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Estudio de los niveles de ácido araquidónico en glicerofosfolípidos de monocitos humanos mediante espectrometría de masas

David Balgoma Hernando

Instituto de Biología y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Universidad de Valladolid, 47003 Valladolid, España

December 15, 2009

El sistema inmune de un organismo tiene la capacidad de reconocer y diferenciar entre lo propio y lo extraño. El fin último de esta capacidad es la defensa frente a infecciones y la proliferación de células tumorales. La especialización celular no sólo ha sido descrita en los organismos multicelulares sino que también ha sido descrita en colonias de organismos eucariotas unicelulares [1]. El sistema inmune utiliza dos estrategias: por una parte está la inmunidad innata, que constituye una estrategia genérica en la defensa del organismo a través de la inflamación y, por otra, la inmunidad adaptativa, que utiliza la especialización celular, incluyendo memoria del patógeno. En los seres humanos, los monocitos son un tipo celular fundamental en las dos estrategias inmunes. Dentro de la actividad biológica de los monocitos, los eicosanoides ejercen un papel central sobre la modulación del proceso inflamatorio. En su producción en la célula inflamatoria, un factor fundamental es la cantidad de ácido araquidónico libre, por lo que la cantidad libre de este ácido graso en estas células está altamente regulada a través de su continua movilización entre glicerolípidos, de modo que se llega a detectar en las células inflamatorias más de veinte especies diferentes con ácido araquidónico. Al ser la regulación de los niveles del ácido araquidónico un proceso complejo, su estudio en profundidad requiere aproximaciones experimentales con capacidad suficiente para evaluar en una misma muestra una gran cantidad de compuestos. En base a estos antecedentes y con el fin último de contribuir a la elucidación de las especies y los mecanismos encargados de la movilización del ácido araquidónico en monocitos humanos, los objetivos últimos del trabajo que describe esta memoria fueron: (a) caracterizar las especies de glicerofosfolípidos que incorporan ácido araquidónico en monocitos humanos de sangre periférica, y (b) estudiar la movilización del ácido araquidónico de glicerofosfolípidos cuando los monocitos son estimulados por agentes fisiopatológicos. (La notación abreviada para representar los diferentes lípidos estudiados fue tomada de la última recomendación propuesta por el International Lipid Classification and Nomenclature Committee (ILCNC) [2]).

1. INTRODUCCION

1.1. Monocitos de sangre periférica e inmunidad - La inmunidad innata constituye la primera línea de defensa contra los microorganismos. Comprende una serie de moléculas solubles, como las opsoninas, con capacidad antimicrobiana, y un conjunto de células especializadas con capacidad de fagocitar y destruir partículas patógenas. Además, estas células tienen la función de retirar compuestos tóxicos producidos por el metabolismo, de producir mediadores inflamatorios capaces de matar bacterias, parásitos o virus, y de activar otros tipos celulares implicados en procesos de control de parásitos. Los monocitos son un tipo celular y están involucrados en los procesos inflamatorios, de modo que ligan inflamación y la defensa innata ante patógenos con la respuesta inmune adaptativa.

1.1.1. Origen y destino de los monocitos – Los monocitos se originan en la médula ósea a partir de las células madre hematopoyéticas a través de varios estadios en los que pierden la capacidad de proliferar. A continuación se liberan a la sangre, donde permanecen entre uno y tres días, constituyendo en los seres humanos el 10% de los leucocitos. Desde la

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sangre migran a los tejidos, donde se diferencian dando lugar a diversos tipos de macrófagos (dependiendo del tejido de que se trate) o a células dendríticas, constituyendo en su conjunto parte del sistema fagocítico mononuclear [3].

1.1.2. Características de los monocitos – Poseen una morfología celular irregular, vesículas citoplasmáticas, un núcleo con forma de riñón y un alto ratio entre citoplasma y núcleo [4]. Gracias a diversos receptores, reconocen no sólo microorganismos, sino también lípidos y células en procesos de muerte. Cuando son estimulados generan especies reactivas de oxígeno (ROS) y moléculas involucradas en la defensa contra patógenos tales como prostaglandinas y citoquinas [5]. Sin embargo, más allá de estas características comunes, se ha descrito que los monocitos humanos están divididos en tres subpoblaciones según la expresión en superficie de CD14 y CD16: una mayoritaria y “clásica” CD14+/CD16-, otra CD14+/CD16+ y otra CD14dism/CD16+ [6]. Además, cada subpoblación responde de manera diferente ante un proceso infeccioso [7, 8]. La caracterización de subpoblaciones en los monocitos también ha sido descrita en otras especies de mamíferos, tales como ratas o cerdos [9].

1.1.3. Los monocitos y enfermedades asociadas – Como se ha descrito, al ser la inflamación asociada a la inmunidad innata un proceso agresivo, puede llevar al desarrollo de enfermedades en las que los tejidos resultan dañados. Un proceso inflamatorio persistente puede conducir al desarrollo de enfermedades, tales como la artritis y la aterosclerosis, que constituyen causas de alta morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. Debido al papel que juegan los monocitos en los procesos inflamatorios, están involucrados en las enfermedades asociadas a ellos [10-13], por lo que han sido considerados como dianas en el tratamiento de cierto tipos de cáncer [14]. También se ha descrito que la producción y liberación de eicosanoides, compuestos asociados al metabolismo del ácido araquidónico, juegan un papel fundamental en las enfermedades asociadas a lainflamación [15, 16].

1.1.4. Modelos para el estudio de los monocitos – El aislamiento de monocitos humanos de sangre periférica se ha llevado a cabo de diferentes maneras, entre las que cabe destacar el uso de gradientes en centrifugación con posterior adhesión a una superficie [17, 18] y el uso de cuentas magnéticas asociadas a anticuerpos monoclonales [19]; pudiendo conservarse después del aislamiento mediante congelación [20]. Por otra parte, diversas líneas celulares en cultivo se han utilizado como modelo de monocitos, entre las que se encuentran las denominadas U937, MONO MAC-6, HL60 y THP1. Estas líneas pueden madurar y diferenciarse en respuesta a diferentes estímulos tales como ésteres de forbol, DMSO, vitamina D3, interferón gamma, factor de necrosis tumoral y ácido retinoico [21-25], de modo que adoptan características y morfología de células maduras [26-28]. Es debido a estas características por lo que se han utilizado como modelos de monocitos en cultivo, para el estudio de la diferenciación monocito/macrófago y en estudios sobre el cáncer.

1.2. El ácido araquidónico y la inflamación - A pesar de haber sido considerados tradicionalmente como una simple barrera y posteriormetne como reserva de energía, desde hace tiempo los lípidos han sido asociados como reguladores de multitud de procesos tanto fisiológicos como fisiopatológicos [16, 29-31]. En concreto, los eicosanoides producidos por las células del sistema inmune participan en la inflamación [32] y, por ende, en multitud de enfermedades asociadas a ella, tales como la artritis reumatoide, el asma, alergias, sepsis, aterosclerosis, la enfermedad de Alzheimer, el cáncer y diversos procesos vasculares [33-35]. La presencia de eicosanoides en los tejidos es importante dada su influencia en la activación, migración y diferenciación de las células del sistema inmune. En cuanto a la regulación de su producción, es bien conocido que un factor importante en la síntesis de eicosanoides es la disponibilidad de ácido araquidónico (ácido cis-5,8,11,14-eicosatetraenoico, 20:4(n-6)) libre. De este modo, debido a que tanto el ácido araquidónico como sus metabolitos están involucrados en numerosas funciones celulares, la movilización del ácido araquidónico es un punto de regulación clave en diversos procesos, incluida la inflamación. En este caso, mientras que

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el ácido araquidónico y sus metabolitos son considerados como protectores en caso de enfermedad, pueden llegar a ser tóxicos cuando se producen en cantidad excesiva. Además, otro tipo de compuestos que también están involucrados en procesos de señalización y que tienen una relación estructural con el ácido araquidónico, son los endocannabinoides (v. infra).

1.2.1. Origen del ácido araquidónico en los seres humanos – El metabolismo del ácido araquidónico de las células responsables de los procesos inflamatorios está condicionado, en gran parte, por la concentración de ácido araquidónico a la que son expuestas. Por consiguiente, en el caso de los monocitos de sangre periférica, de la concentración de éste en la sangre. En mamíferos, han sido descritas dos fuentes primarias de ácido araquidónico [36]. En la primera de ellas, su generación tiene lugar por transformación de un ácido graso esencial, el ácido linoleico, 18:2(n-6), que es absorbido de la dieta a través del intestino [37]. En esta transformación están involucradas una enzima desaturasa ∆6, una elongasa y una enzima desaturasa ∆5, de modo que en esta ruta biosintética también se forman además del ácido araquidónico, otros ácidos grasos poliinsaturados [38]. La síntesis de ácido araquidónico a partir de linoleico ocurre principalmente en el hígado, aunque también puede producirse en otros tejidos. Desde el hígado, el ácido araquidónico es liberado al torrente sanguíneo, quedando así accesible a las células de la sangre periférica (entre ellos los monocitos) y los tejidos.

La otra fuente de ácido araquidónico es su asimilación directa de la dieta, de la carne de ave, huevos y pescado. En los seres humanos, la mayor parte del ácido araquidónico proviene por transformación del ácido linoleico ingerido (10-20 g/día), frente a la ingesta indirecta de ácido araquidónico (alrededor de 0.25 g/día), de manera que, grosso modo, se estima que el contenido de ácido araquidónico en un ser humano de 70 kg está entre 50 g y 100 g [36].

1.2.2. Localización del ácido araquidónico en el cuerpo y el sistema inmune – El ácido araquidónico no se encuentra distribuido uniformemente entre los tejidos. De ello se encargan una serie de mecanismos basados en reacciones específicas de acilación, la asociación a lipoproteínas y la regulación de la producción a partir del ácido linoleico. Desde el hígado, el ácido araquidónico se incorpora a la sangre esterificado en los lípidos de diversas lipoproteínas (VLDL, HDL, LDL) o como 1-liso-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, lisoglicerofosfolípido que se asocia a albúmina [36, 39] y es producido por la acción de una enzima PLA1. El significado de este último mecanismo sería el transporte de ácido araquidónico a tejidos a los que las lipoproteínas tienen un difícil acceso y sin la necesidad de que éste esté libre en el torrente sanguíneo. Tomando tanto la forma libre como la asociada, la concentración de ácido araquidónico en el suero humano está alrededor de 0,5 mM, representando un entre un 10 y un 11% de los ácidos grasos en los glicerofosfolípidos del plasma, mientras que en el hígado constituye un 13% de los mismos [40]. Independientemente de su origen, cuando el ácido araquidónico se incorpora a las células asociadas a los procesos inflamatorios, se produce su movilización entre los diferentes depósitos de glicerolípidos. A fin de conseguir un control sobre la cantidad de ácido araquidónico libre en la célula, éste se encuentra en continuo tráfico entre diferentes glicerofosfolípidos, que llegan a ser más de veinte especies diferentes [41, 42].

Dentro de las células del sistema inflamatorio, el ácido araquidónico principalmente se encuentra esterificado en la posición sn-2 de una gran variedad de glicerofosfolípidos que pueden tener, a su vez, en la posición sn-1 unida una cadena hidrofóbica con enlace éster, éter o viniléter, y en la cabeza polar diferentes grupos, tales como colina, etanolamina o inositol (Figura 1. 2). Debido a que su disponibilidad es un punto clave en la producción de eicosanoides y a que su forma libre o la modificación de su metabolismo puede inducir apoptosis [43-45], los niveles de ácido araquidónico libre están regulados en un ciclo de desacilación/reacilación de y hacia los glicerofosfolípidos de membrana, el llamado ciclo de Lands (Figura 1. 3) [46]. De modo general, un ácido graso de un glicerofosfolípido es liberado de la posición sn-2 del esqueleto de glicerol por una PLA2. En este proceso también se produce un lisoglicerofosfolípido, que actúa a su vez como aceptor de un resto de ácido araquidónico por la acción de

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aciltransferasas [47, 48]. A continuación se describe el esquema general de la movilización del ácido araquidónico en glicerofosfolípidos en las células asociadas a procesos inflamatorios.

1.2.3. Incorporación del ácido araquidónico en glicerofosfolípidos – La incorporación del ácido araquidónico libre en glicerofosfolípidos se ha descrito mediante dos rutas modelo, dependiendo de la cantidad de ácido araquidónico libre en la célula. La primera de ellas es una ruta de alta afinidad/baja capacidad que siempre está activa y que está asociada a una concentración baja de ácido araquidónico y, por consiguiente, está relacionada con el estado basal de las células inflamatorias, en el que la reacilación predomina sobre la liberación de este ácido graso. En esta ruta, el ácido araquidónico libre se une a coenzima A (CoA) por la acción de una acil-CoA sintetasa de ácido graso de cadena larga (especialmente la ACSL4, que muestra preferencia por ácido araquidónico [49, 50]), e incorporado principalmente a glicerofosfolípidos de colina por una aciltransferasa dependiente de CoA (LPCAT) [51]. Por consiguiente, esta ruta de incorporación del ácido araquidónico depende de manera crítica de la disponibilidad de lisoglicerofosfolípidos de colina, aceptores producidos por la actividad de la iPLA2 [52, 53]. Una vez que el ácido araquidónico se ha incorporado en PC, en un proceso llamado remodelación, es transferido a lisoglicerofosfolípidos de etanolamina en una reacción catalizada por la transacilasa independiente de CoA (CoA-IT) [22] (Figura 1. 4). En consecuencia, dos aceptores de lisoglicerofosfolípidos deben estar presentes para la incorporación del ácido araquidónico por esta vía. El proceso de remodelación del ácido araquidónico sucede a una velocidad relativamente lenta y constante en las células en el estado basal.

La segunda ruta es de baja afinidad/alta capacidad y está asociada a una concentración alta de ácido araquidónico. En esta vía de incorporación, una primera molécula de ácido araquidónico es transferida desde CoA a la posición sn-1 del glicerofosfato por una glicerol-3-fosfato acil transferasa para, a continuación, ser transferida una segunda molécula de ácido araquidónico desde CoA a este intermediario por una 1-acil-2-liso-sn-glicerol-3-fosfato acil transferasa y producir 1,2-diaraquidonoilsn-glicero-3-fosfato. Seguidamente, una fosfatidato fosfohidrolasa (PAP) produce 1,2- diaraquidonoilglicerol, molécula que puede tener dos destinos: por una parte sufrir la acción de una fosfocolina transferasa y producir 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina o, por otra parte, someterse a la acción de una diacilglicerol acil transferasa para producir una especie de triacilglicerol con dos araquidonoílos (Figura 1. 5). La aparición de estas especies es indicativa de la incorporación del ácido araquidónico por la vía de baja afinidad/alta capacidad [42], aunque, debido a que es la vía de síntesis de novo de glicerofosfolípidos, pueden estar presentes otras especies con un solo araquidonoílo. Además, aunque la cantidad de ácido araquidónico libre sea alta, incluso en condiciones de estimulación sólo una pequeña parte es transformada en eicosanoides y la mayor parte del ácido araquidónico es reincorporado por las dos vías.

1.2.4. Liberación del ácido araquidónico de los glicerofosfolípidos – En total, se han descrito unos 15 genes que codifican PLA2 implicadas en la liberación mediante hidrólisis del enlace éster de ácidos grasos en la posición sn-2 de los glicerofosfolípidos [54, 55]. Según sus características bioquímicas, se han dividido en tres grupos: independiente de calcio (iPLA2), citosólica (cPLA2) y secretada (sPLA2). Por una parte se encuentra la fosfolipasa iPLA2, que está siempre activa, tanto en la célula basal como en el estado activado. La iPLA2 no parece tener preferencia ni por el tipo de glicerofosfolípido ni por el ácido graso de la posición sn-2. Las iPLA2 son miembros de la familia del GVI de las PLA2, siendo la mejor caracterizada la GVIA iPLA2. Las formas de splicing activas contienen siete u ocho repeticiones de anquirina, una región de unión y un dominio catalítico [56] que utiliza una serina catalítica para la hidrólisis de los grupos éster de la posición sn-2 de los glicerofosfolípidos. Además, poseen actividad lisofosfolipasa y transacilasa [53]. La función, la regulación y la condición de mantenimiento del funcionamiento de la célula (housekeeping) de la iPLA2 son complejas y han sido ampliamente discutidas [57], pudiendo depender su carácter del tipo celular [58, 59]. En concreto, en monocitosse ha asociado a la quimiotaxis por mediación de los

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lisoglicerofosfolípidos que produce [60]. Sin embargo, cuando la célula está estimulada, la liberación del ácido araquidónico no sólo se produce por la actividad de la iPLA2, sino también por la activación de la cPLA2. En este caso, cuando la célula está activada, la mayor parte del ácido araquidónico es liberado principalmente de la posición sn-2 de los plasmanilos (enlace éter en la posición sn-1) de glicerofosfolípidos de colina y de los plasmenilos (enlace viniléter en la posición sn-1) de glicerofosfolípidos de etanolamina en mastocitos y neutrófilos [61, 62]. La activación de esta enzima se produce por fosforilación en los restos de serinas 505, 727 y 515 por enzimas MAPK [63-65]. Además, el calcio regula esta enzima mediante unión al dominio C2, induciendo la translocación al Golgi, al retículo endoplasmático y a la envoltura nuclear [66] para hacer que sea accesible a sus substratos. A pesar de la importancia de la regulación postraducción, la cPLA2 también está sujeta a regulación transcripcional en respuesta a citoquinas y factores de crecimiento.

Las sPLA2 fueron las primeras fosfolipasas A2 descubiertas. Su participación en la liberación de ácido araquidónico ha sido estudiada ampliamente [58, 67]. Estas enzimas tienen un bajo peso molecular (de 13 a 15 kDa) y poseen una histidina en el sitio catalítico y uniones disulfuro. Se ha descrito una relación entre la sPLA2 y la cPLA2 en macrófagos diferenciados de células U937, según la cual es necesario el inicio de la liberación del ácido araquidónico por parte de la cPLA2 y la transformación de éste en ácido hidroperoxieicosatetraenoico para que la sPLA2 libere ácido araquidónico [68, 69]. Sin embargo, los inihibidores de la sPLA2 no ha mostrado efectos terapéuticos en ensayos clínicos frente a artritis y a alérgenos [56].

1.2.5. Movilización del ácido araquidónico durante la estimulación – Como se acaba de exponer, en el estado basal la cantidad de ácido araquidónico libre en las células es proporcionado únicamente por la actividad iPLA2, pero esto no quiere decir necesariamente ni que su cantidad sea baja ni que la reincorporación de ácido araquidónico en el estado basal se produzca sólo por la vía de alta afinidad/baja capacidad. No obstante, puede considerarse que hay una asociación, aunque no rígida, entre el estado basal y la incorporación de ácido araquidónico sólo por esta vía, ya que la cantidad de ácido araquidónico libre es, en principio, baja (3 pmol por millón de células [42]). Análogamente, en el estado estimulado, cuando la cPLA2 está activa, la cantidad de ácido araquidónico libre es alta y gran parte del ácido araquidónico liberado desde glicerofosfolípidos acaba en triacilglicerol [42]. Esta movilización hacia triacilglicerol conlleva la aparición de cuerpos lipídicos y una disminución de la densidad celular, fenotipo que se ha asociado a diversas enfermedades inflamatorias, tales como el asma o el síndrome de distrés respiratorio [70]. Además, la activación celular conlleva un incremento no sólo de la capacidad celular de liberar e incorporar el ácido araquidónico en glicerofosfolípidos [71], sino también del movimiento de ácido araquidónico entre glicerofosfolípidos, acelerándose la remodelación hacia glicerofosfolípidos de etanolamina por parte de la CoA-IT [71-74]. En cuanto a los substratos, la disponibilidad de LPC y LPE es fundamental en el incremento de la incorporación y remodelación en células activadas. Con el objetivo de interpretar el sentido de esta maquinaria celular, se ha sugerido que el aumento de la actividad de la CoA-IT está asociado a la producción del factor activador de plaquetas (PAF, 1-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina, donde alquil representa hexadecil u octadecil). De este modo, al transferirse el ácido araquidónico de la posición sn-2 de los glicerofosfolípidos de colina a glicerofosfolípidos de etanolamina, se estaría produciendo 1-alquil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina, precursor de PAF por acetilación [75]. La importancia de esta enzima en la incorporación del ácido araquidónico en depósitos desde los que es liberado se ha puesto de manifiesto en que al ser inhibida en leucocitos estimulados, tanto la liberación de ácido araquidónico como la producción de leucotrienos se ven bloqueadas [76]. En consecuencia, la producción de eicosanoides y PAF está regulada fuertemente tanto por la acilación y transferencia del ácido araquidónico en depósitos específicos por aciltransferasas y transacilasas como por la liberación desde estos depósitos por las PLA2. Esta dinámica de movilización del ácido araquidónico ha sido descrita, dentro de las células asociadas al proceso inflamatorio, principalmente en macrófagos y neutrófilos. En éstos, las fuentes de ácido araquidónico desde glicerofosfolípidos para la producción de leucotrienos son, principalmente, los

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que tienen un enlace éter en la posición sn-1 [77]. Sin embargo, tomando en su conjunto los estudios realizados sobre este aspecto, se apunta a que la movilización de ácido araquidónico tiene especificidades para cada tipo de célula involucrada en la inflamación dentro del patrón general que se acaba de describir.

1.2.6. Eicosanoides – El término eicosanoides hace referencia a un grupo de ácidos grasos biológicamente activos de manera tanto autocrina como paracrina [78-80] y cuyo denominador estructural común es que contienen grupos funcionales oxigenados y poseen veinte átomos de carbono. Como se ha expuesto anteriormente, el ácido araquidónico es el principal precursor de estos compuestos, aunque también se pueden sintetizar a partir de los ácidos eicosapentaenoico y dihomo-³ -linolénico [36]. La producción de estos compuestos tiene lugar a través de tres rutas, a saber, la de la ciclooxigenasa, la de la lipoxigenasa y la de las epoxigenasas del citocromo P-450. Los prostanoides (prostaglandinas más el tromboxano A2) se forman por la vía de la ciclooxigenasa en la superficie del retículo endoplásmico. Actúan como hormonas locales cerca del sitio donde son sintetizados dado que son inactivados rápidamente en la circulación [81]. Sus funciones son variadas, como, a modo de ejemplo, la coordinación de la arginina vasopresina por parte de la PGE2 o la promoción de la adhesión y agregación de las plaquetas en circulación al subendotelio por parte del TXA2.

Los hidroxi e hidroperoxieicosanoides junto con los leucotrienos se forman por la vía de la lipoxigenasa. Estas enzimas catalizan la inserción de oxígeno en ácidos grasos poliinsaturados [82]. A modo de ejemplo, entre sus funciones se encuentra la constricción del músculo liso del tracto respiratorio por parte de LTC4, LTD4 y LTE4. También han sido relacionados con procesos asmáticos [83]. Por la vía de la epoxigenasa, un sólo átomo de oxígeno es introducido en el ácido araquidónico por monooxigenasas del citocromo P450 [84]. Entre las funciones de este grupo de eicosanoides se encuentra la inhibición de la actividad ciclooxigenasa, y, además, están involucrados en la homeostasis vascular [85].

Para la fabricación de eicosanoides por parte de las células inflamatorias de la sangre, éstas no sólo tienen accesibles los depósitos de ácido araquidónico internos, sino también el ácido araquidónico asociado, especialmente a albúmina [36]. Por consiguiente, se puede distinguir de manera general entre depósitos internos y externos y, dentro de ellos, las diferentes substancias que contienen unidades estructurales de ácido araquidónico. Por otra parte, dentro de célula podría haber distinta distribución del ácido araquidónico, dependiendo del compartimento celular. Además, se ha descrito que los distintos tipos de eicosanoides se sintetizan a partir de distintos depósitos. Así, en un estudio en eritrocitos en plasma estimulados mediante colágeno, se ha encontrado que el compuesto 12-HETE tuvo su origen en el ácido araquidónico exógeno, mientras que para la generación del TXB2 se utilizó el depósito interno [86]. Debido a la complejidad del metabolismo del ácido araquidónico dentro de la célula inflamatoria, se ha planteado que la producción de cada tipo de eicosanoide podría depender también del depósito intracelular de origen [42]. Sin embargo, precisamente debido a esa complejidad y al continuo tráfico que sufre el ácido araquidónico dentro de la célula inflamatoria, los resultados de estos estudios, que precisan de marcado isotópico, no son de fácil interpretación. A modo de ejemplo, en mastocitos se ha encontrado que el ácido araquidónico libre en el sobrenadante está relacionado con los niveles de 1-(1Z-alquenil)- 2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, mientras que la producción de leucotrienos lo está con los de glicerofosfocolina y glicerofosfoinositol [87].

1.2.7. Endocannabinoides – Los endocannabinoides son un grupo de lípidos cuya función es la modulación del funcionamiento del sistema nervioso [88, 89], especialmente por estar involucrados en los mecanismos del dolor [90]. Estos compuestos reciben este nombre porque se unen a los receptores de los cannabinoides, ya que se descubrieron antes estos ligandos que los endógenos. Contienen en su estructura una unidad de ácido araquidónico, de modo que se han identificado la araquidonoiletanolamida (anandamida), el 2-araquidonoilglicerol, el éter de 2-araquidonoilgliceriléter (éter de noladina), la O-araquidonoiletanolamina (viodramina) y la N-araquidonoildopamina [91]. Además, esta familia de substancias se ha relacionado con el proceso inflamatorio y con varias enfermedades

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[92]. En cuanto a los monocitos, se ha descrito la presencia de receptores de los cannabinoides y los endocannabinoides [93].

1.3. Análisos de lípidos: del marcaje radiactivo a la lipidómica

La primera función reconocida de los lípidos fue la formación de membranas por parte de los glicerofosfolípidos. Esta membrana proporciona estructura tanto a las células en su conjunto como a sus orgánulos, creando el medio idóneo para que la maquinaria celular funcione. Otra de las funciones de los lípidos es ser fuente de energía en tanto en cuanto los triglicéridos constituyen los mayores almacenes de energía en células mamíferas. Además, como se ha expuesto anteriormente, toman parte tanto en la señalización autocrina como paracrina. Clásicamente se han definido como substancias insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos, lo que hace a esta familia de compuestos lo suficientemente amplia y compleja como para que los métodos que se ocupan de su análisis también lo sean. En concreto, los glicerofosfolípidos constituyen el 60% de la masa lipídica de la membrana de la célula eucariota, por lo que pequeños cambios en la composición de estos compuestos puede conllevar grandes cambios en las propiedades de ésta. La estructura de los lípidos va íntimamente unida a las funciones que realizan, siendo, en el caso de los glicerofosfolípidos, el carácter anfipático el motivo que da lugar a la organización en las bicapas que constituyen las membranas celulares.

Los estudios clásicos de los lípidos en general, y de los glicerofosfolípidos en particular, se han llevado a cabo mediante el uso de radioisótopos, especialmente del ácido araquidónico tritiado. Estos estudios han permitido estudiar el tráfico del ácido araquidónico entre las distintas clases de glicerolípidos (PE, PC, PI, DG…) [94]. Sin embargo, la combinación del marcado radiactivo con la separación de los lípidos mediante cromatografía en capa fina (TLC) no permite determinar las especies dentro de cada clase de glicerolípido que participa en la incorporación o cesión de moléculas de ácido araquidónico. Sólo mediante un laborioso proceso de separación que conlleva la recogida de fracciones de la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y la posterior cuantificación mediante conteo de centelleo, se conseguía la identificación de las otras cadenas laterales que acompañaban al ácido araquidónico en las especies de glicerofosfolípidos [41, 95]. Este proceso, junto con la necesidad de marcado, limita el análisis, pudiendo ser fuente de errores de método.

El avance técnico que supone la posibilidad del análisis simultáneo de múltiples metabolitos mediante el acoplamiento de la cromatografía de líquidos a la espectrometría de masas y los nuevos analizadores de esta técnica han permitido no sólo un salto cuantitativo en la identificación de metabolitos, sino también cualitativo, emergiendo nuevos campos, como la metabolómica [96-99] y, dentro de ella, la lipidómica (v. infra). La metabolómica se ha definido como la cuantificación total de compuestos moleculares de baja masa molecular (metabolitos) presentes en una célula u organismo, y que participan en reacciones metabólicas requeridas para su crecimiento, mantenimiento y funcionamiento normal [100]. Por consiguiente, utiliza de manera integrada nuevas herramientas técnicas y estadísticas para caracterizar el estado metabólico de la célula y/u organismo. En este sentido, viene a ser la tercera “ómica”, que junto con la genómica y proteómica completa la descripción molecular de las muestras biológicas. Además, se ha propuesto un concepto relacionado, la metabonómica [101], en la que el énfasis estaría en las variaciones dinámicas del metaboloma dentro de una célula u organismo. La importancia de este concepto radicaría en el uso y cantidad de un fármaco en relación al estado metabólico del paciente [102]. La diferencia entre metabolómica y metabonómica es más filosófica que técnica, por lo que muchos autores sólo usan la denominación metabolómica. Además, es importante tener en cuenta que pequeñas variaciones en las condiciones de la muestra biológica de origen pueden tener variaciones de varios órdenes de magnitud en los metabolitos en cuestión de segundos, emergiendo como marcadores analíticos de

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esos cambios. Dentro de la metabolómica, la resonancia magnética nuclear ha sido utilizada para la caracterización de marcadores metabólicos en pacientes, habiéndose descrito los compuestos de colina como marcadores en cáncer de próstata [103].

A pesar de la gran complejidad de la genómica y la proteómica, lidian con secuencias de cuatro nucleótidos y veinte aminoácidos, respectivamente. Sin embargo, el metaboloma está integrado por gran cantidad de compuestos con grandes diferencias estructurales y, por ende, fisicoquímicas. Esto hace que no sea posible una única estrategia de separación e identificación del metaboloma, al contrario que en las otras ómicas. Por consiguiente, son necesarias estrategias para el análisis de diferentes subgrupos dentro del metaboloma, emergiendo la lipidómica como parte de la metabolómica [104-106]. Esta disciplina se ha definido como la caracterización de los lípidos y sus papeles biológicos respecto a la expresión de proteínas involucradas en el metabolismo, incluyendo la regulación génica [107, 108]. Dentro de las diferentes técnicas integradas en la lipidómica, la espectrometría de masas con ionización por electrospray proporciona la selectividad y sensibilidad necesaria para el análisis de lípidos y, en concreto, los glicerofosfolípidos, ya se introduzca la muestra mediante infusión directa y rastreo de los iones precursores, ya previa separación de la misma mediante cromatografía de líquidos. Además, se ha propuesto el término metabolipidómica como análogo a la metabonómica en el estudio de los lípidos [109].

1.3.1. La espectrometría de masas y el análisis de lípidos – La espectrometría de masas se caracteriza por ser una técnica capaz de separar los analitos según su relación m/z, cuando éstos están cargados eléctricamente, ya sea naturalmente o al estar situados en un campo eléctrico. Por consiguiente, la ionización de las moléculas que se quiera analizar es un punto clave en esta técnica. El desarrollo de nuevos métodos de ionización para el análisis mediante espectrometría de masas [110] ha hecho que esta técnica sea el último avance del análisis de los metabolitos en general, y de los glicerofosfolípidos en particular. Diversos han sido los aspectos que se

han abordado en el desarrollo de la técnica, aunque puede considerarse que un espectrómetro de masas se caracteriza, principalmente, por el tipo de ionización que emplea para que los analitos adquieran carga (fuente de ionización) y por el proceso que utiliza para separar esos iones (analizador). Debido a que las moléculas adquieren energía en el proceso de adquisición de carga, pueden fragmentarse, por lo que las fuentes de ionización se han clasificado según el grado de fragmentación que producen en los analitos. La ionización fuerte, como el impacto electrónico, proporciona una gran cantidad de energía interna a la muestra de modo que las moléculas se rompen en numerosos fragmentos. La ionización por impacto electrónico necesita que los analitos estén en fase gaseosa, y los glicerofosfolípidos no son volátiles, por lo que la derivatización de la muestra se hace necesaria. La ionización suave, a su vez, comunica menos energía y produce menos fragmentaciones en las moléculas ionizadas. La muestra se introduce en una matriz (sólida o líquida) que absorbe parte de la energía de ionización de modo que las moléculas no se fragmentan en un alto grado. Debido a que la volatilización de la muestra no es necesaria, la ionización suave ha sido ampliamente utilizada en la detección de glicerofosfolípidos. Dentro de los métodos suaves, se encuentran el bombardeo con átomos rápidos (FAB), la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI), la ionización mediante electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI).

a) FAB fue la modalidad pionera en la ionización suave de glicerofosfolípidos. Un haz de átomos es conducido hacia la muestra y la energía es transferida a los analitos. A pesar de producir fragmentación parcialmente, los primeros estudios

sobre glicerofosfolípidos mediante ionización suave se llevaron a cabo con esta técnica [111, 112].

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b) MALDI conlleva la dispersión de la muestra en una matriz con las características adecuadas para que cuando incida un láser, se produzca la volatilización y la adquisición de carga por parte de los analitos. Las ventajas de MALDI son la rapidez tanto en el análisis como en la preparación de la muestra y una buena reproducibilidad. Por contra, sus desventajas son una capacidad de cuantificación limitada, la necesidad de separación previa si la muestra es compleja [113] y que, en concreto para los glicerofosfolípidos, se puede producir su oxidación en las condiciones de ionización de la muestra, provocando posibles interferentes si se quiere estudiar los lípidos oxidados en las células. Por otra parte, una aplicación MALDI especialmente interesante es la formación de imágenes de la distribución de glicerofosfolípidos en muestras celulares mediante detección de los iones por espectrometría de masas [114].

c) ESI y APCI. Estas son las modalidades que mayoritariamente se han acoplado a la cromatografía de líquidos [115]. En estas técnicas, el disolvente en el que está la muestra adquiere carga y, mediante la evaporación de éste, la carga es transferida a los analitos, generalmente como ganancia o pérdida de un protón. El uso de ESI o APCI depende de las características fisicoquímicas del analito en cuestión. ESI consigue la ionización de compuestos de polaridad media y media-alta con relación m/z desde 100 hasta más allá de 10000 unidades, mientras que APCI es apta para compuestos de polaridad media y media-baja con m/z entre 100 y 1000. Debido a que los glicerofosfolípidos poseen una naturaleza anfipática, su análisis se ha llevado a cabo principalmente mediante ESI, aunque también hay estudios mediante APCI [116]. Además, la ionización se puede llevar a cabo tanto en modo positivo como en negativo, proporcionando una variable más a la hora de la optimización de la detección de los analitos. Las ventajas de ESI son que la ionización depende de la concentración en que se encuentren los analitos (no de la cantidad de muestra que se introduzca en la cámara de ionización), una buena relación señal/ruido y su capacidad de acoplamiento a HPLC.

En cuanto a los analizadores de masa, diferentes tipos han sido utilizados en el análisis de glicerofosfolípidos, entre los que cabe mencionar el de tiempo de vuelo (ToF) [117], el triple cuadrupolo [118], la trampa de iones [119], el q-trap [120], el basado en la transformada de Fourier (FTICR) [121] y el orbitrap [122, 123]. Desde la implementación de estas técnicas, el análisis de los lípidos mediante espectrometría de masas ha pasado a ser el último avance de este tipo de análisis. Esto es debido a las características de la ionización de los glicerofosfolípidos, que en último término dependen de su estructura. Dicha estructura comprende un esqueleto de glicerofosfato con una cabeza polar. Las posiciones del glicerol están numeradas de manera estereoespecífica (sn), de tal manera que todos tienen un grupo fosfato en la posición sn-3 del glicerol. La cabeza polar que está unida a ese grupo fosfato los divide en clases, a saber, glicerofosfolípidos de colina, etanolamina, inositol, glicerol, serina y, cuando no hay unido nada, ácido fosfatídico (Figura 1. 2). Mientras que en la posición sn-2 las cadenas laterales están unidas mediante enlace éster, en la posición sn-1 puede haber diferentes tipos de enlaces, a saber, éter vinílico, éter o éster, que describen, respectivamente, las subclases plasmenil, plasmanil y fosfatidil. En la posición sn-2 de los glicerofosfolípidos hay esterificado un ácido graso que preferentemente es insaturado. En conclusión, debido a su estructura, un glicerofosfolípido está perfectamente caracterizado en su clase por la cabeza polar y en su especie por la longitud específica de las cadenas laterales de las posiciones sn-1 y sn-2, teniendo en cuenta la regioisomería (posición relativa de las cadenas laterales en el esqueleto de glicerol) para las subclases fosfatidil. Esta estructura es lo que los hace aptos para el análisis mediante espectrometría de masas, ya que adquieren carga negativa o positiva fácilmente en ESI por el fosfato o la cabeza polar unida a él.

Elucidar esta estructura de grupos funcionales y cadenas hidrocarbonadas es el objetivo de la identificación de las especies de glicerofosfolípidos. Esto se alcanza mediante espectrometría de masas con analizadores que puedan romper las moléculas después de la ionización. Esta fragmentación se lleva a cabo mediante el aislamiento y transmisión de energía a los iones producidos en la cámara de nebulización. En este sentido, el triple cuadrupolo ha sido el analizador más utilizado, aunque la trampa de iones permite un mayor número de etapas de fragmentación (MSn). Cuando los

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glicerofosfolípidos son fragmentados en alguno de estos analizadores, debido a sus características estructurales, producen unos iones específicos [124] que permiten identificar el compuesto. Además, la espectrometría de masas no sólo sirve para identificar, sino también para cuantificar los glicerofosfolípidos de una muestra biológica. A continuación se describen las distintas opciones que se han utilizado para el análisis de glicerofosfolípidos, centrándose en la fragmentación y la cuantificación.

1.3.2. Análisis de glicerofosfolípidos mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo: rastreo de los iones precursores – En esta metodología de análisis, llamada rastreo de los iones precursores, los glicerofosfolípidos de una muestra biológica deben estar disueltos adecuadamente para que la muestra pueda ser introducida directamente en la cámara de nebulización [125]. Dependiendo de la cabeza polar del compuesto y sus cadenas laterales, se producen unos fragmentos en el análisis mediante MS en tándem (o MS2, o MS/MS) con diferente valor de m/z [124, 125]. Una relación entre el tipo de glicerofosfolípido y el fragmento específico (o pérdida neutra) que genera se encuentra resumida en la Tabla 1. 1. De este modo, mediante la introducción de la muestra por infusión directa y el uso de ionización mediante electrospray y analizador de triple cuadrupolo, los analitos pueden ser ionizados, aislados en el primer cuadrupolo, fragmentados en la segunda celda (por disociación espontánea o disociación inducida por colisión, CID) y sus fragmentos específicos, llamados iones hijos, pueden ser aislados en la última celda y enviados al detector (Figura 1. 6) [126-129]. Además, no sólo se puede dejar pasar un ion producto específico, sino que también se pueden coordinar la primera y la tercera celda para detectar los iones que dan lugar a pérdidas neutras específicas. La determinación de estas pérdidas neutras es importante porque el ácido graso de la posición sn-2 se pierde preferentemente en la fragmentación por CID como cetena (pérdida neutra) [124] y para la detección de PS. A modo de ejemplo, si se fija en el último cuadrupolo que sólo pasen m/z 184 y en el primer cuadrupolo se rastrean las diferentes m/z, se puede saber qué compuestos con una m/z determinada (la

seleccionada en el primer cuadrupolo) contienen la unidad estructural de fosfocolina. Tabla 1. 1. Fragmentos específicos generados por los glicerofosfolípidos en la fragmentación dependiendo de la cabeza polar que tienen unida al grupo fosfato

PA [M-H]- m/z 153

PI [M-H]- m/z 241

PIP [M-H]- m/z 321

PIP2 [M-H]- m/z 401

PS [M-H]- NL 87

PE [M-H]- m/z 196

PC [M+H]+ m/z 184

Como se ha descrito anteriormente, los principales glicerofosfolípidos con ácido araquidónico son los de colina (PC), los de inositol (PI) y los de etanolamina (PE). Las especies de PC se ionizan bien en modo positivo proporcionando únicamente el ion correspondiente a la ganancia de un protón, mientras que en modo negativo su ionización depende del disolvente en el que se introduzca la muestra, pudiéndose obtener uno o varios iones. Por el contrario, PE y PI obtienen una mejor señal/ruido por ionización en modo negativo. La ionización de los analitos también puede llevarse a cabo mediante la formación de un aducto con iones presentes en la mezcla de infusión. Debido a la naturaleza zwiteriónica de los PC, el litio ha sido utilizado para su ionización en positivo [130] y el acetato para su ionización en

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modo negativo [131]. Por otra parte, la posición de los dobles enlaces en las cadenas laterales puede ser determinada mediante ozonización de los dobles enlaces [132, 133].

La cuantificación mediante espectrometría de masas se basa en que la intensidad de la señal que se obtiene es proporcional a la concentración del analito en la muestra. En el caso de ESI, la respuesta depende principalmente de la cabeza polar del glicerofosfolípido, pero también se ve afectada tanto por la longitud de las cadenas laterales como por su grado de insaturación, siendo peor la ionización en la fuente de nebulización a mayor longitud de cadena y menor número de insaturaciones. Con el fin de corregir estos factores, se han utilizado para la cuantificación uno o varios patrones internos, tales como glicerofosfolípidos deuterados y glicerofosfolípidos que no se encuentren en la muestra (a modo de ejemplo, ácidos grasos de cadena corta o de número impar de átomos de carbono) [125]. En cualquier caso, hay que tener en cuenta el efecto isotópico entre las especies que aparecen contiguas en el espectro de masas. Este efecto aparece por la contribución de la presencia de isótopos en la composición elemental de la molécula (principalmente contribuye el 13C) y debe ser corregido para evitar que las especies mayoritarias den falsos positivos o interfieran en el análisis de las minoritarias [134]. A pesar de que el efecto de las cadenas laterales es significativo, disminuye con la concentración en la muestra, de modo que deben ser analizadas con concentraciones de analito por debajo de concentración µM [135, 136].

Debido a su rapidez y sencillez, la infusión directa en la cámara de ESI junto con la detección mediante triple cuadrupolo se ha utilizado para el análisis de diferentes muestras, como lípidos endonucleares [137] o el estudio de PC(16:0/16:0) como surfactante pulmonar [138]. Por otra parte, en vez de rastrear un fragmento específico de la cabeza polar, se puede rastrear el fragmento que se debe a un ácido graso y obtener un perfil de éste. Además, mediante el marcado de las cabezas polares de los glicerofosfolípidos con isótopos no radiactivos, se puede analizar simultáneamente tanto una clase natural como la marcada [139]. Mediante esta metodología, la información que se obtiene es que una relación m/z producida en la fuente de ionización proporciona un fragmento específico de la cabeza polar. Por consiguiente, según esa relación m/z y el fragmento de la cabeza polar podemos deducir la suma total de carbonos de las cadenas laterales (v. g. PI(38:4)), pero no su composición específica (v. g. PI(18:0/20:4)), siendo la principal desventaja de esta metodología. También ha de tenerse en cuenta que en la detección por rastreo de los iones padres para ácidos grasos marcados con deuterio puede interferir la presencia en la muestra de ácidos grasos con la misma masa molecular.

1.3.3. Análisis de glicerofosfolípidos mediante cromatografía. Acoplamiento a la espectrometría de masas – Debido a la gran complejidad de los glicerofosfolípidos (hay alrededor de mil especies posibles) y a que, como se ha descrito en el apartado anterior, mediante la infusión directa en espectrometría de masas no se consigue la total caracterización de los grupos de glicerofosfolípidos, surge la necesidad de separar los analitos presentes en la muestra. La técnica analítica de separación por excelencia es la cromatografía, de la que, a continuación, se describen sus diferentes modalidades.

a) Cromatografía en capa fina (TLC). La TLC ha sido utilizada tradicionalmente por su bajo coste y porque permite el análisis de varias muestras en la misma carrera. Gracias a estas características aún hoy es ampliamente utilizada en el análisis de glicerofosfolípidos [140] e incluso como separación previa al análisis mediante HPLC o MS. Sus desventajas radican en que los métodos de detección son destructivos y en que los analitos están expuestos a la atmósfera, de modo que puede haber oxidación en la misma placa cromatográfica. Además, la reproducibilidad y resolución de la TLC respecto a las otras alternativas es menor.

b) Cromatografía de gases (GC). Este tipo de cromatografía analiza compuestos volátiles, por lo que los glicerofosfolípidos no pueden ser analizados directamente. En los métodos de análisis de glicerofosfolípidos mediante esta técnica, los analitos se hidrolizan mediante una fosfolipasa C para producir diacilglicerol y se derivatizan para

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obtener compuestos volátiles que puedan ser analizados. Por consiguiente, la principal desventaja del proceso es la derivatización, que conlleva un laborioso proceso que puede ser fuente de errores.

c) Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Jungalwala et al. Fueron pioneros en 1975 en el análisis de glicerofosfolípidos mediante esta técnica [141]. La cromatografía de líquidos ofrece rapidez, resolución, alta especificidad y alta sensibilidad. Además, a diferencia de la TLC, la muestra no está expuesta a la atmósfera, por lo que se evita la oxidación de los glicerofosfolípidos y los analitos separados se pueden recoger automáticamente en fracciones para su posterior purificación o análisis. En este tipo de separación, los analitos se reparten entre una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida, de modo que se pueden distinguir dos modalidades: en fase normal y en fase inversa. En la modalidad de fase normal (NP-HPLC), la fase móvil es no polar y la fase estacionaria polar, de modo que la separación de glicerofosfolípidos se ha llevado a cabo con fases estacionarias de sílice o sílice modificada (diol, cianopropil o aminopropil). Los glicerofosfolípidos se separan por un mecanismo de adsorción, fundamentalmente según la polaridad de su cabeza polar, de modo que, dado que la fase estacionaria es polar, primero eluyen aquellos con cabeza más apolar y finalmente los que tienen la cabeza más polar. Los eluyentes utilizados para la separación de glicerofosfolípidos mediante NP-HPLC han sido cloroformo, metanol, isopropanol, hexano, etanol, agua y acetonitrilo. Entre los modificantes están el hidróxido de amonio, sales de amonio y el ácido trifluoroacético [142].

En cuanto a la modalidad en fase inversa (RP-HPLC), la fase móvil es más polar que la fase estacionaria. La separación se basa en un mecanismo de reparto entre la fase móvil y la fase estacionaria, que consiste en sílice modificada. En esta modalidad los glicerofosfolípidos se separan fundamentalmente según las características de las cadenas laterales (longitud y dobles enlaces) unidas en las posiciones sn-1 y sn-2 del esqueleto de glicerol. Al ser la fase estacionaria apolar el tiempo de elución será menor a menores cadenas laterales y mayor número de dobles enlaces (dado que los dobles enlaces biológicos poseen isomería cis). Se ha descrito que el cambio del tiempo de retención que supone quitar dos metilenos en las cadenas laterales equivale a añadir un doble enlace, por lo que hay coelución, al menos parcial [143]. La fase estacionaria más utilizada es octadecilsilano (C18) [140] aunque también se han utilizado columnas de octilsilano (C8) [144]. Los detectores tradicionalmente utilizados para registrar la elución de los glicerofosfolípidos separados por la cromatografía de líquidos han sido los de Evaporative Light-Scattering Detector (ELSD), por absorbancia ultravioletavisible y fluorescencia [140]. En los últimos años, como se ha mencionado anteriormente, se han desarrollado métodos de acoplamiento de la cromatografía de líquidos a la espectrometría de masas, que combinan la capacidad deseparación de la cromatografía según las propiedades químicas de los compuestos con la capacidad de separación y detección de la espectrometría de masas. Mediante este acoplamiento, se pueden evitar las interferencias por coelución en RP-HPLC. Los primeros en aplicar el acoplamiento del HPLC a la espectrometría de masas con ionización por ESI fueron Kim et al. en 1994 [145]. A partir de entonces, en esta detección se han usado columnas capilares y multitud de métodos tanto en fase normal como inversa [140]. La principal desventaja del acoplamiento HPLC-ESI es que no todos los disolventes y modificantes de la cromatografía de líquidos son aptos para la ionización mediante electrospray. Por ejemplo, el ácido trifluoroacético, modificante ampliamente utilizado en HPLC, no es apto para ESI por afectar negativamente al proceso de nebulización y transmisión de carga a los analitos. Es por esta razón que, a pesar de haber sido desarrollados multitud de métodos para la separación de glicerofosfolípidos mediante cromatografía de líquidos con detección por ELSD, los eluyentes deben ser adaptados a las necesidades de la ionización en electrospray. Los analizadores de iones más utilizados en análisis de glicerofosfolípidos por espectrometría de masas acoplada a la cromatografía de líquidos han sido el analizador de triple cuadrupolo y la trampa iónica. Como se ha expuesto anteriormente, el triple cuadrupolo permite un ciclo de fragmentación (MS2). Es por esta característica que ha sido utilizado principalmente para la cuantificación mediante Multiple Reaction Monitoring (MRM). Con esta metodología se detectan diferentes transiciones de los iones padres a los iones hijos, que son características de cada tipo de analito. Por otra parte, la trampa de iones se caracteriza por la

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capacidad de confinar los iones en fase gaseosa en un espacio tridimensional y enviarlos al detector de manera ordenada según su relación m/z (Figura 1. 7), de modo que, al tener la trampa una capacidad de almacenamiento de iones determinada, se requiere una separación previa para el análisis de compuestos minoritarios [146]. Además, al igual que en el triple cuadrupolo, los iones que llegan a la trampa iónica se pueden fragmentar mediante disociación inducida por colisión (CID). En la trampa de iones, la fragmentación se produce por transmisión de energía cinética al ion que se pretende fragmentar y, mediante choques con el gas de colisión (He o Ar), aumenta la energía interna, de modo que se produce la fragmentación según la estructura del analito. Además, la trampa de iones otorga la posibilidad de realizar más de un ciclo de aislamiento y fragmentación (MSn), de modo que se puede conseguir una mayor caracterización estructural de los analitos. Sin embargo, el proceso de aislamiento y fragmentación de iones de la trampa de iones es fuertemente dependiente del tiempo, por lo que los métodos descritos han llevado a cabo la cuantificación mediante registro de los iones producidos en la fuente de ionización (MS) y no mediante MRM. Así, el acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas con analizador de trampa iónica se han utilizado para diversos análisis de glicerofosfolípidos [147, 148].

1.3.4. Preparación de la muestra – El análisis de los lípidos conlleva la separación de los analitos que son objeto del análisis de su matriz biológica. Hay dos opciones que han sido ampliamente utilizadas: extracción líquido-líquido y extracción en fase sólida (SPE). La extracción líquido-líquido se lleva a cabo por el reparto de las moléculas entre dos fases líquidas inmiscibles, normalmente un disolvente orgánico hidrofóbico y uno acuoso. Los lípidos se posicionan en la fase apolar, mientras que otros compuestos se sitúan a la fase acuosa (polar). Dependiendo del lípido objetivo se utilizarán unos disolventes u otros. En concreto, los métodos más usados para los glicerofosfolípidos son los métodos de Folch et al. [149] para tejidos completos y Bligh & Dyer [150] para fluidos biológicos. Estos métodos utilizan mezclas de metanol/cloroformo, aunque se han descrito otros métodos que evitan los disolventes halogenados con mezclas de hexano/isopropanol [151] o, más recientemente, con metiltercbutiléter [152].

A pesar de la sencillez de la extracción líquido-líquido, tiene la desventaja de ser un proceso difícilmente automatizable, al contrario que la extracción en fase sólida (SPE). Esta modalidad utiliza una fase estacionaria y una fase líquida entre las que los analitos se reparten con principios y modalidades similares al HPLC: una fase sólida de sílice o sílice modificada que retiene los analitos y un disolvente orgánico que permite eluir específicamente los glicerofosfolípidos de la columna [153]. La principal desventaja de este tipo de extracción es que la fase sólida puede saturarse, perdiéndose parte del analito y, por consiguiente, parte de la señal. Ya se extraiga mediante reparto líquido-líquido ya en fase sólida, los extractos lipídicos se deben conservar al menos a -70 ºC y, si el almacenamiento se produce por un largo intervalo de tiempo, bajo un gas inerte como nitrógeno o argón. Además, un antioxidante como hidroxitolueno butilado (BHT) puede ser añadido a la muestra para prevenir la oxidación [140].

2. DISEÑO EXPERIMENTAL

A pesar de que la espectrometría de masas es una técnica muy sensible, tiene como desventajas una baja reproducibilidad interlaboratorio y que los patrones deben ser caracterizados en cada equipo. Además, como se ha expuesto, la mayoría de las caracterizaciones de los glicerofosfolípidos se han llevado a cabo mediante ionización con FAB y analizador de triple cuadrupolo. Por consiguiente, se hizo necesario un objetivo intermedio que consiste en la caracterización por infusión directa de los diferentes tipos de glicerofosfolípidos en el equipo en el que se iban a realizar las medidas; concretamente, un equipo con ionización mediante electrospray y analizador de trampa iónica. Respecto a este analizador y a la fragmentación de los iones producidos por los glicerofosfolípidos cuando la

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ionización se lleva a cabo en modo negativo, se ha descrito que forma preferentemente iones producto por la pérdida neutra de las cadenas laterales, mientras que en el triple cuadrupolo se forman carboxilatos [154].

Por otra parte, para la caracterización de la incorporación del ácido araquidónico exógeno en monocitos y células U937 mediante espectrometría de masas, el ácido araquidónico deuterado ([2H]AA) era una opción óptima. En consecuencia, para evitar la aparición de iones con la misma relación m/z que los posibles glicerofosfolípidos que hubiesen incorporado ácido araquidónico, se hizo necesaria la separación cromatográfica en fase inversa con fase estacionaria de octadecilsilano, de modo que los glicerofosfolípidos se separasen fundamentalmente por las cadenas laterales. Además, otro objetivo fue el estudio de la influencia de la iPLA2 y la cPLA2 en la incorporación de [2H]AA en las especies específicas que lo contuviesen. Este mismo método sería utilizado para separar los glicerofosfolípidos en los estudios llevados a cabo para determinar aquellos que contienen ácido araquidónico nativo en monocitos, tanto en el estado basal como estimulado. Para la estimulación se tomaron como modelo las partículas de zimosán no opsonizadas.

3. MATERIALES Y METODOS

4. RESULTADOS

5. DISCUSIÓN

5.1. Caracterización de los glicerolípidos por ESI-IT-MS

La caracterización de las diferentes clases de glicerofosfolípidos muestra la adecuación de la espectrometría de masas de trampa iónica con ionización por electrospray con el fin de detectar las diferentes especies de estos compuestos, ya que el analizador de trampa iónica permite tanto la detección como la fragmentación hasta MS3 de los glicerofosfolípidos. La sensibilidad de la combinación de ESI con el analizador de trampa iónica se pone de manifiesto en que cuando al separar mediante HPLC diferentes patrones de glicerofosfolípidos y al analizar el eluyente en el espectrómetro, se consigue un límite de detección de hasta 1 pmol. Los experimentos MSn en la trampa iónica con el fin de caracterizar las distintas clases y especies de glicerofosfolípidos muestran similitudes y diferencias con lo descrito en la bibliografía. En primer lugar, ya que en los procesos de fragmentación se comunica energía al ion, los fragmentos obtenidos tanto en triple cuadrupolo como en trampa iónica tienen la misma m/z [124]. Además, debido a que este proceso de fragmentación se produce con los iones en fase gaseosa a alto vacío, es decir, con una mínima asociación a otras moléculas, se puede asumir que la energía transmitida al ion provoca la producción de iones hijos por ruptura de los grupos funcionales y, por consiguiente, de manera similar entre los diferentes analizadores capaces de fragmentación. Precisamente es debido a que los grupos funcionales son los que caracterizan las especies de cada glicerofosfolípido por lo que tiene lugar la identificación estructural en los experimentos de fragmentación. Sin embargo, como se ha descrito [154], la fragmentación en la trampa iónica comparada con el triple cuadrupolo produce una mayor proporción relativa de pérdida de los ácidos grasos como fragmentos neutros que como fragmentos acilo, ya que se comunica menos energía interna a los iones que en el triple cuadrupolo [124, 154]. Esta diferencia entre el analizador de triple cuadrupolo y el de trampa iónica también se pone de manifiesto en la fragmentación de los glicerofosfolípidos de colina cuando se ioniza en modo negativo: mientras que en la trampa iónica la primera fragmentación sólo proporciona el ion [M-CH3]- por la pérdida de un metilo de la cabeza polar y se hace necesaria una segunda fragmentación para obtener los iones identificativos, en el de triple cuadrupolo se obtienen éstos en el único ciclo de fragmentación del que éste es capaz. Además, la combinación del menor grado de ruptura de los iones en la

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trampa iónica con su capacidad de nuevos ciclos de aislamiento y fragmentación de iones ha hecho posible comparar el espectro MS3 de PE(P-18:0/20:4) con el de PE(P-17:0/20:4) y observar una analogía estructural a través de una analogía de fragmentación.

La regioisomería de las especies fosfatidil de glicerofosfolípidos de colina, etanolamina e inositol también puede ser determinada. Se ha discutido ampliamente sobre la determinación de la regioisomería de estos compuestos a partir de su patrón de fragmentación en la espectrometría de masas. Aunque algunos investigadores han usado la relación entre los carboxilatos [R1CO2]-/[R2CO2]-, este ratio depende de la longitud de la cadena y del grado de insaturación de la cadena en sn-2 y no es estrictamente lineal para los regioisómeros PC(16:0/18:1) y PC(18:1/16:0) [179]. Además, como se ha mostrado para el ácido araquidónico y había sido descrito antes [128], los ácidos grasos poliinsaturados tienden a fragmentarse por descarboxilación y este ratio se vería afectado. Sin embargo, se ha encontrado que, en los glicerofosfolípidos, la pérdida neutra del ácido graso de la posición sn-2 como cetena domina sobre la pérdida del ácido graso de la posición sn-1 en la fragmentación con un analizador de trampa iónica. Esto se debe a que la pérdida de la cadena de sn-2 es más favorable por razones estéricas [173] en un mecanismo de fragmentación dirigido por la carga [180], que es especialmente abundante en los analizadores de trampa iónica comparados con los de triple cuadrupolo [124] (un esquema de este proceso se encuentra en la Figura 5. 1).

5.2. Incorporación del ácido araquidónico en monocitos humanos

El estudio de la incorporación del ácido araquidónico con espectrometría de masas acoplada a cromatografía de líquidos, mediante la adición de [2H]AA en células U937 y monocitos humanos aislados de sangre periférica, ha producido resultados análogos a los descritos anteriormente para otros tipos de líneas celulares en PI, PE y PC [22, 41, 42, 175]. Sin embargo, una nueva especie, identificada como PI(AA/AA), ha sido caracterizada en este trabajo como aceptor de ácido araquidónico exógeno en células U937. Además, esta especie aparece también en los monocitos tanto en estado basal como cuando se trataron con [2H]AA en las mismas condiciones que las células U937, descartando la posibilidad de que esta especie se produzca en células U937 como un artefacto derivado de las características de las líneas celulares en cultivo. Por otra parte, esta especie desaparece en células U937 a partir de 3 h después de un pulso de marcado de manera exponencial, que corresponde a una cinética típica en la que la velocidad de desaparición del compuesto es proporcional a la concentración de dicho compuesto. Esta evolución está descrita por la ecuación diferencial d[PI(AA/AA)]/dt = -K[PI(AA/AA)], cuya integración y ajuste proporciona la ecuación exponencial [PI(AA/AA)]/[PI(AA/AA)]0 = exp(-0,0138·t·min-1) con R2 = 0,99 para la versión lineal. Sin embargo, las especies PI(18:1/AA) y PI(18:0/AA), que habían incorporado ácido araquidónico exógeno, no presentan una disminución exponencial de sus niveles y, dado que sus análogos naturales se encuentran en el estado basal, representan una reserva estable de ácido araquidónico en fosfatidilinositol en células U937. A pesar de que PI(20:4/20:4) está presente en el estado basal de monocitos, se ha encontrado un perfil similar de desaparición cuando se los marcó con [2H]AA, caracterizando a PI(AA/AA) como un aceptor temporal de ácido araquidónico en ambos tipos de células.

Considerando el hecho de que la especie PI(AA/AA) es un aceptor transitorio de ácido araquidónico y teniendo en cuenta la deficiencia en ácido araquidónico de las células en cultivo [181], cobra sentido el que esta especie se detecte en el estado basal de los monocitos, pero no en las células U937 sin añadir ácido araquidónico exógeno, máxime cuando la cantidad de ácido araquidónico a la que los monocitos están expuestos en su origen es alta (la concentración del ácido araquidónico en el suero humano está alrededor de 0,5 mM [36]).

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Dado que la especie PI(AA/AA) no había sido descrita anteriormente como aceptor de ácido araquidónico en células mamíferas, se estudió su presencia en otras líneas celulares, tales como HEK293 y RAW 264.7, al exponerlas a [2H]AA en condiciones análogas a las descritas para U937. Sin embargo, la especie PI([2H]AA/[2H]AA) se encontró bajo el límite de detección de la técnica, lo que indica que, a pesar de ser un aceptor de ácido araquidónico, no es universal. A su vez, cuando se estudia la presencia de la especie PI(AA/AA) en el proceso de diferenciación de monocitos a macrófagos, se observa que la aparición de PI(AA/AA) por incorporación de [2H]AA exógeno en células U937 diferenciadas durante 4 días con DMSO se ve dramáticamente disminuida. Sin embargo, cuando la diferenciación se lleva a cabo durante 24 h con 35 ng mL-1 de PMA, la incorporación del ácido araquidónico en esta especie se ve completamente impedida. Por otra parte, de acuerdo con resultados no publicados del laboratorio, incluso después de 1 h de tratamiento con PMA, se detecta una disminución del 50% de incorporación de [2H]AA en PI([2H]AA/[2H]AA), indicando que en este caso hay tanto un efecto de diferenciación como de activación. Cuando los macrófagos diferenciados de monocitos humanos de sangre periférica se exponen a [2H]AA, la especie PI(AA/AA) sólo se puede detectar a una concentración tan alta como 30 µM, descartándose por ello que sea un aceptor de ácido araquidónico en el estado basal de los macrófagos. En este sentido, la especie PI(AA/AA) puede ser descrita como un glicerofosfolípido marcador de diferenciación entre monocitos y macrófagos. En resumen, cuando los diferentes tipos celulares estudiados se exponen a [2H]AA, la especie PI(AA/AA) sólo está presente en monocitos y células U937.

Además, la aparición de esta especie se ve limitada en células U937 diferenciadas con DMSO o completamente impedida en macrófagos diferenciados de monocitos. Teniendo en cuenta estos dos resultados y que no se detecte esta especie en otras líneas celulares, la línea en cultivo U937 ha resultado a posteriori ser un modelo adecuado para la caracterización de esta especie en monocitos humanos. Sin embargo, difiriendo entre las células primarias y su modelo, cuando los monocitos y las células U937 se exponen durante 30 min a [2H]AA 1 µM, el ácido araquidónico exógeno es detectado en PE en las células U937 pero no en los monocitos. Esta diferencia entre los monocitos y su modelo se debe probablemente a una diferente actividad CoA-IT, ya que ha sido descrito que el proceso de remodelación del ácido araquidónico por transacilación desde PC a PE es mucho más rápido en líneas tumorales que en células primarias [182-184].

De este modo, al igual que se ha descrito en el esquema general de incorporación de ácido araquidónico en células inflamatorias [42], el ácido araquidónico se incorpora en especies de PC para a continuación ser transferido a especies de PE por la actividad CoA-IT. Debido a que esta actividad es mayor en líneas tumorales, el ácido araquidónico exógeno desaparece de PC y aparece en PE antes en la línea celular U937 que en los monocitos, que son células primarias. Así, a 30 min de incorporación de ácido araquidónico exógeno, se detectan menos especies de PC con [2H]AA en células U937 que en monocitos y, a su vez, aparecen especies de PE con [2H]AA en células U937 pero no en monocitos.

Dos posibilidades surgen en cuanto a la ruta de biosíntesis del PI(AA/AA) en los monocitos humanos. La primera vía es una de alta afinidad/baja capacidad mediante un proceso de desacilación/reacilación (ciclo de Lands) que siempre está activo y se asocia a que la cantidad de ácido araquidónico libre en la célula sea baja. La otra vía es de baja

afinidad/alta capacidad por la que el ácido araquidónico se incorpora vía de novo, a través de DG(AA/AA) en PC(AA/AA) y triacilglicerol [42, 185]. De acuerdo con los resultados expuestos, el ácido araquidónico se incorpora vía de novo en células U937 cuando se expusieron a ácido araquidónico 30 µM, mientras que no lo hace cuando la concentración es 1 µM. Por otra parte, la detección de PI(AA/AA) es posible cuando la concentración de ácido araquidónico exógeno es tan baja como 160 nM, es decir, cuando la incorporación de ácido araquidónico vía de novo no se produce, como ha sido descrito previamente [42, 185]. Además, resultados no publicados del laboratorio no muestran incorporación de [3H]AA en triacilglicerol de monocitos cuando éstos se exponen a 1 µM de [3H]AA,

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indicando, de manera coherente con los resultados obtenidos mediante espectrometría de masas, que el ácido araquidónico exógeno no se incorpora por la ruta de baja afinidad/alta capacidad a esa concentración de ácido araquidónico exógeno.

El hecho de que la aparición de esta especie sea inhibida por la bromoenol lactona (BEL), un inhibidor de la iPLA2 [68, 156, 162], refuerza la idea de que PI(AA/AA) se genera en un proceso de desacilación/acilación. BEL es un inhibidor específico de iPLA2 dentro de la familia de las fosfolipasas y no inhibe ni las aciltransferasas dependientes de CoA, ni las transacilasas independientes de CoA ni las sintetasas de araquidonoil-CoA [175]. Además, tampoco afecta a ninguna de las enzimas que conducen a la biosíntesis de PA(AA/AA) en la ruta de novo [186], que es la substancia previa a la generación de PI en esta ruta [176, 187, 188]. Por consiguiente, BEL inhibe la ruta de desacilación/reacilación, pero no la síntesis de novo de esta especie. Por otra parte, la producción de esta especie no es inhibida por la pirrofenona, inhibidor específico de la cPLA2, apuntando a una dependencia específica dentro del proceso de desacilación/reacilación respecto a la iPLA2 dentro de la familia de las fosfolipasas.

BEL también inhibe tanto los niveles de los lisoglicerofosfolípidos de inositol como la incorporación de [2H]AA en PI(16:0/[2H]AA), PI(18:1/[2H]AA) y PI(18:0/[2H]AA). La reducción de la incorporación del ácido araquidónico mediante el bloqueo de esta enzima ha sido descrita anteriormente [166, 175, 189] y el control de los niveles de lisoglicerofosfolípidos es uno de los papeles que tiene atribuidos en células del sistema inmune para glicerofosfolípidos de colina [52, 53, 163, 190]. En este estudio, mediante la aproximación HPLC-ESI-MS se caracteriza el papel de la iPLA2 como generadora de especies de lisofosfatidilinositol, que actúan como aceptores del ácido araquidónico. Sin embargo, no se ha podido observar la especie LPI([2H]AA) cuando las células U937 se expusieron a bajas concentraciones de [2H]AA, por lo que no se ha podido determinar la secuencia de acilación en el proceso de síntesis de PI(AA/AA) a la luz de los resultados obtenidos. Debido a que la iPLA2 posee no sólo actividad fosfolipasa sino también lisofosfolipasa [191], se puede pensar en una desacilación simultánea. A diferencia de los glicerofosfolípidos de colina y etanolamina, los glicerofosfolípidos de inositol no poseen enlaces éter en la posición sn-1 del esqueleto de glicerol, dejando la posibilidad de que la acción de la iPLA2 libere dos ácidos grasos y glicerofosfoinositol, en lugar de un ácido graso y un lisoglicerofosfolípido. De este modo, la acilación directa de las dos posiciones del glicerofosfoinositol podría dar lugar a la especie que se ha descrito como aceptor de ácido araquidónico en monocitos, PI(AA/AA).

5.3. Movilización del ácido araquidónico en glicerofosfolípidos de monocitos de sangre periférica estimulados

Una vez caracterizados los aceptores principales de ácido araquidónico en los monocitos, el siguiente objetivo planteado consistió en la caracterización de los glicerofosfolípidos de colina, etanolamina e inositol que lo contienen en el estado basal de los monocitos aislados de sangre periférica, dado que estas son las clases de glicerofosfolípidos que lo contienen mayoritariamente. En total, se han detectado más de veinte especies con ácido araquidónico, como había sido descrito anteriormente [42].

Dentro de las especies con cabeza polar de colina que lo contienen en monocitos, las mayoritarias son PC(18:0/20:4), PC(18:1/20:4), PC(O-18:1/20:4 y PC(O-16:0/20:4) y, como especie minoritaria característica, se encuentra PC(20:4/20:4). La presencia de esta última especie indica que en el estado basal de los monocitos el ácido araquidónico se incorpora por la ruta de novo (baja afinidad/alta capacidad) [42]. Como ha sido descrito en el apartado anterior, las células en cultivo sufren de falta de ácido araquidónico en comparación con las células primarias, por lo que, incluso después de una noche en cultivo sin suero, los monocitos humanos aislados de sangre periférica poseen suficiente

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cantidad de ácido araquidónico libre como para que se incorpore por la ruta de síntesis de glicerofosfolípidos (vía de novo). Esto también se pone de manifiesto en que cuando se evalúa la incorporación de [2H]AA en células U937, no se detecta la especie PC([2H]AA/[2H]AA), mientras que en monocitos sí se detecta.

En cuanto a las especies de PE con ácido araquidónico, las mayoritarias son dos plasmenilos y una especie diacil: PE(P-18:0/20:4), PE(P-16:0/20:4) y PE(18:0/20:4). Entre las especies minoritarias no cuantificables, la especie PE(P-17:0/20:4) se detecta de manera prevalente en los monocitos aislados en diferentes días y de diferentes donantes. La presencia de esta especie puede explicarse, a pesar de que es sabido que las cadenas hidrocarbonadas con número impar de átomos de carbono no son mayoritarias en los mamíferos, por la incorporación a partir de la dieta, ya que la composición de los plasmalógenos de PE y el metabolismo de ácido araquidónico han sido asociados a la dieta en ratas [192]. Los primeros pasos en la síntesis de glicerofosfolípidos con un enlace viniléter en la posición sn-1 del esqueleto de glicerol tiene lugar en los peroxisomas [193] por la transferencia de un alcohol alifático a la posición sn-1 de acil dihidroxiacetona fosfato. Este alcohol alifático de cadena larga puede provenir directamente de la dieta y/o por la acción de la actividad acil-CoA reductasa sobre el ácido carboxílico de la misma longitud de cadena [194]. En nuestro caso sería la reducción del ácido heptadecanoico, comúnmente conocido como ácido margárico, y cuya aparición en humanos ha sido asociada a la ingesta de productos lácteos [195, 196]. Adicionalmente, la alimentación de ratas con comida mezclada con ácido heptadecanoico provoca en hígado y riñón el aumento de plasmalógenos con cadena 17:0 en la posición sn-1 del glicerol de PE [197], mostrando una relación directa entre la ingesta de ácido heptadecanoico y su aparición en plasmenilos de PE. Por consiguiente, tomando los hechos descritos en la bibliografía, la presencia de la especie PE(P-17:0/20:4) en monocitos humanos aislados de sangre periférica podría estar asociada a la ingesta de productos lácteos.

En cuanto a los glicerofosfolípidos de inositol que contienen ácido araquidónico en el estado basal de los monocitos, éste aparece en más de un 85% en PI(18:0/20:4), resultado que concuerda con estudios anteriores [41]. Como especie minoritaria, se encontró la especie PI(20:4/20:4), que se había caracterizado anteriormente como aceptor de ácido araquidónico mediante la incorporación de [2H]AA en células U937 y monocitos.

La estimulación de los monocitos con zimosán induce cambios en los glicerofosfolípidos con ácido araquidónico. Es importante destacar que la pirrofenona no tiene efecto sobre estos glicerofosfolípidos en el estado basal, pero sí cuando los monocitos fueron estimulados, indicando que, como ha sido descrito en la introducción, la cPLA2 no está activa en células en el estado basal y sí durante la estimulación. En concreto, la suma de todas las especies de PC con ácido araquidónico muestra un descenso del 30% respecto al nivel basal, revelándose como los donadores de manera neta de ácido araquidónico durante la estimulación. Además, la inhibición de la acción de la cPLA2 mediante pirrofenona, revierte a diferentes tiempos este descenso hasta niveles comparables, aunque ligeramente inferiores, a los del estado basal. La especie minoritaria PC(20:4/20:4), al contrario que las demás, muestra un incremento dependiente del ciclo de desacilación/reacilación por la acción de la cPLA2 y la síntesis de araquidonoil-CoA inhibida por la triacsina C.

Las especies de PI con ácido araquidónico también muestran una disminución de sus niveles bajo estimulación, aunque la inhibición de la cPLA2 no consigue recuperar esos niveles hasta los del estado basal. La dependencia de la especie minoritaria PI(20:4/20:4) frente a la acción de cPLA2 y la síntesis de araquidonoil-CoA sensible a triacsina C es análoga a la descrita para PC(20:4/20:4), siendo su incremento, por lo tanto, dependiente del proceso de desacilación/reacilación del ácido araquidónico. Las especies de PE con ácido araquidónico, no muestran una disminución dramática de sus niveles a lo largo de los tiempos de estimulación ensayados, manteniéndose en niveles comparables a la condición de no estimulación, de modo análogo a lo que ha sido descrito por Rouzer et al. en macrófagos peritoneales residentes de ratón [198]. Además, durante la estimulación, la inhibición de la cPLA2 mediante pirrofenona provoca un aumento de estos niveles respeto al control. Teniendo en cuenta que los niveles de PE

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con ácido araquidónico están controlados tanto por la liberación de este ácido gracias a la acción de la iPLA2 y de la cPLA2 como por su transacilación por la acción de la CoA-IT, este incremento sobre el estado basal cuando la estimulación se lleva a cabo en presencia de pirrofenona debe atribuirse a estas enzimas. Durante la estimulación la actividad de la iPLA2 no varía, pero sí que aumenta la actividad tanto de la cPLA2 como de la CoA-IT [71, 72, 74], por lo que las variaciones de los glicerofosfolípidos durante la estimulación se deben atribuir sólo a la acción de estas dos enzimas. La actividad de la CoA-IT, que transfiere ácido araquidónico desde los glicerofosfolípidos de colina a los de etanolamina, se pone de manifiesto en que, como se ve en la Figura 4. 28, cuando se inhibe previamente la actividad de la cPLA2 con pirrofenona, a partir de 15 min de estimulación, los niveles de PC con ácido araquidónico son comparables, aunque levemente inferiores a los del estado basal (tiempo inicial). Esta bajada, que no se debe a la cPLA2, puede atribuirse a la actividad de la CoA-IT. Por consiguiente, los niveles de ácido araquidónico en PC y PE están conectados directamente mediante la actividad CoA-IT. Esta conexión se visualiza claramente en el aumento de los niveles de PE con ácido araquidónico cuando se estimula en presencia de pirrofenona: este incremento no sólo se debe a un aumento de la actividad CoA-IT, sino también a que esta enzima tiene más substrato disponible para ser transferido a PE, ya que, al estar inhibida la cPLA2, las especies de PC no han liberado ácido araquidónico. Apoyando este argumento, la aparición de la especie PE(16:1/20:4), que no está presente en el estado basal, y que no es inhibida ni por la pirrofenona ni por la triacsina C, se debe a ese aumento en la actividad CoA-IT. Esta mayor disponibilidad de ácido araquidónico en PC durante la estimulación en presencia de pirrofenona (que no afecta al incremento de actividad de la CoA-IT) también se pone de manifiesto en que la especie PE(16:1/20:4), cuya síntesis no depende del ciclo de desacilación/reacilación, aumenta en la estimulación con pirrofenona respecto al control de estimulación (Figura 4. 30. B). Sin embargo, a pesar de las evidencias que apoyan un aumento de la actividad de la CoA-IT y que están en consonancia con los datos bibliográficos, los monocitos estimulados presentaron niveles de PE con ácido araquidónico comparables con los del estado basal. Por consiguiente, si la CoA-IT tiende a aumentar los niveles de ácido araquidónico en PE y estos no varían de manera significativa, debe asumirse que la estimulación también debe provocar una acción contraria, en el sentido de liberar ácido araquidónico de PE. Dado que, como se ha expuesto anteriormente, la liberación de ácido araquidónico en monocitos se debe a la iPLA2 y a la cPLA2, pero la iPLA2 no varía su actividad y sí la cPLA2, cuando los monocitos son estimulados mediante zimosán, podemos concluir que el ácido araquidónico en PE permanece en un estado cuasiestacionario por el compromiso entre dos acciones contrapuestas, que son la activación de la cPLA2 y el aumento de la actividad de CoA-IT.

Precisamente por la presencia de PE(P-17:0/20:4) y PE(16:1/20:4), glicerofosfolípidos que muestran una relación m/z 736 y un patrón similar de fragmentación (excepto por la presencia de m/z 253 y 500 para PE(16:1/20:4)), se evidencia la conveniencia de la utilización de la separación de los glicerofosfolípidos mediante cromatografía de líquidos en fase inversa antes de la detección espectrométrica, ya que en fase normal estas dos especies coeluirían (poseen la misma cabeza polar). De este modo las dos substancias presentan diferente tiempo de retención y no hay posible error de asignación. Además, el uso de detección por trampa iónica permitió realizar experimentos MS3 para la identificación inequívoca del patrón de fragmentación de PE(P-17:0/20:4) y su comparación con el de PE(P-18:0/20:4).

Tomando en conjunto la variación de glicerofosfolípidos de colina, etanolamina e inositol en monocitos bajo estimulación, tres especies minoritarias son dignas de resaltar. Dos especies diaraquidonoiladas, PC(20:4/20:4) y PI(20:4/20:4), mostraron un incremento similar a lo largo de la estimulación que fue inhibido por pirrofenona y triacsina C. Por consiguiente, el aumento de estas especies necesita la liberación de ácido araquidónico desde otras especies y la posterior síntesis de araquidonoil-CoA para ser transferido por una aciltransferasa. La aparición de la tercera especie, PE(16:1/20:4), no se ve afectada por ninguno de los inhibidores, indicando una síntesis ligada a transacilasa independiente de CoA. En conjunto, el aumento de las dos especies diaraquidonoiladas y, especialmente,

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la aparición de la especie PE(16:1/20:4) sugieren a estas tres especies como marcadores lipídicos de monocitos estimulados con zimosán frente a su estado basal.

6. CONCLUSIONES

6.1. La cromatografía de líquidos de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas con ionización por electrospray y analizador de trampa iónica ha permitido la detección, caracterización y cuantificación de los glicerofosfolípidos que incorporan y contienen ácido araquidónico en muestras biológicas.

6.2. La especie 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoinositol se ha identificado como un aceptor temporal de ácido araquidónico en monocitos humanos aislados de sangre periférica. Dicha especie se forma en el contexto del ciclo de Lands por la ruta de incorporación del ácido araquidónico de alta afinidad/baja capacidad y no por la síntesis de novo.

6.3. La especie 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoinositol se ha mostrado como un marcador lipídico de la diferenciación de monocitos a macrófagos.

6.4. Se ha relacionado la fosfolipasa A2 independiente de Ca2+ con el mantenimiento de los niveles basales de las especies de lisoglicerofosfoinositol, que actúan como aceptores de ácido araquidónico para su incorporación en fosfatidilinositol.

6.5. En el estado basal de los monocitos, se ha encontrado que la incorporación del ácido araquidónico no sólo se produce en el contexto del ciclo de Lands (alta afinidad/baja capacidad), sino que también se produce por la síntesis de novo (baja afinidad/alta capacidad).

6.6. En el estado basal de los monocitos, se ha detectado una especie minoritaria con ácido araquidónico y número impar de átomos de carbono en la otra cadena, que se ha identificado como 1-(1-Z-heptadecenil)-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina.

6.7. Al estimular a los monocitos con zimosán, los glicerofosfolípidos de colina se han revelado como los dadores netos del ácido araquidónico por activación de la fosfolipasa A2 citosólica.

6.8. Durante la estimulación, los glicerofosfolípidos de etanolamina no han mostrado una variación en sus niveles respecto al control por el efecto contrapuesto entre la activación de la fosfolipasa A2 citosólica y de la transacilasa independiente de coenzima A.

6.9. De las especies con ácido araquidónico en el estado basal de los monocitos, sólo 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoinositol y 1,2-diaraquidonoil-snglicero-3-fosfocolina han mostrado un incremento acusado durante la estimulación con zimosán.

6.10. La especie 1-hexadecenoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina apareció por incremento de la actividad de la transacilasa independiente de coenzima A durante la estimulación, constituyendo, junto con las dos especies diaraquidonoiladas 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfoinositol y 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, un marcador lipídico de monocitos estimulados.

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Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a una beca predoctoral del Ministerio de Ciencia e Innovación de España, enmarcada en el Programa de Formación del Profesorado Universitario.

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