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UNIVERSIDAD DE MATANZAS “CAMILO CIENFUEGOS”

ESTACIÓN EXPERIMENTAL DE PASTOS Y FORRAJES “INDIO HATUEY”

Efectos de tratamientos de hidratación-deshidratación y de choque ácido sobre la germinación y emergencia

en Leucaena leucocephala

Autor: Ing. Jorge Reino Molina Tutor: Dr. Jorge A. Sánchez Rendón

Cotutora: MSc. Yolanda González Rosado

Tesis presentada en opción al título de Master en Pastos y Forrajes

2005

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A mis padres con todo amor a su memoria A mi tía y hermanos por su cariño, comprensión y apoyo durante toda mi vida

A Dios por su presencia en los momentos difíciles

TzÜtwxv|Å|xÇàÉá

Al Dr. Jorge Sánchez Rendón, tutor de este trabajo, por incentivar en mí el interés en realizar esta maestría, por el aporte de sus conocimientos en la materia y por su ayuda incondicional.

A la M.Sc. Yolanda González Rosado, cotutora, compañera y amiga, por su aliento en los momentos de vacilación, por sus conocimientos e ideas en la realización de este trabajo.

A las M.Sc. Bárbara Muñoz, Laura Montejo y Guillermina Hernández, del Instituto de Ecología y Sistemática, por su ayuda en la realización de los experimentos, así como en la redacción de los resultados.

A la Dra. Nancy Ricardo, del Instituto de Ecología y Sistemática, por haber aceptado la oponentura de este documento.

Al Dr. Rey Machado Castro, Dr. Anesio Mesa Sardiñas y al Ing. Osmel Alonso Amaro por la revisión y sugerencias para la confección de la tesis.

A las Lic. Alicia Ojeda, Nayda Armengol y Nidia Amador por la revisión del documento y de la bibliografía, también a Nancy Pérez por la edición.

A la M.Sc. Yuseika Olivera Castro y a la secretaria Mercedes Armas por su colaboración y ayuda.

A los amigos presentes y ausentes por su apoyo y estímulo, además por su confianza.

A todos los que de una forma u otra contribuyeron a la realización y culminación de esta tesis.

Gracias

De la semilla nace un árbol,

y de él una nueva esperanza

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Resumen

Se investigaron por primera vez en Cuba, los efectos de los tratamientos de hidratación-

deshidratación sobre la respuesta germinativa y el vigor de las plántulas de Leucaena

leucocephala cv. Cunningham, leguminosa arbórea de interés forrajero muy usada en los

sistemas silvopastoriles, de difícil adaptación a las condiciones de suelo ácido que abundan en

la ganadería cubana. Estos tratamientos han probado ser eficientes para revigorizar semillas

envejecidas y frescas, acelerar y sincronizar la germinación, así como los rendimientos de los

cultivos bajo diferentes condiciones ecológicas. El objetivo fundamental de este estudio fue la

estandarización de estos tratamientos y el de choque ácido. La efectividad de dichos

procedimientos se determinaron en semillas envejecidas (18 años de cosechadas) y frescas,

sembradas a temperatura subóptima para la germinación. Los ensayos de germinación con los

tratamientos robustecedores (hídricos y de choque ácido) se realizaron bajo condiciones de

estrés calórico y sustrato ácido (pruebas de laboratorio) y las pruebas de vigor de las plántulas

en condiciones de vivero en suelo neutro y ácido. Previo a los tratamientos de hidratación–

deshidratación se determinó el rango óptimo de temperatura para la germinación de este

cultivar (25-30ºC); así como el patrón de imbibición de las semillas. Las simientes frescas

presentaron un patrón trifásico de absorción de agua, cuando se eliminó la dormancia innata

(con escarificación térmica) que presentan por impermeabilidad de la cubierta al agua y los

gases; no ocurriendo así con las semillas envejecidas. Los tratamientos de hidratación–

deshidratación fueron adecuados para revigorizar semillas frescas con incrementos de la

germinación bajo condiciones de estrés calórico, y los mejores resultados para incrementar la

termotolerancia fueron alcanzados con la hidratación parcial en agua de las semillas hasta dos

horas antes de la germinación visible (28 horas); mientras que en las semillas envejecidas los

mejores efectos se alcanzaron con cortos periodos de hidratación (2 y 4 horas) y no produjeron

incrementos de la termotolerancia en éstas. Además, los tratamientos de hidratación-

deshidratación, de choque ácido y la combinación de éstos son efectivos para mejorar la

germinación, la emergencia y el vigor de las plántulas en sustrato ácido. También existió una

correlación positiva entre el porcentaje de germinación final en condiciones de laboratorio y las

condiciones de estrés (calórico y ácido) y el porcentaje de emergencia de las plántulas en vivero

(para suelo neutro y ácido respectivamente).

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ÍNDICE INTRODUCCIÓN............................................................................................................................. 1 CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 4

I.1 Descripción morfológica y botánica de Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit ................... 4 I.2 Fisiología de las semillas de las leguminosas forrajeras ...................................................... 5

I.2.1 Dormancia ....................................................................................................................... 5 I.2.2 Vigor y germinación......................................................................................................... 5 I.2.3 Envejecimiento ................................................................................................................ 6

I.3 Tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación .............................................. 7 I.3.1 Métodos de imbibición..................................................................................................... 8 I.3.2 Soluciones empleadas en los tratamientos .................................................................... 9 I.3.3 Utilidad de los tratamientos hídricos en la práctica agrícola ........................................ 10

CAPITULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ....................................................................... 15 II.1 Sitio de colecta de las semillas ........................................................................................... 15 II.2 Descripción de la investigación........................................................................................... 15

II.2.1 Experimento 1. Determinación de la temperatura óptima de germinación................. 15 II.2.2 Experimento 2. Determinación del patrón de imbibición de las semillas en agua...... 15 II.2.3 Experimento 3. Aplicación de tratamientos hídricos y pruebas de germinación bajo

condiciones de estrés calórico..................................................................................... 16 II.2.4 Experimento 4. Tratamientos hídricos para incrementar la emergencia y el vigor de

las plántulas en suelo de pH neutro ............................................................................ 16 II.2.5 Experimento 5. Aplicación de tratamientos hídricos mas choque ácido y pruebas de

germinación en sustrato ácido ..................................................................................... 17 II.2.6 Experimento 6. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la

emergencia y el vigor de las plántulas en suelo de pH ácido ..................................... 17 II.3 Análisis estadístico.............................................................................................................. 18

CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................. 19 III.1 Experimento 1. Determinación de la temperatura óptima de germinación....................... 19 III.2 Experimento 2. Determinación del patrón de imbibición de las semillas en agua............ 20 III.3 Experimento 3. Tratamientos hídricos para incrementar la germinación bajo condiciones

de estrés calórico ............................................................................................................... 22 III.4 Experimento 4. Tratamientos hídricos para incrementar la emergencia y el vigor de las

plántulas en suelo de pH neutro ........................................................................................ 24 III.5 Experimento 5. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la germinación

en sustrato de pH ácido ..................................................................................................... 25 III.6 Experimento 6. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la emergencia

y el vigor de las plántulas en suelo de pH ácido ............................................................... 27 III.7 Discusión general ............................................................................................................... 29

CONCLUSIONES.......................................................................................................................... 32 RECOMENDACIONES ................................................................................................................. 33 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 34

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INTRODUCCIÓN

La Estación Experimental de Pastos y Forrajes (EEPF) “Indio Hatuey”, desde su fundación, tiene el compromiso estatal de conservar el germoplasma de especies pratenses y forrajeras introducidas en el país, así como el obtenido producto de la colecta y del trabajo de la mejora genética y la biotecnología. Dentro de la infraestructura necesaria para tal objetivo, posee una cámara donde se almacenan las semillas de la familia de las leguminosas de origen tropical y subtropical.

La riqueza genética aquí conservada tiene gran importancia, no sólo como punto de partida para la obtención de nuevas especies y la recuperación de otras, sino también para la conservación de un patrimonio biológico y económico esencial para la seguridad alimentaria del país. Además, posee un marcado interés para los productores e investigadores en el ámbito nacional e internacional, por lo que se precisa mantener su viabilidad y alto poder germinativo como parte esencial de una estrategia global para la conservación de la biodiversidad.

Sin embargo, muchas de las semillas aquí conservadas han sufrido un progresivo deterioro (envejecimiento) provocado por las condiciones no óptimas de almacenamiento, como son la temperatura y la humedad ambiental, que según Harrington, (1972) son de gran importancia para su conservación. Esto hace incuestionable la necesidad de buscar métodos o vías que estimulen su germinación, indicador que en muchos casos se puede encontrar en niveles marcadamente bajos, pero que puede alcanzar, a través de estos métodos, valores aceptables para su posterior regeneración y conservación, asegurando de esta manera una mayor longevidad de las semillas conservadas.

Entre los métodos más utilizados para incrementar la germinación de las semillas se encuentran los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación (Bradford, 1986; McDonald, 2000; Sánchez, Orta y Muñoz, 2001a). Estos tratamientos se basan, fundamentalmente, en la inmersión de las semillas en agua o en soluciones osmóticas (polietilenglicol, sales y azúcares) durante cierto tiempo, con deshidratación previa a la siembra o sin ella (Heydecker, Higgins y Gulliver, 1973; Henckel, 1982), lo que permite que un gran número de semillas alcance rápidamente el nivel de humedad y estado metabólico deseado, como consecuencia de la activación de numerosos procesos bioquímico-fisiológicos relacionados con la germinación, la tolerancia al estrés ambiental y la autorreparación enzimática de las membranas celulares (Heydecker y Coolbear, 1977; Bray, 1995). En general, los tratamientos de hidratación-deshidra-tación de las semillas también se conocen como tratamientos de hidratación parcial, de humedecimiento-desecación, de prehidratación o hídricos (Sánchez et al., 2001a).

Los tratamientos de hidratación parcial de las semillas han demostrado ser eficientes para los siguientes fines agrícolas: a) revigorización de semillas para recuperar el vigor e incrementar la longevidad durante el almacenamiento; b) acondicionamiento para incrementar, acelerar y sincronizar la germinación y el establecimiento; c) acondicionamiento de semillas para eliminar la dormancia orgánica o impuesta; y d) robustecimiento de semillas para incrementar la germinación, el establecimiento y los rendimientos de las plantas resultantes de los tratamientos bajo condiciones ambientales adversas (Bradford, 1986; Khan, 1992; Olouch y Welbaum, 1996; Sánchez, Calvo, Muñoz y Orta, 1999a, b).

En Cuba se han obtenido incrementos notables con el empleo de estos tratamientos pregerminativos, tanto en la germinación como en el establecimiento bajo condiciones de déficit hídrico con respecto al testigo, en semillas de tomate (Lycopersicon esculentum, Mill) por Capote y Fleites (1978), y en semillas de Macroptilium atropurpureum Urb (Siratro) por Orta, Pozo, Pérez y Espinosa (1983). También con la aplicación de los tratamientos hídricos, Sánchez, Calvo, Orta y Muñoz (1997), Orta, Sánchez, Muñoz y Calvo (1998), Sánchez et al. (1999a) y Sánchez, Muñoz, Reino y Montejo (2003a) lograron mejorar la germinación, el establecimiento y los rendimientos en diversas especies de hortalizas, forestales pioneras y leguminosas no arbóreas de interés forrajero. Por su parte, Sánchez, Muñoz y Fresneda (2001b); Sánchez, Muñoz y Montejo (2003b) y Sánchez (2003) lograron incrementar la germinación y el establecimiento de especies hortícolas y forestales pioneras, bajo condiciones ambientales extremas, cuando combinaron los tratamientos hídricos con los de choque térmico al nivel de semillas sin germinar.

Dentro de las cientos de especies de la familia de las leguminosas y otras que conforman el germoplasma conservado por la EEPF “Indio Hatuey” se encuentra Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit. Las semillas de esta especie presentan una dormancia primaria impuesta por la impermeabilidad de las cubiertas seminales al agua y a los gases (Schmidt, 2000), y además sus plantas se caracterizan por un lento establecimiento con respecto a otras especies de leguminosas herbáceas (Piggin, Shelton y Dart, 1994). Hutton (1982) consideró que la mayoría de las leguminosas tropicales presentaban deficiencia en su adaptación y falta de vigor de las plántulas, lo cual en ocasiones dificulta su


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establecimiento. Así, en muchas regiones del mundo L. leucocephala se considera establecida entre los 12 y 18 meses después de sembrada (Clavero, 1998; Ferreira y Andrade, 2000).

Por su parte, para la eliminación del tipo de dormancia exógena que presentan las semillas de L. leucocephala se han recomendado tratamientos pregerminativos de escarificación térmica, mecánica y química (González, Hernández y Mendoza, 1998; Cakmakci y Aydinoglu, 1999; Amodu, Omokange, Onifade y Balogun, 2000). Sin embargo, existen pocos reportes de investigación donde se han aplicado los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación a semillas de L. leucocephala (Lima-e-Borges, Borges y Paula, 1997; Sarmento y Schifino-Wittmann, 2000). Además, los resultados de los autores antes mencionados con la aplicación de los referidos procedimientos no han sido efectivos para incrementar la germinación de esta leguminosa, debido posiblemente a la falta de estandarización de los tratamientos de hidratación-deshidratación para las semillas de los lotes usados, o a la no aplicación de tratamientos de escarificación previos al empleo de los procedimientos hídricos.

Tampoco se conoce acerca de la aplicación de los referidos tratamientos para incrementar la germinación y el establecimiento de L. leucocephala en suelo ácido, y menos aún de la aplicación combinada de un tratamiento robustecedor de tipo hídrico con algún tratamiento de choque ácido, tal como se practicó la combinación de tratamientos robustecedores de hidratación-deshidratación con los de choque térmico en semillas de especies hortícolas y forestales pioneras, para mejorar su funcionamiento bajo condiciones de estrés hídrico y calórico (Sánchez et al., 2001b; Sánchez, Muñoz y Montejo, 2003b; Sánchez, 2003).

Por todo lo anteriormente expuesto se plantea la siguiente hipótesis de trabajo:

• Los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación mejoran la germinación y el

establecimiento de las plantas hortícolas, las leguminosas no arbóreas y las forestales pioneras en diferentes condiciones ambientales; entonces los referidos procedimientos, en combinación o no con los de choque ácido, deben producir efectos similares en semillas de L. leucocephala cv. Cunningham, especie leguminosa arbórea de interés forrajero.

Para darle respuesta a estas hipótesis se plantea el siguiente objetivo general:

Estandarización de la técnica de hidratación-deshidratación y el tratamiento de choque ácido en

semillas de L. leucocephala cv Cunnnigham procedentes del germoplasma de la EEPF “Indio Hatuey”, para incrementar la germinación y el vigor de las plántulas.

Con los siguientes objetivos específicos:

Establecer la temperatura óptima para la germinación de semillas frescas y envejecidas, así como

su patrón de imbibición. Determinar los efectos de los tratamientos de hidratación-deshidratación en la germinación de

semillas frescas y envejecidas, y el vigor de las plántulas. Conocer los efectos que produce la combinación de tratamientos robustecedores de hidratación-

deshidratación con los de choque ácido, en la germinación, la emergencia y el vigor de las plántulas en sustrato ácido.

Los estudios del presente trabajo se desarrollaron como parte del Proyecto “Utilización de

tratamientos pregerminativos en semilla envejecida y fresca para la regeneración e incremento de la germinación”, perteneciente al Ministerio de Ciencia Tecnología y Medio Ambiente (CITMA Territorial de Matanzas). Se han presentado en diferentes talleres científicos y en un evento internacional, y constituyeron parte de un Premio Nacional de la Academia de Ciencias de Cuba 2003.

La importancia teórica, ambiental y práctica del presente estudio consiste en que: • Constituye un aporte al conocimiento de la fisiología de la germinación y del establecimiento de una

leguminosa arbórea muy empleada en la agricultura tropical, dado sus múltiples usos.


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• Contribuye a promover la introducción y aplicación de ecotecnologías de bajos insumos en el país, que permiten el uso sostenible y mejor aprovechamiento de la biodiversidad, aspecto considerado en la implementación del Plan de Acción Nacional para la Estrategia de la Diversidad Biológica cubana.

• La presente tesis sirve como modelo experimental para el montaje de los tratamientos de hidratación-deshidratación y de choque ácido en semillas de otras accesiones de L. leucocephala y leguminosas de interés forrajero.

La novedad científica que presenta esta investigación es que por primera vez en Cuba se

determinan:

• Los efectos de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación en la germinación de semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham y su establecimiento en condiciones de vivero.

• La efectividad de los tratamientos hídricos para recuperar el vigor germinativo en semillas envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham.

• Los efectos combinados de los tratamientos robustecedores de hidratación-deshidratación con los de choque ácido, en la germinación, la emergencia y el vigor de las plántulas de L. leucocephala cv. Cunningham en sustrato ácido.

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CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.1 Descripción morfológica y botánica de Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit

L. leucocephala se ubica en la familia Leguminosae, subfamilia Mimosoideae, tribu Mimosa y en el género Leucaena (Benth) (Barreto, 1990; Hughes, 1998); entre sus nombres vulgares se encuentran aroma blanca y aroma mansa, entre otros. Es originaria de Latinoamérica, en específico del sureste de México, aunque se ha naturalizado en varias regiones del planeta y cuenta con un amplio número de variedades forrajeras, cuyos rendimientos de materia seca (MS) fluctúan entre 8 y 20 t/ha/año, con niveles proteicos entre 25 y 30%, así como una alta palatabilidad y digestibilidad (Clavero y Razz, 1997).

Se caracteriza por ser un árbol o arbusto de porte entre 1 y 10 m de altura, aunque puede alcanzar hasta los 20 m (Hughes, 1998). Presenta una raíz principal profunda, lo que la hace resistente a la sequía; además tiene raíces laterales de menor tamaño y gran cantidad de nódulos con bacterias fijadoras de nitrógeno (Sánchez y Urdaneta, 1997).

El follaje es perenne, de copa abierta y rala, la cual varía en dependencia de la especie (Brewbaker y Sorensson, 1994); la inflorescencia es capitada o globular, axilar, con pedúnculos de hasta 5 cm de largo y con numerosas flores densamente dispuestas de color blanco, globulares, en número de 100 a 180 florecillas en cabezuelas, una o más juntas; pedúnculo de hasta 5 cm de largo, con pétalos casi el doble de largo, legumbres delgadas y planas de hasta 20 cm de largo y 2 cm de ancho, incriminadas, con semillas elípticas, comprimidas, de color pardo (Barnard, 1967).

Requiere 750 mm o más de precipitación anual, puede persistir en períodos secos prolongados (Skerman, Cameron y Riveros, 1991) y no ha sido muy específica a las necesidades de suelo. Sin embargo, esta leguminosa se desarrolla mejor en los que son profundos, bien drenados y no tolera pH bajos (Dijkman, 1950). Es un árbol leguminoso de múltiples propósitos, especialmente para la ganadería, dada su producción de biomasa, de alto valor biológico durante todo el año, lo que resulta muy útil tanto para la producción de leche como de carne (Iglesias, 1996). Además, posee la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico al suelo, que posteriormente favorece el crecimiento de las gramíneas acompañantes en el pastizal e incrementa su contenido de proteína bruta (PB) (Lamela, Matías, Fung y Valdés, 2001).

También tiene otros usos dentro de los sistemas ganaderos, tales como: control de la erosión, reforestación, producción de madera y sus derivados, árbol de sombra y fertilizante orgánico (Ruiz, Febles, Bernal, Díaz y Díaz, 1993). Además, es útil como vía para el mejoramiento del microambiente, la estabilidad del ecosistema y la alimentación humana (Gutteridge y Shelton, 1997).

Según Hughes (1998) existen 22 especies reconocidas, con seis taxas intraespecíficas y dos híbridos espontáneos. Estas abarcan 40º de latitud y 2 500 m en altitud, y crecen bajo variadas condiciones de clima y suelo, a criterios de Shelton y Brewbaker (1994).

Aunque existe un amplio número de especies diferentes, L. leucocephala (Lam.) de Wit es la que más se ha estudiado en el trópico y el subtrópico (Funes, 1980; Ruiz y Febles, 1987). En Cuba es monotípica y se encuentra en casi todos los suelos (Menéndez, 1982). Dentro de los cultivares pertenecientes a esta especie se encuentra el Cunningham, obtenido de una línea resultante del cruzamiento del cultivar Perú y la línea CPI 18228, originaria de Guatemala, el cual ha presentado rendimientos superiores a los de sus progenitores (Hutton y Beattie, 1976). Fue introducido en Cuba en 1977, procedente de Australia.

Este cultivar se caracteriza por ser un arbusto de 5 a 6 m de altura, profusamente ramificado desde la base, con un gran número de yemas basales, de hojas grandes (entre 15 y 20 cm de largo), compuestas por foliolos de 7 a 12 mm, con glándulas secretoras ovaladas; sus flores son de color blanco y se agrupan en cabezuelas, de las cuales emergen legumbres planas de 10 a 15 cm, que contienen semillas de color café oscuro, ovaladas y planas.

Se adapta al trópico en zonas donde las precipitaciones sean superiores a los 760 mm, prefiere suelos neutros con un adecuado contenido de Ca y un pH mayor que 5,5. La mejor época de siembra es al inicio del período lluvioso (abril-junio), con una buena preparación del suelo, y tiene como limitante el lento crecimiento en su fase de establecimiento (Machado y Núñez, 1994). Puede producir más de 20 t de MS/ha/año si las condiciones del medio son favorables.


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I.2 Fisiología de las semillas de las leguminosas forrajeras

Las semillas de las especies de Leucaena, al igual que las de otras leguminosas forrajeras, pueden secarse y almacenarse a bajas temperaturas y bajos contenidos de humedad, según los patrones convencionales para las semillas forestales; estos dos factores son determinantes para el éxito en su conservación. Una disminución simultánea de ambos factores permite, teóricamente, mantener durante cientos de años la viabilidad de sus semillas (Harrington, 1972).

Las semillas de las leguminosas forrajeras como Albizia, Cassia, Erythrina y Leucaena, entre otras, presentan cubiertas impermeables al agua y los gases (Buch, Jara y Franco, 1997), lo que propicia que su vigor y viabilidad se prolonguen por más tiempo, con una mayor longevidad. I.2.1 Dormancia

La dormancia es un estado en el que las semillas viables no germinan bajo condiciones favorables de temperatura, humedad, luz y oxígeno (Schmidt, 2000). Harper (1977) clasificó la dormancia, según su desarrollo, en tres tipos: 1) Dormancia innata, cuando las semillas recién dispersadas son incapaces de germinar en condiciones ambientales favorables; 2) Dormancia forzada, cuando las semillas no germinan por condiciones ambientales desfavorables; y 3) Dormancia inducida o secundaria, referida a las semillas que en el momento de dispersión no presentan dormancia innata, pero que por dormancia forzada desarrollan algún tipo de dormancia.

Las semillas del género Leucaena se caracterizan por la presencia de cubiertas impermeables al agua y a los gases (Whisenant y Veckert, 1982; Sabiiti, 1983; Buch et al., 1997), que restringen su germinación, condición biológica común en muchas leguminosas y otras familias de plantas. Nikolaeva (1982) designa este fenómeno como dormancia exógena física, la cual, según Khan (1982), está gobernada genéticamente, aunque influyen otros factores bioclimáticos como la temperatura, la humedad de almacenamiento, el contenido de humedad de la semilla y el grado de desarrollo de la semilla, entre otros (Duguma, Kang y Okali, 1988).

En la naturaleza la liberación de esta dormancia física puede ocurrir, fundamentalmente, a partir de la alternancia de temperatura a que se encuentra sometida la semilla cuando llega al suelo, lo que provoca una fractura del micrópilo para facilitar la entrada de agua (Vázquez-Yanes y Orozco-Segovia, 1987; Bewley y Black, 1994).

La literatura recoge una amplia información acerca de los métodos y técnicas utilizados para eliminar la dormancia en las leguminosas, como son el empleo de bajas temperaturas, la escarificación mecánica, el uso de sustancias químicas y el almacenamiento (Iriondo y Pérez, 1999), y los más utilizados en esta especie son los tratamientos con ácidos (Sarmento y Schifino-Wittmann, 2000), la escarificación mecánica (Teles, Alves, Oliveira y Becerra, 2000) y, por último, la inmersión en agua a diferentes temperaturas (González et al., 1998). I.2.2 Vigor y germinación

Poulsen (2000) plantea que el porcentaje de germinación final no es suficiente para expresar el grado de calidad que poseen las semillas de una determinada especie, por lo que los análisis de vigor son los más adecuados para detectar las diferencias en cuanto a calidad germinativa entre lotes que poseen altos porcentajes de germinación (Marcos Filho, 1998).

Existen varias formas para definir el vigor de las semillas, las dos más comunes fueron las formuladas por la Association of Official Seed Analysis (AOSA) y la Internacional Seed Testing Association (ISTA): a) Aquellas propiedades de las semillas que determinan el potencial para una rápida y uniforme

emergencia y desarrollo de plántulas normales en un amplio rango de condiciones de campo (AOSA, 1983).

b) La suma de las propiedades que determinan el nivel potencial de actividad y comportamiento de las semillas o lote de estas durante el proceso de germinación y emergencia de las plántulas. A las semillas de mejor comportamiento se les denomina de alto vigor (ISTA, 1995).

A partir de estos dos conceptos se infiere que este indicador puede influir y persistir en el crecimiento y

desarrollo de la planta ya adulta, en la uniformidad de la cosecha y en el rendimiento de la especie en


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cuestión. Para evaluarlo en las semillas de las especies arbóreas han sido empleados varios métodos, entre ellos: 1) Velocidad de germinación. La germinación rápida de las semillas es una ventaja para el

establecimiento de las futuras plántulas, por lo que la velocidad de germinación es una expresión del vigor, dado que las semillas de un alto vigor germinan más rápido que aquellas que poseen un bajo valor, en cualquier condición de siembra (Venter, 2000).

2) Prueba del crecimiento de plántulas. Implica la germinación en condiciones estándar, donde se

incluyen mediciones del tamaño de las plántulas y/o la masa, o también la clasificación de estas en clases de vigor (Perry, 1981).

3) Prueba de estrés. Para la realización de esta prueba se requiere que las muestras de semillas sean

germinadas en condiciones estresantes o bajo la prueba estándar de germinación, la cual va seguida de un tratamiento separado de estrés (Bonner, 1998). Actualmente la prueba de estrés más extendida en las semillas de árboles es la de envejecimiento acelerado (EA), usada para evaluar el potencial de almacenamiento de los lotes de semillas, y se convierte en estos momentos en un indicador del vigor para muchos cultivos agrícolas (Marcos Filho, Novembre y Chamma, 2001). La mayoría de los estudios de EA en semillas de arbóreas se ha concentrado en las temperaturas supraóptimas y la duración del examen (en horas) para llevar a cabo el envejecimiento, lo que ha sido informado para un gran número de especies (Thapliyal y Connor, 1997; Bonner, 1998; Sánchez, Muñoz y Montejo, 2004).

4) Prueba de Tetrazolium (TZ o Cloruro de 2, 3, 5 Trifenil Tetrazolium). Usada frecuentemente para

estimar la viabilidad de las semillas dormantes en árboles (Yu y Wang, 1996), al estar esta relacionada con la pérdida en la capacidad de respiración, la reducción de la actividad enzimática y el contenido de ARN mensajero (Poulsen y Stubsgaard, 2000).

I.2.3 Envejecimiento

Las semillas de L. leucocephala, de acuerdo con su tolerancia al almacenamiento, se pueden clasificar

como ortodoxas, dado que pueden ser conservadas por largos períodos en recipientes herméticos a bajas temperaturas (-18ºC a -20ºC) y con un contenido de humedad residual entre 3 y 7%, según lo recomendado por el International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI, 1999), lo que garantiza una mayor longevidad.

Navarro (2002) plantea que el deterioro de las semillas no sólo ocurre durante el período en que estas se encuentran almacenadas, sino que se inicia en el campo, continúa con una incorrecta manipulación durante la cosecha, en la transportación y momentos antes de comenzar esta. Por ello, cualquier daño durante el procesamiento de las semillas afectará su almacenamiento y, por consiguiente, su viabilidad.

El contenido de humedad y la temperatura son los principales factores que determinan el ritmo de envejecimiento en las semillas (Roberts, 1972). Harrington (1972) plantea que la longevidad de las semillas ortodoxas se puede duplicar por cada reducción de 5ºC de temperatura y del 1% en el contenido de humedad, por lo que se deduce que aquellas que se conserven a temperaturas bajas y, a su vez, con muy bajo contenido de humedad, se mantendrán viables durantes largos períodos (Iriondo, 2001). Otros factores, como las bajas y altas presiones de oxígeno, pueden o no estimular el proceso degenerativo relacionado con la desnaturalización de los constituyentes de las células (enzimas, ADN, membranas), el cual ocurre en condiciones aerobias (Harada, 1997). También la luz influye de forma natural en el envejecimiento por la acción de las radiaciones ionizantes (Roberts, 1972), al igual que en las semillas ortodoxas que presentan fotodormancia (Vázquez-Yanes y Orozco-Segovia, 1996).

Finalmente, McDonald (1980) planteó que el proceso de deterioro de las semillas comprende una serie de etapas sucesivas, que se inician cuando la semilla alcanza la madurez fisiológica y continúan con velocidad variable hasta su muerte (fig. 1).


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MADUREZ FISIOLÓGICA

I.3 Tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación

Fig. 1. Secuencia probable del proceso de deterioro, sus posibles efectos y consecuencias (tomado de McDonald, 1980).

Hidratar las semillas antes de la siembra es una técnica empleada en el siglo pasado y forma parte de

la cultura de los campesinos para muchos cultivos. Kidd y West (1918, 1919), al realizar una revisión sobre las experiencias obtenidas al respecto, concluyeron que: “Las semillas remojadas en un mínimo de agua y después secadas al ambiente lentamente, imbiben y germinan mucho más rápido que aquellas que no han sido tratadas”, enunciando además los aspectos a tener en cuenta para ello, como son: cantidad adecuada de agua, duración y temperatura óptima del proceso de imbibición. Aunque este efecto es de carácter universal, debe tenerse en cuenta que el tratamiento adecuado puede ser diferente para cada especie o variedad muy cercana (Chippindale, 1934).

Levitt y Hamm (1943) introdujeron, por primera vez, la metodología de hidratar semillas con el uso de soluciones osmóticas, logrando activar una serie de reacciones fisiológicas pregerminativas, pero que impedirían la culminación de este proceso de germinación por limitaciones hídricas.

Posteriormente, a partir de una revisión de May, Milthorpe y Milthorpe (1962), estos tratamientos volvieron a ser centro de interés por parte de los investigadores occidentales, inaugurando la era

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Disminución de los mecanismos energéticos y síntesis

Disminución de la velocidad de germinación

Disminución de la tasa de crecimiento y desarrollo

Disminución de la resistencia de la planta al estrés

Disminución de la emergencia en campo

Degradación del sistema de membranas

Disminución de la respiración y biosíntesis

Disminución del potencial de almacenamiento

Disminución en uniformidad

Disminución en rendimiento

Aumento del porcentaje de plántulas anormales

PÉRDIDA DE LA GERMINACIÓN

MUERTE


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moderna Heydecker et al. (1973) y Khan, Tao, Knypl, Borkowska y Powell (1978), los cuales resumieron todo el conocimiento sobre los tratamientos de hidratación parcial de las semillas en soluciones bioquímicamente inertes, como el polietilenglicol (PEG), o con aditivos bioactivos, por lo que concluyeron que estos pueden ser utilizados con tres propósitos fundamentales: 1) revigorizar semillas envejecidas (seed reinvigoration); 2) acondicionar semillas para acelerar y uniformar la germinación (seed priming); y 3) robustecer semillas para incrementar la resistencia de las plantas a condiciones adversas del medio (seed hardening). I.3.1 Métodos de imbibición

Los métodos de hidratación parcial de las semillas fueron agrupados en dos categorías, en dependencia de si el suministro de agua a estas es controlado o no (Taylor, Allen, Bennett, Bradford, Burris y Misra, 1998). Los de hidratación ideados por Heydecker et al. (1973) y Khan (1977) se fundamentan en el uso de soluciones osmóticas que permiten la hidratación de las semillas en función del equilibrio de potenciales hídricos que establecen en el sistema solución-semilla, el cual mantiene un nivel de humedad deseado y desencadena una serie de mecanismos bioquímico-fisiológicos relacionados con la germinación, pero que no permite la emergencia de la radícula por limitaciones hídricas. Esta metodología ha sido aplicada con éxito en un gran número de cultivos como hortalizas, leguminosas y cereales (Heydecker, 1977; Khan et al., 1978).

A posteriori, Dearman, Brocklehurst y Drew (1986) y Buljaski, Nienow y Gray (1989) desarrollaron tecnologías para el uso comercial de los procedimientos osmóticos y lograron tratar hasta 10 kg de semillas, con la limitante que representa el empleo en esta técnica de osmóticos perfectos, como es el PEG, por su alto costo en el mercado mundial (Lawlor, 1970; Parera y Cantliffe, 1994).

Los tratamientos robustecedores empleados por Henckel y sus colaboradores pueden considerarse como un método no osmótico que controla el nivel de humedad que se suministra a la semilla (Henckel, 1982). Sin embargo, este procedimiento es muy difícil de aplicar a grandes volúmenes de semillas, debido a que no todos los propágulos alcanzan el mismo nivel de humedad durante su hidratación parcial (Orta et al., 1998).

Los métodos que no controlan el agua que toman las semillas, son aquellos en los que el agua está libremente disponible a las semillas y no se regula por el ambiente que las rodea (Taylor et al., 1998). Por tanto, la toma de agua es regida por la afinidad establecida entre los tejidos seminales y el agua. La técnica de hidratación parcial propuesta por Orta et al. (1998) se basa en el papel que desempeña el agua en los procesos bioquímico-fisiológicos sucesivos que ocurren en las semillas durante las distintas fases del proceso germinativo (Obroucheva y Antipova, 1985; 1989). Este método regula la imbibición parcial en función del tiempo en que se mantiene en contacto cualquier volumen de semilla con suficiente cantidad de agua, y no en función del equilibrio de potenciales hídricos, ni de la limitación en la cantidad de agua añadida, propuesto por los modelos desarrollados anteriormente. Con dicha técnica se alcanzan resultados satisfactorios para acondicionar, revigorizar y robustecer semillas de hortalizas y de especies forestales pioneras (Sánchez, 1997, 2000; Sánchez, Blanco y Muñoz, 1998; Sánchez et al., 1999a; Orta, Sánchez, Muñoz y Calvo, 2001).

La aplicación efectiva de los modelos de imbibición parcial en agua propuestos por Henckel (1982) y Orta et al. (1998), conlleva que la totalidad de las semillas logren alcanzar el mismo nivel de humedad deseado con el fin de obtener la homogeneidad en la germinación. Este riesgo no ocurre con la utilización de soluciones osmóticas, por cuanto la barrera a la absorción del agua se establece sobre la base del equilibrio de potenciales hídricos, que se crea en el sistema solución-semilla, y no en el tiempo de inmersión de las semillas (Orta et al., 1998) ni en la limitación en agua, (Henckel, 1982). Para superar esta dificultad Henckel (1982) y Orta et al. (1998) sugieren someter las semillas a dos o más ciclos de hidratación parcial-desecación.

Finalmente, según Hegarty (1978) los efectos de los tratamientos pregerminativos de hidratación parcial de las simientes dependen fundamentalmente de: 1) el grado de hidratación que alcancen las semillas, 2) la temperatura y duración del tratamiento, 3) el nivel de aireación del medio, 4) la cantidad de semillas, y 5) el proceso de deshidratación. Por ello, cada método que se lleve a cabo deberá tener en cuenta los aspectos antes mencionados y la modificación se hará según los intereses de los investigadores.


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I.3.2 Soluciones empleadas en los tratamientos

Como se ha señalado anteriormente, las dos principales sustancias aplicadas en los tratamientos de hidratación parcial son el agua y las soluciones osmóticas; estas últimas pueden dividirse en tres grandes grupos: a) Las que están compuestas por un polímero de alto peso molecular (100-20000) conocido como

Polietilenglicol (PEG) o Carbowax (nombre comercial) (Heydecker y Coolbear, 1977; Khan, Peck y Samimy, 1980-1981; Gray, Drew, Bujalski y Nienow, 1991). Dentro de este rango también se cuenta con PEG de peso molecular entre 2 000 y 8 000, el cual ha sido recomendado como osmótico ideal para osmoacondicionar las semillas, al no penetrar las membranas celulares, no presentar carácter tóxico, mantener casi constante la molaridad de la solución y cuando están presentes en pequeñas cantidades permiten una aireación aceptable del medio (Parmar y Moore, 1968; Suzuki, Obayanhi y Luo, 1989; McDonald, 2000). Por otra parte, se conoce que cuando el PEG se utiliza para crear estrés hídrico en las plantas, puede ser absorbido y secretado por estas (Lawlor, 1970; Tingey y Stockwell, 1977; Yaniv y Wecker, 1983). Este osmótico ha sido utilizado también en combinación con reguladores del crecimiento, como las citoquininas, para evitar la termoinhibición de las semillas bajo temperaturas subóptimas y supraóptimas de germinación, por lo que se elimina de esta manera la termodormancia en ellas (Khan, 1977; Prusinski y Khan, 1993). Por otra parte, Khan, Karssen, Leve y Roe (1979) demostraron los efectos positivos del osmoacondicionamiento y de las fitohormonas en la germinación de las semillas de hortalizas bajo condiciones de estrés abiótico. Ellos concluyeron que esto se debió a la activación de numerosos procesos pregerminativos, alcanzada con el uso combinado de los tratamientos osmóticos con los reguladores del crecimiento, los cuales actúan eliminando cualquier tipo de dormancia fisiológica que pueden adquirir las semillas durante la germinación en condiciones desfavorables. Por último, al incluir fungicidas y antibióticos, como el Tiran (0,2%) en soluciones de PEG durante el tratamiento osmótico en semillas de diferentes cultivos, se observó una reducción considerable en la proliferación bacteriana y fúngica durante la emergencia y el establecimiento de las plantas en condiciones de campo (Khan, 1992).

b) La soluciones salinas ampliamente utilizadas para osmoacondicionar son una mezcla de K3PO4 y

KNO3 (Suzuki et al., 1989; Rehman, Harris y Bourne, 1998a) y otras sales como NaCl (Cocchete y Guerra, 1986; Thanos y Georghiou, 1988); MgSO4 (Levitt y Hamm, 1943; Heydecker y Coolbear, 1977; Khan, Peck, Talor y Samimy, 1983); NH4NO4, Ca(NO3) (Levitt y Hamm, 1943) y KH2PO4 (Levitt y Hamm 1943; Brocklehurst y Dearman, 1984). Estas soluciones mantienen una aireación aceptable del medio, al osmoacondicionar las semillas a gran escala (Suzuki et al., 1989), y se atribuye la promoción de la germinación a sus propiedades osmóticas y no a sus propiedades químicas (Thanos y Georghiou, 1988), aunque estas últimas pueden afectar las estructuras celulares de las semillas y, por consiguiente, su viabilidad (Khan et al., 1983; Brocklehurst y Dearman, 1984; Bradford, 1995).

c) Con el uso de las soluciones compuestas de azúcares (Sacarosa y Manitol) se han obtenido

resultados satisfactorios para acelerar e incrementar la germinación (Thanos y Georghiou, 1988; Thanos y Mitrakos, 1992; Sánchez et al., 1997); pero existe el inconveniente de que son sustancias que se contaminan rápidamente, lo que puede afectar considerablemente la viabilidad o el poder germinativo de las semillas (Sánchez et al., 2001a).

Recientemente se ha comparado la efectividad de los tratamientos que utilizan sustancias osmóticas

(PEG, sales, azúcares), conocidos también como acondicionamiento osmótico, con el acondicionamiento mátrico de las semillas; este último no es más que la unión de las semillas con partículas sólidas (e. g., vermiculita) y agua. Con el acondicionamiento mátrico en hortalizas se han obtenido los mejores resultados para el incremento de la germinación con relación al acondicionamiento osmótico, aunque las diferencias fisiológicas que producen en las semillas ambos tratamientos están pobremente dilucidadas (Khan, 1992).


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Sin embargo, estudios recientes realizados por Jett, Welbaum y Morse (1996) han demostrado que la efectividad del tratamiento mátrico o “matric priming seeds” sobre el tratamiento osmótico, se debe fundamentalmente al mayor aporte de oxígeno y calcio que hace el soporte del acondicionamiento mátrico a las simientes durante el intercambio que se establece en el sistema semilla-sustrato. Como es conocido, estos elementos son esenciales en la división celular y en la activación de diferentes funciones de las membranas y de las proteínas (Roberts y Harmon, 1992). Esto explica porqué las semillas tratadas mediante el acondicionamiento mátrico funcionan mejor que las acondicionadas con los tratamientos osmóticos. I.3.3 Utilidad de los tratamientos hídricos en la práctica agrícola

Los tratamientos de hidratación parcial de las semillas, en la actualidad, han demostrado ser eficientes para su utilización con los siguientes fines agrícolas: 1) revigorizar semillas para incrementar el vigor y la viabilidad durante la conservación; 2) acondicionamiento para el incremento, aceleración y sincronización de la germinación y el establecimiento; y 3) el robustecimiento de las semillas para el incremento de la germinación, el establecimiento y los rendimientos en condiciones de estrés biótico y/o abiótico del medio (Bradford, 1986; Welbaum y Bradford, 1991; Khan, 1992; Prisco, Baptista-Haddad y Pinherio-Bastos, 1992; Corbineau, Picard y Côme, 1994; Jett, Welbaum, O’Dell y Morse, 1995; Olouch y Welbaum, 1996; Chojnowski, Corbineau y Côme, 1997; Orta et al., 1998; Halmer, 2000; McDonald, 2000; Sánchez et al., 2001a; Sánchez et al., 2004).

También Sánchez et al. (2001a), Sánchez y Muñoz (2004) y Montejo, Sánchez y Muñoz (2004) señalaron y demostraron que los tratamientos hídricos se han utilizado para eliminar dormancia innata en las semillas e impuesta por condiciones inadecuadas de iluminación, temperatura y agua.

En nuestro país, al ser estudiados estos tratamientos en semillas envejecidas de leguminosas no arbóreas, se han obtenido resultados muy favorables para el incremento de la germinación, la emergencia, el establecimiento y los rendimientos (Machado y Sánchez, 2003). Cuando se aplicaron en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.), en específico en las variedades Hatuey-1 y Japonés, las plantas procedentes de semillas tratadas presentaron significativamente más vigor, reflejado en la masa seca de sus partes aéreas y subterráneas, además del incremento de sus rendimientos hasta duplicarlos con relación a las plantas resultantes de las semillas no tratadas (Sánchez et al., 1999b).

También en tres variedades de tomate (Lycopersicon esculentum, Mill.), HC-7880 y L-103 (semillas frescas) y HC-3880 (semillas envejecidas), se observó un incremento de hasta el 20% del vigor perdido para el caso de las semillas de la última variedad, así como un aumento de los rendimientos, al provocar estos tratamientos una respuesta reproductiva más amplia, lo que les permitió a las plantas tratadas asignar una mayor cantidad de recursos energéticos a la producción de frutos que a la de raíces y partes aéreas, contrariamente a las plantas control, en las que el proceso fue inverso. Ello prueba los cambios metabólicos y/o morfológicos que producen estos tratamientos al incrementar la capacidad reproductiva de las plantas, en este caso el rendimiento (Orta et al., 1998).

Al estudiar esta técnica en especies de leguminosas forrajeras, como Mimosa invisa, Macroptilium atropurpureum (Urban) y Crotalaria spectabilis (Roth), Sánchez et al. (2003a) obtuvieron resultados satisfactorios, ya que estos tratamientos fueron los más adecuados para mejorar la germinación y la emergencia de las plántulas para cada una de las especies, en combinación con tratamientos de escarificación térmica y ácida. Además, la combinación de tratamientos incrementó la termotolerancia de los tres cultivares y en M. invisa se hizo más evidente esta respuesta.

Cuando se estudiaron en especies de árboles pioneras, como Trichospermum mexicanum (DC.) Baill., Cecropia schreberiana Miq., Talipariti elatum Sw., y Guazuma ulmifolia Lam., se obtuvieron incrementos en la velocidad de germinación y en el vigor de las plántulas en condiciones de estrés hídrico, calórico y lumínico (Sánchez et al., 1998; Sánchez et al., 2003b). Lo planteado anteriormente demuestra la efectividad de estos procedimientos no sólo para plantas hortícolas, sino también para especies forestales pioneras, que desempeñan un papel muy importante en la repoblación de los bosques tropicales (Herrera, Ulloa, Valdés-Lafont, Priego y Valdés, 1997; Muñoz, 1998).

Por otra parte, la utilización de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación está limitada en la práctica agrícola, fundamentalmente, por: 1) la falta de estandarización u optimización de ellos en cada especie, variedad o lote en particular (Bradford, 1986; 1990); 2) lo costoso de su aplicación para grandes volúmenes de semillas (Henckel, 1982); y 3) la inadecuada extensión y divulgación, entre


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los campesinos y productores, de los resultados obtenidos en especies de interés agrícola como hortalizas y gramíneas (Sánchez, 1997; Orta et al., 1998).

En general, el estado del conocimiento actual sobre los tratamientos de hidratación-deshidratación ha acumulado bastantes evidencias de las potencialidades de estos para su utilización en la práctica agrícola, como vía alternativa para mejorar el comportamiento agronómico de las especies cultivadas (tabla 1). Sin embargo, existen muy pocas experiencias donde se han aplicado con éxito los referidos procedimientos en semillas de L. leucocephala. Por consiguiente, se dispone de suficientes razones para continuar investigando la respuesta que promueven los tratamientos hídricos, no sólo por su interés teórico, sino por la significación práctica que podría tener su aplicación para acelerar el crecimiento de las especies forestales empleadas en los sistemas silvopastoriles. Además, la aplicación de los tratamientos de hidratación-deshidratación en combinación con algún tipo de tratamiento pregerminativo de choque ácido, podría contribuir al incremento de la tolerancia de las plantas a la acidez de los suelos, que en el caso de la ganadería comprenden el 29% de los empleados en el país.

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Tabla 1. Tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación en semillas de especies cosechadas, métodos y resultados prácticos. Las soluciones de polietilenglicol (PEG) utilizadas por los autores fueron de peso molecular entre 6 000 y 8 000.

Especie Sustancia Temperatura de imbibición

(oC)

Duración (días) Resultados Referencias

Algodón (Gossypium hirsutum L.) Apio (Apiium graveolens L.) Arroz (Oryza sativa L.) Cebada (Hordeum vulgara L.) Cebolla (Allium cepa L.) Col (Brassica oleracea L.) Chícharo (Pisum sativum L.) Espinaca (Spinacea oleracea L.) Garbanzo (Cicer arietinum L.)

H2O

PEG PEG

H2O

PEG

Na2HPO4 Al(NO3)3

PEG

Glicerol

PEG

PEG

PEG

H2O

25

15 15

30

10

10 10

15

15

10 y 22

15

10

20

0.66

14 14

0.5-1.5

1-8 1

0.83

14

14

1 y 21

4.8

14

0.33

Incrementa la germinación bajo estrés hídrico. Acelera la germinación. Acelera la emergencia en casa de vegetación. Incrementa el peso fresco de las plantas. Incrementa la emergencia y el vigor de las plántulas. Acelera la cosecha e incrementa los rendi-mientos. Acelera y uniforma la germi-nación. Incrementa el rendimiento. Acelera la germinación. Acelera la germinación. Reduce la germinación. Acelera la germinación y la velocidad de crecimiento de los tallos y las raíces. Incrementa la germinación en altas temperaturas. Incrementa la emergencia de las plántulas, el crecimiento y la producción en granos. También la tolerancia a la sequía.

Prisco et al. (1992) Brocklehurst y Dearman (1983a) Brocklehurst y Dearman (1983b) Harris, Joshi, Khan, Gothkal y Sudhi (1999) Bodsworth y Bewley (1981) Chatterjee y Singh (1983) Brocklehurst y Dearman (1983b) Khan et al. (1978) Hegarty (1977) Khan et al. (1978) Atherton y Faroque (1983) Harris et al. (1999)

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(Continuación tabla 1)

Especie Sustancia Temperatura de imbibición

(oC)


Girasol (Helianthus annuus L.) Lechuga (Lactuca sativa L.) Maíz (Zea mays L.) Melón de castilla (Cucumis melo L.) Melón de agua (Citrullus lanatusThunb.) Nabo (Brassica rapa L. y B. napus L.)

PEG

PEG

PEG

PEG + reguladores crecimiento

PEG

PEG

H2O

KNO3 KNO3 y H2O

H2O

H2O + regulador

de crecimiento

15

15

15

15

16-20

15

20 y 30

25

20 y 30

10 y 23

23

3-5

1-7

0.38

2-3

1

1-8

0.33 – 1 6

0.25-0.75

0.83 – 3.5

0.58 - 1

Incrementa la germinación a temperaturas subóptimas. Restaura la capacidad germi-nativa inicial de semillas sometidas a envejecimiento acelerado. Mejora la germinación y la emergencia en campo. Evita la termoinhibición e incrementa la emergencia en campo. Mejora la germinación en altas temperaturas de semillas pele-tizadas. Acelera y uniforma la germi-nación a bajas temperaturas. Incrementa la germinación, la emergencia de las plántulas y los rendimientos. Mejora la germinación de semillas frescas y almacenadas. Reduce el tiempo para germinar y emerger a bajas temperaturas. No tiene efecto en altas tempe-raturas. Incrementa y sincroniza la germinación y la emergencia a bajas temperaturas. Incrementa el establecimiento bajo estrés hídrico, salino y en suelo inoculado con hongos patógenos.

Chojnowski et al. (1997) Bailly et al. (1998) Cantliffe, Shuler y Guedes (1981) Prusinski y Khan (1993) Valdés, Bradford y Mayberry (1985) Bodsworth y Bewley (1981) Harris et al. (1999) Nascimento y West (2000) Demir y Venter (1999) Zheng, Wilen, Slinkard y Gusta (1994) Zheng, Gao, Wilen, Kirkland y Gusta (1998)

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(Continuación tabla 1)

Especies Sustancias Temperatura de imbibición

(oC)


Pepino (Cucumis sativus L.) Perejil (Petroselinum hortense Hoffm) Pimiento (Capsicum annuum L.) Pino (Pinus elliotti Engelm) Sorgo (Sorghum bicolor L.) Soya (Glycine max L.) Tomate (Lycopersicon esculentum Mill) Trigo (Triticum aestivum L.) Zanahoria (Daucus carota L.)

H2O

PEG

KNO3

KH2PO4 +

(NH4) HPO4

PEG y H20

PEG

PEG

PEG

PEG y H2O

PEG

PEG

25

15

20-22

27-29

25

25

10

15

25

10

15

1.2

21 6 3

0.4 - 3

6

1-8

4-10 3

1-8

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Incrementa la germinación en semillas frescas, pero no en las almacenadas. Incrementa el vigor de las plántulas y los rendimientos. Acelera la germinación e incrementa la producción. Acelera la germinación y la emergencia, e incrementa el peso seco de las plantas. Acelera la germinación y los rendimientos en casa de vegetación. Incrementa la germinación en semillas con potencial germina-tivo inicial reducido o nulo. Incrementa y acelera la germi-nación. Acelera la germinación a bajas temperaturas. Acelera la emergencia y la velocidad de crecimiento de las plantas. Incrementa la germinación y rendimientos. Mejora la germinación. Acelera la emergencia

Sánchez et al. (1999b) Heydecker y Coolbear (1977) Rivas, Surdstrom y Edwards (1984) Yaklich y Orzolek (1977) Sánchez et al. (1999a) Haridi (1985) Bodsworth y Bewley (1981) Khan et al. (1978) Orta, Sánchez, Muñoz y Calvo (1993, 1998) Bodsworth y Bewley (1981) Brocklehurst y Dearman (1983a)

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CAPITULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL II.1 Sitio de colecta de las semillas

Se utilizaron semillas envejecidas y frescas de L. leucocephala cv. Cunningham, procedentes del banco de germoplasma de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes “Indio Hatuey”, provincia de Matanzas, Cuba (81º 21’ O, 22º 7’ N) a una altura de 19,01 msnm. Las simientes fueron tomadas de frutos maduros en el mes de noviembre; la colecta de las semillas frescas se realizó en el 2002 y la de las envejecidas en 1984. Todas las semillas se almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso.

El clima se corresponde con el de sabana tropical, característico del país, en el que predominan las condiciones tropicales marítimas con una marcada estacionalidad de las lluvias, donde las masas de aire ártico y polares continentales hacen sentir su influencia en el período poco lluvioso, que se enmarca entre los meses de noviembre y abril (Academia de Ciencias de Cuba, 1989). Las medias anuales de las precipitaciones fueron de 1 424,3 y 1 670,1 mm en 1984 y el 2002, respectivamente. El suelo donde se encontraba este cultivar es de topografía llana, clasificado como Ferralítico Rojo lixiviado (Hernández et al., 1999) y caracterizado por presentar una textura arcillosa y un pH (H2O) de 6,3 (Iglesias, 1996). II.2 Descripción de la investigación II.2.1 Experimento 1. Determinación de la temperatura óptima de germinación

Se diseñó un experimento de clasificación simple unifactorial y cinco réplicas (25 semillas cada una) para conocer la respuesta germinativa de las semillas a diferentes temperaturas del sustrato. Antes de la siembra todas las semillas se sometieron a inmersión en agua a 80ºC durante dos minutos, tal como ha sido recomendado por González et al. (1998) para la eliminación de la dormancia exógena (por impermeabilidad de las cubiertas al agua) que presentan las semillas frescas y envejecidas de esta accesión de L. leucocephala. Se utilizó una temperatura constante de 25ºC y tres niveles de temperatura fluctuante: 25/30ºC, 25/35ºC y 25/40ºC, con una alternancia de ocho horas para la temperatura más elevada y 12 horas para 25ºC, con una transición entre ambas de cuatro horas.

Las pruebas de germinación se realizaron en placas de Petri (9 cm de diámetro) sobre papel de filtro humedecido con agua destilada de pH (H2O) 6,8. Las placas se colocaron en una cámara de crecimiento (Gallenkamp, Londres) equipada con lámparas fluorescentes de 40 W, situadas a 20 cm del nivel de las placas, con un fotoperíodo de ocho horas-luz que coincidió con el termoperíodo de mayor temperatura. El conteo de la germinación se realizó a diario durante 15 días. Se determinó el porcentaje de germinación final, tanto en semillas frescas como en envejecidas, y la velocidad de germinación mediante el índice T50, que representó el tiempo (días) necesario para alcanzar el 50% de germinación en la muestra. Altos valores de esta variable implican una menor velocidad de germinación. Este último índice se estimó sólo para semillas frescas. También se determinó el porcentaje de semillas muertas mediante la prueba de TZ (ISTA, 1999). II.2.2 Experimento 2. Determinación del patrón de imbibición de las semillas en agua

Las semillas previamente escarificadas (como se describió anteriormente) se colocaron en placas de Petri (9 cm de diámetro) sobre papel de filtro humedecido con agua destilada (pH: 6,8), al rango de temperatura óptimo determinado en el experimento 1 y bajo luz blanca fluorescente (con similar termoperíodo y fotoperíodo al descrito anteriormente). En diferentes tiempos de imbibición, de cuatro horas durante dos días, se pesaron para determinar la dinámica de absorción de agua en relación con el peso fresco. Para tal propósito se tomaron cinco réplicas de 50 semillas cada una por punto de imbibición. El contenido de humedad inicial de las semillas se determinó mediante el secado de estas durante 17 horas en una estufa mantenida a 103 ± 2ºC (ISTA, 1999). La hidratación de las semillas se consideró completa hasta el inicio de la germinación visible.


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II.2.3 Experimento 3. Aplicación de tratamientos hídricos y pruebas de germinación bajo condiciones de estrés calórico

Se aplicó un diseño de clasificación simple con arreglo factorial de los tratamientos y cinco réplicas

(25 semillas cada una), para conocer la respuesta germinativa de semillas frescas y envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham a diferentes tratamientos pregerminativos y condiciones controladas de estrés calórico del sustrato.

Todas las semillas antes de la siembra se sometieron a escarificación térmica y posteriormente se combinaron con diferentes tratamientos de hidratación parcial en agua destilada de pH (H2O) 6,8, que representaron distintos niveles de humedad que pueden alcanzar según su patrón de absorción de agua. La deshidratación de las semillas se llevó a cabo al aire durante 48 horas, hasta alcanzar aproximadamente el contenido inicial de humedad de las semillas (12-15% con base a la masa fresca).

Los tratamientos pregerminativos utilizados en semillas frescas fueron: T1: escarificación térmica en agua a 80ºC durante 2 min. (Control). T2: T1 + hidratación parcial hasta el final de la fase I (8 horas). T3: T1 + hidratación parcial hasta la mitad de la fase II (20 horas). T4: T1 + hidratación parcial hasta 2 horas antes del final de la fase II (28 horas).

En las semillas envejecidas los tratamientos pregerminativos fueron: T1: escarificación térmica en agua a 80ºC durante 2 min.(Control). T2: T1 + hidratación parcial durante 2 horas. T3: T1 + hidratación parcial durante 4 horas. T4: T1 + hidratación parcial durante 8 horas.

Las pruebas de germinación se realizaron bajo condiciones de termoperíodo y fotoperíodo similares a

las descritas previamente en las pruebas de determinación de la temperatura óptima de germinación. El porcentaje de germinación se determinó a diario durante 15 días. En el caso de las semillas frescas se estimó la velocidad de germinación mediante el índice T50. II.2.4 Experimento 4. Tratamientos hídricos para incrementar la emergencia y el vigor de las

plántulas en suelo de pH neutro

El experimento se realizó en el mes de mayo del 2003, en áreas del Instituto de Ecología y Sistemática-CITMA, en el municipio de Boyeros, Ciudad de La Habana (82º 21’ O, 23º 01’ N), a una altura de 71 msnm. El clima es subtropical húmedo, con una época lluviosa que se extiende de mayo a octubre y un período seco de noviembre a abril (Academia de Ciencias de Cuba, 1989). El suelo es Fersialítico Amarillento ócrico (Hernández et al., 1999),.y sus características químicas son las siguientes: pH (H20): 7,10; materia orgánica: 2,8%, según Walkley-Black; fósforo asimilable: 6,2 mg g-1, según Machiguin; el potasio cambiable: 0,29 cmol Kg-1, por fotometría de llama; el nitrógeno total: 0,22%, por micro Kjeldahl (Norma Ramal, 1987, 1988). La textura del sustrato es franco arcillosa.

Las semillas frescas provenientes de los tratamientos pregerminativos T1, T2, T3 y T4 (descritos anteriormente) se sembraron en potes plásticos de 0,85 dm3 de capacidad, a 2 cm de profundidad. En cada pote se colocaron cinco semillas y la siembra se realizó bajo cielo abierto. El diseño utilizado fue completamente aleatorizado, con 10 réplicas por tratamiento. La siembra se realizó en los primeros días de mayo del 2003 y se desmontó al cabo de los 90 días. El suelo se regó diariamente durante los primeros 15 días y luego tres veces por semana a capacidad de campo.

El conteo de la emergencia se realizó diariamente durante 15 días, una vez iniciado el proceso. Se determinó el porcentaje de emergencia final de las plántulas y la velocidad de emergencia, expresada ésta última variable por el tiempo en que se alcanzó el 50% de emergencia en la muestra (T50).

A los 20 días después de la siembra se practicó el entresaque de las plántulas y se dejó un individuo por pote. Al final del experimento (90 días) se determinaron las siguientes variables de vigor: masa seca (g) de las raíces y de las partes aéreas (hojas, ramas y tallo), determinadas mediante el secado de las muestras durante 48 horas en una estufa a 70ºC. La distribución de la biomasa en sus componentes aéreos y subterráneos se calculó por la relación masa seca raíz/parte aérea total (g g-1).


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Las condiciones microambientales durante el período de experimentación fueron las siguientes: temperatura promedio: 26,5ºC (máxima 32,2ºC; mínima, 21,9ºC) y humedad relativa promedio: 82,0%. II.2.5 Experimento 5. Aplicación de tratamientos hídricos mas choque ácido y pruebas de

germinación en sustrato ácido

El tratamiento de choque ácido se aplicó a las semillas frescas durante el período de hidratación del tratamiento robustecedor T4 (descrito en el experimento 3 para semillas frescas), según la metodología propuesta por Sánchez et al. (2001b) para la combinación de tratamientos pregerminativos de tipo robustecedor. Las semillas fueron sometidas a hidratación en agua acidificada (choque ácido) de pH (H2O) 5,0 durante una hora, y el momento de aplicación del choque ácido fue tres horas antes del inicio de la germinación, para así detener el proceso de imbibición dos horas antes de la primera señal visible de la germinación.

Las semillas se hidrataron a temperatura alterna de 25/30ºC bajo luz blanca fluorescente (con termoperíodo y fotoperíodo similar al descrito anteriormente). Para la aplicación de los tratamientos de hidratación parcial se utilizó agua destilada de pH (H2O) 6,8. El choque ácido se logró con agua acidificada preparada con HCl. La deshidratación se realizó a 25 ± 2ºC y 45% de humedad relativa durante 48 horas, hasta alcanzar aproximadamente el contenido inicial de humedad de las semillas. Todas las semillas sometidas a los tratamientos de choque ácido se enjuagaron con agua destilada durante 10 minutos previos a su deshidratación y/o posterior transferencia a las condiciones de siembra.

Los tratamientos pregerminativos utilizados fueron: T1: escarificación térmica en agua a 80ºC durante 2 min. (Control). T2: T1+ hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes de la germinación. T3: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a agua acidificada (choque ácido), 3 horas antes

de la germinación. T4: T1 + hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes de la germinación y deshidratación previa

a la siembra. T5: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a choque ácido, 3 horas antes de la germinación,

y seguidamente deshidratadas previa a la siembra.

El tratamiento T2 se utilizó como control del tratamiento de choque ácido (T3) y el tratamiento T5 representó la combinación de los procedimientos de hidratación-deshidratación de las semillas con los de choque ácido.

Las pruebas de germinación se realizaron a temperatura alterna de 25/30ºC y bajo luz blanca fluorescente (con termoperíodo y fotoperíodo similares al descrito en el experimento 1). Las semillas se colocaron en placas sobre papel de filtro humedecido con agua acidificada (pH: 5,5), la cual se cambió en días alternos para evitar cambio del pH. El conteo de la germinación se realizó a diario durante cuatro días, y se determinaron el porcentaje de germinación final y la velocidad de germinación (expresado por el índice T10, que representó el tiempo para alcanzar el 10% de germinación en la muestra) II.2.6 Experimento 6. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la emergencia y el

vigor de las plántulas en suelo de pH ácido

Las pruebas de vigor de las plántulas se determinaron en condiciones experimentales similares a las descritas en el experimento 4. Sólo cambió el tipo de suelo empleado. El suelo ácido proviene de la microestación de pastos de Cascajal, localizada en la provincia de Villa Clara, Cuba (30º 21´ E y 20º 21´ O) a una altura de 60 msnm. El sustrato es Alítico de baja actividad arcillosa, de textura Loam-arenosa y baja fertilidad natural (Hernández et al., 1999). Las características químicas son las siguientes: pH (H2O): 4,9; materia orgánica: 2,50%, según Walkley-Black; fósforo asimilable: 13 mg kg-1, según Machiguin; potasio cambiable: 0,9 cmolkg-1, por fotometría de llama; nitrógeno total: 0,41% por micro Kjeldahl (Norma Ramal, 1987, 1988).

Los tratamientos pregerminativos utilizados fueron: T1: escarificación térmica en agua a 80ºC durante 2 min. (Control). T2: T1+ hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes de la germinación.


18

T3: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a agua acidificada (choque ácido), 3 horas antes de la germinación.

T4: T1 + hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes de la germinación y deshidratación previa a la siembra.

T5: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a choque ácido, 3 horas antes de la germinación y seguidamente deshidratadas previa a la siembra.

El experimento se realizó bajo cielo abierto, el suelo se regó a diario durante los primeros días y luego

tres veces por semana, a capacidad de campo, con agua destilada o de lluvia. Las variables estudiadas fueron similares a las descritas en el experimento 4; sólo cambió la velocidad de emergencia de las plántulas, que en este caso se estimó por el T20 (que representa el 20% de emergencia en la muestra). II.3 Análisis estadístico

Las variables estudiadas para cada experimento fueron sometidas a las pruebas de Bartlett y Komolgorov-Smirnov para conocer si cumplían con las premisas de homogeneidad de varianza y normalidad, respectivamente. Los datos expresados en porcentaje se transformaron en arcsen √% y se procesaron todos por ANOVA de clasificación simple o factorial, según el diseño de cada experimento. Para la aplicación de las pruebas de comparación múltiple de medias a posteriori se siguió el criterio propuesto por Blanco (2001). La relación entre el porcentaje de germinación final y el porcentaje de emergencia final de las plántulas se estableció mediante un análisis de correlación lineal. El procesamiento estadístico se realizó por el programa STATITCF versión 4, 1987-1988-1991.

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19

CAPITULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1 Experimento 1. Determinación de la temperatura óptima de germinación

En las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham, tanto el porcentaje de germinación final como la velocidad de dicho proceso se afectaron significativamente (P≤0,001) por la temperatura del sustrato (fig. 2). Los mejores resultados para incrementar y acelerar significativamente la germinación se obtuvieron a temperatura alterna de 25/30ºC. En cambio, la temperatura alterna de 25/40ºC fue subletal para la ocurrencia de la germinación de las semillas de este cultivar; en dichas condiciones de siembra se incrementó considerablemente el porcentaje de semillas muertas (fig. 3) con relación a los otros rangos de temperatura ensayados.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

25 25/30 25/35 25/40

Temperatura (ºC)

% d

e ge

rmin

ació

n

0

1

2

3

4

5

6

7

Velo

cida

d de

ger

min

ació

n (d

ías)

Germinación finalVelocidad de germinación

Fig. 2. Efecto de la temperatura del sustrato en el porcentaje y la velocidad de germinación de

semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham (las líneas verticales representan el error estándar de las medias).

Los resultados con la temperatura constante de 25ºC no difirieron significativamente de los

alcanzados a 25/35ºC, aunque en este último termoperíodo se incrementó significativamente la velocidad de germinación con relación a lo obtenido a 25ºC y a 25/40ºC.

En general, los resultados evidenciaron que la germinación de las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham se desencadena tanto a temperatura constante como alterna, aunque la máxima germinación se alcanzó en el rango de temperatura de 25/30ºC. McDonald (2002) demostró que las semillas frescas de L. leucocephala mostraron la mayor velocidad de germinación en un amplio rango de temperaturas, que abarcó desde 24ºC hasta 36ºC. En cambio, Souza-Filho (2000) obtuvo la máxima germinación a temperatura constante de 35ºC y alterna de 20/35ºC, 20/40ºC, 25/35ºC y 25/40ºC.

Por su parte, el termoperíodo de 25/40ºC pudo haber sido inefectivo para la germinación, por inducir termoinhibición de eventos bioquímico-fisiológicos relacionados con el proceso germinativo (por ejemplo: síntesis de proteínas, elongación y división celular, etc.), tal como ha sido informado en condiciones de estrés calórico para semillas de hortalizas por Cantliffe, Fischer y Nell (1984); Khan (1992) y Bray (1995). Este fenómeno posiblemente se deba también al agotamiento de las reservas nutricionales destinadas para la germinación (Bonner, 1998).

Otra explicación posible al comportamiento germinativo obtenido a 25/40ºC podría ser el grado de maduración o vigor germinativo que tienen las semillas del lote empleado en el momento de la colecta o


20

el manejo posterior de estas, como ha sido informado en diversas especies de interés agrícola (Anderson y Milberg, 1998; Sánchez et al., 2001a).

0

20

40

60

80

100

25 25/30 25/35 25/40

Temperaturas (ºC)

% d

e se

mill

as m

uert

as

Fig. 3. Efecto de la temperatura del sustrato en el porcentaje de semillas

muertas de L. leucocephala cv. Cunningham (las líneas verticales representan el error estándar de las medias).

En las semillas envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham no se obtuvo germinación a

temperatura constante de 25ºC, ni en los termoperíodos de 25/35ºC y 25/40ºC, excepto en el termoperíodo de 25/30ºC; donde se alcanzó un 5,3% de germinación final al cuarto día de iniciada la siembra. Por consiguiente, la temperatura alterna de 25/30ºC también puede considerarse el rango óptimo para la imbibición de las semillas frescas y envejecidas de este cultivar, dado que se obtuvo la máxima germinación en el menor tiempo posible. Este fenómeno ha sido bien documentado en un gran número de semillas de importancia agrícola (Welbaum, Shen, Olouch y Jett, 1998; Audoh y Kobata, 2001). III.2 Experimento 2. Determinación del patrón de imbibición de las semillas en agua

Cuando las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham se hidrataron a temperatura alterna de 25/30ºC, siguieron un patrón trifásico de absorción de agua (fig. 4), tal como sucede en la generalidad de las semillas de todos los cultivos (Bewley y Black, 1994; Bewley, 1997; Sánchez et al., 2001a, b). El final de la fase I se alcanzó a las 8 horas y se caracterizó por una rápida imbibición, que según Bewley y Black (1994) se debe a factores puramente físicos, en particular al componente mátrico del potencial hídrico de los tejidos. La fase II fue un largo proceso de absorción de agua, que hasta las 25 horas fue un segmento estacionario de la curva; según Bewley (1997), esta fase se asocia con la mayoría de los eventos metabólicos relacionados con la germinación. La última etapa de la curva de imbibición (fase III) representó la emergencia de la radícula (i.e., germinación visible), que se alcanzó al cabo de las 30 horas de hidratación de las semillas.

El comportamiento de absorción de agua alcanzado en las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham fue normal, debido a que no presentaron ningún tipo de dormancia innata después de la escarificación. Obroucheva y Antipova (1997) plantearon que el patrón trifásico de absorción de agua sólo aparece en aquellas semillas que no presentan profundos mecanismos de dormancia innata. También este patrón de imbibición de las semillas se ha observado en otras especies forestales cubanas, tales como C. schreberiana, T. elatum, G. ulmifolia, T. mexicanum y Calophyllum pinetorum Bisse (Sánchez, Muñoz, Remis y Torres-Arias, 2002; Sánchez et al., 2004). Esto demuestra que las tres fases de absorción de agua no son únicas para las especies cultivadas, como las hortalizas.


21

En las semillas envejecidas no se observó un patrón trifásico de absorción de agua (fig. 5). Sin embargo, a partir de las 10 horas de imbibición se apreció un incremento lento y sostenido del contenido de humedad, sin alcanzar el inicio de la germinación visible o fase III durante el tiempo de imbibición a que fueron sometidas las semillas (50 horas). Este resultado demostró la incapacidad del lote empleado para germinar en dichas condiciones de siembra, lo cual se debió, posiblemente, a la falta de vigor germinativo causada por el deterioro celular a que estuvieron sometidas las semillas durante su almacenamiento. Resultados similares obtuvieron Sánchez et al. (1999a) en semillas de pimiento con bajo poder germinativo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (horas)

% d

e hu

med

ad

Fase I Fase II Fase III

Fig. 4. Curva de hidratación de semillas frescas de L. leucocephala cv.

Cunningham, en agua a 25/30ºC (las barras verticales muestran el error estándar de la media (±) cuando es más grande que el símbolo; las líneas verticales representan la duración de cada fase de hidratación; y la flecha la primera señal visible de la germinación).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50Tiempo (horas)

% d

e hu

med

ad

Fig. 5. Curva de hidratación de semillas envejecidas de L. leucocephala cv.

Cunningham, en agua a 25/30ºC (las barras verticales muestran el error estándar de la media (±) cuando es más grande que el símbolo).


22

III.3 Experimento 3. Tratamientos hídricos para incrementar la germinación bajo condiciones de estrés calórico

La respuesta germinativa de las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham dependió

significativamente (P≤0,01) de la interacción que se estableció entre el tratamiento pregerminativo aplicado y la temperatura del sustrato (tabla 2). Resultados similares han sido obtenidos por Welbaum y Bradford (1991) y Sánchez et al. (2001b) en semillas de diversos cultivos sometidas a diferentes tratamientos de hidratación-deshidratación y condiciones físicas del medio durante su siembra.

Tabla 2. Efecto de los tratamientos pregerminativos y la temperatura del sustrato en la germinación de semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham (la velocidad de germinación se expresó por el T50).

Temperatura (ºC) Tratamientos pregerminativos

25 25/30 25/35 25/40 Germinación final (%) T1 T2 T3 T4 ES ±

55,6b 63,3a 62,6a 66,6a 2,3*

68,0 68,0 68,0 64,0

1,0 NS

57,3 57,3 62,0 64,0

1,6 NS

29,3c 46,3b

54,6ab 62,6a

7,1** Velocidad de germinación (días)

T1 T2 T3 T4 ES ±

6,2a 2,4b 1,7b 2,0b

1,0**

1,7 2,0 1,6 1,7

0,0 NS

4,7b 2,2a 1,8a 2,9a 0,6 *

DND1 DND

3,2b 1,6c

0,8** T1: escarificación térmica (agua a 80ºC durante 2 min). T2: T1 + hidratación parcial hasta final de la fase I (8 horas). T3: T1 + hidratación parcial hasta mitad de la fase II (20 horas). T4: T1 + hidratación parcial hasta final de la fase II (28 horas). a,b,c Medias con letras distintas, por columnas, difieren significativamente a (P≤0,05) (Duncan, 1955) 1 Datos no disponibles *P≤0,05; ** P≤0,01; NS: no significativo Sin embargo, sólo en las semillas que se colocaron a temperatura fija de 25ºC y alterna de 25/40ºC,

los tratamientos de hidratación-deshidratación fueron adecuados para incrementar significativamente el porcentaje de germinación final con relación al tratamiento control (T1), y se observaron los mayores incrementos con el tratamiento pregerminativo T4 (hidratación parcial de las semillas hasta 2 horas antes del final de la fase II). No obstante, los resultados del tratamiento T4 no difirieron significativamente de los alcanzados con los tratamientos pregerminativos T2 y T3 (hidratación parcial hasta el final de la fase I o la mitad de la fase II de la curva de imbibición, respectivamente) cuando las semillas se colocaron a 25ºC, ni de los obtenidos con el procedimiento T3 a 25/40ºC. En este último rango de temperatura, la respuesta germinativa del tratamiento T2 fue significativamente superior a la del tratamiento T1 (control), pero inferior a la alcanzada con los procedimientos T3 y T4.

Con los tratamientos pregerminativos T2, T3 y T4 también se aceleró significativamente la velocidad de germinación a temperatura constante de 25ºC y en las alternas de 25/35ºC y 25/40ºC, y fue el tratamiento T4 el óptimo para acelerar la germinación, sobre todo al incrementarse el estrés calórico del medio. Además, llama la atención que en la temperatura alterna de 25/35ºC no se logró incrementos significativos del porcentaje de germinación inicial con los tratamientos pregerminativos aplicados, pero se aceleró significativamente la velocidad de germinación. En este rango de temperatura con el tratamiento T3 se logró el 50% de la germinación en menos de dos días; en cambio con el control este resultado se alcanzó aproximadamente en cinco días.

Este resultado es interesante, debido a que son las condiciones de estrés las que usualmente encuentran las semillas cuando llegan al suelo (Bradford, 1995; Sánchez et al., 2001a; 2003b). También


23

se conoce que la velocidad de germinación está correlacionada positivamente con una emergencia rápida en condiciones de campo y un mayor desarrollo vegetativo de las plántulas (Bonner, 1998; Sánchez et al., 2003b); por consiguiente, tales evidencias demuestran la importancia práctica que tiene el incremento de la velocidad de germinación alcanzado con los tratamientos hídricos.

Diversos autores (Henckel, 1964; Welbaum y Bradford, 1991; Bray, 1995; McDonald, 2000; Audoh y Kobata, 2001) lograron mejorar el comportamiento germinativo de diferentes cultivos, bajo condiciones ecológicas muy variadas, al acondicionar o robustecer las semillas antes de la siembra. Ellos concluyeron que tales efectos se deben a la activación que producen los referidos tratamientos en el aparato metabólico relacionado con la germinación, y en los numerosos procesos bioquímico-fisiológicos de tolerancia al estrés que permanecen latentes, estos últimos bajo condiciones ambientales óptimas (Kozlowski y Pallardy, 2002). Entre estos mecanismos, según Bradford (1995) y Bray (1995), sobresalen el incremento de la síntesis de proteínas (i.e., cambios cuantitativos) y la disminución del potencial mínimo para que ocurra la germinación (hacia valores más negativos).

Sin embargo, Lima-e-Borges, Borges y Paula (1997) informaron que la germinación de semillas de L. leucocephala disminuyó cuando fueron sometidas a diversos ciclos de hidratación-deshidratación. Estos resultados podrían deberse a la falta de estandarización de los tratamientos pregerminativos para cada lote de semillas empleado (Bradford, 1995). También se conoce que la efectividad de los tratamientos hídricos depende del grado de maduración fisiológica que tengan las semillas en el momento de su colecta (Bradford, Steiner y Trawatha, 1990).

En las semillas envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham los tratamientos hídricos utilizados incrementaron significativamente el porcentaje de germinación final con relación al tratamiento control (T1) en todos los termoperíodos ensayados, excepto a 25/40ºC que no se logró germinación (tabla 3). Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento pregerminativo T3 (hidratación parcial en agua durante 4 horas). Sin embargo, cuando las semillas se hidrataron durante 8 horas (T4) se alcanzaron resultados inferiores al tratamiento T2 (hidratación parcial durante 2 horas) y al T3. Al parecer, los períodos prolongados de hidratación parcial (hasta aproximadamente el final de la fase I, tratamiento T4) agotaron la viabilidad de las semillas envejecidas de esta especie, fenómeno que posiblemente se debió a que el procedimiento T4 indujo una utilización rápida de las reservas de energía destinadas para la germinación.

Tabla 3. Efecto de los tratamientos pregerminativos y la tempe-ratura del sustrato en el porcentaje de germinación final de semillas envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham.

Temperatura (ºC) Tratamientos

pregerminativos 25 25/30 25/35 T1 T2 T3 T4

ES ±

0,0 10,6b 17,3a 5,3c

1,8**

5,3c 16,0b 28,0a 8,0c

5,0**

0,0 0,0

8,1a 1,3b

3,4** T1: escarificación térmica (agua a 80ºC durante 2 min) T2: T1 + hidratación parcial en agua durante 2 horas T3: T1 + hidratación parcial en agua durante 4 horas T4: T1 + hidratación parcial en agua durante 8 horas a,b Medias con letras distintas, por columnas, difieren significativamente

(P≤0,05) (Duncan, 1955)

La efectividad de los tratamientos pregerminativos para revigorizar las semillas ha sido comprobada en diversas especies de interés agrícola y forestales pioneras (McDonald, 1999, 2000; Sánchez et al., 2004). Según Bailly, Benamar, Corbineau y Côme (1998, 2000) y McDonald (1999, 2000) estos procedimientos son beneficiosos porque promueven los mecanismos enzimáticos de reparación de membranas y también activan los mecanismos antioxidantes, eliminadores de radicales libres, que son los principales responsables del envejecimiento de las semillas (McDonald, 1999).

En general, los resultados hallados en las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham con la aplicación combinada de los tratamientos de escarificación térmica y los de hidratación parcial en agua,


24

pueden considerarse muy satisfactorios para incrementar la termotolerancia de este cultivar y, por consiguiente, el establecimiento de las plántulas bajo plena exposición solar en condiciones de vivero o de campo. Por su parte, los efectos logrados en semillas envejecidas (18 años de almacenadas a temperatura ambiente) con los tratamientos hídricos demostraron que éstos son muy promisorios para mejorar el vigor germinativo de las semillas envejecidas de esta especie; dichos efectos podrían ser mayores en condiciones naturales, si se tiene en cuenta que el envejecimiento de las semillas también afecta el establecimiento, al aumentar el número de plántulas anormales y disminuir la velocidad de crecimiento (McDonald, 2000). III.4 Experimento 4. Tratamientos hídricos para incrementar la emergencia y el vigor de las

plántulas en suelo de pH neutro

Todos los tratamientos de hidratación parcial aplicados resultaron adecuados para incrementar la emergencia de las plántulas de L. leucocephala cv. Cunningham, en condiciones de vivero, con relación al tratamiento control (tabla 4). Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento pregerminativo T4 (hidratación parcial de las semillas hasta 2 horas antes del final de la fase II), aunque los efectos obtenidos con dicho procedimiento no difirieron significativamente de los alcanzados con los tratamientos T2 y T3 (hidratación parcial de las semillas hasta el final de la fase I y mitad de la fase II, respectivamente). Tabla 4. Efecto de los tratamientos pregerminativos en la emergencia y el vigor de las plántulas de L.

leucocephala cv. Cunningham (la velocidad de emergencia se expresó por el T50).

Masa seca (g) Tratamientos

pregerminativos

Emergencia final (%)

Velocidad emergencia

(días) Aérea Subterránea Total Masa seca raíz/aérea

T1 T2 T3 T4

64,0b

88,0a 84,0a 98,0a

6,4a 4,8b

5,6ab 3,1c

1,8b 1,8b 2,0b 2,4a

0,6b 0,5b 0,6b 0,9a

2,5b 2,4b 2,7b 3,3a

0,35 0,30 0,31 0,35

ES ± 7,1** 0,7*** 0,1** 0,1** 0,2** 0,0 NS T1: escarificación térmica (agua a 80ºC durante 2 min). T2: T1 + hidratación parcial hasta final de la fase I (8 horas). T3: T1 + hidratación parcial hasta mitad de la fase II (20 horas). T4: T1 + hidratación parcial hasta 2horas antes del final de la fase II (28 horas). a,b,c Medias con letras distintas, por columnas, difieren significativamente (P≤0,05) (Duncan, 1955) **P≤0,01; *** P≤0,001; NS: no significativo.

También existió una correspondencia casi exacta entre el porcentaje de emergencia final obtenido en vivero y el porcentaje de germinación final alcanzado en laboratorio, bajo condiciones de estrés calórico (25/40ºC; ver tabla 2) y similares tratamientos pregerminativos (fig. 6). Al incrementarse la germinación con los tratamientos hídricos, se incrementó linealmente la emergencia final de las plántulas en vivero (r = 0,88 ***, P≤0,001).

Sin embargo, cabe señalar que los porcentajes de emergencia obtenidos en vivero fueron superiores a los alcanzados en las condiciones de laboratorio, bajo cualquier temperatura y tratamiento pregerminativo empleado. Al parecer, las condiciones ambientales a que estuvieron expuestas las semillas en condiciones de vivero favorecieron la mayor emergencia de las plántulas. Este es un resultado sumamente interesante, debido a que generalmente la germinación en laboratorio es mayor que la emergencia de las plántulas en condiciones de vivero o de campo (Khan, 1992).

Los efectos obtenidos con los tratamientos hídricos (en particular con el T4) demostraron que dichos procedimientos son adecuados, tanto para mejorar la germinación como la emergencia de las plántulas. Resultados similares han alcanzado Sánchez et al. (2001a, 2003a,b) en semillas de diversas especies (hortícolas, forestales pioneras y leguminosas no arbóreas) sometidas a tratamientos de hidratación-deshidratación, en combinación o no con tratamientos de escarificación.


25

La efectividad de los tratamientos hídricos para incrementar y acelerar la emergencia de las plántulas no sólo se debe a la activación de eventos metabólicos relacionados con la fase pregerminativa, sino también a los profundos cambios bioquímico-fisiológicos que inducen la tolerancia de las plantas al estrés ambiental, como ha sido señalado por; Kozlowski y Pallardy (2002) y Sánchez et al. (2003b). Welbaum et al. (1998) proponen que los tratamientos de hidratación parcial incrementan el establecimiento, debido a que aceleran la emergencia de las plántulas (lo que permite evadir la incertidumbre del ambiente) y disminuyen la pérdida de electrolitos por las semillas (i.e., aminoácidos y azúcares). Esto último contribuye considerablemente a disminuir los ataques fúngicos.

T 4

T 3

T 2

T 1

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0

G e rm in a c ió n fin a l (% )

Emer

genc

ia fi

nal (

%)

Fig. 6. Relación lineal entre el porcentaje de germinación final en laboratorio y

el porcentaje de emergencia final de plántulas en vivero.

El vigor de las plántulas también se afectó significativamente por la aplicación de los tratamientos (tabla 4). En general, los resultados de la prueba de comparación múltiple de medias evidenciaron la formación de dos grupos: el primero constituido por las plántulas procedentes del tratamiento control (T1) y de los tratamientos pregerminativos T2 y T3, que no difirieron significativamente entre sí, y el segundo grupo constituido por los individuos procedentes del tratamiento pregerminativo T4, que produjo las plántulas con mayor desarrollo vegetativo. Sin embargo, es válido aclarar que aunque no existen diferencias significativas entre los individuos del primer grupo, se observó cierta tendencia a incrementarse el vigor de las plántulas con el tratamiento T3. Al parecer, los tratamientos pregerminativos inducen cambios metabólicos y/o morfológicos en las semillas que aceleran el desarrollo vegetativo de las plántulas, como ha sido informado en diversas especies cultivadas bajo distintas situaciones del ambiente (Orta et al., 1998; Sánchez et al., 2001a).

La variable que representó la distribución de la biomasa (masa seca raíz/aérea) no difirió significativamente entre tratamientos, aunque se evidenció que las plántulas asignaron una mayor cantidad de recursos al desarrollo vegetativo de la parte aérea, en detrimento de la parte subterránea; posiblemente como vía para asegurar un rápido crecimiento y con esto evadir o escapar de las fluctuaciones del ambiente. Resultados similares se han obtenido en especies forestales pioneras que presentan pocas reservas nutricionales en sus semillas y ocupan sitios abiertos o semiabiertos (Bazzaz, 1996; Sánchez, 2003). Esta “estrategia” de distribución de la biomasa probablemente también se deba a que las plántulas, durante su estancia en condiciones de vivero, estuvieron expuestas a un buen suministro de agua. III.5 Experimento 5. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la germinación en

sustrato de pH ácido

Todos los tratamientos robustecedores aplicados resultaron adecuados para incrementar significativamente la germinación en semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham con relación al tratamiento control (T1) cuando la siembra se realizó en agua acidificada (fig. 7). Los mejores resultados


26

para incrementar y acelerar la germinación se consiguieron con la combinación de tratamientos de hidratación-deshidratación más el tratamiento de choque ácido (T5), que logró triplicar el porcentaje de germinación final con relación a los resultados del tratamiento T1. Además, con la combinación del tratamiento robustecedor se alcanzó, en menos de un día, el 10% de germinación en la muestra; en cambio, con el tratamiento control (semillas escarificadas) este resultado se alcanzó después del tercer día de la germinación.

0

10

20

30

40

50

T1 T2 T3 T4 T5

Tratamientos pregerm inativos

% d

e ge

rmin

ació

n

0

1

2

3

4

Vel

ocid

ad d

e g

erm

inac

ión

(día

s)

% de germ inación

Velocidad de germ inac ión

e

d

c

b

aA

B

CD

D

Fig. 7. Efecto de la acidez del sustrato y los tratamientos pregerminativos (T1, T2, T3,

T4, y T5) en el porcentaje y la velocidad de germinación de semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham (las líneas verticales representan el error estándar de las medias).

Igualmente, con el tratamiento de hidratación-deshidratación (T4) se lograron incrementos

significativos de la germinación con relación al tratamiento testigo, aunque fueron significativamente inferiores a los que se obtuvieron con la combinación de tratamientos robustecedores. Por su parte, con el tratamiento de choque ácido (T3) y el procedimiento T2 (hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes del inicio de la germinación) se obtuvieron resultados considerablemente superiores a los del tratamiento control, pero estos fueron inferiores a los alcanzados con los tratamientos T4 y T5. La efectividad del tratamiento de choque ácido (T3) para mejorar la germinación con relación al procedimiento T2, demostró que el incremento de la germinación obtenido con el primero se debe al choque ácido al cual estuvieron expuestas las semillas y no sólo al avance de la germinación logrado con dichos tratamientos.

La respuesta germinativa obtenida en semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham demuestra el sinergismo que establece la combinación de los tratamientos de hidratación-deshidratación con los de choque ácido, para incrementar la germinación de las semillas frescas de este cultivar bajo condiciones de acidez del sustrato. La efectividad de los tratamientos robustecedores de hidratación parcial para incrementar la germinación bajo diferentes condiciones de estrés abiótico (calor, sequía y salinidad) ha sido comprobada en diversos cultivos y se conoce con relativa profundidad los cambios moleculares y fisiológicos que inducen en las semillas y en las plantas (Henckel, 1982; Kozlowski y Pallardy, 2002; Sánchez, 2003).

Por su parte, Hsiao, Vidaver y Quick (1984) determinaron que la inmersión de las semillas de lechuga en soluciones ácidas incrementó la penetración y la sensibilidad a la luz roja y con esto se eliminó la latencia por condiciones adversas de iluminación. Sin embargo, no se conoce si el tratamiento de choque ácido también pudiera activar mecanismos bioquímicos y fisiológicos de tolerancia a la acidez. De hecho,


27

una breve exposición a condiciones subletales para el crecimiento de las plantas puede inducir, posteriormente, tolerancia bajo condiciones ambientales letales para la supervivencia (Henckel, 1982). Basándose en este principio de endurecimiento de las plantas, otros investigadores han propuesto diferentes métodos de robustecimiento, como es someter a las semillas recién germinadas (plántulas) a: altas temperaturas (choque térmico); bajas temperaturas; diferentes concentraciones de microelementos; inhibidores bioquímicos de la germinación; y otros compuestos orgánicos (Galli y Levi, 1982; Grierson, Soule y Kawada, 1982; Bhattacharjee y Choudhari, 1986; Kozlowski y Pallardy, 2002).

También sobre la base de este principio se han propuesto combinaciones de tratamientos robustecedores de semillas, como son los de hidratación-deshidratación con los de choque térmico (Sánchez et al., 2001a,b; Sánchez et al., 2003b) para incrementar la germinación y el crecimiento de las plantas bajo diferentes situaciones de estrés abiótico. Con la combinación de los referidos procedimientos se ha demostrado igualmente la efectividad de ambos con relación a la de los tratamientos de hidratación-deshidratación y de choque térmico tradicionalmente empleados, tal como se evidenció con la combinación de tratamientos hídricos con los de choque ácido en semillas de L. leucocephala cv. Cunningham (fig. 7). III.6 Experimento 6. Tratamientos hídricos y de choque ácido para incrementar la emergencia y el

vigor de las plántulas en suelo de pH ácido

Los tratamientos robustecedores de choque ácido y de hidratación-deshidratación resultaron adecuados para incrementar y acelerar la emergencia de las plántulas de L. leucocephala cv. Cunningham con relación al tratamiento control (T1) cuando la siembra se realizó en suelo ácido (tabla 5). Se alcanzaron los mayores porcentajes de emergencia final con los tratamientos T4 y T5, que lograron incrementar a más de 25% la emergencia final de las plántulas con relación al tratamiento control. Tabla 5. Efecto de los tratamientos pregerminativos y el choque ácido en la emergencia y el vigor de las

plántulas de L. leucocephala cv. Cunningham en suelo ácido (la velocidad de emergencia se expresó por el T20).

Tratamientos

pregerminativos Emergencia

final (%)

Velocidad emergencia

(días)

Masa seca (g) Aérea Subterránea Total

Masa seca raíz/aérea

T1 T2 T3 T4 T5

20,0c 22,0c 33,0b 46,0a 52,0a

6,7a 5,9ab 4,7bc 3,4cd 3,2d

1,1c 1,1c 1,4b 1,7a 1,8a

0,43c 0,45c 0,61b 0,76a 0,84a

1,5b 1,5b 2,0c 2,5a 2,7a

0,40 0,40 0,46 0,44 0,44

ES ± 6,3*** 0,68*** 0,14*** 0,08*** 0,23** 0,01 NS T1: semillas sometidas a escarificación térmica T2: T1 + hidratación en agua destilada hasta 2 horas antes del inicio de la germinación T3: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a choque ácido, 3 horas antes de la germinación T4: T1 + un ciclo de hidratación-deshidratación. T5: T1 + hidratación en agua destilada y transferidas a choque ácido, 3 horas antes de la germinación y

seguidamente deshidratadas a,b,c,d Medias con letras distintas, por columnas, difieren a P≤0,05 (Duncan, 1955) *** P≤0,001; NS no significativo

Los resultados hallados con los procedimientos T4 y T5 no difirieron significativamente entre sí, aunque con la combinación de tratamientos robustecedores (T5) se alcanzaron los valores más altos del porcentaje de emergencia. Por consiguiente, se demuestra el sinergismo que establece la combinación de tratamientos robustecedores para mejorar la emergencia de L. leucocephala cv. Cunningham bajo condiciones adversas para su establecimiento, tal como ha sido planteado por Wencomo, Cepero e Iglesias (2003).

Por su parte, los efectos obtenidos con el tratamiento T3 (choque ácido) con relación al tratamiento T2, evidenciaron que el incremento de la emergencia de las plántulas con el procedimiento T3 se debió al choque ácido al cual estuvieron expuestas las semillas y no al avance de la germinación que se consiguió


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con dichos procedimientos. Es de notar que en estas condiciones experimentales, los resultados que se obtuvieron con el tratamiento T2 no difirieron significativamente de los alcanzados con el tratamiento testigo (T1). Por consiguiente, es posible que los efectos encontrados en la emergencia de las plántulas con los tratamientos T4 y T5 se deban, en parte, a la fase de deshidratación de las semillas, que activa diferentes mecanismos bioquímicos y fisiológicos relacionados con la tolerancia a la sequía o a la acidez. De hecho, Henckel (1964, 1982) plantea que los mecanismos de tolerancia a la sequía se inducen en las semillas durante la fase de deshidratación de los tratamientos robustecedores de hidratación-deshidratación.

También existió una correspondencia casi exacta entre el porcentaje de emergencia final en suelo ácido y el porcentaje de germinación final en agua acidificada (fig. 8). Al incrementarse la germinación con los tratamientos robustecedores, se incrementó linealmente la emergencia final de las plántulas en vivero (r= 0,92 ***, P ≤0,001).

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50

Germinación final (%)

Emer

genc

ia fi

nal (

%)

T 1 T 2

T 3

T 4 T 5

Fig. 8. Relación lineal entre el porcentaje de germinación final en laboratorio y

el porcentaje de emergencia final de plántulas en vivero para L. leucocephala cv. Cunningham.

Sin embargo, cabe señalar que los valores de emergencia final en suelo ácido son mayores que los

alcanzados en agua acidificada. Al parecer, la condición de acidificación a la que estuvieron expuestas las semillas en laboratorio fue más letal que la experimentada por las semillas cuando se sembraron en suelo ácido. Probablemente, el riego de las plántulas con agua destilada (pH: 6,8) disminuyó la acidez del suelo y, con ello, se favoreció la emergencia de las plántulas. Este fenómeno también pudo haber sido afectado por la compleja interacción que se establece entre las condiciones edafoclimáticas del suelo y las características de las semillas y las plántulas (Perry, 1981; Whalley, Lipiec, Finch-Savage, Cope, Clark y Rowse, 2001).

De igual forma, el vigor de las plántulas se afectó significativamente por la aplicación de los tratamientos robustecedores de semillas (tabla .5). La prueba de comparación múltiple de medias mostró la formación de tres grupos: el primero constituido por las plántulas procedentes del tratamiento control (T1) y del tratamiento (T2); un segundo grupo formado por las plántulas procedentes del tratamiento de choque ácido (T3); y un tercer grupo constituido por los individuos derivados de las semillas que fueron sometidas a los tratamientos de hidratación-deshidratación, en combinación o no con los de choque ácido (T4 y T5), que produjeron las plántulas con mayor desarrollo vegetativo de la biomasa aérea, subterránea y total. El grupo de las plántulas derivadas del tratamiento de choque ácido presentó menor vigor que aquellas procedentes de los tratamientos T4 y T5, pero su crecimiento vegetativo fue superior al de las plántulas derivadas de los procedimientos T1 y T2.

El incremento del vigor de las plántulas en suelo ácido por los tratamientos hídricos en combinación o no con el choque ácido, podría deberse a que los referidos procedimientos estimulan mecanismos de tolerancia a la acidez en las plántulas, tal como ha sido reportado con relación a la tolerancia a la sequía


29

cuando las semillas son previamente sometidas a tratamientos de hidratación parcial (Henckel, 1964, 1982). Otra explicación a este fenómeno es que, posiblemente, los mecanismos relacionados con la tolerancia a la sequía que se activan con los tratamientos robustecedores de hidratación parcial, también proporcionan cierta tolerancia de las plántulas a la acidez del suelo. De hecho se conoce que las plantas, en muchas ocasiones, están sometidas a múltiples condiciones de estrés abiótico; por consiguiente, dichas condiciones ambientales propician el desarrollo de mecanismos múltiples de resistencia o tolerancia a diversas situaciones de estrés (Mooney, Winner y Pell, 1991). Welbaum et al. (1998) también señalan que los tratamientos de hidratación parcial incrementan el establecimiento, debido a que aceleran la emergencia de las plántulas y de esta forma se evita la incertidumbre del ambiente.

Asimismo, es importante señalar que tampoco se observaron diferencias significativas entre los tratamientos T4 y T5 para incrementar el vigor de las plántulas de L. leucocephala cv. Cunningham en suelo ácido, aunque siempre existió una tendencia a aumentar el vigor de las plántulas con la combinación del tratamiento de hidratación-deshidratación más el procedimiento de choque ácido.

Por otra parte, se conoce que L. leucocephala cv. Cunningham no sólo es intolerante a suelos con pH bajos, sino también a suelos con alta saturación de aluminio (Al), según Hughes (1998). Este elemento es abundante en los suelos de naturaleza ácida y produce la muerte en las plantas intolerantes a él (Jansen, Broadley, Robbrecht y Smets, 2002), principalmente debido a que inhibe el crecimiento de las raíces y con esto se reduce considerablemente la absorción de nutrientes y de agua (Kochian, 1995; Cuenca, Andrade y Meneses, 2001). Entre los mecanismos celulares que se afectan en las plantas intolerantes al exceso de Al se encuentra la elongación y división celular, el bloqueo al sistema de transportación de iones específicos en la membrana plasmática y el DNA, y la reducción de la actividad de la bomba ATPasa (Kochian, 1995).

Por consiguiente, los efectos de los tratamientos robustecedores de hidratación-deshidratación para incrementar el vigor de las plántulas podrían deberse a que activan mecanismos celulares que evitan o diminuyen los daños provocados por la abundancia de Al en los suelos ácidos. Según Henckel (1964; 1975) y Henckel y Tvorus (1978; 1982) las características adaptativas adquiridas por las plantas después del tratamiento robustecedor de hidratación parcial pueden resumirse como: 1) citoplasma con alta viscosidad y elasticidad; 2) alto nivel hidrofílico de los coloides citoplasmáticos; 3) mayores contenidos de RNA, DNA y ATP; 4) potencial osmótico ligeramente mayor; 5) mayor resistencia de polisomas al recalentamiento y a la deshidratación; 6) más rápida recuperación de las funciones perdidas después de la sequía, como por ejemplo la fosforilación oxidativa; 7) estructuras xeromórficas específicas, como células más pequeñas; y 8) mayor velocidad de la fotosíntesis.

Otros autores han planteado que los tratamientos de hidratación parcial restauran la integridad de las células (autorreparación enzimática de las membranas) a través de la síntesis de lípidos, proteínas, RNA y DNA, como fue descrito en semillas frescas por Bewley y Black (1994) y Bewley (1997). También existen evidencias de que los tratamientos de hidratación parcial de las semillas activan mecanismos de reparación del DNA, proteínas, membranas y enzimas, y los sistemas desintoxicantes (i.e., eliminadores de radicales libres) (Dell’Aquila y Triíto, 1991; Jeng y Sung, 1994; Kalpana y Madhava-Rao, 1997; Bailly et al., 1998; 2000; Nascimento y West, 2000). III.7 Discusión general

La dinámica de absorción de agua de las semillas frescas de L. leucocephala cv. Cunningham (i.e., patrón trifásico) y su respuesta germinativa a temperatura alterna del sustrato de 25-30ºC y bajo luz blanca (i.e., condiciones óptimas para la germinación y la imbibición), demostraron que las semillas de este cultivar no presentan ningún tipo de dormancia endógena después que se eliminó la dormancia primaria por impermeabilidad de las cubiertas seminales al agua y a los gases. Este resultado es típico de muchas especies de leguminosas (Nikolaeva, 1977), y en Cuba también se ha presentado en otras especies forestales no leguminosas que ocupan sitios abiertos y cuyas semillas llegan al suelo en la época no óptima para el crecimiento vegetal, que para Cuba se corresponde con la estación poco lluviosa.

La respuesta germinativa obtenida en el termoperíodo de 25-30ºC evidenció que este cultivar es una planta que requiere altas temperaturas para su crecimiento. De hecho, Hughes (1998) plantea que el crecimiento óptimo de L. leucocephala se obtiene en un rango de temperatura de 25 a 30ºC. Los resultados de los otros termoperíodos ensayados (25-35ºC y 25-40ºC) y en la temperatura fija de 25ºC


30

demostraron que este cultivar tiene la capacidad para germinar en los claros o en el interior de los bosques, aunque su germinación se afecta considerablemente en el termoperíodo de 25-40ºC.

Por su parte, el comportamiento germinativo obtenido a 25-40ºC con la aplicación de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación, demostró que los referidos tratamientos inducen termotolerancia en este cultivar bajo condiciones extremas para la germinación (Bewley y Black, 1994), tal como ha sido reportado en otras leguminosas no arbóreas, especies hortícolas y forestales pioneras (Sánchez et al., 2001b; 2003a, b). Este aspecto que podría ser muy importante para la supervivencia de la especie frente a la competencia con las malezas o ante los posibles escenarios ambientales inducidos por el cambio climático (Gitay, Suárez, Watson y Dukken, 2002).

La efectividad de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación para la activación de los mecanismos de reparación de daños celulares también se comprobó en las semillas envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham (i.e., almacenadas a temperatura ambiente durante 18 años). Este efecto de los tratamientos hídricos ha sido informado en diversas especies de interés agroforestal (McDonald, 1999, 2000; Sánchez et al., 2004), demostrándose una vez más las potencialidades que tienen los tratamientos revigorizadores de hidratación parcial para recuperar el vigor germinativo de semillas frescas o envejecidas. Esto podría tener gran significación práctica en los sistemas silvopastoriles, donde se emplean grandes volúmenes de simientes para el establecimiento, así como en la recuperación de accesiones deterioradas del banco de germoplasma.

Por su parte, los resultados de los tratamientos de hidratación-deshidratación, en combinación o no con los de choque ácido, definieron las posibilidades que tienen los referidos procedimientos para mejorar el comportamiento de las plántulas en condiciones de vivero y sobre sustrato ácido. Este es un resultado muy interesante, dadas las grandes posibilidades que brinda para el establecimiento de dicho cultivar en suelos con pH bajo. Los efectos hallados con la combinación de los tratamientos robustecedores, en particular la germinación en agua acidificada, demostraron el sinergismo que se establece con la aplicación combinada de ambos procedimientos para mejorar la germinación y el establecimiento de las plantas en sustrato ácido. Efectos similares se han reportado por Sánchez et al. (2001a; 2003b) en semillas de hortalizas y especies forestales pioneras, cuando combinaron los tratamientos hídricos con los de choque térmico.

De hecho, los resultados logrados con la combinación de los tratamientos robustecedores (hidratación parcial y choque ácido) no sólo tienen importancia práctica, sino también evidencian el principio teórico del robustecimiento de las plantas, propuesto por Henckel (1964) y otros investigadores (Kozlowski y Pallardy, 2002).

Igualmente, se demostró la efectividad de los tratamientos de hidratación-deshidratación, en combinación o no con los de choque ácido, para incrementar el vigor de las semillas frescas y envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham en diferentes condiciones de estrés (tabla 6). Estos efectos están en perfecta correspondencia con el concepto de vigor de las semillas que se emplea internacionalmente (Bonner, 1998; ISTA, 1999; McDonald, 2000; Sánchez et al., 2004). Según estos autores, las semillas con alto vigor son aquellas que en condiciones ambientales extremas son capaces de poseer altos porcentajes de germinación final y de emergencia final de las plántulas en el menor tiempo posible, además de producir gran cantidad de plántulas normales y vigorosas.

En conclusión, los resultados en L. leucocephala cv. Cunningham con la aplicación de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación, en combinación o no con los de choque ácido, demostraron que los referidos procedimientos aceleran e incrementan la germinación, la emergencia y el crecimiento de las plántulas, aspectos que pueden considerarse muy satisfactorios si se tiene en cuenta que los experimentos de vivero se desarrollaron sin la aplicación de aditivos químicos (i.e., plaguicidas, fertilizantes). Por tanto, la ecotecnología aplicada podría constituir una alternativa en Cuba para desarrollar una agricultura sostenible o agroecológica. La aplicación de los tratamientos de hidratación-deshidratación y de choque ácido contribuiría también a disminuir el número de semillas que se emplean en los ensayos de vivero, así como el tiempo de estancia de las plantas en dichas condiciones de siembra. Por su parte, los resultados de la combinación de los tratamientos robustecedores de hidratación-deshidratación con el de choque ácido, muestran un camino muy promisorio para la introducción de este cultivar en los sistemas silvopastoriles que se sustenten en suelo ácido.


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Tabla 6. Resumen de los efectos de los tratamientos pregerminativos de hidratación-deshidratación y choque ácido en el vigor de las semillas frescas y envejecidas de L. leucocephala cv. Cunningham.

Variables Control1 Tratamientos Incremento con relación al control

Germinación bajo estrés calórico (25/40ºC) 29,3 62,62 33,3

Germinación de semillas envejecidas 5,3 28,02 22,7

Emergencia de las plántulas en vivero y pH neutro 64,0 98,02 34,0

Masa seca de las plántulas en vivero y pH neutro 2,5 3,32 0,8

Germinación en sustrato ácido 13,0 40,03 27,0 Emergencia de las plántulas en vivero y pH ácido 20,0 52,03 32,0

Masa seca de las plántulas en vivero y pH ácido 1,5 2,73 1,2

1: semillas sometidas a escarificación térmica 2: semillas sometidas a un ciclo de hidratación-deshidratación 3: semillas sometidas a un ciclo de hidratación-deshidratación más choque ácido

VÉÇvÄâá|ÉÇxá

32

CONCLUSIONES

La temperatura alterna de 25/30ºC fue la óptima para la germinación de semillas frescas y envejecidas de Leucaena leucocephala cv. Cunningham. El rango de 25/40ºC se considera subletal para la germinación.

Las semillas frescas de este cultivar presentaron un patrón trifásico de absorción de agua cuando se

elimina la dormancia innata que presentan por impermeabilidad al agua y a los gases. Las semillas viejas no mostraron este patrón de absorción de agua.

Los tratamientos de hidratación–deshidratación en semillas frescas incrementaron la germinación en

condiciones de estrés calórico. Los mejores resultados para incrementar la termotolerancia se obtienen con la hidratación parcial de las semillas en agua hasta dos horas antes de la germinación visible.

Los tratamientos hídricos tuvieron efectos revigorizadores en las semillas envejecidas de Leucaena

leucocephala cv. Cunningham. Los mejores resultados se alcanzan con cortos períodos de hidratación parcial.

La respuesta germinativa y el vigor de las plántulas se afecto considerablemente bajo condiciones de

acidez del sustrato.

Los tratamientos de hidratación-deshidratación, los de choque ácido y la combinación de estos procedimientos fueron efectivos para mejorar la germinación, la emergencia y el vigor de las plántulas en sustrato ácido. Con la combinación de los tratamientos robustecedores se lograron los mejores efectos.

Existió una correlación positiva entre el porcentaje de germinación final obtenido en laboratorio bajo

condiciones de estrés y el porcentaje de emergencia de las plántulas en vivero. Se corroboró la efectividad de la aplicación combinada de los tratamientos robustecedores en

semillas sin germinar, para incrementar la tolerancia a condiciones adversas de la germinación y del establecimiento.

exvÉÅxÇwtv|ÉÇxá

33

RECOMENDACIONES

Probar la efectividad de esta técnica para grandes volúmenes de semillas frescas de Leucaena leucocephala cv. Cunningham en condiciones de producción.

Dar continuidad a la aplicación de estas técnicas en semillas de especies arbustivas y arbóreas con

características para su uso y conservación en condiciones de germoplasma.

Determinar los cambios bioquímicos y fisiológicos que producen los tratamientos de hidratación-deshidratación y de choque ácido en las semillas y las plántulas.

Incluir, en las pruebas germinativas de laboratorio, ensayos de estrés para predecir el vigor de las

plántulas en condiciones de vivero.

exyxÜxÇv|tá u|uÄ|ÉzÜöy|vtá

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