determinar la

capacidad que tiene el microorganismo de fermentar un azúcar como la glucosa.

Para esto se utiliza el indicador de pH rojo de fenol, el cual cambia de color en

cuanto el pH del medio cambia, observándose acido (amarillo) cuando el azúcar

fue fermentada y alcalino (rojo) cuando no.

Sensibilidad a antibióticos: Muchos microorganismos presentan sensibilidad o no

a cierto tipo de antibióticos. Mediante estas pruebas se puede determinar que tan

sensibles son frente a cualquier antibiótico. Esto se define observando el halo de

inhibición que el microorganismo presenta en presencia de antibióticos. (Velasco

2002)

2.7 Laboratorio LABSER

La globalización es una realidad que Chile debe asumir para asegurar su

desarrollo económico y bienestar social. LABSER es un laboratorio dotado de

infraestructura tecnológica y profesional que permite ofrecer servicio y asesoría

permanente a las actividades de importación y/o exportación, principalmente de

alimentos y materias primas de manera de garantizar la calidad e inocuidad de

tales bienes de consumo.

Hoy en día la calidad e inocuidad de los alimentos vale decir ausencia de

contaminantes químicos, microbiológicos o físicos- es una condición exigida

- 19 -

prioritariamente por distribuidores y consumidores para aceptar o rechazar un

determinado producto alimenticio.

El laboratorio en el área de microbiología cuenta con diversos análisis tales como:

• Recuento de Aerobios Mesófilos (BAM FDA / Petrifilm AOAC)

• Recuento de Microorganismos cultivables.

• Determinación de Salmonellas (BAM – FDA / USDA – FSIS / SAG /

Assurance EIA)

• Recuento de Hongos y Levaduras.

• Recuento de Enterobacterias.

• Determinación Coliformes (tubos múltiples / Petrifilm)

• Determinación Listeria

• Análisis Ambiental de superficie

• Recuento S. aureus

• Recuento Clostridium perfringens

• Recuento Sulfito Reductores

• Metodología PCR (http://www.labser.cl/HOME.htm)

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3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

3.1 Formulación del problema.

El propósito de este trabajo es hacer un estudio financiero (costos) para

determinar si se puede implementar el análisis de Campylobacter spp según la

metodología descrita por USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 en el laboratorio

LABSER de Rancagua Chile.

3.2 Preguntas de investigación.

La presente propuesta plantea los siguientes interrogantes:

¿Al realizar el estudio financiero (costos) será posible implementar el análisis de

Campylobacter spp USDA/FSIS Capitulo 6 1998 en el laboratorio LABSER?

¿Será que la implementación de esta técnica es muy costosa?

3.3 Justificación de la investigación.

El laboratorio LABSER ubicado en la ciudad de Rancagua Chile es un laboratorio

encargado de realizar diferentes análisis tanto químicos como microbiológicos.

Este laboratorio no cuenta con todo el procedimiento para análisis de

Campylobacter spp por eso este trabajo se realizo con el fin de evaluar los costos

para determinar si se puede implementar el método de análisis de Campylobacter

spp según la USDA/FSIS Capitulo 6 1998.

Campylobacter es el microorganismo causante de muchas enfermedades en el

hombre como en los animales. La mayoría de las infecciones se originan por

consumo de alimentos de origen animal, sobretodo la carne de pollo y derivados

de aves. Otros alimentos implicados son las carnes rojas, despojos, moluscos,

leche y quesos no pasteurizados y aguas no cloradas. Por eso su identificación es

muy importante hacerla en muestras de alimentos.

- 21 -

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Realizar un estudio para la implementación del análisis de Campylobacter spp

basado en la metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 en el laboratorio

LABSER de Rancagua Chile, haciendo una investigación económica- financiera y

según esta determinar si es posible la implementación de este método en el

laboratorio.

4.2 Objetivos específicos

Comparar entre las diferentes casas comerciales de productos microbiológicos

cual es la más económica y conveniente para el análisis de Campylobacter spp.

Determinar cuales son los equipos que se utilizan en este análisis con los que el

laboratorio no cuenta y cual debe ser su inversión para obtenerlos.

Establecer el costo del análisis para los clientes, basándose en insumos,

horas/hombres, gestión de calidad, costos indirectos etc.

Comparar el costo final del análisis en esta investigación con el costo establecido

por el laboratorio de la Universidad de Chile a la cual LABSER subcontrata para

el análisis.

- 22 -

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Materiales

Los materiales y métodos descritos a continuación, son los propuestos por la

metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998

5.1.1 Materiales para el aislamiento, identificación y cuantificación de

Campylobacter jejuni/coli en productos de carne y aves de corral.

5.1.1.1 Equipos

• Microscopio. Objetivo de 100X

• Incubadoras con agitación/baño termostatado a 37 ± 1.0°C y 42 ± 1.0ºC

• Incubadora estática 42 ± 1.0 ºC

• Balanza, sensibilidad de 0.1 g

• Bolsas de Qwik Seal® (metales Co. de Reynolds, Richmond, VA; # RS78)

tamaño 1/4

• Jarras anaerobiosis (expresadas o no ventiladas)

• CampyPak PlusÔ (BBL 71045) o kits para Campylobacter que generan gas

(Oxoid BR56 para tarros de 3.0-3.5 litros, o BR60 para tarros de 2.5-3.0 litros)

• Bomba al vacío con tubería y conectores para la evacuación de gas en jarras

anaerobiosis

• Cilindro de gas que contiene una mezcla de O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al

85% con tubería y conectores apropiados para traspasarse a jarras de

anaerobiosis y bolsas de Qwik Seal®

• Regulador para el cilindro de gas compatible con la conexión en el cilindro

• Papel de filtro (para humectar con glicerol y para la prueba de oxidasa)

• Placas de Petri (100 x 15 milímetros)

• Asas estériles

• Filtros de membrana estériles de 0.2 µm

• Laminas, laminillas y aceite de inmersión

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• Tubos de tapa rosca de 16 x 150 milímetros y de 16 x 125 milímetros

• Frascos de 250 ml

• Esponjas estériles

• Pinzas y tijeras estériles

• Pipetas estériles

• Bolsas plásticas grandes estériles

• Stomacher 400, y bolsas Stamacher 400

• Centrifuga, rotor, para botellas de 250 ml estériles

• Embudos estériles

5.1.1.2 Reactivos

• Glicerol

• Solución de peróxido de hidrógeno al 3%

• Discos de sensibilidad a antibióticos (Cefalotina 30 µg)

• Discos de sensibilidad a antibióticos (Acido Nalidixico 30 µg)

• Reactivo para prueba de Oxidasa (Solución tetrametil-p-fenilendiamina

dihidrocloridrico al 1%)

5.1.1.3 Medios de cultivo

• Caldo de enriquecimiento Hunt (HEB)

• Agua peptonada al 0.1%

• Agar diferencial modificado para Campylobacter (MCCDA)

• Caldo Brucella-FBP (BFBP)

• Medio semisólido glucosa Brucella

• Agar Brucella-FBP (BFBP)

- 24 -

5.1.2 Métodos

5.1.2.1 Preparación de medios de cultivo

• Caldo de enriquecimiento Hunt (HEB)

Caldo básico

Caldo nutritivo 25.0g

Extracto de levadura 6.0g

Agua destilada 950.0ml

Disolver el caldo nutritivo y el extracto de levadura en agua destilada. Autoclavar

121ºC por 15 minutos. pH final 7.5 ± 0.2 a 25ºC

Los suplementos (FBP, antibióticos, y sangre del caballo esterilizados con filtro

por filtración) se agregan momentos antes del uso y se mezclan.

Suplemento FBP

Sulfato ferroso 0.25g

Metabisulfito de sodio 0.25g

Piruvato de sodio 0.25g

Ver preparación abajo.

Antibióticos

Clorohidrato vancomicina 10.0 mg

Solución stock de Vancomicina

En un frasco volumétrico, disolver 0.25g vancomicina en 100ml de agua

destilada, mezclar y esterilizar con filtración por membrana. Almacenar a 4oC.

Utilizar 4ml para cada litro de caldo del enriquecimiento.

Trimetoprim Lactato 12.5 mg

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Solución stock de lactato del Trimetoprim

En un frasco volumétrico, disolver 0.3125g de lactato de trimetoprim en 100ml de

agua destilada, mezclarte y esterilizarlos con filtro. Almacenar en 4oC. Utilizar

4ml para cada litro de caldo del enriquecimiento.

Cefoperazona de Sodio 15.0 mg

Solución stock de Cefoperazona

En un frasco volumétrico, disolver 0.375g de cefoperazona en 100ml de agua

destilada, mezclar, y esterilizarlos con filtración por membrana. Almacenar a -

70oC en alícuotas de 4ml. Inicialmente, utilizar 4ml para cada litro de caldo de

enriquecimiento (para las primeras cuatro horas, la incubación está a 37oC).

Después de cuatro horas, agregar 4ml/l adicional, para traer la concentración final

a 30mg/l, y aumentar la temperatura de incubación a 42oC.

Cicloheximida 100.0 mg

Solución stock de Cicloheximida

Preparar una solución al 10% en etanol al 50%. En un frasco volumétrico de 50

ml, disolver 5g de cicloheximida en 50 ml de etanol al 50%, mezclar y esterilizar

con filtración por membrana y almacenar en 4oC. Utilizar 1ml para cada L de

caldo.

Sangre lisada de caballo estéril 50.0 ml

Lise la sangre del caballo sujetándola a dos ciclos de heladas/deshielo. Almacenar

en congelación.

• Agua peptonada al 0.1%

Agregar 0.1g de peptona en 100ml de agua destilada según el análisis lo requiera.

• Agar diferencial modificado para Campylobacter (MCCDA)

Caldo nutritivo 25.0 g

- 26 -

Carbón activado 4.0 g

Caseína hidrolizada 3.0 g

Desoxicolato de sodio1.0 g

Sulfato ferroso 0.25 g

Piruvato sodico0.25 g

Agar 12.0 g

Cefoperazona de sodio 0.032 g

Agua destilada 1.0 L

Preparación del medio:

Suspender 45.5g del agar base selectiva sin sangre de Campylobacter Oxoid

(CM739) en 1L de agua destilada y llevarlo a ebullición para disolver. Esterilizar

en autoclave a 121°C por 15 minutos. Enfriar a 50°C. Agregar en condiciones

asépticas 1 vial del suplemento selectivo SR0155 de CCDA. Mezclar bien y verter

en las placas de Petri estériles.

• Caldo Brucella-FBP (BFBP)

Bacto triptona 10.0 g

Bacto Peptona 10.0 g

Bacto dextrosa 1.0 g

Bacto extracto de levadura 2.0 g

Cloruro de sodio 5.0 g

Bisulfito de sodio 0.10 g


Suplemento FBP




Ver preparación abajo

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Disolver 28g de caldo Brucella en 1L de agua destilada y autoclavar a 121oC por

15 minutos. Enfriar el medio a temperatura ambiente y agregar la solución FBP.

En condiciones asépticas dispensar en tubos tapa rosca. pH final 7.2 ± 0.2 a 25ºC

• Medio semisólido glucosa Brucella

Pancreatic digest of casein 15.0 g

Peptic digest of animal tissue 5.0 g

Extracto de levadura 2.0 g



Agar 1.6 g

Dextrosa 11.0 g

Rojo de fenol 0.02 g


Suspender 28g del caldo Brucella (Albimi; deshidratado; BBL) excepto rojo de

fenol y el agar en 1L de agua destilada, y ajustar el pH a 7.4 con NaOH al 8 N.

Agregar el agar. Calentar la mezcla hasta que se observe que está bien disuelta.

Enfriar a 55°C y agregar 2.5ml de la solución rojo de fenol (0.08 g/10 ml de 0.1 N

NaOH ). Reajustar el pH a 7.4 en caso de necesidad, dispensarlo y esterilizarlo en

121oC por 10 minutos.

pH final 7.0 + 0.2 a 25oC.

• Agar Brucella-FBP (BFBP)

Bacto peptona 20.0 g

Bacto dextrosa 1.0 g

Bacto extracto de levadura 2.0 g



- 28 -

Bacto Agar 15.0 g


Suplemento FBP




Ver preparación abajo.

Suspender 43g de agar Brucella (Deshidratado; Difco) en 1L de agua destilada.

Calentar la mezcla hasta observar que está bien disuelta. Autoclavar a 121oC por

15 minutos. Enfriar a 50oC y agregar la solución ferrosa esterilizada con filtro por

filtración 4 ml de la solución FBP. Mezclarte y servir.

• solución stock FBP




Disolver los ingredientes en 100ml de agua destilada en un frasco volumétrico.

Conservar a -20oC. Utilizar 4ml por cada litro de caldo del enriquecimiento.

5.1.2.2 Aislamiento y cuantificación

1. 25g para muestras de carne o esponja en 100 ml de HEB en bolsas de Qwik

Seal® tamaño 1/4. Colocar las bolsas en el Stomacher a 400 RPM durante 2

minutos. Quitar todo el aire posible sin derramar el contenido, después sellar

las bolsas, dejando una abertura de 1/2 pulgada en un extremo. En condiciones

asépticas insertar una pipeta estéril de 10 ml. Conectar la boca de la pipeta con

la mezcla del gas de Campy microaerofilo (O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al

85%) con un tubo de goma estéril y un filtro estéril, inflar lentamente la bolsa

- 29 -

con el Campy para proveer gas a la mezcla y continuar llenando hasta que

exceso del gas salga de la bolsa. Continuar con el párrafo 4.

2. Colocar la carcasa o la carne de pollo cruda (hasta 1360 g) en una bolsa

plástica grande estéril y agregar 200 ml de agua peptonada al 0.1%. Sellar las

bolsas y mezclar el contenido por 2 minutos. Inclinar la bolsa permitiendo

fluir el líquido a una esquina. Esterilizar la esquina de la bolsa con una

solución de hipoclorito 1000 PPM o etanol al 70%, después enjuagar con agua

destilada estéril. En condiciones asépticas cortar la esquina de la bolsa y verter

el líquido en una botella estéril de 250 ml para centrifugar. Centrifugar a

16.000 RPM x g durante 15 minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender

el pellet en 10 ml de agua peptonada al 0.1%. Para la detección, inocular 1 ml

del lavado concentrado en 100 ml HEB en una bolsa de Qwik Seal®. Seguir

con los pasos descritos en la tercera línea del párrafo 1.

3. Si desea cuantificar, debe realizar NMP con HEB utilizando series de tres

tubos. Se deben elegir las diluciones y los volúmenes de caldo HEB según el

nivel de contaminación que las muestras tengan. Por ejemplo, para productos

de aves de corral se agregan 10ml de la muestra en tres bolsas o botellas con

90ml de caldo HEB. Realizar diluciones seriadas de la muestra con agua

peptonada al 0.1%. Preparar el NMP en tubos subsecuentes y agregar 1ml en

tubos de 9ml de HEB por triplicado para la dilución decimal. Colocar todos

los tubos en jarras de anaerobiosis, como se indica en el párrafo 7. Seguir los

pasos de la incubación del párrafo 4. Según los tubos positivos obtenidos

después de la incubación calcular el resultado según la tabla MPN de

Campylobacter.

4. Incubar las bolsas de Qwik Seal® o las jarras de anaerobiosis que contienen

los tubos de NMP a 37 ± 1 ºC, agitando a 100 RPM durante 4 H.

5. Después de la incubación, en condiciones asépticas agregar una solución

adicional de cefoperazona estéril 4 ml/l para tener una concentración final en

- 30 -

cada recipiente de enriquecimiento de 30 mg/l. Restablecer la atmósfera

microaerófila y aumentar temperatura 42 al ± 1 ºC. Continuar la incubación

durante 20 h a 100 RPM.

6. Enriquecimiento directo de la esponja en dilución 1:100 sobre las placas de

MCCDA (para productos cocinados, dilución 1:50) la dilución se hace

dependiendo del tipo de matriz que se vaya a analizar, puede ser directa o

consecutiva. Sembrar 0.1ml del caldo de enriquecimiento o de las diluciones y

con un rastrillo expandir la muestra.

7. Incubar las placas de MCCDA a 42 ± 1 ºC durante 24 h en las jarras de

anaerobiosis bajo condiciones microaerófilas. Agregar cerca de 4 gotas de

glicerol a un papel de filtro y colocarlo en la jarra, para disminuir el

confluente. Si no hay crecimiento después de 24 h, reincubar las placas

durante 24 a 48 h adicionales para procurar la recuperación. Las condiciones

microaerófilas se pueden alcanzar en la jarra con cualquiera de los siguientes

métodos:

• Evacuar el aire en una jarra de anaerobiosis expresado al vacío con 20

pulgadas de mercurio y llenar la jarra con una mezcla del gas del O2 al 5%,

CO2 al 10%, y N2 al 85%. Repetir el procedimiento del evacuación reemplazo

tres veces para asegurar las condiciones atmosféricas apropiadas.

• CampyPak PlusÔ (BBL) o kit para Campylobacter que genera gas (Oxoid).

Seguir las instrucciones de uso del fabricante y la disposición de los materiales

del kit.

5.1.2.3 Identificación de Campylobacter

Las colonias de Campylobacter en MCCDA son lisas, brillantes, con borde plano

o definido, transparente o translúcido, y con superficie de borde irregular;

descolorido como crema grisácea y ligera; y generalmente 1 a 2 milímetros de

diámetro pero dentro pueden tener una punta de varios milímetros. Las placas con

- 31 -

las colonias de Campylobacter se pueden almacenar hasta 48 h refrigeradas bajo

condiciones microaerófilas.

Utilizar un asa para escoger tres colonias sospechosas de Campylobacter de las

placas de MCCDA y transferirlas cada una a 10 ml de caldo del Brucella-FBP

(BFBP). Puesto que Campylobacter puede tener varios cambios en cuanto a su

morfología colonial, es recomendable cultivar paralelamente por lo menos uno o

todos los tipos de colonias presentes en las placas, para asegurar no pasar por alto

ninguna. Alternativamente, las colonias se pueden investigar con microscopia

antes de sembrarlas en BFBP. Para cultivar colonias aisladas, se deben incubar los

tubos de BFBP con las tapas flojas durante 24 a 48 h a 42 ± 1 ºC en una atmósfera

del O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al 85%. Los tubos no deben ser mezclados ya

que esto introducirá oxígeno en los medios.

Realizar las siguientes pruebas para la identificación de las colonias crecidas en

caldo BFBP:

• Examinar superficie mojada en el caldo BFBP y observar las colonias en el

microscopio con un objetivo de 100X usando aceite de inmersión. Las células

jóvenes de Campylobacter aparecen como barras curvadas estrechas (0.2 a

0.8µm de ancho por 1.5 a 5µm de largo). Estos microorganismos demuestran

el movimiento rápido. Los pares de células pueden asemejarse a la silueta de

la letra S. Cuando las cadenas son mas largas pueden parecer helicoidales,

curvadas, y multiespirales, las formas filamentosas alargadas pueden existir.

Células crecidas durante más de 72 h pueden convertirse en no cultivables y

cocoides. Campylobacter se caracteriza por ser Gram – pero las características

más significativas de estos organismos son la morfología y la motilidad.

5.1.2.3.1 Pruebas bioquímicas

• Inocular las colonias del caldo BFBP a una profundidad de 10 milímetros en

los tubos de medio semisólido glucosa para Brucella. Incubar los tubos con las

tapas flojas dentro de una jarra de anaerobiosis bajo condiciones

microaerófilas a 42 ± 1.0oC durante 1 a 3 días.

- 32 -

1. Prueba de la fermentación de la glucosa: Campylobacter no es un fermentador

de la glucosa, así que el color del medio seguirá siendo rojo-anaranjado. Una

reacción positiva demuestra un color amarillo (ácido con el indicador del rojo

de fenol) en el medio semisólido glucosa para Brucella.

2. Prueba de la Catalasa: Después de leer los resultados de la prueba de la

fermentación de la glucosa, agregar 1 ml de peroxido de hidrógeno al 3% a la

colonia en el medio semisólido glucosa para Bruella, después de dos a tres

minutos, invertir suavemente el tubo para distribuir el reactivo. Examinar

después de 1 a 10 minutos la formación de burbujas, indicando una reacción

positiva. C, Jejuni y C. coli son catalasa positivo.

• Agregar cerca de seis gotas de la colonia del caldo de BFBP a una placa de

agar BFBP, y sembrar por agotamiento el inoculo sobre la superficie con una

torula o con un rastrillo. En condiciones asépticas colocar un disco de ácido

nalidixico (30µg) y un disco de cefalotina (30µg) en cada placa. Presionar

cada disco con pinzas estériles para adherirlo a la superficie del agar. Incubar

las placas en una jarra de anaerobiosis a 42 ± 1 ºC durante 1 a 3 días en una

atmósfera microaerófila.

1. Susceptibilidad al ácido nalidixico y a la cefalotina: Observar el crecimiento

alrededor de los discos impregnados con el antibiótico C. Jejuni y C. coli son

sensibles al ácido nalidixico, existirá alrededor del disco una zona clara debido

a la inhibición. Una zona de cualquier tamaño que indica la sensibilidad. Este

organismo es resistente a la cefalotina, así que el crecimiento será presente

hasta el disco. El crecimiento de Campylobacter puede ser muy ligero y difícil

de ver, así que es adecuado inclinar la placa en ángulo bajo luz para verlo.

2. Prueba de Oxidasa: Poner un pedazo de papel de filtro cuadrado de 2

centímetros en una placa vacía y agregar de 1 a 2 gotas del reactivo de oxidasa

al papel. Impregnar el papel con reactivo sobre un punto con células de 3 a 5

milímetros diámetro usando un asa en loop de platino o plástico. La prueba es

positiva si el papel cambia a color púrpura oscuro en un plazo de 30 segundos.

- 33 -

Alternativamente, la prueba de oxidasa de Disco DrySlideÔ puede ser

utilizada. Campylobacter es oxidasa positivo. (USDA/FSIS MLG 1998.

Capitulo 6)

5.2 Métodos

Según la metodología USDA/FSIS descrita en el numeral 5.1 se determino cuales

eran los equipos, reactivos y medios de cultivo necesarios para implementar

Campylobacter spp en el laboratorio LABSER.

Estos fueron organizados en una lista, y en el caso de los equipos se verifico con

cuales contaba el laboratorio y en cuales tenia que hacer la inversión.

Posteriormente se hicieron las diferentes cotizaciones para los medios de cultivo,

reactivos y equipos. Estas cotizaciones se realizaron en diferentes casas

comerciales de productos microbiológicos, de las cuales LABSER provee todos

sus materiales. Se hizo una comparación entre estas casas comerciales para

determinar cual era la más conveniente en el laboratorio.

Después de haber realizado este estudio financiero se estableció cual es el costo

total del análisis que se ofrecerá a los clientes, basado en insumos, horas hombres,

gestión de calidad y costos indirectos etc.

Los costos horas hombres, gestión de calidad y costos indirectos se obtuvieron

según los valores establecidos por LABSER en previos análisis. Las horas

hombres se adquieren haciendo un análisis directo del tiempo de trabajo que

requiere el método, los costos indirectos incluyen inversión, servicios de agua, luz

y gas, además de la utilización de equipos, materiales de trabajo, los insumos

necesarios para el área de lavado y preparación de material; y en gestión de

calidad se evalúa el trabajo diario del personal realizando control de calidad a

equipos , medio ambiente, materiales, cepas, y medios de cultivo a los cuales se

les hace pruebas de estabilidad, selectividad, productividad y control de pH.

- 34 -

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Cotizaciones

6.1.1 Equipos

Según el listado de equipos necesarios para el análisis de Campylobacter spp

LABSER tiene los siguientes: microscopio, incubadora estática, balanza, bomba

al vacío con tubería y conectores para la evacuación de gas en jarras anaerobiosis,

cilindro de gas que contiene una mezcla de O2 al 5%, CO2 al 10%, y N2 al 85%

con tubería y conectores apropiados para traspasarse a jarras de anaerobiosis y

bolsas de Qwik Seal, regulador para el cilindro de gas compatible con la conexión

en el cilindro, stomacher. Algunos de estos se encuentran disponibles en el área de

química. En la tabla 1 se indican los equipos con los que este laboratorio no

cuenta y sus respectivas cotizaciones.

Dentro de los equipos está la incubadora con agitación, que es muy importante ya

que esta tiene establecidas las temperaturas a las cuales Campylobacter spp debe

ser sometido para su crecimiento, además de proporcionar un permanente

movimiento al medio facilitando un mejor desarrollo del microorganismo. Debido

a que Cambylobacter spp es un microorganismo microaerofilico es importante

someterlo a una atmósfera mínima de oxigeno, para esto se utilizan las jarras de

anaerobiosis las cuales protegen a los cultivos del oxigeno libre.

La centrifuga es un aparato mecánico que utiliza la fuerza centrípeta para separar

sustancias de diferentes densidades, pueden usarse para la separación rápida de

sustancias que en condiciones normales se separarían lentamente bajo la

influencia de la gravedad. El principio de la centrifuga es separar partículas en un

medio líquido por sedimentación.

(http://www.aguamarket.com/diccionario/terminos.asp?Temas=453&termino=&I

d=453)

En este caso la centrifuga se utilizara para separar el microorganismo del medio

de cultivo, esto con el fin de obtener mas concentración para los posteriores

análisis.

- 35 -

Tabla 1. Cotización de equipos

Equipos Costo Merck Costo Arquimed Costo Andes Import Costo Establecido Recipiente de anaerobios 2.5 L $ 87.313 $ 95.700 $ 87.313 Centrifuga botellas $ 4.438.000 $ 4.968.900 $ 4.438.000 Baño termoregulado con agitación $ 1.779.500 $ 1.779.500

Total $ 6.304.813 Tabla 2. Cotización reactivos

Reactivos Costo/l-uni Merck Costo/l-uni PV Equip

S.A Costo/l-uni Andes

import Costo/l-uni Establecido

Peróxido de hidrógeno al 3% $ 21.720 /1L $ 21.720 /1L Discos (Cefalotina 30 µg) $ 7.200 / 250 Discos $ 5.900 / 250 Discos $ 5.900 / 250 Discos Discos (Acido Nalidixico 30 µg) $ 7.200 / 250 Discos $ 5.900 / 250 Discos $ 5.900 / 250 Discos Oxidasa $ 17.550 / 50 Tiras $ 17.550 / 50 Tiras * Sin IVA * Valores en pesos chilenos

- 36 -

Tabla 3. Cotización medios de cultivo

Componentes y/o Medios Costo/g-ml Merck Costo/g-ml PV Equip

S.A Costo/g-ml Andes

Import Costo/g-ml Establecido

Caldo nutritivo $ 46.100 / 500g $ 41.630 / 500g $ 46.100 / 500g Extracto de levadura $ 27.900 / 500g $ 19.398 / 454g $ 19.398 / 454g Peptona $ 77.000 / 500g $ 33.095 / 500g $ 33.095 / 500g Suplemento FBP $ 31.770/ 3.75g $ 31.770/ 3.75g Agar (MCCDA) $57.960/ 500g $57.960/ 500g Caldo Brucella FBP (BFBP) $ 58.536 /500g $ 58.536 /500g Caldo Brucella Albimi BBL $ 50.560 / 500g $ 50.560 / 500g Agar Brucella FBP (BFBP) $ 52.682 /500g $ 52.682 /500g Clorohidrato Vancomicina $ 65.300 /250mg $ 61.990 / 250mg $ 61.990 / 250mg Trimetoprim Lactato $ 71.100 /50mg $ 65.750 / 50mg $ 65.750 / 50mg Cefoperazona de Sodio $ 56.500 /1g $ 55.700 / 1g $ 55.700 / 1g Cicloheximida $ 198.102 / 5g $ 60.600 / 1g $ 198.102 / 5g NaOH $ 9,500/ 500ml $ 11,200/ 500ml $ 9,500/ 500ml Rojo de fenol $ 15.600/ 5g $ 17.800/ 5g $ 15.600/ 5g Sangre lisada de caballo $ 63.000 /500ml $ 63.000 /500ml * Sin IVA * Valores en pesos chilenos

- 37 -

Según la tabla 1 el laboratorio tendría que hacer una inversión de $ 6.304.813 para

adquirir estos equipos, el costo es alto y se requiere de tener una alta demanda con

el análisis de Campylobacter spp para recuperar la inversión. Se debe tener en

cuenta que al laboratorio no entran muchos análisis para este microorganismo con

relación a los otros.

Para operar estos equipos es importante que el personal este capacitado, además

requieren mantenimiento cada cierto periodo de tiempo y son equipos que

únicamente se utilizarían en el laboratorio para este análisis.

6.1.2 Reactivos

LASER trabaja con la mayoría de estos reactivos debido a los diferentes análisis

que este laboratorio realiza. Estos reactivos son importantes para la identificación

bioquímica de Campylobacter spp. Las cotizaciones de estos se muestran en la

tabla 2.

6.1.3 Medios de cultivo

En el caso de los medios de cultivo se hicieron varias averiguaciones en las

diferentes casas comerciales que LABSER maneja, estas no contaban con el caldo

HEB descrito en la técnica, por esta razón se realizo la cotización de los

componentes por separado, los otros medios junto con el suplemento FPB fueron

cotizados sin ningún problema. La tabla 3 muestra cada medio necesario para

implementar este análisis.

Para el estudio de reactivos y medios de cultivo se hicieron cotizaciones a tres

proveedores con los cuales LABSER trabaja hace mucho tiempo, el parámetro de

elección para estos insumos fue escoger precio más económico para el laboratorio.

Estos medios de cultivo proveen al microorganismo de interés todos los nutrientes

necesarios para su crecimiento y desarrollo. Algunos de estos tienen sustancias

inhibidoras de flora acompañante que puede ser competencia de nutrientes para y

además intervenir en el aislamiento e identificación de Campylobacter spp.

- 38 -

Campylobacter spp es un microorganismo patógeno causante de enfermedades en

animales y humanos por eso su aislamiento y caracterización es muy importante

en muestras de alimentos, principalmente productos carnicos de aves de corral y

ganado vacuno. Está demostrado que la carne de pollo es sin duda la fuente de

infección más importante.

Diferentes estudios epidemiológicos han establecido que entre el 50-70 % de las

infecciones esporádicas de origen alimentario por Campylobacter spp. se deben al

consumo o manipulación de la carne de pollo. (Canals, A)

Para prevenir infecciones por esta bacteria es importante la higiene escrupulosa en

la Industria Alimentaría, detección de los portadores sanos, detección precoz de

la enfermedad, correctos tratamiento térmicos y de manipulación posterior así

como de almacenamiento, para impedir recontaminaciones cruzadas. Los

laboratorios de análisis de alimentos son los responsables de aislar e identificar

diferentes microorganismos causantes de enfermedades por esta razón es

importante someter los alimentos que se comercializan, a un análisis

microbiológico.

6.2 Costo por análisis

La metodología descrita por la USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 va dirigida a

cuatro matrices para el análisis de Campylobacter spp en alimentos. Las matrices

son: Carne de ave, carne de vacuno, esponja y carcasa. Estas se pueden cuantificar

mediante la técnica de número más probable (NMP) o identificar por medio de

aislamiento y pruebas bioquímicas.

En las tablas 4 y 5 se muestra el análisis de costos para la prueba de NMP

correspondiente a las cuatro matrices y en las tablas 6 y 7 el costo para el

aislamiento e identificación del microorganismo en las diferentes matrices.

- 39 -

Tabla No.4 NMP Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno o esponja. Series 3 tubos. Dil 3

Insumo Presentación en Análisis

Cantidad a Usar Volumen ml/Mta $/Producto

Presentación por Producto $/g-ml

Receta Envase(g/Lt)

g-ml/Mta $/Mta

Hra. Hombre HR $ 817 Aseg. Calidad UN $ 160

Costos indirectos UN $ 12.456 Bolsa estéril UN 1 $ 114 $ 114

Agua peptonada 0,1% Tubo 3 9 27 $ 33.095 500 66,2 1 0,027 $ 2 HEB

Extracto de Levadura Botella 1 100 100 $ 19.398 454 42,7 6 0,600 $ 26 Caldo nutritivo Botella 1 100 100 $ 41.630 500 83,3 25 2,500 $ 208

Suplemento FBP Botella 1 100 100 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,075 $ 635 Clorohidrato vancomicina Botella 1 100 100 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,001 $ 248

Trimetoprim lactato Botella 1 100 100 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,001 $ 1.644 Cefaperazona de sodio Botella 1 100 100 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,002 $ 84

Cicloheximida Botella 1 100 100 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,010 $ 396 Sangre lisada de caballo Botella 1 100 100 $ 63.000 500 126,0 50 5,000 $ 630

HEB Extracto de Levadura Tubo 9 9 81 $ 19.398 454 42,7 6 0,486 $ 21

Caldo nutritivo Tubo 9 9 81 $ 41.630 500 83,3 25 2,025 $ 169 Suplemento FBP Tubo 9 9 81 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,061 $ 515

Clorohidrato vancomicina Tubo 9 9 81 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,001 $ 201 Trimetoprim lactato Tubo 9 9 81 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,001 $ 1.331

Cefaperazona de sodio Tubo 9 9 81 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,001 $ 68 Cicloheximida Tubo 9 9 81 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,008 $ 321

Sangre lisada de caballo Tubo 9 9 81 $ 63.000 500 126,0 50 4,050 $ 510

- 40 -

Glicerol Gota 4 0,05 0,2 $ 4.900 1000 4,9 1 0,200 $ 1 Campi Pack Plus Bolsa 1 0,5 0,5 $ 44.660 25 1786,4 1 0,500 $ 893

Papel filtro UN 1 0,5 0,5 $ 5.363 100 53,6 1 0,500 $ 27 Total $ 21.476

* Sin IVA * Valores en pesos chilenos

- 41 -

Tabla No.5 NMP Campylobacter spp en muestras de carcasa o carne de ave. Series 3 tubos. Dil 3




Receta Envase(g/Lt)

g-ml/Mta $/Mta



Agua peptonada 0,1% Botella 1 200 200 $ 33.095 500 66,2 1 0,200 $ 13 Agua peptonada 0,1% Tubo 3 9 27 $ 33.095 500 66,2 1 0,027 $ 2

HEB Extracto de Levadura Botella 3 90 270 $ 19.398 454 42,7 6 1,620 $ 69

Caldo nutritivo Botella 3 90 270 $ 41.630 500 83,3 25 6,750 $ 562 Suplemento FBP Botella 3 90 270 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,203 $ 1.716

Clorohidrato vancomicina Botella 3 90 270 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,003 $ 669 Trimetoprim lactato Botella 3 90 270 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,003 $ 4.438

Cefaperazona de sodio Botella 3 90 270 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,004 $ 226 Cicloheximida Botella 3 90 270 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,027 $ 1.070

Sangre lisada de caballo Botella 3 90 270 $ 63.000 500 126,0 50 13,500 $ 1.701 HEB

Extracto de Levadura Tubo 9 9 81 $ 19.398 454 42,7 6 0,486 $ 21 Caldo nutritivo Tubo 9 9 81 $ 41.630 500 83,3 25 2,025 $ 169

Suplemento FBP Tubo 9 9 81 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,061 $ 515 Clorohidrato vancomicina Tubo 9 9 81 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,001 $ 201

Trimetoprim lactato Tubo 9 9 81 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,001 $ 1.331 Cefaperazona de sodio Tubo 9 9 81 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,001 $ 68

Cicloheximida Tubo 9 9 81 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,008 $ 321 Sangre lisada de caballo Tubo 9 9 81 $ 63.000 500 126,0 50 4,050 $ 510

- 42 -

Glicerol Gota 4 0,05 0,2 $ 4.900 1000 4,9 1 0,200 $ 1

Campi Pack Plus Bolsa 1 0,5 0,5 $ 44.660 25 1786,4 1 0,500 $ 893 Papel filtro UN 1 0,5 0,5 $ 5.363 100 53,6 1 0,500 $ 27 Total $ 26.393


- 43 -

Tabla No.6 Aislamiento e identificación Campylobacter spp en muestras de carne de vacuno o esponja. Dil 3




Receta Envase(g/Lt)

g-ml/Mta $/Mta


Costos indirectos UN $ 7.647 Bolsa Qwik Seal UN 1 $ 304 $ 304

Agua peptonada 0,1% Tubo 3 9 27 $ 33.095 500 66,2 1 0,027 $ 2 HEB

Extracto de Levadura Botella 1 100 100 $ 19.398 454 42,7 6 0,600 $ 26 Caldo nutritivo Botella 1 100 100 $ 41.630 500 83,3 25 2,500 $ 208

Suplemento FBP Botella 1 100 100 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,075 $ 635 Clorohidrato vancomicina Botella 1 100 100 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,001 $ 248

Trimetoprim lactato Botella 1 100 100 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,001 $ 1.644 Cefaperazona de sodio Botella 1 100 100 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,002 $ 84

Cicloheximida Botella 1 100 100 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,010 $ 396 Sangre lisada de caballo Botella 1 100 100 $ 63.000 500 126,0 50 5,000 $ 630

MCCDA Placa 1 80 80 $ 57.960 500 115,9 45,5 3,640 $ 422 Glicerol Gota 16 0,05 0,8 $ 4.900 1000 4,9 1 0,800 $ 4

Campi Pack Plus Bolsa 4 0,5 2 $ 44.660 25 1786,4 1 2,000 $ 3.573 Papel filtro UN 4 0,5 2 $ 5.363 100 53,6 1 2,000 $ 107

Caldo Brucella Tubo 3 10 30 $ 58.536 500 117,1 28 0,840 $ 98 Suplemento FBP Tubo 3 10 30 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,023 $ 191

M. semisólido glucosa Tubo 3 10 30 $ 50.560 500 101,1 28 0,840 $ 85 Rojo de fenol Tubo 1 2,5 2,5 $ 15.600 5 3120,0 0,08 0,000 $ 1

NaOH Tubo 1 10 10 $ 9.500 500 19,0 100 1,000 $ 19

- 44 -

Peroxido de hidrogeno Gota 3 1 3 $ 21.720 1000 21,7 1 3,000 $ 65 Agar BFBP Placa 3 20 60 $ 52.682 500 105,3 43 2,580 $ 272

Suplemento FBP Placa 3 20 60 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,045 $ 381 Disco Cefalotina UN 3 1 3 $ 5.900 250 23,6 1 3,000 $ 71

Disco Acido nalidixico UN 3 1 3 $ 5.900 250 23,6 1 3,000 $ 71 Bactident Oxidasa UN 3 1 3 $ 17.500 50 350,0 1 3,000 $ 1.050

Placa Petri Desechable Placa 7 $ 45 $ 315 TOTAL $ 19.665


- 45 -

Tabla No.7 Aislamiento e identificación Campylobacter spp en muestras de carcasa o carne de ave. Dil 3




Receta Envase(g/Lt)

g-ml/Mta $/Mta



Bolsa Qwik Seal UN 1 $ 304 $ 304 Agua peptonada 0,1% Botella 1 200 200 $ 33.095 500 66,2 1 0,200 $ 13 Agua peptonada 0,1% Tubo 3 9 27 $ 33.095 500 66,2 1 0,027 $ 2 Agua peptonada 0,1% Tubo 1 10 10 $ 28.000 500 56,0 39,5 0,395 $ 22

HEB Extracto de Levadura Botella 1 100 100 $ 19.398 454 42,7 6 0,600 $ 26

Caldo nutritivo Botella 1 100 100 $ 41.630 500 83,3 25 2,500 $ 208 Suplemento FBP Botella 1 100 100 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,075 $ 635

Clorohidrato vancomicina Botella 1 100 100 $ 61.990 0,25 247960,0 0,01 0,001 $ 248 Trimetoprim lactato Botella 1 100 100 $ 65.750 0,05 1315000,0 0,0125 0,001 $ 1.644

Cefaperazona de sodio Botella 1 100 100 $ 55.700 1 55700,0 0,015 0,002 $ 84 Cicloheximida Botella 1 100 100 $ 198.102 5 39620,4 0,1 0,010 $ 396

Sangre lisada de caballo Botella 1 100 100 $ 63.000 500 126,0 50 5,000 $ 630

MCCDA Placa 1 80 80 $ 57.960 500 115,9 45,5 3,640 $ 422 Glicerol Gota 16 0,05 0,8 $ 4.900 1000 4,9 1 0,800 $ 4

Campi Pack Plus Bolsa 4 0,5 2 $ 44.660 25 1786,4 1 2,000 $ 3.573 Papel filtro UN 4 0,5 2 $ 5.363 100 53,6 1 2,000 $ 107

Caldo Brucella Tubo 3 10 30 $ 58.536 500 117,1 28 0,840 $ 98 Suplemento FBP Tubo 3 10 30 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,023 $ 191

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M. semisólido glucosa Tubo 3 10 30 $ 50.560 500 101,1 28 0,840 $ 85 Rojo de fenol Tubo 1 2,5 2,5 $ 15.600 5 3120,0 0,08 0,000 $ 1

NaOH Tubo 1 10 10 $ 9.500 500 19,0 100 1,000 $ 19 Peroxido de hidrogeno Gota 3 1 3 $ 21.720 1000 21,7 1 3,000 $ 65

Agar BFBP Placa 3 20 60 $ 52.682 500 105,3 43 2,580 $ 272 Suplemento FBP Placa 3 20 60 $ 31.770 3,75 8472,0 0,75 0,045 $ 381 Disco Cefalotina UN 3 1 3 $ 5.900 250 23,6 1 3,000 $ 71

Disco Acido nalidixico UN 3 1 3 $ 5.900 250 23,6 1 3,000 $ 71 Bactident Oxidasa UN 3 1 3 $ 17.500 50 350,0 1 3,000 $ 1.050

Placa Petri Desechable Placa 7 $ 45 $ 315 TOTAL $ 19.909


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Según las anteriores tablas podemos determinar que el análisis de Campylobacter

spp es costoso tanto para el laboratorio como para el cliente; ya que esta técnica

requiere de equipos y medios de cultivos específicos que tienen un alto valor en el

mercado. Se debe tener en cuenta que estos precios no incluyen IVA ni tampoco

el porcentaje de ganancia que el laboratorio establece. Cuando estos valores se

sumen al costo del análisis, el valor final de la prueba será mayor y este no

favorece a los clientes.

No todas las empresas chilenas le dan importancia a este análisis, son pocas las

que tienen en cuenta hacerlo. Desde enero hasta agosto del 2007 solo entraron 14

muestras para el análisis de Campylobacter spp al laboratorio, numero que no es

bueno para una prueba tan costosa.

La inversión que el laboratorio tendría que hacer en equipos es alta y pasaría

mucho tiempo en recuperarse si tenemos en cuenta los pocos análisis que llegan al

laboratorio, un promedio de 2 análisis por mes. La proyección de ingresos es baja.

Actualmente el laboratorio subcontrata a la Universidad de Chile para realizar este

análisis, ellos se basan en la metodología de la 4º ED. Compendium of Methods

for the Microbiological Examination of Foods, APHA donde hacen únicamente la

cuantificación del microorganismo por un valor de $ 20.640 por análisis.

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8. CONCLUCIONES

No es posible implementar el análisis de Campylobacter spp basado en la

metodología USDA/FSIS MLG Capitulo 6 1998 debido a que es muy costoso.

Al comparar el costo del análisis determinado por la investigación y el costo del

análisis subcontratado es conveniente seguir con el laboratorio subcontratado.

Según este estudio los equipos necesarios para el análisis de Campylobacter spp

basado en la USDA/ FSIS son muy costosos y solo se utilizarían para esta prueba.

La proyección de ingresos no es prospera para el laboratorio ya que no muestra la

recuperación de la inversión a corto o mediano plazo.

La metodología USDA/FSIS MLG capitulo 6 1998 para el aislamiento y

cuantificación de Campylobacter spp descrita en este estudio es de fácil manejo.

Para los clientes no es favorable realizar un análisis tan costoso teniendo en

cuenta la competencia que hay en el mercado.

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9. RECOMENDACIONES

Para implementar el análisis de Campylobacter spp en el laboratorio LABSER es

importante hacer una evaluación de otros métodos para el aislamiento e

identificación y cuantificación de este microorganismo.

Se podría desarrollar una segunda evaluación de costos directos e indirectos para

tener el margen de precios que existen en el mercado actualmente.

Realizar diferentes cotizaciones de los insumos con otras casas comerciales ya que

en este estudio solo se tuvieron en cuenta algunos proveedores a los cuales

LABSER siempre compra sus productos.

Hacer un análisis mercados y exigencias futuras que estos tienen para

exportaciones de productos alimentarios; que países exigen este análisis a los que

Chile exporta, y si realmente es importante implementar Campylobacter spp.

Desarrollar un programa con el proveedor con el fin de disminuir el costo del

análisis.

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10. REFERENCIAS

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