estación experimental de pastos y forrajes indio hatuey
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UNIVERSIDAD DE MATANZAS “CAMILO CIENFUEGOS”
ESTACIÓN EXPERIMENTAL DE PASTOS Y FORRAJES
“INDIO HATUEY”
Efecto in vitro de extractos acuosos de diferentes plantas en el desarrollo de las fases exógenas de estrongílidos
gastrointestinales de ovinos
Autor:
M.V. Mileydy Puerto Abreu
Tutor
Dr.C. Javier Arece García
Tesis presentada en opción al título académico de Máster en Pastos y Forrajes
Matanzas, 2013
Poner ciencia en lengua diaria: he ahí un gran bien que pocos hacen.
Que ciencia hay mejor que la que salta a la vista, ni que biblioteca enseña lo que un rayo de sol.
José Martí
DEDICATORIA
A mi pequeña hija Anileny, quien es mi mayor alegría y el motor impulsor que me dio
suficiente fuerzas para seguir adelante.
A mi mamá, por permitir con su amor y desvelo realizar todos mis sueños.
A mis hermanos, por todo el apoyo que me han brindado.
A Migue, esposo y compañero, por toda la comprensión y amor.
A mi familia por su constante preocupación.
A la memoria de mi padre Andrés Puerto †
AGRADECIMIENTOS
Mis más sinceros agradecimientos a mi tutor Javier Arece García, por su paciencia y
dedicación. Por sus sabias orientaciones en la conducción de esta tesis Por más que mi tutor
lo considero mi amigo.
A mi familia por su apoyo incondicional.
A mi gran y excepcional amigo Jose por su entrega, dedicación y amor.
A las técnicas Yaima y Marisol de las cuales aprendí a trabajar en el laboratorio.
A Yoel y Michael por la ayuda que me brindaron cuando los necesité.
A mis amigos y compañeros Yolanda, Yanet, María J., María R., Igleny, Nilda, Tamara,
Mercedes, Isabel, Iracelys, Rosiel y Eugenio por su apoyo.
A mi Director Julio C. por permitir mi superación.
Al Dr.C Félix Ojeda y Rey Machado por sus sabios consejos.
A Héctor Santana por la ayuda prestada.
A la Dr C Mildrey por brindarme material para la realización de esta tesis.
A todos los que de una forma u otra colaboraron con la realización de este trabajo.
A todos muchas Gracias.
Índice de figuras
Figura 1. Representación esquemática del ciclo biológico de los estrongílidos
gastrointestinales de pequeños rumiantes. .............................................................................. 6
Figura 2. Esquema de la distribución de los extractos de los tratamientos en las placas. .... 43
Figura 3. Esquema de la distribución de los tratamientos en las placas. .............................. 43
Figura 4. Esquema de distribución de los tratamientos ........................................................ 44
Figura 5. Dispositivo de migración ...................................................................................... 45
Figura 6. Características del inserto. VL-vista lateral VS- vista superior ............................ 46
Figura 7. Regresión lineal entre los valores Probit y la dosis (Log10) para M. oleifera (A),
G. sepium (B) y D. cinerea (C). ........................................................................................... 51
Figura 8. Porcentaje de migración de larvas L3 de estrongílidos gastrointestinales de ovinos
frente a extractos acuosos de M. oleifera (MO), G. sepium (GS) y D. cinerea (DS). .......... 52
Índice de tablas
Tabla 1. Principales especies de trichostróngilos de los rumiantes y su localización en el
tubo digestivo. ........................................................................................................................ 4
Tabla 2. Característica fenológicas de las plantas de marabú (D. cinerea) e indicadores de la
composición química de sus hojas y pecíolos con diferentes alturas en época seca. ........... 37
Tabla 3. Porcentaje de eclosión de huevecillos de estrongílidos gastrointestinales de ovinos
frente a extractos acuosos de M. oleifera, G. sepium y D. cinerea. ..................................... 49
Tabla 4. Dosis letal media (DL50) y ecuación de regresión de los diferentes extractos en la
eclosión de huevecillos de estrongílidos gastrointestinales de ovinos. ................................ 50
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
°C- Grados Celsius µg- Microgramos µL- Microlitros ABZ- Albendazol AHs- Antihelmínticos Cm- Centímetro DL50- Dosis letal media DMSO- Dimetilsulfóxido FND- Fibra detergente neutra GLR- Gliricidia K- Potasio Kg- Kilogramos L1- Larva del primer estadio L2- Larva del segundo estadio L3- Larva del tercer estadio MAR- Marabú mg- Milígramos mL- Mililitros mm- Milímetro MOR- Moringa MS- Materia seca Na- Sodio NaCl- Cloruro de sodio NGI- Nematodos gastrointestinales PB- Proteína bruta PBS- Solución tampón PEH- Prueba de eclosión de huevos PMS- Metabolitos secundarios S5- Estado preadulto-juvenil TC- Taninos condensados TGI- Tracto gastrointestinal THs- Taninos hidrosolubles
RESUMEN
Con el objetivo de evaluar las propiedades antiparasitarias in vitro de Moringa oleifera,
Gliricidia sepium y Dichrostachys cinerea en fases exógenas del ciclo biológico de
nematodos gastrointestinales de ovinos se evaluó el efecto de extractos acuosos en la
inhibición de la eclosión de huevecillos y la migración de las larvas del tercer estadio. Para
ello se prepararon para cada planta extractos acuosos en tres concentraciones (50, 25 y 12.5
mg/mL) y, se evaluó su efecto sobre la eclosión de huevos y la migración de las larvas
comparado con controles positivos y negativos. Las tres plantas inhibieron la capacidad de
eclosión de huevos con mayores (p<0.05) tasas de inhibición de la eclosión para D. cinerea
y M. oleifera. El análisis Probit demostró que la dosis letal media para cada especie fue de
60.92, 30.70 y 9.41 mg/mL para M. oleifera, G. sepium y D. cinerea, respectivamente. Las
tres plantas mostraron efectos en la migración larvaria comparadas con los controles con
los mayores tasas de inhibición de la migración a través de un tamiz de 20 µm (p<0.05)
para M. oleifera y G. sepium con valores por encima de 97%. Los resultados in vitro
sugieren que las tres plantas poseen propiedades antiparasitarias que pudieran ser valoradas
en posteriores estudios in vivo.
ÍNDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1 CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................. 4
Los nematodos gastrointestinales de los rumiantes ............................................................ 4 Generalidades de los nematodos gastrointestinales ........................................................ 4 Ciclo biológico ................................................................................................................ 5 La fase de vida libre ........................................................................................................ 6 Biología de las larvas infestantes .................................................................................... 7
Consecuencias de las strongylosiss gastrointestinales en los rumiantes ............................. 8 Cuadro clínico de los estrongílidos gastrointestinales .................................................... 9 Mecanismos fisiopatológicos y patogénicos ................................................................... 9 Impacto sobre las producciones ...................................................................................... 9 Efectos sobre la fisiología digestiva .............................................................................. 10
Métodos de control parasitario. Métodos alternativos al uso de los antihelmínticos (AHs). .......................................................................................................................................... 12
Reducir las fuentes de contaminación de los animales ................................................. 12 Mejorar la resistencia de los hospederos ....................................................................... 14 Eliminar los NGI ........................................................................................................... 15 Plantas con propiedades antihelmínticas ....................................................................... 15 Papel de los taninos en las plantas ................................................................................ 17 Localización de los taninos en los tejidos vegetales ..................................................... 18 Efectos de los taninos en los rumiantes no parasitados ................................................. 22
Gliricidia sepium (Jacq.) ................................................................................................... 28 Posición Sistemática ...................................................................................................... 28 Sinonimias ..................................................................................................................... 28 Nombres comunes ......................................................................................................... 28 Origen y distribución ..................................................................................................... 29 Características de la especie G. sepium ......................................................................... 29 Principales usos de la Gliricidia .................................................................................... 30
Moringa oleifera Lam. ...................................................................................................... 31 Sinonimias ..................................................................................................................... 32 Nombres comunes ......................................................................................................... 32 Origen y distribución ..................................................................................................... 32 Características de la especie M. oleifera ....................................................................... 32 Ecología ......................................................................................................................... 33 Principales usos de la Moringa...................................................................................... 33
Dichrostachys cinerea (L.) (Wight & Arn) ...................................................................... 35 Sinonimias ..................................................................................................................... 36 Nombres comunes ......................................................................................................... 36 Origen y distribución ..................................................................................................... 36 Características de la especie D.cinerea ......................................................................... 36 Características fenológicas e indicadores de la composición química .......................... 37 Principales usos del marabú .......................................................................................... 38
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................... 40 Localización ...................................................................................................................... 40 Colección del material vegetal y preparación de los extractos ......................................... 40
Preparación de las soluciones ........................................................................................... 40 Diseño experimental y tratamientos.................................................................................. 41 Prueba de eclosión de huevos (PEH) ................................................................................ 42 Prueba de inhibición de la migración larvaria (L3) .......................................................... 44 Análisis estadístico ........................................................................................................... 47
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................... 48 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 55 RECOMENDACIONES .................................................................................................... 56 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 57
1
INTRODUCCIÓN
La búsqueda de alternativas que minimicen el uso irracional de los antihelmínticos para el
control parasitario en pequeños rumiantes constituye una de los principales retos en un
ambiente en el cual la resistencia a los principales medicamentos antiparasitarios
constituyen una amenaza para la producción animal mundial como resultado de su uso
indiscriminado (Arece et al., 2004). Esta situación se agudiza por el lento desarrollo, a
corto plazo, de moléculas antiparasitarias.
En la actualidad existen diferentes estrategias que se han estudiado con el objetivo de
encontrar soluciones a la problemática del parasitismo gastrointestinal en ovinos. Entre
ellos se destacan los relacionados con el uso de plantas con potencialidades antiparasitarias
(Githiori et al., 2006; Marie-Magdeleine, et al. 2010)
Se han desarrollado estudios in vivo con plantas nativas de diferentes países en los cuales se
ha encontrado una mejor respuesta de los animales ante la infestación parasitaria y a lo cual
se le ha atribuido dos efectos fundamentales: 1) efectos directos que están relacionados con
el efecto de algún metabolito secundario de las plantas sobre los parásitos
(fundamentalmente taninos condensados) y 2) efectos secundarios que posee estrecho
vínculo con un incremento del estado de resiliencia de los animales que se garantiza por el
efecto directo de una mejora de la dieta de esos animales (Kyriazakis et al., 2010).
Por otro lado también se han desarrollado investigaciones in vitro: determinación del efecto
de extractos de plantas sobre 1) la eclosión de los huevecillos, 2) sobre el desarrollo
larvario, 3) en la migración larvaria y 4) en la motilidad de parásitos adultos (Marie-
Magdeleine, 2009). Este tipo de estudio ha permitido realizar screening sobre un gran
número de plantas de las cuales se posee alguna sospecha sobre su actividad antiparasitaria.
En Cuba existen experiencias del uso de fitofármacos en el control parasitario. El resultado
de mayor impacto se desarrolló en Bromelia pinguin (Piña de ratón) la cual mostró ser
efectiva ante Haemonchus spp. en terneros (Marrero et al, 1994) y posteriormente se evaluó
en México en infestaciones por Oesophagostomum columbianum en ovinos (Olivares,
2001)
2
Los recursos vegetales bioactivos contienen sustancias activas contra ciertos patógenos. Las
plantas o sus extractos han sido usadas durante siglos en medicina veterinaria, tanto de
forma interna como externa para el tratamiento de diversas patologías. Las plantas elaboran
una multitud de moléculas orgánicas (glúcidos, lípidos, ácidos, sustancias pépticas,
saponinas, alcaloides, polifenoles, terpenos, esteroides, vitaminas y elementos minerales).
Estos metabolitos son necesarios para su funcionamiento y para su relación con el medio
externo.
Entre ellos, los metabolitos secundarios (saponinas, alcaloides, polifenoles, terpenos,
esteroides, ácidos y aminas no proteicas, glucósidos cianogénicos, y otros heterósidos) son
como su denominación lo indica: compuestos que no son sensu stricto indispensables para
las funciones principales de la planta.
Estos metabolitos secundarios son actualmente asociados a la defensa contra los insectos
herbívoros de la planta (bacterias, hongos y virus), la lucha contra otras plantas en la
competencia por los nutrientes y la luz y, la protección contra los efectos nefastos de los
rayos ultra violetas, entre otros (Fraenkel, 1969, Wink, 1988).
Un paso importante para el establecimiento de una estrategia integral para el control
parasitario es el estudio de las posibles propiedades antihelmínticas de plantas consumidas
por los animales.
Problema
El parasitismo gastrointestinal en ovinos constituye una de las limitantes más importantes
en la producción ovina y los métodos tradicionales de control no son lo suficientemente
efectivos y se ha demostrado la aparición de resistencia a los fármacos por su uso reiterado.
Hipótesis
El extracto acuoso de hojas de Moringa oleifera, Gliricidia sepium y Dichrostachys cinerea
poseen efectos in vitro en la eclosión y la actividad migratoria de las L3 de estrongílidos
gastrointestinales de ovinos.
Objetivo general
• Evaluar la actividad antihelmíntica in vitro de extractos acuosos de Moringa
oleifera, Gliricidia sepium y Dichrostachys cinerea en estrongílidos
gastrointestinales de ovinos.
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Objetivos específicos
• Evaluar el efecto de extracto acuoso de M. oleifera, G. sepium y D. cinerea en la
eclosión y la migración larvaria (L3) de estrongílidos gastrointestinales de ovinos.
• Determinar la dosis letal media (DL50) de los extractos acuosos de M. oleifera, G.
sepium y D. cinerea en la eclosión de huevecillos de estrogílidos gastrointestinales
de ovinos.
• Realizar una revisión del estado del arte de la temática tratada en la tesis.
4
CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Los nematodos gastrointestinales de los rumiantes
Generalidades de los nematodos gastrointestinales
En medicina veterinaria, los nematodos parásitos del tubo digestivo de los rumiantes
domésticos, los que comúnmente se les denominan estróngilos gastrointestinales
constituyen la mayor patogología de estos animales en pastoreo. Estos nematodos
pertenecen a dos superfamilias distintas del orden Strongylidea: Los Trihostrongyloidea
(principales géneros: Haemonchus. Teladorsagia, Cooperia, Trichostrongylus y
Nematodirus) y los Strongyloidea (género: Oesophagostomum) (Euzéby, 1963; Urquhart et
al., 1996) (Tabla 1).
Tabla 1. Principales especies de trichostróngilos de los rumiantes y su localización en el tubo digestivo.
Sub Familia Especies Localización en el hospedero
Hospederos
Haemonchinae Haemonchus contortus Abomaso Ovinos y caprinos Haemonchus placei Bovinos Haemonchus longistipes Dromedarios
Trichostrongylinae Trichostrongylus colubriformis
Intestino delgado
Ovinos, caprinos y bovinos
Trichostrongylus axei Abomaso Ovinos, caprinos, bovinos, cerdos y caballos
Trichostrongylus vitrinus Intestino delgado
Ovinos y caprinos
Trichostrongylus capricola Intestino delgado
Ovinos y caprinos
Ostertargiinae Teladorsagia circumcincta Abomaso Ovinos y caprinos Ostertagia ostertagi Bovinos Ostertagia occidentalis Ovinos Ostertagia trifurcata Ovinos y caprinos
Cooperiinae Cooperia curticei Intestino delgado
Ovinos y caprinos Cooperia oncophora Bovinos Cooperia punctata Bovinos
Nematodirinae Nematodirus battus Intestino delgado
Ovinos y bovinos Nematodirus helvetianus Bovinos Nematodirus spathiger Ovinos, aprinos y
bovinos
5
Nematodirus fillicolis Ovinos y caprinos Oesophagostominae Oesophagostomum
venulosum Ciego y colon Ovinos y caprinos
Oesophagostomum columbianum
Ovinos y caprinos
Oesophagostomum radiatum Bovinos y búfalos Chabertiiinae Chabertia ovina Colon Ovinos, bovinos y
caprinos
Los nematodos gastrointestinales (NGI) tienen una distribución mundial con el predominio
variable de especies según las grandes zonas climáticas. En zonas templadas los géneros de
trichostrongilos más frecuentes en los sistemas de producción de pequeños rumiantes son
Telodorsagia spp: T.circumcincta, T.trifurcata (especies abomasales), Trichostrongylus
spp., T.colubriformis, T.axei, T.vitrinus, T.capricola (especies abomasales o del intestino) y
Cooperia spp., C.curticei, C.oncophora, C.punctata (especies intestinales) (Etter et al.,
2000; O´connor et al., 2006). Haemonchus contortus, que es la especie más patógena del
abomaso, es menos frecuente en zonas templadas; en Francia, por ejemplo, aparece en
aproximadamente el 40% de las unidades de producción de pequeños rumiantes (Chartier y
Reche, 1992).
Lo inverso ocurre en zonas tropicales y subtropicales, donde H. contortus es la especie de
mayor incidencia y prevalencia en sistemas de ovinos y caprinos en pastoreo (Urquhart et
al., 1996; O´connor et al., 2006, Arece et al., 2004). T.colubriformis y O.columbianum son
regularmente encontradas en zonas calientes y húmedas (Arece, 2005).
Ciclo biológico
El ciclo biológico de los NGI de los rumiantes es monógeno (figura 1) (posee un solo
hospedero definitivo) y comprende dos fases: una fase libre en el medio exterior (fase
exógena) y una fase parasitaria en el hospedero (fase endógena) (Urquhart et al., 1996).
6
Figura 1. Representación esquemática del ciclo biológico de los estrongílidos
gastrointestinales de pequeños rumiantes.
La fase de vida libre
Esta fase exógena del ciclo de vida de los NGI se inicia por la eliminación por las heces de
huevecillos ovipositados por las hembras de los parásitos al medio exterior. Este elemento
asegura la contaminación de las praderas las cuales con condiciones externas favorables
(temperatura mínima de 10°C; humedad relativa de 60%) los huevos embrionan y
eclosionan liberando larvas del primer estadio (L1) (Euzéby, 1963; Urquhart et al., 1996).
Después de dos mudas sucesivas, las L1 evolucionan hasta la larva del tercer estadio o larva
infestante (L3). Contrariamente a los huevos y las larvas L3 las L1 y L2 son poco resistentes
a las condiciones adversas del medio ambiente. En zonas templadas y según las condiciones
ambientales, las L3 pueden sobrevivir varios meses en las praderas (O´Connor et al., 2006).
Al contrario, en zonas tropicales/subtropicales, la sobrevivencia de las L3 es menor
pudiendo ser de algunas semanas debido al incremento de la actividad física favorecida por
7
las elevadas temperaturas y humedad que agota sus reservas lipídicas (Urquhart et al.,
1996; O´connor et al., 2006).
La fase parasitaria
Esta fase comienza después del a ingestión de las larvas L3 por el hospedero. La primera
etapa de la invasión del tubo digestivo por las L3 corresponde a su desenvainamiento
(pérdida de la vaina procedente de las L2). Este fenómeno marca la transición entre la vida
libre y la vida parasitaria (Hertzberg et al., 2002). Después del desenvainamiento, las L3
penetran en la mucosa de los órganos digestivos, lugar donde mudan a larvas L4.
Inmediatamente alcanzan el estado 5 (S5), también denominado estado pre-adulto o adulto
juvenil. El paso del S5 al estado adulto corresponde la adquisición de la madurez sexual.
Después de la fecundación por los machos, las hembras depositan sus huevecillos en la
materia fecal de los hospederos (Euzéby, 1963).
La cronología del desarrollo de los estados parasitarios de los NGI difiere en función de la
especie, de la importancia de la infestación o del hospedero (resistencia). El tiempo entre la
ingestión de las L3 por el hospedero y la primera puesta de huevos por los adultos se
denomina periodo prepatente. En general, este dura de 2 a 3 semanas por la mayor parte de
las especies de los ovinos y caprinos. Puede durar hasta cinco semanas para ciertas especies
de Strongyloidea de los bovinos, por ejemplo, O. radiatum (Urquhart et al., 1996).
En periodos invernales, en zonas templadas o durante un prolongado periodo seco en zonas
tropicales, es muy frecuente que las larvas se enquisten dentro de la mucosa digestiva y
entran en hipobiosis larvaria lo cual retarda su desarrollo. Estas larvas enquistadas
continúan su evolución en la primavera o en los periodos lluviosos siguientes (Euzéby,
1963). En este caso, la duración del periodo prepatente pasa de 3 semanas a 3 o 4 meses.
Biología de las larvas infestantes
En el pasto, las larvas L3 de los NGI poseen una vaina que es un vestigio de la cutícula de
la L2. Por la presencia de esta vaina, las L3 son más resistentes a las condiciones exteriores
(O´Connor et al., 2006). La sobrevivencia de las L3 depende de la especie de parásito, de
las condiciones climáticas y del ambiente externo (O´Connor et al., 2006). En general, las
L3 de H. contortus, sobreviven de 10 a 15 semanas en la primavera, mientras que durante el
periodo seco y caluroso este periodo se acorta a 3 o 4 semanas. Los musgos y la materias
8
fecales ofrecen condiciones óptimas para la sobrevivencia de las L3, por la creación de
condiciones microclimáticas favorables (Rogers y Sommerville, 1963).
Además de los factores físicos, las larvas L3 son muy resistentes a los agentes químicos o
biológicos. Sin embargo, estas larvas son presas o sustratos naturales de otros organismos
bacterianos (Bacillus thuringiensis) o ciertos hongos calificados como nematófagos
(Duddingtonia flagrans) (Chandrawathani et al., 2004)
Las L3 son muy móviles y se desplazan horizontal y verticalmente sobre la hierba siguiendo
un hidrotropismo positivo (en busca de la humedad), un fototropismo negativo (huyen
fuertemente del a luz) y un geotropismo negativo (Euzéby, 1963; Rogers y Sommerville,
1963). Este movimiento favorece la ingestión de los animales de cantidades considerables
de larvas y por tanto lograr la parasitación de los rumiantes. Sin embargo, estos
movimientos constantes son perjudiciales para la sobrevivencia de las L3 ya que estas son
incapaces de nutrirse, por lo que agotan sus reservas energéticas en esos movimientos
(Rogers y Sommerville, 1963; O´Connor et al., 2006).
La infestación del hospedero por las L3 se inicia con el desenvainamiento. Este fenómeno
ocurre en el órgano digestivo que le antecede. De este modo, las larvas L3 de las especies
abomasales se desenvainan en el rumen, mientras que las especies intestinales en el
abomaso (Rogers y Sommerville, 1963). El desenvainamiento ocurre de 60-80 minutos
después de la ingestión de la larva infestante (Hertzberg et al., 2002).
Consecuencias de las strongylosiss gastrointestinales en los rumiantes
Las consecuencias de la infestación por estrongílidos gastrointestinales difieren según la
tasa de infestación del hospedero. En general, las estrongilosis digestivas evolucionan de
una forma crónica, de expresión subclínica y provoca serios daños económicos. En el caso
de infestaciones masivas, el parasitismo de nematodos gastrointestinales puede mostrar
signos clínicos visibles, conllevando en muchos casos a la muerte de los animales más
susceptibles.
El grado de estas consecuencias depende de factores ligados al hospedero (especie, edad,
estado fisiológico o nutricional) o a los parásitos (cantidad de parásitos, cantidad de otros
parásitos en órganos del sistema digestivo), aunque el nivel de infestación (carga global
parasitaria) sigue siendo el factor más importante.
9
Cuadro clínico de los estrongílidos gastrointestinales
La evolución generalmente crónica de las estrongilosis digestivas conducen a un deterioro
del estado general de los animales que pueden conducir a la muerte si no son identificados
y tratados oportunamente. Inicialmente, aparecen síntomas generales como pérdida del
apetito, una emaciación progresiva, debilidad o signos de desnutrición (Urquhart et al.,
1996).
Los signos de gastroenteritis son también acompañados de diarreas agudas, situación muy
común en estas infestaciones parasitarias (Rahman y Collins, 1990). Los síntomas más
específicos pueden ser constatados con las especies de nematodos presentes (Urquhart et
al., 1996; Brugère-Picoux, 2004). Así, la especie hematófaga muestra signos de anemia
visible y edemas submandibulares (Urquhart et al., 1996). Se ha estimado que una oveja
parasitada por 5000 Haemonchus pierde el equivalente a 250 mL de sangre al día (Urquhart
et al., 1996).
Mecanismos fisiopatológicos y patogénicos
Los retrasos o síntomas observados en los animales zootécnicos infectados con los
nematodos se explican por una combinación de varios trastornos de la fisiología digestiva.
Si los principales procesos fisiopatológicos implicados frente a estas entidades han sido
ampliamente estudiados, los mecanismos patogénicos en el origen de estos trastornos a
menudo están mal descritos.
Impacto sobre las producciones
En términos económicos, los estrongílidos gastrointestinales son reconocidos a escala
global como una de las primeras patologías de los rumiantes, debido a las pérdidas
económicas que ellos ocasionan. En los sistemas productivos de pequeños rumiantes, la
presencia de estos vermes perturba a la vez la cantidad y la calidad de sus producciones.
El parasitismo por los NGI son responsables de un retardo del crecimiento en los ovinos y
cabritos jóvenes (Kyriazakis et al., 1996) que se traducen en reducciones del peso de
sacrificio de los animales, combinado con la disminución de la calidad de las canales y las
carnes (Sykes y Coop 1977).
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En las hembras lecheras, las infestaciones por trichostrongilos gastrointestinales están
regularmente asociadas con bajas en la producción de leche (Chartier y Hoste, 1994) y, a
veces en alteraciones en su composición (Chartier y Hoste, 1994), sobre todo observado en
los animales mejores productores de un rebaño.
Finalmente, múltiples estudios en el hemisferio Sur han mostrado que el parasitismo
digestivo en los ovinos está asociado también a alteraciones de la calidad de la lana (Knox
et al., 2006).
Efectos sobre la fisiología digestiva
Disminución de la ingestión
En general, las infestaciones por los NGI están asociadas a una pérdida del apetito. Se ha
encontrado que en infestaciones severas esta disminución del apetito puede llevar a una
anorexia total (Urquhart et al, 1996; Hoste et al, 1997; Knox et al, 2006). Sin embargo, los
mecanismos patogénicos implicados no están totalmente identificados, aunque a veces se
ha mencionado el posible papel de hormonas peptídicas secretadas por las células
digestivas (por ejemplo, la gastrina, colecistoquinina), (Dynes et al., 1998).
Maldigestión y malabsorción
Los nematodos que parasitan los diversos órganos digestivos inducen las lesiones mayores
en los epitelios. En el abomaso, la presencia de vermes está asociada a modificaciones de
las glándulas gástricas, incluyendo una menor densidad de células diferenciadas,
especialmente las células que producen el ácido clorhídrico.
Las mayores alteraciones descritas en el intestino a escala tisular o celular son abrasiones
de las vellosidades, con hiperplasia de las glándulas Lieberkühn y, una alteración severa
(menor diferenciación) de los eritrocitos (Hoste et al., 1997).
Lógicamente, esas modificaciones estructurales poseen repercusiones funcionales notables
sobre la digestión de los alimentos y la absorción de los nutrientes a los largo del tracto
digestivo. En el estómago funcional de los rumiantes (abomaso), el parasitismo
gastrointestinal provoca un aumento del pH gástrico dando lugar a una caída de la actividad
de la pepsina, así como un agotamiento profundo de las actividades enzimáticas asociadas
con enterocitos intestinales. La presencia de los vermes son el origen de las alteraciones de
11
la permeabilidad de los epitelios y los trastornos del peristaltismo que reducen el tiempo de
contacto entre las membranas mucosas y el quimo (Hoste et al., 1997).
La combinación de estos diversos procesos que afectan tanto las estructuras o funciones
digestivas, explica los fenómenos de la mala digestión/absorción clásica que se describe en
las infestaciones por NGI estrongílidos (Hoste et al., 1997; Knox et al., 2006).
Modificaciones y reorientaciones del metabolismo
Mientras los efectos negativos del parasitismo en la ingestión y digestión de los alimentos
aumentan, ocurre un cambio en la reorientación del metabolismo del hospedero (Hoste et
al., 1997). La reducción de la ingestión y de la absorción resulta en una disminución de la
disponibilidad de nutrimentos. Paralelamente, la presencia de los parásitos aumentan las
necesidades nutricionales de los hospederos para mantener la homeostasis sanguínea (en el
caso de los vermes hematófagos) y la integridad de sus epitelios y mucosas digestivas y,
también para desarrollar una respuesta inmunitaria efectiva (Kyriazakis y Houdijk, 2006).
La conjugación de estos fenómenos, conducen a una demanda de nutrientes, especialmente
proteínas para reparar las lesiones provocadas a nivel de los sitios de acción de los
parásitos, en detrimento de los sitios habituales de síntesis de proteínas por los hospederos
(glándula mamaria, folículo piloso, músculo), lo cual aumenta las pérdidas en producción.
Estas profundas perturbaciones del metabolismo energético y proteico contribuyen a
mantener las pérdidas zootécnicas por las infestaciones parasitarias (Hoste et al., 1997).
Además, Knox et al. (2006) sugirieron que el metabolismo del fósforo, del calcio y del
hierro también se modifica por la presencia de los NGI.
Los mecanismos patogénicos
Las perturbaciones patofisiológicas son el resultado de efectos puramente mecánicos
asociados a los efectos de excresión-secreción de los nematodos.
Los efectos mecánicos
Las lesiones de la mucosa digestiva se deben en parte al efecto mecánico de los vermes,
relacionado con su adhesión a los epitelios ocasionando daños a las estructuras anatómicas
especializadas del hospedero (Hoste et al., 1997). Determinadas especies de Strongylidae
12
(Chabertia ovina, por ejemplo), presentan una cápsula bucal bien desarrollada que le
permite fijarse al epitelio digestivo (Euzéby, 1963; Urquhart et al., 1996).
Sin embargo, Trichostrongyloidae posee una cápsula bucal reducida. Sólo los hematófagos
como H. contortus presentan una neoformación dental. Por otra parte, para las especies
intestinales como Trichostrongylus o Cooperia spp., ha sido descrito un efecto abrasivo de
su cutícula sobre los enterocitos (Hoste et al., 1997).
Efectos de los productos de excresión-secreción
La mayoría de los nematodos gastrointestinales liberan dentro de su ambiente productos de
excresión-secreción (E/S). La naturaleza bioquímica de estos productos están dotados de
propiedades enzimáticas (proteasas, acetilcolinoestearasas) (Hoste et al., 1997), pero
también glicoproteínas y monosacáridos, lípidos, prostanoides (Garretson, 2007).
El papel de estos productos de E/S no está del todo claro, pero se sospecha de su
participación en la instalación de las L3, su nutrición y la reproducción de los parásitos
adultos en el hospedero (Huby et al., 1999).
Algunas moléculas liberadas también afectan las mucosas del hospedero, participando en la
génesis de las perturbaciones patofisiológicas, y también contribuyen a mantener el
equilibrio parásito-hospedero (Huby et al., 1999).
Métodos de control parasitario. Métodos alternativos al uso de los antihelmínticos
(AHs).
El conocimiento del creciente desarrollo de resistencia a las drogas AHs de síntesis, los
investigadores están enfocados en reactualizar y desarrollar métodos alternativos de lucha
contra los NGI. Estos métodos se apoyan en tres principios generales de prevención y
tratamiento dirigidos a: 1) Reducir el origen o fuentes de contaminación, 2) Aumentar la
resistencia de los hospederos y, 3) Eliminar los parásitos (Torres-Acosta y Hoste, 2008).
Reducir las fuentes de contaminación de los animales
El objetivo de este método está dirigido a bloquear el ciclo biológico de los NGI y su
importancia se manifiesta en las larvas del tercer estadio en el medio exterior (reducción de
la infestación de las áreas de pastoreo), a fin de limitar al máximo los riesgos de contacto
13
entre las L3 y los hospederos susceptibles (Hoste et al., 1997; Heckendorn, 2007). Estos
objetivos se pueden lograr mediante tres métodos principales (Pomroy, 2006):
La prevención. Consiste en llevar los animales sanos, libres de parásitos a áreas de
pastoreo no contaminadas, como por ejemplo áreas post cosechas o áreas marginales como
guardarrayas de áreas cañeras u otro tipo de cultivo como los sistemas silvícolas.
La evasión. Se trata de la transferencia de animales tratados con AHs de praderas
contaminadas a áreas de pastoreo de baja carga parasitaria como las mencionadas
anteriormente.
Estos principios de prevención o de evasión suponen la disponibilidad de áreas de pastoreo
libres de parásitos o de bajos niveles de infestación. Un medio para tener este tipo de
praderas es tener prolongados periodos de reposo que permita la muerte natural de las L3
presentes en la hierba antes que los animales retornen a la misma parcela (Pomroy, 2006;
Legarto y Leclerc, 2007). Este proceso adquiere mayor importancia en las zonas tropicales
en la que la duración media de las L3 es más reducida (alrededor de dos meses) comparado
con climas templados (vida promedio de 6 a 12 meses) (Mahieu et al., 2008).
La dilución que va dirigida a reducir el riesgo de infestación por las L3 en disminución de
su concentración en el pastoreo.
La dilución de la infestación del pastoreo puede ser considerado con lograr una
disminución de la densidad de animales (Ettet et al., 2000). Sin embargo, la mezcla de
animales susceptibles y resistentes según criterios como la edad, el pastoreo mixto,
alternado o simultaneo, entre dos especies de hospederos que muestren diferencias de
especificidad hospedadora para los NGI (Niezen et al., 1996; Mahieu et al., 2008; Hoste et
al., 2010).
Por otro lado, una reducción activa de la infestación parasitaria puede ser obtenida a través
del uso de métodos químicos, pero también físicas (explotación de pastoreos de áreas pos
cosechas (Hounzangbe-Adote, 2004). También se pueden usar medios de lucha biológicos
en los que la mayoría de los estudios se han concentrado en las propiedades nematófagas de
determinados hongos microscópicos (ej. D. flagrans) que capturan las L3 entre su micelio,
favoreciendo así la contaminación de las áreas de pastoreo (Legarto y Leclerc, 2007).
14
Mejorar la resistencia de los hospederos
Hasta la fecha se ha enfatizado en tres estrategias fundamentales dirigidas a mejorar la
resistencia (natural o adquirida) de los hospederos, 1) El desarrollo de vacunas, 2) La
selección de animales resistentes a los NGI y, 3) Mejora de la nutrición del hospedero.
La vacunación
El principio de la vacunación consiste en poner en contacto preventivo al hospedero con
dosis de antígenos parasitarios para estimular sus defensas inmunitarias y así protegerlos de
las infestaciones futuras por los NGI (Waller y Thamsborg, 2004; Jackson y Miller, 2006).
El concepto dirigido a encontrar vacunas eficaces para el control de los NGI en rumiantes
no es una tarea reciente, sino que desde el año 1960 se desarrollaron para validar el empleo
de L3 irradiadas de H.contortus y de T. colubriformis para proteger los animales (Mulligan
et al., 1989). Posteriormente aparecen estudios más recientes destinados a aislar antígenos
de tejidos específicos del tubo digestivo de los NGI (Smith 2008).
La selección de animales genéticamente resistentes
La selección de animales resistentes a los NGI es un enfoque que ha sido acogido
fuertemente en el hemisferio Sur para reducir el empleo de AHs sintéticos (Baker et al.,
1998; Pomroy, 2006), y se basa en la selección de los animales más resistentes; este
concepto se ha desarrollado incluso entre e intra razas.
Un proceso consistente de selección aplicado durante varios años debe conducir a una
teoría de reducción de infestación en los hospederos y una disminución progresiva de la
disminución de las áreas de pastoreo (Baker et al., 1998).
Mejora de la nutrición del hospedero
La presencia de los estrongílidos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal está
asociado con lesiones y perturbaciones severas de la fisiología digestiva que inducen
grandes consecuencias en el metabolismo del hospedero, principalmente sobre la fracción
proteica y, en menor magnitud la fracción energética (Knox et al., 2006).
Partiendo de esta constante, se sugiere que la mejoría de la ración alimentaria en la cual el
hospedero pueda cubrir sus necesidades suplementarias asociadas con la presencia de los
15
parásitos, será posible mejorar de ese modo la respuesta del hospedero al parasitismo, en
particular aquellos que son factores limitantes en la ración. Es reconocido que en general el
metabolismo proteico es el más afectado por el parasitismo gastrointestinal que el
metabolismo energético (Bown et al., 1991). En consecuencia, la mayoría de los estudios
han estado dirigidos a obtener beneficios eventuales unidos a una suplementación proteica,
que ha sido confirmado en la mayoría de las ocasiones dicho enfoque (Hoste et al., 2005)
Sin embargo, determinadas ocasiones, la presencia de leguminosas como fuente nutricional
en zonas tropicales, además como fuentes complementarias energéticas son de igual manera
eficaces en el control parasitario (Torres-Acosta et al., 2004).
Eliminar los NGI
El principio de este método va dirigido a truncar el ciclo biológico del parásito adulto, o sea
la eliminación mediante tratamiento de los parásitos adultos. Para evitar el desarrollo y la
aparición de resistencia a los AHs sintéticos, se han explorado métodos alternativos por
más de 20 años. Las estrategias de control pueden entonces recaer en la combinación de los
métodos de control “clásicos” a través del uso de los AHs sintéticos, usados de una forma
racional o de tratamientos “alternativos”.
Estos métodos alternativos se basan en la administración de sustancias con propiedades
antiparasitarias que recaen la mayoría del tiempo en la base de la etnoveterinaria en lugar
del desarrollo y uso de AHs sintéticos. En este caso se destaca el uso del óxido de cobre
que, utilizado en forma de agujas de cobre metálicas de descarga o liberación lenta,
presenta una actividad significativa sobre H. contortus (Burke et al., 2010).
El empleo de plantas con propiedades antiparasitarias es otra de las grandes oportunidades
para el tratamiento de los NGI que muestra gran interés por la comunidad científica
internacional.
Plantas con propiedades antihelmínticas
En la mayoría de los continentes, fundamentalmente en países en vías de desarrollo, la
medicina tradicional se basa en el conocimiento empírico del uso de plantas (etnomedicina
veterinaria) y es ampliamente difundida (Hounzangbe-Adote, 2004; Githiori et al., 2006).
Por otro lado, en los países desarrollados apuestan por una agricultura sostenible y
16
biológica, que logren reducir los residuos químicos en los alimentos de origen animal
(Waller y Thamsborg, 2004).
Otro aspecto a considerar en el empleo de métodos alternativos de control parasitario es la
reducción de la presión de selección al minimizar su uso pues presentan ventajas
comparativas como 1) la disponibilidad de recursos de este tipo, 2) la ausencia actual de
resistencia a los compuestos activos y, 3) escasa disponibilidad de antiparasitarios de
calidad en los países en desarrollo.
Las plantas pueden funcionar ya sea como remedios con preparaciones a base de ellas, o de
acuerdo con el concepto más innovador de las plantas como operadores nutracéticos, a
menudo como forraje.
Las preparaciones fitoterapéuticas a base de plantas son por lo general preparadas con
mezclas complejas de compuestos activos, que se brindan para tratar los animales
infestados por un periodo corto. Los nutracéticos se definen como una planta que es
consumida por los animales y brinda ventajas tanto sobre la salud de los animales como en
su nutrición en su sentido estricto (Andlauer y Furst, 2002). Su incorporación en la ración,
por periodos más prolongados (de varios días a un mes) es generalmente concebido con
fines preventivos.
Los estudios sobre el efecto de las plantas con propiedades antiparasitarias han permitido
confirmar el interés potencial del ajo (Allium sativa), de saifoin (Onobrychis viciifolia),
papaya (Carica papaya), hoja de yuca (Manihot esculenta), o algunas arbustivas tropicales
como leucaena (Leucaena leucocephala y Lysiloma latisiliquum, entre otras), (Marley et
al., 2003; Githiori et al., 2006; Chagas et al., 2008).
El empleo potencial de las plantas con principios bioactivos presenta también sus
limitantes. La primera de ella resulta la escasez de información científica sobre los
compuestos activos, su modo de acción y, los factores que influyen en su efectividad. Otro
elemento es la toxicidad eventual en los animales de algunas especies y la adecuada
posología para encontrar su efecto benéfico (Githiori et al., 2006).
Sin embargo, debido a su explotación como forrajes, los efectos nutracéticos a menudo se
consideran de bajo riesgo tóxico. La variabilidad inherente de las plantas de acuerdo a las
condiciones ambientales o de crecimiento en función de las especies o variedades utilizadas
17
deben también ser consideradas y estudiadas a fin de estandarizar los mejores tratamientos
fitoterapéuticos, de acuerdo a la planta, las condiciones climáticas y las prácticas de crianza
de los animales (Rochfort et al., 2008). Una última limitación es el riesgo ecológico
posible. Los casos de sobre-explotación de las plantas por sus propiedades medicinales ya
han sido reportadas con un impacto ambiental relacionada con el riesgo de extinción de las
especies de plantas o de ecotipos de interés en ciertas regiones (Hounzangbe-Adote, 2004).
Chagas et al. (2008) demostraron en ovejas como los alcaloides son responsables del efecto
antihelmíntico del árbol del Neem (Azadirachta indica). Las Lactonas sesquiterpenos se
sospecha sean los responsables de las propiedades antiparasitaria de achicoria (Cychorium
intybus) (Marley et al., 2003). Por su parte, Githiori et al., (2006) informaron que los
compuestos responsables de la actividad antiparasitaria de Calotropis procera y Terminalia
glaucescens parecen ser alcaloides y antraquinonas, respectivamente.
En la temática del uso de plantas con propiedades antiparasitarias en los últimos 20 años se
ha puesto de manifiesto que la explotación de las propiedades bioactivas de las plantas
antiparasitarias son una alternativa válida para el empleo de los AHs sintéticos (Niezen et
al., 1996; Githiori et al., 2006; Hoste et al., 2006). En particular, los resultados más
alentadores se presentan en el valor potencial de las plantas, incluidas las leguminosas,
ricas en taninos condensados.
Papel de los taninos en las plantas
Los taninos como metabolitos secundarios de los vegetales (Bruneton, 1999) no están
implicados en el crecimiento y la reproducción de las plantas, sin embargo desempeñan un
papel en la defensa frente a agresiones de diversos fitófagos. Por lo tanto, altas
concentraciones de estos metabolitos en las plantas inhiben el desarrollo de bacterias,
hongos y nematodos patógenos (Collingborn et al., 2000).
Se ha demostrado que la ingestión de taninos causa lesiones en el tracto gastrointestinal
(TGI) de los herbívoros (Ayres et al., 1997). La presencia excesiva de taninos también
afecta el sabor de las plantas por lo que disminuye su palatabilidad y capacidad de
consumo, como resultado de la astringencia que estos ocasiona (Jean-Blain, 1998; Bennick,
2002).
18
Localización de los taninos en los tejidos vegetales
Todos los órganos de las plantas pueden contener taninos, pero la localización principal
difiere según la especie de planta en cuestión. De manera general los taninos son
mayoritariamente almacenados dentro de los tejidos epidérmicos y sub epidérmicos de las
hojas, pero también se pueden encontrar dentro del pericarpo de los frutos y raíces. A nivel
celular, los taninos hidrosolubles (THs) están predominantemente dentro de las paredes
celulares y entre los espacios intracelulares. Los taninos condensados (TC) son sobre todo
almacenados en la vacuolas intracelulares en forma libre y, en proporciones variables,
vinculadas a las fibras (lignina) o proteínas de las paredes celulares (Frutos et al., 2002).
Una misma especie de planta puede sintetizar TC y THs y pueden tener una diferencia en la
distribución de cada uno de ellos de acuerdo al órgano de la planta en cuestión (Jean-Blain,
1998).
Efectos de los taninos hidrolizables
Las intoxicaciones severas de diversas especies de animales después de la ingestión
excesiva de planas ricas en THs ha sido atribuida, sobre todo, a la presencia de gallotaninos
(Butter et al., 1999; Min et al., 2003; Mueller-Harvey, 2006). En los rumiantes, los THs son
hidrolizados por las bacterias ruminales provocando la liberación del ácido gálico, que es
rápidamente descarboxilado en pyrogallol y, convertido inmediatamente en resorcinol (Min
et al., 2003). Estos metabolitos resultados de la descomposición del ácido gálico (resorcinol
y punicalagin) son hepato y nefro-tóxicos y son rápidamente absorbidos para la sangre
(Mueller-Harvey, 2006). Sin embargo, se ha demostrado que la toxicidad de los THs
depende de su calidad (estructura química, peso metabólico) y de la cantidad (dosis) de los
THs ingeridos (Zhu et al., 1992).
Efecto de los taninos condensados
Para los TCs, el principio enunciado por Paracelso (“la dosis solo hace el veneno”) sigue
siendo válida para el caso de los TC, ya que los efectos nefastos sobre la producción y la
salud de los animales han sido observadas únicamente después de la ingestión masiva de
recursos forrajeros ricos en TCs.
Inversamente a los THs, los TCs son raramente asociados con una toxicidad aguda en los
rumiantes (Butter et al., 1999). Un nivel de consumo bajo o moderado de TC se asocia con
19
efectos favorables, mientras que la ingestión de elevados niveles resulta en aspectos
negativos en parámetros de salud y sobre la fisiología digestiva de los animales (Butter et
al., 1999; Min et al., 2003). Por consiguiente, se pueden identificar tres tipos de
consecuencias zootécnicas según los tenores de TCs en la ración (Paolini, 2004).
Plantas ricas en taninos hidrosolubles (THs)
Los THs están presentes en muchas familias de las angiospermas y las dicotildóneas y en
algunas familias de las fagáceas, Anacardiacea y Geraniaceae (Bruneton, 1999). Por el
contrario están ausentes en las gimnospermas y monocotiledóneas (Jean-Blain, 1998).
Plantas ricas en taninos condensados (TC)
De manera general, los TC se encuentran mayormente distribuidos en el reino vegetal que
los THs (Jean-Blain, 1998), ya que estos se encuentran tanto en las Angiospermas como en
las Gymnospermas (Bruneton, 1999). Determinadas especies de la familia Pinaceae, de
Fagaceae (roble), de Rosideae (acacias) y, de Rosaceae (manzanas, fresas) contienen
cantidades considerables de TC superiores al 5% de la MS. Entre las Fabaceae
(leguminosas), determinadas especies forrajeras, como Onobrychis viciifoliae, Hedysarum
coronarium, Lotus pedunculatus poseen niveles entre 2 y 5%. En tanto, en las zonas
tropicales los arbustos como, L. leucocephala, D. cinerea, Gliricidia sepium (Romero, et
al., 2000; Mlambo et al., 2004)
Efectos sobre la ingestión voluntaria de alimentos (consumo voluntario)
La masticación de las plantas por los animales provocan la ruptura de las paredes de las
células vegetales por lo que se liberan los TC contenidos en las vacuolas dentro de la boca
del animal. Debido a la sensación de astringencia asociada a la presencia de los TC en la
boca, se inducen efectos sobe la ingestión voluntaria de los alimentos (consumo voluntario)
y además se pueden modificar las funciones ruminales y post ruminales sobre el bolo
alimenticio. Sin embargo, para las leguminosas de zonas templadas, cuyo contenido de TC
es de bajo a moderado (<4 a 5% de la materia seca) los consumos de alimentos son
escasamente modificados (Terrill et al., 1992) y, en consecuencia provocan efectos
favorables en el proceso fisiólogo digestivo por el efecto protector fundamentalmente de la
proteína, convirtiéndola en proteína pasante.
20
Efectos sobre la digestión de los alimentos
Los TC afectan las diferentes etapas de la digestión a nivel ruminal y post ruminal, lo que
explica las consecuencias asociadas sobre los diversos aspectos de la producción de los
rumiantes.
• Efectos en la fermentación ruminal
El rumen se caracteriza por poseer un pH entre 6 y 7. A esta gama de pH, los complejos
que se forman entre los TC y las proteínas son estables (Butter et al., 1999) y contribuyen a
proteger las proteínas de la degradación ruminal. La formación de estos complejos entre los
TC y las proteínas alimentarias o su fijación a las enzimas bacterianas reducen globalmente
la proteólisis ruminal (Jean-Blain, 1998; Min et al., 2003).
Una de las primeras consecuencias de este fenómeno es limitar la producción y excreción
de metano y amoniaco (Mc Nabb et al., 1993; Animut et al., 2008).
• Efectos post ruminales
La protección de la degradación de las proteínas dentro del rumen conducen al aumento del
flujo de proteínas asimilables hacia el intestino y, por consiguiente, un aumento de la
absorción de aminoácidos (Mc Nabb et al., 1993; Min et al., 2003). Según Butter et al.,
(1999) el pH ácido induce una disociación de los complejos TCs-Proteínas, y la liberación
de las proteínas y aminoácidos, permitiendo así su digestión y absorción a nivel intestinal
(Zimmer y Cordesse, 1996; Butter et al., 1999; Mc Sweeney et al., 2008). En ovejas se ha
encontrado un aumento del 50% del flujo de nitrógeno post ruminal cuando consumen
trébol (Lotus corniculatus), comparados con un grupo control (Waghorn et al., 1987).
Mejora de las producciones
Se ha demostrado que el consumo de plantas que contienen TC (L. corniculatus) en
cantidades moderadas afecta el crecimiento de ovinos en desarrollo (Ramírez-Restrepo y
Barry, 2005), o en bovinos en desarrollo (Moore et al., 2003). Por otra parte, la ingestión de
niveles bajos de TC influye también en los niveles de producción y la calidad de la leche
(Min et al., 2003; Molle et al., 2003; Rochfort et al., 2008). El consumo de lotus o de sulla
(Hedysarum coronarium) se ha asociado a un incremento de la producción de leche en
ovinos y bovinos (Min et al., 2003). Por otra parte, se ha demostrado un aumento de la tasa
21
de proteínas en la leche en vacas de un 10% y un 12% en ovejas que consumen TC, la tasa
de lactosa se incrementó a un 14% en ovejas al ser comparado con animales que no
recibieron esta la suplementación con plantas ricas en TC (Min et al., 2003; Rochfort et al.,
2008). Finalmente, una ingestión moderada de TC (de 2 a 4% del total de la ración) se
asocia a un aumento de la producción de lana. Por ejemplo, el consumo de L. corniculatus
induce un aumento de un 11% de la producción de lana en ovinos (Luque et al., 2000), que
está asociado con un incremento de la absorción en particular de cisteína, el cual es un
aminoácido esencial para la producción de la lana (Mc Nabb et al., 1993).
Mejora de los indicadores reproductivos
Solo escasos estudios han determinado los efectos potenciales de los TC sobre la
reproducción de los rumiantes. La mayoría de ellos han mostrado que el consumo de L.
corniculatus, rica en TC indujo un aumento de la tasa de ovulación de ovejas (Min et al.,
2001; Rochfort et al., 2008; Luque et al., 2000) y, también han encontrado correlaciones
positivas entre el número de días de pastoreo en esa leguminosa forrajera y las tasa de
ovulación (Ramírez-Restrepo y Barry, 2005).
Efectos sobre la salud de los animales
• Prevención del a meteorización espumosa
En los rumiantes, la meteorización espumosa, también conocido como timpanismo
espumoso, es el resultado de la acumulación de gas derivados de la fermentación
exacerbada en el rumen que es “secuestrada” dentro de una espuma estable formada a partir
de proteínas solubles de la ración (Rochfort et al., 2008). Este desorden sanitario aparece
con frecuencia tras consumos excesivos de leguminosas como el Trifolium repens o alfalfa
(Medicado sativa).
Contrariamente, el consumo moderado de plantas ricas en TC (en el orden del 0,5% de la
MS) como algunas leguminosas forrajeras se asocian a una prevención de los riesgos de
timpanismo espumoso (Ramírez-Restrepo y Barry, 2005; Rochfort et al., 2008). Ello se
explicaría por la formación de complejos de los TC con las proteínas procedentes de los
alimentos, reduciendo de este modo las fermentaciones ruminales (Zimmer y Cordesse,
1996).
22
Los TC inhiben también el crecimiento y la multiplicación de los microorganismos del
rumen para su fijación a las constituyentes de sus paredes celulares, bloqueando de ese
modo, el transporte molecular, además que esa agregación celular entre ellos bloquea su
capacidad de división (Mc Sweeney et al., 2008).
• Prevención de episodios diarreicos
El consumo de forrajes ricos en TC está generalmente asociado a un aumento de la materia
seca de las heces lo que contribuye a evitar los episodios diarreicos (Min et al., 2001;).
Además, como consecuencia disminuyen los riesgos de miasis cutáneas debido a la
disminución de las suciedades de las zonas del periné como las diarreas (Larsen et al.,
1994).
Efectos de los taninos en los rumiantes no parasitados
El consumo de plantas ricas en taninos induce efectos contradictorios en los rumiantes. Es
importante distinguir que los efectos producidos por los THs de aquellos producidos por los
TCs, pero también tener en cuenta las variaciones relacionadas con las concentraciones de
taninos en la dieta los herbívoros. Los THs pueden ser responsables de intoxicaciones
severas que pueden ocasionar la muerte (Jean-Blain, 1998). Lo contrario sucede con los TC
que por lo general son considerados como menos tóxicos y, raramente responsables de
casos letales, en particular en los rumiantes.
Efectos de los taninos condensados sobre los parásitos gastrointestinales de los
rumiantes
Desde los inicios de los años 90´s, los efectos de los TC sobre el parasitismo
gastrointestinal de los rumiantes han sido estudiados fuertemente y constituyen una
alternativa complementaria al empleo reiterado de AHs sintéticos para combatir las
parasitosis digestivas (Niezen et al., 1996; Paolini, 2004; Waller y Thamsborg, 2004;
Nguyen et al., 2005; Ramírez-Restrepo y Barry, 2005; Githiori et al., 2006; Hoste et al.,
2006).
El interés principal se inicia a partir de leguminosas forrajeras de climas templados como L.
pedunculatus o L. corniculatus, H.coronarium, Lespedeza cuneata, Dorycnium rectum, u
Onobrychis viciifoliae, de las cuales sus efectos antiparasitarios han sido confirmados a
23
través de diversos estudios (Niezen et al., 2002; Marley et al., 2003; Heckendorn et al.,
2007; Hoste et al., 2006). El hecho que estas leguminosas presentan la particularidad de
tener tenores moderados de TC, mientras que están desprovistos o poseen bajos niveles de
THs (Mueller-Harvey, 2006; Hoste et al., 2006) contribuyen fuertemente a considerar el
efecto de los TCs en las respuestas obtenidas en las reducciones parasitarias. Existen
estudios más recientes que integran estos conceptos de plantas de otras familias de zonas
templadas o tropicales consumidas por los ovinos y caprinos que presentan niveles de TCs
de moderados a altos (Akkari et al., 2008; Alonso-Díaz et al., 2008).
En ciertos casos, el papel de los taninos en los efectos observados ha estado subrayado por
el empleo de métodos inhibidores in vivo e in vitro (Brunet et al., 2008).
Estudios in vitro: evidencias de efectos antihelmínticos
Existen en la actualidad un gran número de estudios in vitro aplicados para valorar la
eficacia antihelmíntica de extractos de plantas ricas en taninos, que constituyen
herramientas para la realización de screeening para la selección de plantas con propiedades
antiparasitarias. De manera general, estas se desarrollan a partir los mismos principios que
se evalúan los antiparasitarios sintéticos (Wood et al., 1995).
Estas pruebas in vitro poseen como principal ventaja que permite realizar una selección
rápida y estandarizada de múltiples muestras. La mayoría de ellas son reproducibles,
sensibles y a su vez bastante fiables (Jackson y Hoste, 2010). La interpretación de la
información obtenida descansa en la hipótesis de un efecto directo de tipo farmacológico de
los TC sobre los parásitos. Las concentraciones de TC empleadas a cada test in vitro se
corresponden con varias gamas de concentraciones de TC medidos in vivo (Molan et al.,
2003). No obstante, los resultados obtenidos in vitro están fuera del contexto de la respuesta
fisiológica e inmunológica puede representan, en alguna manera, una predicción de los
efectos in vivo, no obstante los estudios en los animales son necesarios.
Estudios en condiciones de infestación experimental. Efecto sobre las larvas
infestantes (L3)
Para confirmar los estudios in vitro indican un efecto significativo sobre la biología de las
L3 (migración y desenvainamiento) de diversas especies de parásitos en presencia de TC,
son necesarios estudios in vivo para verificar si la instalación de las L3 está siendo
24
modificada en un ambiente digestivo rico en TC, unido al consumo de recursos forrajeros
ricos en TC (quebracho, leguminosas templadas o tropicales).
En presencia de quebracho, las reducciones significativas de la instalación larvaria ha
estado en el orden del 65-70% en cabras infestadas por T.colubriformis y T.circumcincta
(Paolini et al., 2003c); en el caso de H. contortus en el orden de un 33% (Paolini et al.,
2005b). Estos efectos son comparables sobre los procesos biológicos iniciales de las larvas
infestantes de H. contortus encontrados después del consumo de L. latisiliquum, en cabras
(Brunet et al., 2008).
Se ha reportado una gran variabilidad similar de resultados en función de las especies de
parásitos implicadas con plantas ricas en TC. Por ejemplo, el empleo de leguminosas
templadas (Onobrychis viciifoliae) obtuvo reducciones considerables en la cantidad de
vermes adultos de T. colubriformis y T. circumcincta en ovinos (Thamsborg et al., 2003);
todo lo contrario sucedió en ovinos y terneros parasitados con H.contortus y T.
colubriformis (Paolini et al., 2005b y Ríos de Alvarez et al., 2008).
Para las plantas tropicales solamente se dispone de un estudio que indica la reducción
significativa en la reducción de vermes adultos de H. contortus en caprinos que se les
suministró hojas de Acacia nilotica y Acacia karoo (Kahiya et al., 2003).
Efectos sobre los vermes adultos
Los estudios sobre los efectos de los TC y de las plantas ricas en este metabolito en las
poblaciones de parásitos adultos son mucho más abundantes. Ellos se han desarrollado en
condiciones de infestaciones experimentales o naturales y, posteriormente se les suministra
el tanino o el follaje de la planta rica en este metabolito.
En términos muy generales, los resultados significativos, en primer lugar se refieren a la
disminución de la cantidad de huevecillos de parásitos expulsados por las heces. Según las
plantas empleadas y la especie de parásito en cuestión se considera que esa reducción en el
conteo fecal de huevecillos (CFH) se debe una disminución de la carga parasitaria (Niezen
et al., 2002; Thamsborg et al., 2003), es decir, que estos resultados se deben a la
diminución de la cantidad de parásitos adultos en las necropsias o posiblemente a un efecto
sobre su fertilidad.
25
Los primeros estudios realizados en infestaciones experimentales en ovejas y cabras
recibieron extractos de quebracho (Athanasiadou et al., 2001) o de Acacia spp. (Max et al.,
2004), que se corresponden con las formas concentradas de estos metabolitos.
También se ha confirmado, en gran medida, con las principales leguminosas forrajeras ricas
en TC, que sirven como modelos para diferentes estudios de esta materia en el mundo. En
un reducido número de estudios no se apreciaron diferencias significativas en la
eliminación de huevos de nematodos. Este fue el caso de ovejas que consumieron sulla (H.
coronarium) (Niezen et al., 2002; Athanasiadou et al., 2005), el trébol pedunculado (L.
pedunculatus) (Niezen et al., 1998; Athanasiadou et al., 2005), sainfoin (O. viciifolia)
(Athanasiadou et al., 2005). Muchos de estos resultados son a veces decepcionantes y están
relacionados con el efecto de los TC en el consumo lo cual no garantiza que los animales
consuman la totalidad de la dieta ofrecida sin que haya una tasa de concentración estable
del TC en el sistema digestivo.
En sentido general, como en condiciones controladas, el consumo de forraje de
leguminosas ricas en TC tanto templadas (Marley et al., 2003; Pomroy y Adlington, 2006)
como tropicales (Terrill et al., 2007), se ha asociado con una reducción del nivel expulsión
de huevos de parásitos por las heces en ovejas y cabras. Este fenómeno ha estado asociado
a una disminución de la carga parasitaria (Niezen et al., 1998; Lange et al., 2006; Terrill et
al., 2007), o a la disminución de la fertilidad de los especímenes hembras (Paolini et al.,
2005a).
Los estudios indican que se han apreciado los mismos fenómenos (reducción de la cantidad
de vermes adultos o reducción de la fertilidad de las hembras) al suministrar forrajes
(principalmente de la familia Fabaceae) que son ricos en polifenoles y especialmente en
taninos.
En las regiones tropicales, se han reportado resultados interesantes con el consumo de hojas
de varias especies de Acacia en las infecciones experimentales (Kahiya et al., 2003) o
naturales (Akkari et al., 2008), de L. latisiliquum (leguminosa arbustiva de México)
(Martínez-Ortiz de Montellano, 2010), L. leucocephala (Lin et al., 2003) o de hojas de yuca
(Manihot esculenta) (Rojas et al., 2006; Nguyen et al., 2005). En algunos de estos estudios
26
se ha encontrado una correlación entre la reducción del conteo fecal de huevos y la cantidad
de vermes adultos (Akkari et al., 2008).
Efectos sobre la resiliencia de los animales
En la mayoría de los estudios citados, el consumo de plantas con contenidos considerables
de TC ha estado asociado con una mejora en la resiliencia de los hospederos comparados
con grupos controles. Estos efectos benéficos han sido medidos a través del estado clínico
general de los animales (presencia de diarreas, número de tratamientos antiparasitarios,
mortalidad) (Min et al., 2005), mediante indicadores patofisiológicos (Paolini, et al.,
2005a) y, quizás los más importantes relacionados con los niveles de producción animal
como la ganancia de peso vivo (Niezen et al., 1996), la producción de leche (Hoste et al.,
2005) o de lana (Niezen et al., 1998). No se debe obviar que las leguminosas poseen un
elevado valor nutritivo, que pudiera explicar, en gran medida, las mejores comportamientos
productivos de los animales que han consumido H. coronarium, O. viciifolia, o L.
pedunculatus (Githiori et al., 2006; Tzamaloukas et al., 2006).
Modo de acción de los TC sobre los nematodos gastrointestinales
En un marco general, aparecen dos hipótesis clásicas para explicar los efectos de los TC
sobre los tricostrongílidos (Min et al., 2003; Hoste et al., 2006): la presencia de un efecto
indirecto por la mejora de la respuesta inmunitaria de los hospederos contra los vermes y, la
hipótesis de un efecto directo, de tipo farmacológico que serían las propiedades intrínsecas
de los TC sobre los vermes.
Efectos indirectos de los taninos condensados
Debido a la función protectora de la TC frente a la degradación ruminal de la proteína, su
presencia en la dieta en cantidades moderadas, provoca un aumento de la absorción y
reflujo de aminoácidos en el intestino delgado (Min et al., 2003). Este fenómeno se
considera sucede igual que cualquier suplementación proteica en la dieta, que se asocia
generalmente con una mejor respuesta de los hospederos a la presencia de los parásitos del
TGI (Balic et al., 2000), por ello se considera que el "efecto antiparasitario” de taninos
daría como resultado, al menos en parte, indirectamente a la mejora de la respuesta inmune
en tejidos de las mucosas (Min et al., 2003; Hoste et al., 2006).
27
Sin embargo, hasta la actualidad se han desarrollado pocos estudios en los cuales se
pretenda evaluar el efecto del consumo de plantas ricas en TC en la respuesta celular en los
tejidos del sistema digestivo, o incluso inmunológica en los hospederos. En los escasos
estudios realizados los resultados han sido contradictorios.
En ovinos infestados por T. colubriformis y T. circumcinta el consumo de H. coronarium
ha estado asociada a una disminución de la carga parasitaria y un aumento de los
anticuerpos (Niezen et al., 2002). De manera similar, en comparación con un grupo de
animales que no consumieron H. coronarium o O. viciifolia (grupo control) se encontró un
aumento de las células inflamatorias (eosinófilos, lecucitos y mastocitos) en la mucosa
digestiva de animales infestados artificialmente con T. circumcinta (Tzamaloukas et al.,
2006) o T. colubriformis (Ríos de Álvarez et al. 2008)
En el caso particular de los caprinos se ha encontrado igualmente un aumento de las células
inflamatorias asociada al consumo de quebracho Schinopsis sp ante infestaciones por T.
colubriformis y T. circumcinta (Paolini et al., 2003), sin embargo estos efectos no se
apreciaron frente a infestaciones por H. contortus (Paolini et al., 2003).
Efecto directo de los taninos condensados
Esta es la segunda hipótesis más apoyada por todos los resultados de estudios in vitro, ya
que en estas condiciones, está ausente el papel potencial de los factores que dependen de
los hospederos.
Por lo general, los estudios in vitro han demostrado que los TC afectan cualquier especie de
los nematodos gastrointestinales, aunque existen variaciones que dependen del estado
parasitario y de la fuente existente de TC.
En este sentido, los resultados de algunos estudios desarrollados corroboran la hipótesis de
los efectos directos de los TC en los parásitos, ya sea en infestaciones a corto plazo o
aquellas que se realizan con animales jóvenes, las cuales no son condiciones propicias para
una respuesta efectiva del hospedero ante la infestación parasitaria (Athanasiadou et al.,
2001; Kahiya et al., 2003; Athanasiadou et al., 2005; Paolini et al., 2003).
Los efectos directos de estos metabolitos secundarios sobre los NGI se explican por su
capacidad general de unirse a las proteínas, incluyendo las parasitarias. En consecuencia,
28
las perturbaciones en las propiedades fisicoquímicas resultantes de este proceso afectan la
biología de los parásitos. Ello parece suceder por la capacidad de los TC de unirse a las
glicoproteínas de las cutículas de los parásitos adultos o de las vainas de las larvas
infestantes (dos estructuras ricas en prolina e hidroxiprolina) o las enzimas secretadas que
participan en diversas funciones esenciales y el metabolismo (Min et al., 2003; Molan et
al., 2003; Hoste et al., 2006). También se han mencionado interacciones entre los TC y el
epitelio de los NGI, que pueden afectar el proceso de digestión y nutrición en general de los
parásitos (Molan et al., 2003; Brunet, 2008).
Estos supuestos han sido parcialmente confirmados por los estudios funcionales y
estructurales desarrollados en las larvas (Brunet, 2008) o en parásitos adultos (Martínez-
Ortiz de Montellano, 2010).
Gliricidia sepium (Jacq.)
Posición Sistemática
Reino: Plantae
Orden: Fabales
Subfamilia: Faboideae
Familia: Leguminoseae o Fabaceae
Género: Gliricidia
Especie: G. sepium
En el género se incluyen otras dos especies: G. maculata y G. guatemalensis, que se
diferencian de G. sepium en algunas características morfológicas relacionadas con las
legumbres, las hojas, las flores y el porte de la planta (CATIE, 1991).
Sinonimias
Robina sepium (Jacq).
Lonchocarpus sepium DC.
Nombres comunes
En Cuba Gliricidia es un género monotípico, ya que se encuentra solo G. sepium (Barreto,
1990). Generalmente se conoce como: bienvestido, piñón florido, piñón cubano, piñón
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amoroso, piñón violento y Júpiter en Cuba; matarratón en Colombia; madero negro en
Costa Rica; y otros nombres vulgares de acuerdo con el país. En inglés se denimina cocoa,
en francés lilas etranger y en portugués mae do cacau (Pérez Domínguez, 1989).
Origen y distribución
Esta planta ha sido domesticada por muchos siglos y ampliamente plantada y extendida a
nuevas áreas donde se ha naturalizado. La baja producción de semilla en las zonas más
húmedas de la vertiente del Atlántico de América Central sugiere que el rango nativo se
limita a los bosques secos deciduos de México y América Central, desde Sinaloa en el
noroeste de México hasta Guanacaste en Costa Rica. El borde norte de su distribución sigue
el límite de zonas. Una temperatura anual promedio de entre 22 y 28°C es característica de
las áreas de distribución natural y artificial de la especie, con una máxima promedio de 34 a
41°C durante los meses más calientes y una mínima promedio de 14 a 20°C durante los
meses más fríos.
Posee adaptabilidad a diferentes condiciones adversas (en su hábitat natural se le encuentra
en lugares con precipitaciones de 900 a 1 500 mm anuales y cinco meses de estación seca),
pero puede crecer en lugares con precipitaciones de hasta 500-600 mm/año y también se le
ha reportado en lugares húmedos de hasta 3 500 mm anuales. Puede sobrevivir en zonas
semiáridas de hasta 400 mm/año pero bajo estas condiciones su crecimiento es lento
(Pérez-Domínguez, 1989).
Crece bien en suelos de secos a húmedos, resiste a períodos prolongados de sequía y tiene
capacidad de prosperar en suelos relativamente pobres, aspectos que hacen de esta una
opción inevitable en la selección de especies para zonas difíciles que cumplan con sus
requerimientos ambientales, por lo cual es una de las plantas más recomendadas y
utilizadas en los sistemas agroforestales tanto en América Latina como en África Stewart,
2007; Murgueitio, 2009).
Características de la especie G. sepium
La G. sepium es nativa de las zonas bajas de México hasta Colombia y Venezuela (Sablón,
1985). Se ha difundido en las áreas tropicales de América, África, Asia y Australia,
naturalizándose en lugares húmedos y secos (CATIE, 1991).
30
Es un árbol multipropósito de rápido crecimiento, fácil establecimiento y tolerancia a las
podas regulares (Glover, 1989).Se le conoce como árbol pequeño, caducifolio, muy
ornamental y de crecimiento rápido. A menudo presenta múltiples tallos, copa abierta,
redondeada en árboles no descopados. Se utiliza frecuentemente para formar cercas vivas y
como sombra para el cafeto. Florece de diciembre a marzo y sus frutos maduran de abril a
mayo.
La composición química de esta especie ha sido estudiada por varios investigadores;
Gómez et al., (1990) en estudios realizados informan que G. sepium alcanza altos niveles
de proteína en hojas. Reporta que a los 45, 90 y 270 días después del transplante los niveles
oscilaron de 21 a 29, de 28 a 31 y de 31 a 33% de PC, respectivamente y que mantiene
equilibrado su contenido en minerales Por su parte, Galindo et al. (1989) reportan que el
contenido de minerales y nitrógeno en follaje de matarratón sobre la base del porcentaje de
materia seca es de 0,34; 2,42; 2,4; 0,41 respectivamente para P, K, Ca y Mg; y con niveles
de nitrógeno de 2,6%.
El valor nutricional del follaje de G.sepium está afectado por la frecuencia de recolección,
la época del año y la edad del material vegetativo (Urriola, 1994).
En G. sepium existen algunos compuestos secundarios que pueden ser los causantes de los
problemas que se presentan en los animales, desde rechazo hasta casos aislados de
infertilidad y aborto (Norton, 1994). Su efecto tóxico se debe tanto a la conversión de la
cumarina a dicumarol durante la fermentación bacteriana (Mochiutti, 1995), como a la
acción de otras sustancias tóxicas que han sido detectadas: fenoles, taninos (Ahn et al.,
1989) y esteroides (Galindo et al., 1989).
Principales usos de la Gliricidia
Uno de los árboles multipropósito más promisorios para la ganadería lo constituye G.
sepium. De acuerdo con García (2003) esta especie se destaca por su capacidad de fijar
nitrógeno, lo cual es muy significativo para la recuperación de suelos degradados. La
nodulación de las estacas ocurre en los 3 meses después de plantados (Wiersum y
Dirdjosoemarto, 1987). Las tasas de fijación de nitrógeno anuales para el madre cacao se
han calculado en 13 kg/ha (Roskoski et al., 1986).
31
La madera de esta especie sirve para construcciones pesadas, postes, mangos
deherramientas, artículos de artesanía e implementos agrícolas. Es excelente para leña
(sobre todo la de los árboles viejos). El duramen quema lentamente, produciendo buenas
brasas y poco humo. Asimismo, tiene buena capacidad de rebrote y facilidad para podarla y
cortarla.
Es ampliamente usada como forraje para los animales y presenta diferentes niveles de
aceptabilidad (Stewart, 2007). Su uso como forraje es poco uniforme. En algunos países, no
necesariamente en la misma región (incluyendo Indonesia, Sri Lanka y Colombia), es un
árbol forrajero importante; mientras que en otras partes se ha reportado un problema de
palatabilidad y no se utiliza como forraje.
Cordero y Boshier (2003) informan que bajo condiciones promedio un banco forrajero
suele rendir de 3-4 kg de hojas/árbol/cosecha, equivalente a 9-16 t/ha/año de materia seca o
43 t/ha/año de hojas frescas. Para el caso de la producción de leña un banco energético a 2
x 2 m (2 500 árboles/ha), cortado a 10-20 cm en un ciclo de corte de 3 años, dio un
rendimiento anual de 2,0-2,3 t/ha de leña seca. Para madera de mayores dimensiones, una
primera cosecha a los 3-4 años produce típicamente 8,15 m3/ha y cortes posteriores cada 2-
3 años deberían rendir un 40% más que lo que se obtuvo en la primera cosecha.
Sus flores son comestibles para el hombre (Roig, 1974) y tienen gran utilidad como
melíferas y en ornamentación (Glover, 1989).
Las semillas y la corteza pulverizadas y mezcladas con arroz tienen cualidades rodenticidas
(Roig, 1974). Es de las más conocidas leguminosas forrajeras arbóreas, aunque los altos
consumos producen toxicidad en algunos monogástricos; en los rumiantes puede constituir
una fuente proteica sobre todo en la época de sequía (Simons, 1996).
Se ha empleado como especie mejoradora del suelo (Kang y Mulongoy, 1987), además de
aportar a las gramíneas una parte del nitrógeno fijado.
Moringa oleifera Lam.
Posición Sistemática Reino: Plantae
Orden: Brassicales
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Familia: Moringaceae Género: Moringa
Especie: M. oleifera
Sinonimias
Reyes (2006) identifica a M. oleifera Lam. con los siguientes sinónimos:
Syns. M. pterygosperma Gaert
M. moringa (L.).Millsp
M. nux-ben Perr
Hyperanthera moringa Willd
Guilandina moringa Lam Nombres comunes
García Roa (2003) la conoce con el nombre común marango, pertenece a la familia
Moringaceae y su nombre científico es Moringa oleifera Lam
La Comisión Técnica de Fitomed informa que se conoce además con otros nombres
comunes, como palo jeringa, ben, acacia y jazmín francés.
Origen y distribución
M. oleifera es la especie más conocida del género Moringa. Es un árbol originario del sur
del Himalaya, el nordeste de la India, Bangladesh, Afganistán y Pakistán. Se encuentra
diseminado en una gran parte del planeta, y en América Central fue introducida en los años
1920 como planta ornamental y para cercas vivas (Foidl et al., 1999).
Existen unas 13 especies conocidas de Moringa que son: M. oleifera, M. arborea, M.
borziana, M. concanensis, M. drouhardii, M. hildebrandtii, M. longituba, M. ovalifolia, M.
peregrina, M. pygmaea, M. rivae, M. ruspoliana, M. stenopetala.
Características de la especie M. oleifera
Es un árbol de hasta 9 m de altura. Las hojas son compuestas y están dispuestas en grupos
de folíolos, con cinco pares de éstos acomodados sobre el pecíolo principal y un folíolo en
la parte terminal. Las hojas son alternas tripinnadas, con una longitud de 30-70 cm.
Se trata de un árbol perenne pero poco longevo, que a lo sumo puede vivir 20 años, aunque
se han obtenido variedades en la India que son anuales. Es una especie de muy rápido
crecimiento. Aporta una elevada cantidad de nutrientes al suelo, además de protegerlo de
factores externos como la erosión, la desecación y las altas temperaturas (Morton, 1991).
33
Ecología
Ramachandran et al. (1980) plantearon que es muy resistente a la sequía y se cultiva en
regiones áridas y semiáridas de la India, Paquistán, Afganistán, Arabia Saudita y África del
Este, donde las precipitaciones alcanzan sólo los 300 mm anuales.
Según Reyes (2006) la moringa es resistente a la sequía y tolera una precipitación anual de
500 a 1 500 mm. Además crece en un rango de pH de suelo entre 4,5 y 8, excepto en
arcillas pesadas, y prefiere suelos neutros o ligeramente ácidos.
García Roa (2003) explica que en Centroamérica se encuentra en zonas con temperaturas
de 6 a 38ºC. Es resistente al frío por corto tiempo, pero no menos de 2 a 3ºC. En las
temperaturas menores de 14ºC no florece y solamente se puede reproducir vegetativamente
(por estacas). Se localiza desde el nivel del mar hasta 1 800 msnm. Es una especie adaptada
a una gran variedad de suelos.
En sentido general se puede decir que es una especie de gran plasticidad ecológica, ya que
se encuentra localizada en diferentes condiciones de suelo, precipitación y temperatura.
García et al. (2006) evaluaron la composición química de seis especies en el estado Trujillo
de Venezuela, entre las que se encontraba M. oleifera. El contenido de proteína cruda en
todas las plantas fue alto. Los niveles de P, Ca y Mg no presentaron variaciones
importantes entre las arbóreas y las máximas concentraciones de K y Na se observaron en
M. oleifera (2.65 y 0.24%, respectivamente). Esta especie, de forma individual, presentó
uno de los mayores contenidos de carbohidratos solubles (24.1%) y ceniza (25.8%).
Principales usos de la Moringa
Abono verde
Fugliee (2000) informa sobre el empleo de la moringa como abono verde, lo cual enriquece
significativamente los suelos agrícolas. En este proceso primero se ara la tierra, luego se
siembra la semilla a una profundidad de 1-2 cm y a un espaciamiento de 10 x 10 cm (una
densidad de un millón de semillas por hectárea). Después de 25 días las plántulas son
sembradas con el arado en el suelo, a una profundidad de 15 cm. La tierra se prepara de
nuevo para el cultivo deseado.
Russo (citado por Meléndez, 2000) señaló que la moringa podría utilizarse como soporte
para las plantas de banano; también sus hojas al caer servirían como abono verde, debido a
que pueden proveer cantidades importantes de nitrógeno. El sistema desarrollado utiliza M.
34
oleifera establecida a un espaciamiento de 6 x 2 m, con una doble hilera de banano a 0,5 m
de las líneas de los árboles y un espaciamiento de 1 x 1,5 m (2 222 plantas/ha).
Producción de etanol y biodiesel
Garavito (2008), perteneciente a la Corporación Ecológica Agroganadera S.A. de
Colombia, recomendó a M. oleifera para la producción de etanol y biodiesel. A similar
consideración llegó Corella (2010), en Panamá.
Falasca y Bernabé (2008) consideran que es un cultivo atractivo para la producción de
biodiesel, fundamentalmente porque sus semillas contienen un 31-47% de aceite. El alto
tenor de ácido oleico del aceite indica que es adecuado para la obtención de biodiesel.
Cerca viva y cotina rompevientos
Croess y Villalobos (2008) señalaron que Moringa es un género de plantas con numerosas
especies distribuidas en zonas áridas y semiáridas, y en Venezuela (introducida como
planta ornamental y cerca viva).
Se puede emplear como cerca viva o cortina rompevientos. Evita la erosión del suelo en
zonas con períodos intensos de sequía y vientos fuertes. Permite el intercalamiento porque
da poca sombra y tiene escasas raíces laterales (Becker y Nair, 2004).
La mayor producción se alcanzó con la siembra del piñón a una distancia de 20 cm, que
aportó unos 64 mil postes por hectárea, con los cuales se pueden plantar 32 km de cerca.
Tratamiento del agua y floculante
Foild et al. (1999) recomienda la utilización de la moringa como floculante natural,
energético, fuente de materia prima de celulosa y de hormonas reguladoras del crecimiento
vegetal.
Muñoz et al. (2008) plantearon la importancia de la introducción de los coagulantes
naturales en los procesos de clarificación de agua para el consumo humano, como una
tecnología apropiada ante las condiciones económicas actuales de Cuba. Estos autores
señalan los resultados alcanzados en laboratorios
Otros usos
Price (2000) lo recomienda para la producción de aceites antibióticos, hormona del
crecimiento, para contrarrestar la desnutrición de los niños y como alimento humano en
general.
35
Según Foild et al. (2001), la madera de marango constituye una excelente pulpa tan buena
como la de álamo (Populus sp.). Las hojas son apropiadas para la producción de biogas. Sin
embargo, García Roa (2003) considera que el marango no tiene las cualidades físico-
mecánicas para ser considerado como maderable, por lo que no es una especie apropiada
para este fin.
Este autor señala que además de ser bueno para poste vivo, tiene una característica especial
que consiste en que es rico en néctar y polen, y es una planta melífera por excelencia.
También es un suplemento proteínico (la torta de semilla contiene 60% de proteína y la
semilla entre 32 y 40% de grasa); es un elemento esencial para la alimentación en la época
seca del ganado vacuno y ovino.
Garavito (2008) le concede gran importancia a M. oleifera en la alimentación animal, ya
que por los contenidos de proteínas y vitaminas puede ser un suplemento de importancia en
la ganadería de leche y de ceba, así como en la dieta de aves, peces y cerdos, siempre que
haya un balance nutricional.
Price (2000) informó que la producción de leche fue de 10 kg/vaca/día con el empleo del
40-50% de moringa en la dieta (sin moringa fue de 7 kg/animal/día). El aumento diario de
peso en el ganado de engorde fue de 1 200 kg/día (900 kg/día sin la utilización de moringa).
Dichrostachys cinerea (L.) (Wight & Arn)
Posición sistemática Reino: Plantae Division: Sparmatophyta Sub división: Angiospermae Sub division: Magnoliophytina Clase: Magnoliopsida Subclase: Rosidae Orden: Fabales Familia: Minosaceae R. Br., Flinders Genero: Dichrostachys (DC.), Wight & Arn Especie: D. cinerea
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Sinonimias D. glomerata (Forssk.) Chiov.
D. caffra Meisn. en Krauss
D. nutans (Pers.) Benth. en Hook.
D. callistachys Hassk
Mimosa glomerata Forssk.
Acacia cinerea Spreng.
Cailliea glomerata (Forssk.) J.F.Macbr.
Desmanthus trichostachyus DC.
Nombres comunes
En Cuba recibe los nombres comunes de marabú, aroma, aroma francesa, aroma blanca,
espina del diablo y Weyler.
Origen y distribución
El marabú, originario del desierto de Kalahari en África del Sur (Bryant et al., 1991), existe
también en la India, Tailandia, Malasia. En América fue introducida en el sur de los
Estados Unidos, Cuba, La Española y las Islas Francesas de Guadalupe, María Galante y
Martinico. Se ha descrito nueve subespecies y trece variedades.
Existen unas 12 especies en los trópicos del Viejo Mundo desde África hasta Australia, la
mayoría de las especies provienen de Madagascar. Dichrostachys cinerea (L) Wight & Arn.
Sinonimia: D. glomerata (Forsk.) Chiov.; D. caffra Meissan. En Kraus.; D. nutans (Pers.)
Benth. En Hook.; D. callistachys Hassk.; Mimosa glomerata Forsk.; Acacia cinerea
Spreng.; Cailliea glomerata (Forsk.) Macbride.; Desmanthus trichostachyus Dc. Especie
polimorfa. En Cuba sólo existe la subespecie africana variedad Africana, recibe los
nombres comunes de marabú, aroma, aroma francesa, aroma blanca, espina del diablo y
Weyler (Bryant et al., 1991).
Características de la especie D.cinerea
Arbustos o árboles pequeños, con o sin espinas, sin aguijones. Hojas bipinnadas, raquis con
glándulas, pinnas con algunas hasta numerosos pares de folíolos opuestos. Espigas solitaria
o en glomérulos, axilares. Flores heteromorfas, las superiores hermafroditas, las cuales son
37
estériles y de otro color, cáliz cinco, dentados; pétalos cinco, concreciente en la base;
Estambres diez libres, en las flores hermafroditas todos fértiles; atenas con glándulas;
estaminodios de las flores estériles alargados, sin antenas. Polen en póliades de cuatro,
ocho, dieciséis o veinte cuatro granos o solitarios; frutos en glóselos, comprimidos, lineales,
curvados hasta circinados con o sin sinuosidades, dehiscentes o abriendo irregularmente o
indehiscentes, sin estípe; semillas más o menos aplanadas, sin arilo, con un pleurograma del
75% (Sauget y Liogier, 1995).
Características fenológicas e indicadores de la composición química
Trabajos de Pedraza et al. (2008) muestran algunas características fenológicas de la planta
de marabú e indicadores de la composición química de sus hojas y pecíolos con diferentes
alturas en la época seca.
Tabla 2. Característica fenológicas de las plantas de marabú (D. cinerea) e indicadores de la
composición química de sus hojas y pecíolos con diferentes alturas en época seca.
Variable Altura de la planta (cm) Indicadores fenológicos 30 72 153 EE Altura, cm 30.0 c 72.0 b 153.0a 55.1 Grosor del tallo, mm 7.2 12.3 28.0 10.0 Número de ramas primaria 2.7 b 8.0a 7.7ª 2.7 Peso de la planta verde, g 27.0 b 145.0 b 946.0 a 495.2 Hojas, % en la planta verde 30.9 19.2 17.4 14.4 Hojas, % en base seca 21.6 13.7 14.2 10.6 Indicadores de composición química Materia seca, % 24.2 32.4 44.2 8.84 Proteína bruta, % 15.4 17.7 14.7 1.73 Fibra neutro detergente 32.3 a 26.7b 30.3 a 2.61 PB en la FND, % 29.0 31.3 37.9 5.66 Polifenoles extractables totales (PFET) 12.0 12.7 13.4 0.83
Letras diferentes indican diferencias significativas entre medias (P<0,05). Makkar y Becker (1998) muestran concentraciones de PFET similares en el follaje de
Dichrostachys cinerea y otras arbustivas que crecen en Benin, Zimbabwe y Níger. Aganga
y Adogla-Bessa (1999) también encontraron valores similares en el follaje de esta especie y
otras arbustivas que crecen en Botswana. El contenido de PFET es muy alto si se compara
con el follaje de diversas leguminosas arbustivas utilizadas en distintos sistemas de
producción con rumiantes (Estévez, 2000).
38
Jackson et al. (1996) señala a los compuestos fenólicos, fundamentalmente lo taninos,
como el mayor impedimento en el uso del follaje de leguminosas por los rumiantes.
Aganga y Adogla-Bessa (1999) consideran que debido al alto contenido de taninos y baja
digestibilidad del follaje de D. cinerea se limita grandemente el uso de su proteína por los
animales, casi la tercera parte de la PB se encuentra asociada a la FND (Jones y Palmer,
2000).
Principales usos del marabú
A pesar de su enorme impacto ambiental negativo en Cuba, el marabú resulta allí útil en
algunos aspectos. Protege grandes áreas de suelos desprovistos de vegetación natural contra
la erosión, sobre todo en las franjas hidroreguladoras de las cuencas fluviales. Su madera es
muy dura, duradera, inmune al ataque de hongos e insectos, de alta densidad (1,11- 1,23
g/cm³ con 15% de humedad), de textura fina y grano recto, difícil de trabajar, es utilizada
para cercas, construcciones rústicas y ebanistería. Se utiliza como leña, que tiene buena
combustión, produce brasas duraderas, su poder calórico es de 4654 kcal/kg, y produce
poco humo y cenizas; es muy buena para fabricar carbón (Wikipedia, 2012).
La presencia de esta especie brinda protección al suelo contra los efectos erosivos del
viento, la lluvia y el sol, además del aporte de nitrógeno en su condición de leguminosa. La
caída de su follaje permite un significativo aporte anual de materia orgánica al suelo,
mientras que el potente sistema radicular de la planta, que puede penetrar hasta 2 m de
profundidad, facilita su remoción, aireación y la infiltración del agua, así como la fijación
del nitrógeno atmosférico (Manzanares et al., 2008). Al desmontar un suelo cubierto por
marabú para actividades agrícolas, los campesinos dejan establecidas, entre campo y
campo, estrechas fajas de marabú no solo para aprovechar estas cualidades de la especie,
sino también en función de cinturón protector de la biodiversidad como cortina
rompevientos (Núñez, 2001).
El marabú en Cuba, por su extensión, puede ser fuente de biomasa para combustible sólido
de baja densidad. Se calcula que con maquinaria y el consumo de una tonelada de petróleo
pueden cortarse 800 toneladas de biomasa (que equivalen a la energía de 267 a 400 t de
petróleo), en 13,43 ha (1 caballería cubana), en un turno de trabajo (Méndez y Ramos,
2004).
39
Su posible empleo como alimento para los rumiantes, directamente en pastoreo (Muñoz et
al., 2000) o como forraje, se ha valorado también. Sin embargo, la factibilidad de su
empleo no está debidamente fundamentada, en parte por la poca información que se
dispone de su valor nutritivo. Sin embargo sus hojas y frutos son utilizados en la
alimentación del ganado nativo y de cabras en algunas regiones de África
fundamentalmente en época de seca (Ndlovu et al., 2000), lo que sugiere una adaptación de
esos animales al consumo de esta leguminosa arbustiva. Por otra parte en trabajos de Toral
et al., (2001) en una prospección en la península de Zapata, encontró que tanto en las
encuestas a los campesinos como en las observaciones directas en el campo, quedó
demostrado el papel que desempeñan en la alimentación de los rumiantes especies como el
marabú, considerada una maleza en los sistemas de explotación, ya que junto con las
leguminosas volubles y los arbustos constituye la dieta básica de estos animales.
Según Muñoz et al. (2007), las hojas y brotes tiernos de marabú son un excelente alimento
para el ganado rústico que las pasta en rebrotes. Tienen un 15% de proteína bruta, 21,6% de
fibra cruda asimilable, 1,53% de calcio y un 0,8% de fósforo, entre otros elementos.
Durante el invierno pierden las hojas, acumulando un colchón considerable de materia
orgánica que como tal, aumentan la fertilidad de los suelos que asienta al marabuzal. Sus
raíces son potentes desmenuzadoras del terreno, aumentando la permeabilidad de los suelos
arcillosos, por los que presenta cierta preferencia y participan en la fijación de nitrógeno
simbióticamente. El dosel del marabú y su sistema radical evita la erosión de los lomeríos
de poca capa vegetal, suministrando madera dura y un carbón de primera calidad.
A pesar de su indeseable presencia constituye una potencial reserva de carbón vegetal, muy
cotizado en el mercado mundial. Es un gran suministrador biológico, pues fija nitrógeno al
suelo, y además los preserva de la degradación y desertificación. Su follaje puede
emplearse en la fabricación de biogás a base de cisternas de fermentación para la obtención
de metano. La madera es utilizada en la mueblería artesanal, desarrollada actualmente en la
provincia de Las Tunas (Diario de la juventud cubana, 2007)
40
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
Localización. El estudio se desarrolló en las áreas experimentales y laboratorios de la
Estación Experimental "Indio Hatuey", ubicada a 22°48'7'' de latitud Norte y los 81°1' de
longitud Oeste, a una altitud de 19,01 msnm.
Colección del material vegetal y preparación de los extractos
Se seleccionaron por su importancia en la zona para la producción ovina tres especies
arbóreas: Moringa (M. oleifera), Árbol florido (G. sepium) y Marabú (D. cinerea). El
follaje (hojas en diferente estado de madurez) se colectó en horas de la mañana de áreas
aledañas a la institución y se trasladaron al laboratorio en viales refrigerados para evitar
cambios bioquímicos (FAO, 2000)
Se prepararon extractos acuosos de cada una de las plantas mediante el método propuesto
por (Díaz et al., 2010) de extracción mediante maceración en nitrógeno líquido. Para ello,
se colectaron 100 g de material y, se maceró en nitrógeno líquido y posteriormente se
añadió una solución tampón fosfato de sodio (PBS), 100 mM, pH 7,0 en frío y, con una
relación masa/volumen 1:1. Posteriormente se centrifugó a 12000 r.p.m. durante 15
minutos y se colectó el sobrenadante para la realización de los ensayos in vitro.
Preparación de las soluciones
a) Extractos de las plantas: Moringa (MOR), Piñón florido (GLR) y Marabú (MAR)
Para todos los ensayos se emplearán tres concentraciones de cada planta: 50, 25 y 12,5
mg/mL a partir de una solución madre.
b) Albendazol (Marie-Magdeleine, 2009)
Para los test de desarrollo larvario y eclosión de huevos se emplearon tres concentraciones
de Albendazol: 5; 2,5 y 1,25 mg/mL. Para ello se utilizaron 0,100 g de Albendazol P.A
(Sigma®) y se le añadieron 0,6 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) y 9,4 mL de PBS (pH
41
7,2). Con estas concentraciones se obtuvo una solución de Albendazol al 1%; las diluciones
se realizaron en cascada con PBS como solvente.
b) Levamisol (Marie-Magdeleine, 2009)
Para el test de migración larvaria se preparó una solución madre de Levamisol al 1%. Para
ello se tomarán 340 µL de Levamisol P.A (Sigma®) y se ajustó con 33,66 mL de PBS.
Posteriormente se prepararán soluciones a concentraciones de 5, 2,5 y 1, 25 mg /mL.
Diseño experimental y tratamientos
Se utilizó un diseño completamente al azar con nueve tratamientos y seis réplicas (pocillo
de la placa para cultivo de tejido).
Los tratamientos consistieron en las tres plantas en tres concentraciones:
Moringa: MOR-50, MOR-25, MOR-12,5
Piñón florido: GLR-50, GLR-25, GLR-12,5
Marabú: MAR-50 MAR-25, MAR-12,5
Adicionalmente se empelaron controles negativos (PBS y DMSO) y controles positivos de
Albendazol (ABZ) en sus tres concentraciones para los test de eclosión y desarrollo larvario
(ABZ-5, ABZ-2,5, ABZ-1,25) y Levamisol (LEV) en sus tres concentraciones para el test
de migración larvaria (LEV-5, LEV-2,5, LEV-1,25)
Obtención de los huevecillos de nematodos (Hubert y Kerboeuf, 1984 y Marie-
Magdeleine, 2009).
La recolección de huevecillos se realizó a partir de un animal infestado de forma
experimental. Se hizo una coproscopía inicial para conocer la cantidad de huevecillos por
gramo de heces mediante la técnica de McMaster modificada (Arece et al., 2002). Se
recolectaron las heces del animal infestado por período de seis horas. Se trasladaron al
laboratorio e inmediatamente se trituraron con la adición de agua. Se filtró a través de
42
tamices de diferente tamaño (200-150-63-32 µm); el enjuague de las heces se hará hasta
que el agua salga perfectamente limpia. Los huevecillos quedaron retenidos en el tamiz de
32 µm.
El sedimento obtenido en el tamiz de 32 µm se repartió tubos Falcon® de 50 mL. Se
centrifugaron durante 10 minutos a 2000 r.p.m a 20°C. Posteriormente, se eliminó el
sobrenadante hasta dejar 35 mL, posteriormente se añadió hasta completar los 50 mL
solución saturada de cloruro de socio (NaCl) con una densidad de 1.200 y, se centrifugó
nuevamente a 3000 r.p.m durante 15 minutos a 20°C. Los huevecillos se colectaron con una
pipeta Pasteur en la interface que e forma por las diferencias de densidad entre el agua y la
solución sobresaturada de NaCl, la cual formó un anillo de color blanco. Se realizaron
varios enjuagues a los huevos recolectados con agua corriente y, finalmente con agua
destilada; este enjuague se realizó con el tamiz de 32 µm.
Para la estimación de la cantidad de huevecillos (N); contenidos en un mililitro de agua (C)
se realizaron conteos en 10 alícuotas de 20 µL. La homogenización se realizó mediante
Vortex. El número total de huevos por mL se calculó como sigue: C=N*5. Se garantizó una
concentración una concentración entre 500-700 huevos/mL.
Prueba de eclosión de huevos (PEH) (Hubert y Kerboeuf, 1984 y Marie-Magdeleine,
2009).
El principio de este método consistió en enfrentar una cantidad conocida de huevos de
nematodos a diferentes concentraciones de extracto de las plantas con la presencia de un
grupo control positivo (PBS) y un grupo control negativo (Albendazol) y se evaluó su
efecto sobre la eclosión de los huevecillos, en cada grupo.
Se trabajó con placas de cultivos de 24 pocillos y la distribución de los tratamientos
muestran en las figura 2 y 3 Cada placa contó con un control que se corresponde con el
solvente empleado en cada caso: PBS, pH 7,0 ó DMSO+PBS.
43
Figura 2. Esquema de la distribución de los extractos de los tratamientos en las placas.
Figura 3. Esquema de la distribución de los tratamientos en las placas.
Se depositaron en cada pocillo 0.5 mL de la solución de los huevecillos y se le aplicó este
mismo volumen para cada solución a evaluar. Posteriormente, se mantuvo durante 48 h a
temperatura ambiente y, al finalizar este período se le añadieron 100 µL de solución de
Lugol para detener la eclosión (Assis et al., 2003).
PBS
Extracto Conc. 1
Extracto Conc. 2
Extracto Conc. 3
DMSO
ABZ-5
ABZ-2,5
ABZ-1,25
44
Se realizó un conteo de 20 alícuotas de 10 µL por pocillo, en el microscopio óptico y se
contaron huevos y larvas en cada una de ellas. El porcentaje de eclosión se determinó como
sigue % Ecl.= (L1/(L1+ Huevecillos))*100.
Prueba de inhibición de la migración larvaria (L3)
Principio del método. Las larvas fueron expuestas a los diferentes extractos durante 3
horas. Después se enjuagaron con abundante agua y se depositaron sobre un tamiz de 20
µm. Posterior a ello se esperó 3 horas para contar el número de L3 que atravesó el tamiz.
Obtención de las L3 de Haemonchus spp.
Las larvas infestivas se obtuvieron mediante coprocultivos a través del método de Roberts y
O´Sullivan (1952). Estas se lavaron y concentraron por centrifugación y se ajustó una
cantidad de 1000 L3/mL.
Procedimiento experimental
Se emplearon tres tubos cónicos Falcon® por cada tratamiento (Figura 4): Control (PBS),
Levamisol con sus tres concentraciones (5, 2,5 y 1,25 mg/mL) y las tres concentraciones de
cada planta (EXTR-3, EXTR-2 Y EXTR-1)
Figura 4. Esquema de distribución de los tratamientos
Se distribuyó en cada tubo de ensayo un volumen no superior a 1 mL de solución larvaria
que aporte 1000 L3/mL. Después se añadió la misma cantidad e extracto de la planta o
LEV-1,25 EXTR 3 EXTR-2 EXTR-1 PBS LEV-5 LEV-2,5
45
solución de control (PBS o Levamisol).Se dejó en repodo por tres horas y transcurrido ese
tiempo se centrifugaron los tubos de ensayo a 4500 r.p.m por 5 minutos a 15°C. Con la
ayuda de una pipeta se retiró la mayor cantidad de sobrenadante evitándose la extracción de
larvas.
Las larvas se sometieron a tres lavados consecutivos con PBS para lo cual cada tubo se
ajustó a un volumen de 1 mL de PBS y se realizó la centrifugación como en el
procedimiento anterior. En el último enjuague se retiró la mayor cantidad posible de
sobrenadante. Una vez que se culminó con el lavado de las larvas se ajustó a cada tubo un
volumen de 1 mL y se homogenizó la muestra en Vortex. Todo ese volumen se depositó en
los dispositivos de migración (figura 5). Se dejó reposar por tres horas a temperatura
ambiente evitando movimientos bruscos.
Figura 5. Dispositivo de migración
Después de ese periodo se retiró el inserto (Figura 6) que contiene el dispositivo de
migración con una pinza evitándose movimientos bruscos. A cada tubo, una vez retirado el
inserto, se ajustó a un volumen de 2 mL. Se homogenizó y se contó la cantidad de lavas
migradas en 20 alícuotas de 10 µL por tubo de ensayo.
Tubo cónico
Inserto
46
Figura 6. Características del inserto. VL-vista lateral VS- vista superior
Cálculos y determinaciones
Para la determinación bruto de larvas que migraron (B) se utilizó la siguiente fórmula:
Donde;
N- Número de larvas en contacto con los extractos
Z- Número de larvas que migraron
X- Factor multiplicativo para expresar las larvas contadas por mL ( x=5 ya que el conteo se efectuó a 200 µL, o sea a 20 alícuotas de 10 µL)
T- Volumen de ajuste a los tubos cónicos (2 mL)
A partir de esta información de determinó el porcentaje de migración como sigue:
Inserto (VL)
Inserto (VS)
Tamiz (20 µm)
47
Análisis estadístico
Los datos se procesaron con el paquete estadístico SPSS®. Los valores porcentuales (eclosión y migración) de cada prueba se transformaron ( ) para la realización de una análisis de varianza de clasificación simple. Se comprobó la homogeneidad de las varianzas y la distribución normal de los datos mediante la prueba de Battle y Kolmogorov Smirnov, respectivamente. Las diferencias entre las medias se realizaron mediante la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan (1955).
Se realizó un análisis de regresión Log Probit para la determinación de la dosis letal media (DL50) de cada planta para la eclosión de los huevecillos (Waller et al., 1985).
48
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La principal ventaja del empleo de ensayos in vitro para discriminar plantas con
propiedades antihelmínticas incluye el bajo costo relativo y la rápida respuesta. Ello
permite el trabajo con una cantidad considerable de plantas a gran escala. Adicionalmente,
los ensayos in vitro poseen la ventaja de poder trabajar a la vez en diferentes fases del
desarrollo de los parásitos, ya sea en la validación de la eclosión de huevecillos, el
desarrollo, desenvainamiento y la migración de las larvas, hasta incluso en parásitos
adultos, sin interferir en las funciones fisiológicas de los hospederos (Molan et al., 2003;
Assis et al., 2003; Githiori et al., 2006). En el mundo se han desarrollado varias
investigaciones in vitro para evaluar la actividad de plantas medicinales contra nematodos
de animales de granja (Alawa et al., 2003; Asiss et al., 2003; Diehl et al., 2004; Maciel et
al., 2006; Bizimenyera et al., 2006).
En la tabla 3 se muestra el porcentaje de eclosión de cada tratamiento donde se aprecia que
los extractos, en cierta medida, interfirieron en la eclosión de los huevecillos de
estrongílidos gastrointestinales en las concentraciones utilizadas. De este modo, los grupos
controles negativos (DMSO y PBS) presentaron los porcentajes de eclosión más altos
mostrando diferencias significativas con todos los extractos de plantas. Esta situación
indica la inocuidad de la solución tampón (PBS) y del DMSO.
No obstante esta situación se apreció algunas particularidades. La dosis más baja de D.
cinerea (12.5 mg/mL) y la intermedia de G. sepium (25 mg/mL) presentaron porcentajes de
eclosión similares (p<0.05) a los controles negativos (PBS y DMSO) lo cual pudiera estar
relacionado con posibles efectos dosis-dependiente.
La tasa de eclosión obtenida en los grupos control positivo (ABZ) fue la más baja (p<0.001
lo cual demuestra el efecto ovicida de este fármaco (Martin et al., 1997), razón por la que
es el fármaco de elección como control positivo en este tipo de estudio.
Las tres plantas lograron inhibir de manera significativa (p<0.001) la eclosión de huevos
con efecto dependiente de las dosis empleada. Estos valores estuvieron entre 41 y 58% con
49
los mejores resultados para la concentración más baja (41.40% en dosis de 12.5 mg/mL) de
G. sepium.
Tabla 3. Porcentaje de eclosión de huevecillos de estrongílidos gastrointestinales de ovinos
frente a extractos acuosos de M. oleifera, G. sepium y D. cinerea.
Tratamiento EclosiónΩ ES ±
PBS 81.87 a
2.22***
DMSO 63.93 bc ABZ-5 28.27 h ABZ-2.5 33.78 gh ABZ-1.25 33.29 gh MOR-50 51.99 def MOR-25 44.93 defg MOR-12.5 42.96 efg GLR-50 55.96 bcde GLR-25 67.86 b GLR-12.5 41.40 gh MAR-50 50.75 def MAR-25 47.93 def MAR-12.5 58.22 bcd
*** p<0.001 Ω Corregida según fórmula de Abbott por el PBS como control negativo.
Assis et al. (2003) y Maciel et al. (2006) obtuvieron resultados similares con extractos de
Spigelia anthelmia y Melia azedarach en la eclosión de huevecillos de H. contortus. Por su
parte, Barrabí y Arece (2013) con extractos de A. indica encontraron tasas de eclosión
inferiores posiblemente por los efectos directos de la azadirachtina o algunos metabolitos
secundarios como los triterpenoides y los taninos condensados a los cuales se les atribuyen
efectos ovicidas (Pessoa, 2001). También Costa et al. (2002) estudiaron los efectos de
extractos de mango (Mangifera indica) y encontraron tasa de inhibición de la eclosión de
un 95,66% en concentraciones de 50 mg/mL con efecto dependiente de la dosis empleada.
Los porcentajes de eclosión obtenidos son también similares a los obtenidos con extractos
acuosos de semillas de Carica papaya y superiores a los de hojas de yuca (M. esculenta)
(12,35%) y plátano (Musa paradisiaca) (6.14%), obtenidos en el Caribe oriental
(Guadalupe) por Marie-Magdeleine (2009).
50
En la tabla 4 se aprecian las regresiones realizadas para en el análisis Probit. Este tipo de
estudio se realiza con el objetivo de determinar la dosis letal media (DL50) la cual se define
como la concentración de una droga o extracto que produce el 50% de inhibición en la
eclosión de huevos (Varady et al., 2006). Amarante et al. (1996) encontró en especies de
nematodos gastrointestinales resistentes a determinado fármaco presentó DL50 superiores
que las especies susceptibles lo cual constituye un indicador de eficacia. En el presente
estudio la DL50 más baja fue para D. cinerea mientras que M. oleifera duplicó la de G.
sepium. Este comportamiento posiblemente está relacionado con los contenidos de
metabolitos secundarios presentes en cada una de las plantas y constituye un criterio
importante para evaluar los efectos antiparasitarios del extracto de una planta.
Tabla 4. Dosis letal media (DL50) y ecuación de regresión de los diferentes extractos en la
eclosión de huevecillos de estrongílidos gastrointestinales de ovinos.
Planta Ecuación DL 50
Sign.
M. oleifera Eclosión = -0.65 Log10
(Dosis) + 6.17 60.92 *** G. sepium Eclosión = -0.87 Log
10 (Dosis) + 6.30 30.70 ***
D. cinerea Eclosión = 0.64 Log10
(Dosis) -1.61 9.41 ***
En un estudio desarrollado por Al-Shaibani et al. (2008) encontraron que la dosis letal
media presentó variaciones en función de la especie de nematodo frente al extracto,
justificado por la individualidad de cada especie. Estos autores evaluaron una planta a la
cual se les atribuye propiedades antiparasitarias en Pakistán (Adhatoda vasica) y
encontraron DL50 entre 14 y 15 mg/mL para H. contortus, T. colubriformis y O.
columbianum.
Las ecuaciones de regresión lineal entre el Log10 de la dosis y el valor Probit (Figura 7)
mostraron en el caso de moringa y piñón florido pendientes negativas, mientras que en el
caso del marabú fue positiva. El valor más bajo del la DL50 del marabú se refleja por este
valor así como por el valor más bajo del intercepto de la curva con el eje Y.
51
Figura 7. Regresión lineal entre los valores Probit y la dosis (Log10) para M. oleifera (A),
G. sepium (B) y D. cinerea (C).
La medición de la capacidad de migración de las larvas a través de un tamiz de 20 µm
(figura 8) permitió demostrar que los extractos en sus tres concentraciones tuvieron efectos
inhibitorios en la motilidad de las larvas lo cual evidencia la capacidad de los extractos en
inmovilizarlas y prevenir su paso a través del dispositivo de migración. Mediante este
estudio se demostró que el PBS no interfirió prácticamente en la capacidad migratoria de
las larvas, mientras que el Levamisol solo migró del 6 al 13%. Este fármaco es un potente
A
B
C
52
larvicida tras la producción de una parálisis espástica por actuar como antagonistas selectivos en los receptores nicotínicos y
acetilcolínicos (sinápticos y postsinápticos) de las células musculares de los parásitos (Martin, 1997).
a
fe e
g g g fg fg fg
cd
b
0102030405060708090
PBS LEV-5 LEV-2,5 LEV-1,25 MOR-50 MOR-25 MOR-12,5 GLR-50 GLR-25 GLR-12,5 MAR-50 MAR-25 MAR-12,5
Mig
raci
ón, %
Tratamientos
Figura 8. Porcentaje de migración de larvas L3 de estrongílidos gastrointestinales de ovinos frente a extractos acuosos de M.
oleifera (MOR), G. sepium (GLR) y D. cinerea (MAR).
De los extractos evaluados se apreció que la mayor tasa de inhibición (p<0.05) de la migración larvaria se encontró para M. oleifera y
G. sepium; la primera de estas presentó valores mayores que el grupo control positivo a base de Levamisol. Estos resultados son
inferiores a los reportados por Marie-Magdeleine et al., (2010a,b) en extractos metanólicos de yuca (M. esculenta) y Tabernaemontana
citrifolia con valores de 57.6% y 50.6% para cada uno, respectivamente.
53
Aun cuando los resultados de estas dos plantas fueron impresionantes, en el caso particular
del marabú se puede considerar también como elevado si se tiene en cuanta que logró
inhibir la migración larvaria entre 22 y 51%.
Estos efectos de inhibición tanto del desarrollo de las larvas como de su capacidad de
migración de los extractos de plantas se atribuyen a la presencia de metabolitos secundarios
(PMS). Entre los principales PMS que se les atribuyen efectos antiparasitarios son los
taninos condensados (Nguyen et al., 2005), las lectinas (Ríos de Álvarez et al., 2012), los
terpenoides (Molan et al., 2003) y flavonoides (Ademola et al., 2005).
Estas sustancias del metabolismo secundario de las plantas están presentes en las tres
especies. En el caso del marabú su follaje es considerado una planta tanífera con valores de
178,4 g/kg de MS de este metabolito secundario (Mlambo et al., 2004); en Cuba Pedraza et
al. (2008) reportó contenidos de polifenoles totales de 120 g/kg MS. En el caso de moringa
se encontró en tamizaje fitoquímico la presencia de alcaloides, glicósidos, flavonoides,
esteroides, terpenoides, saponinas, taninos y antraquinonas (Sinha, 2012); en Nigeria se
encontraron niveles de TC de 21,9% (Ogbe y Affiku, 2012). Por su parte, el piñón florido
es una planta que presenta una gran variedad de metabolitos secundarios con presencia
importante de saponinas, taninos y alcaloides (García y Medina, 2006); se han encontrado
niveles de taninos entre 3,6 y 4,6% (Romero, 2000).
Es muy probable que los TC (fundamentalmente ante D. cinerea y M. oleifera) sean los
principales responsables de la actividad inhibitoria de la migración larvaria. La forma en
que los TC actúan continúa en un debate profundo. Existen dos hipótesis de cómo los TC
actúan, la primera de ellas se sustenta en los posibles efectos directos de estas sustancias al
poseer la capacidad de formar complejos con las proteínas de los parásitos del tracto
gastrointestinal (Mueller-Harvey, 2006). Estos se considera actúan de dos formas
fundamentales: 1) conexión a las proteínas libres por lo tanto reducen la cantidad de
nutrientes por lo que las larvas mueren o, 2) conexión a la cutícula de la larva que es rica en
glicoproteínas causando la muerte de la larva (Cala et al., 2012). Esta hipótesis constituye
la más aceptada en estudios in vivo de corta duración o en estudios in vitro. En adición, los
taninos intervienen en una disminución de la capacidad fecundativa de los parásitos
54
(Martínez-Ortíz de Motellano et al., 2010) y, directamente sobre los parásitos adultos
(Manolaraki, et al., 2010, Martínez-Ortíz de Montellano, 2010).
Es muy probable que los efectos antiparasitarios no sean solo por algún metabolito
secundario en particular, sino por la presencia combinada de algunos de ellos. Es conocido
que la moringa (Coehlo et al., 2009) y el piñón florido (Ríos de Álvarez et al., 2012)
poseen niveles considerables de lectinas. Posiblemente la combinación de efectos de los
taninos condensados y este metabolito secundario contribuyeron a inmovilizar mayor
cantidad de larvas y posiblemente interfirieron en la capacidad de migración de las L3 de
nematodos gastrointestinales de ovinos.
55
CONCLUSIONES
• Los extractos acuosos de hojas de M. oleifera, G. sepium y D. cinerea redujeron la eclosión de huevecillos con determinada variabilidad en cuanto entre ellas, destacándose M.oleifera y D. cinerea con valores de inhibición de la capacidad de eclosión superiores al 50%.
• Las tres plantas evaluadas inhibieron considerablemente la capacidad de migración de las larvas con valores superiores de inhibición a un 50%, destacándose M.oleifera y G.sepium con valores de inhibición similares al grupo control positivo (Levamisol).
• La dosis letal media encontrada fue baja para las tres plantas no superando los 61 mg/mL; la DL50 más baja se encontró para D.cinerea con valores inferiores a 10 mg/mL.
56
RECOMENDACIONES
A partir de los resultados encontrados en la presente tesis se recomienda:
• Diseñar y ejecutar investigaciones en otros estadios del ciclo de vida de los
estrongílidos gastrointestinales de ovinos que permita dilucidar los posibles efectos
antihelmínticos in vitro de estas plantas con la finalidad de ser evaluados en otra
fase in vivo.
• Realizar estudios in vitro similares con otras arbustivas y otros tipos de extractos
con diferente polaridad (extracción metanólica y diclorometanólica).
• Divulgar los resultados y metodología de trabajo obtenidos en la presente
investigación mediante Congresos y Publicaciones.
57
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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