EritromisineEritromisine dirençli klinikdirençli klinik StreptococcusStreptococcus

pneumoniaepneumoniae izolatlarındaizolatlarında makrolidmakrolid direncinindirencinin

genetik profili ilegenetik profili ile serotipserotip ilişkisiilişkisi

EritromisineEritromisine dirençli klinikdirençli klinik StreptococcusStreptococcus

pneumoniaepneumoniae izolatlarındaizolatlarında makrolidmakrolid direncinindirencinin

genetik profili ilegenetik profili ile serotipserotip ilişkisiilişkisi

N. Tiryakioğlu, B. Aksu, M. U. HasdemirMarmara Üni. Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İstanbul

S. pneumoniae’da Makrolid Direnci

• Uzak-Doğu %74-97• Avrupa >%25

İtalya, Fransa, İspanya, Macaristan, Türkiye

Türkiye• 2005 %10• 2008 %29

Marmara Üni. Hastanesi• >%40

• Uzak-Doğu %74-97• Avrupa >%25

İtalya, Fransa, İspanya, Macaristan, Türkiye

Türkiye• 2005 %10• 2008 %29

Marmara Üni. Hastanesi• >%40

S. pneumoniae’da Makrolid DirençMekanizması

Hedefte Değişiklik• 23S rRNA’da bir adenin

rezidüsünün metillenmesi• erm(B) geni (Tn917, Tn1545)

erm(TR) nadir

Makrolid aktif atım pompası• Mef(A) veya Mef(E): MFS

üyesi membran transportproteini

• mef (A) veya mef(E) genikontrolünde

• Düşük düzey makrolid direnci

Hedefte Değişiklik• 23S rRNA’da bir adenin

rezidüsünün metillenmesi• erm(B) geni (Tn917, Tn1545)

erm(TR) nadir

cMLSB fenotipi

iMLSB fenotipi

L EL E

Makrolid aktif atım pompası• Mef(A) veya Mef(E): MFS

üyesi membran transportproteini

• mef (A) veya mef(E) genikontrolünde

• Düşük düzey makrolid direnci

E L

M fenotipi

Eritromisin direnci-Serotip İlişkisi

• Eritromisin direnciSerogrup 1, 14, 19 (daha az olarak 6, 9, 33)

• Eritromisin ve penisilin dirençli izolatlarSerogrup 6, 9, 14, 19 ve 23

• Eritromisin direnciSerogrup 1, 14, 19 (daha az olarak 6, 9, 33)

• Eritromisin ve penisilin dirençli izolatlarSerogrup 6, 9, 14, 19 ve 23

Direnç genlerinin epidemiyolojisi• erm(B) denetimindeki direnç: Avrupa ve Güney

Afrika’da daha yaygın

• mef(A)/(E) denetimindeki direnç: Kuzey Amerika,Japonya, Avustralya, Kanada, Almanya, Yunanistan,İtalya, İngiltere’de daha yaygın

• erm(B) denetimindeki direnç: Avrupa ve GüneyAfrika’da daha yaygın

• mef(A)/(E) denetimindeki direnç: Kuzey Amerika,Japonya, Avustralya, Kanada, Almanya, Yunanistan,İtalya, İngiltere’de daha yaygın

Amaç

Enfeksiyon etkeni Streptococcus pneumoniaekökenlerinde

• Makrolid direncinden sorumlu mekanizmalarıve

• Direnç mekanizması ile serotip ilişkisinibelirlemek

Enfeksiyon etkeni Streptococcus pneumoniaekökenlerinde

• Makrolid direncinden sorumlu mekanizmalarıve

• Direnç mekanizması ile serotip ilişkisinibelirlemek

İzolatlar

Enfeksiyon etkeni ve eritromisine dirençli50 S. pneumoniae izolatı

Balgam 35 izolatETA 11BAL 1Kan 2Yara 1

Enfeksiyon etkeni ve eritromisine dirençli50 S. pneumoniae izolatı

Balgam 35 izolatETA 11BAL 1Kan 2Yara 1

YöntemMakrolid-linkozamid duyarlılıkları• Disk difüzyon• Sıvı mikrodilüsyon

Eritromisin, klaritromisin, azitromisin, klindamisin

Makrolid direnç fenotipi• Eritromisin-Klindamisin çift disk metodu

Makrolid direncinin genetik determinantları• PZR: erm(B), erm(TR), mef(A), mef(E)

İzolatların serotipleri• Multipleks PZR

Makrolid-linkozamid duyarlılıkları• Disk difüzyon• Sıvı mikrodilüsyon

Eritromisin, klaritromisin, azitromisin, klindamisin

Makrolid direnç fenotipi• Eritromisin-Klindamisin çift disk metodu

Makrolid direncinin genetik determinantları• PZR: erm(B), erm(TR), mef(A), mef(E)

İzolatların serotipleri• Multipleks PZR

Standart / Kontrol kökenler• ATCC 49619• ATCC 700675 / gen negatif• ATCC 700677 / erm(B) +• ATCC 700676 / mef(A) +• KTL spn-237 / mef(E) +• S. pyogenes A200 / erm(TR) +

erm(B) 5’-ATTGGAACAGGTAAAGGGC-3' 5’-GAACATCTGTGGTATGGCG-3’ (1)

meƒ(A) 5’-TGGTTCGGTGCTTACTATTGT-3’ 5’-CCCCTATCAACATTCCAGA-3’ (2)

meƒ(E) 5’-GGGAGATGAAAAGAAGGAGT -‘3 5’-TAAAATGGCACCGAAAG -3’ (3)

erm(TR) 5’-ACAGAAAAACCCGAAAAATACG-3’ 5'-TTGGATAATTTATCAAGATCAG-3' (4)

1.Amezaga MR, 2002, J. Clin. Microbiol., 40, 3313–3318 / 2. Seppälä H., 1998AAC, 42, 257-62 / 3. Clancy J, 1996, Mol. Microbiol., 22, 867-879 / 4. Tait-Kamradt A,1997, AAC, 41, 2251-2255.

Primerler

Kontrol ve test izolatların direnç genleriiçin PZR sonuçları

2. Negatif kontrol3. erm(B) pozitif kontrol ATCC 700677 (442 bp)4. mef(A) pozitif kontrol ATCC 700676 (553 bp)5. mef(E) pozitif kontrol KTL spn-237 (363 bp)6,7,10,11 erm(B) pozitif klinik kökenler8. mef(E) pozitif klinik köken9. erm(B)+ mef(E) pozitif klinik köken

Serotipleme / Multipleks PZR

40 serotip• St- 1, 2, 3, 4, 5, 6A/B, 6C, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 10F, 11A, 12F,

13, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22F, 23A,23B, 23F, 24F, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F, 38, 39.

CPSA

Pai R. Sequential multiplex PCR approach for determining capsularserotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol2006; 44:124-131.

CPSA

6A/B

19F

23F

25F/38

9V

Sonuçlar

İzolatların%100’ü Eritromisin, Klaritromisin, Azitromisine%88’i Klindamisin’e dirençli

Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK) (µg/mL)

Antibiyotik ≥ 512 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125

Eritromisin n (%) 25(50) 6(12) 8(16) 4(8) 4(8) 1(2) 1(2) 1(2)

Azitromisin n (%) 22(44) 5(10) 11(22) 2(4) 1(2) 2(4) 4(8) 2(4) 1(2)

Klaritromisin n (%) 1(2) 15(30) 13(26) 8(16) 4(8) 3(6) 5(10) 1(2)

Klindamisin n (%) 2(4) 2(4) 22(44) 10(20) 6(12) 2(4) 3(6) 3(6)

Fenotip İzolat sayısı (%)

cMLSB 43 (86)

iMLSB 2 (4)

M 5 (10)

Makrolid Direnç FenotipiDağılımı

Serotip Dağılımı

Genler İzolat sayısı (%)

sadece erm(B) 21 (42)

sadece meƒ(E) 6 (12)

erm(B)+ meƒ(E) 23 (46)

Makrolid Direnç GenleriDağılımı

Makrolid Direnç Genlerinin Serotiplerdeki Dağılımı

Sonuçlar

2 pediatrik kan izolatı 6A/B serotipinde ve erm(B)+mef(E) taşıyor

Yorum

• M fenotipinin azımsanmayacak oranı (%10)• mef(E) geninin yaygınlığı (%58)• erm(B)+mef(E) taşıyan izolatların yaygınlığı (%46)

İzolatlarımızda makrolid efluksu etkin bir dirençmekanizması olarak erm(B) denetimindekihedef mutasyonuna katkıda bulunmakta

• M fenotipinin azımsanmayacak oranı (%10)• mef(E) geninin yaygınlığı (%58)• erm(B)+mef(E) taşıyan izolatların yaygınlığı (%46)

İzolatlarımızda makrolid efluksu etkin bir dirençmekanizması olarak erm(B) denetimindekihedef mutasyonuna katkıda bulunmakta

Yorum

• Yaygın serotipler olan 19F, 6A/B izolatlarda erm(B)+mef(E)birlikteliği oldukça yüksek oranda

• Üçüncü en yaygın serotip olan 23F serotipindeki izolatların%80’inin M fenotipinde olması ve erm(B)+mef(E) birlikteliğinebu serotipte rastlanmaması ilginç

• Yaygın serotipler olan 19F, 6A/B izolatlarda erm(B)+mef(E)birlikteliği oldukça yüksek oranda

• Üçüncü en yaygın serotip olan 23F serotipindeki izolatların%80’inin M fenotipinde olması ve erm(B)+mef(E) birlikteliğinebu serotipte rastlanmaması ilginç

Teşekkürler…

Serotypes

MLSB phenotype n (%)

M phenotype n(%) Total n(%)

erm(B) mef(A)/(E) erm(B)+mef(A)/(E) mef(A)/(E)

19F 6 (15.8) 1 (2.6)3 26 (68.4) 5 (13.2) 38 (39.2)

23F 10 (41.7) 1 (4.2) 3 (12.5) 10 (41.7) 24 (24.7)

6A/B 8 (72.7) 1 (9.1)) 1 (9.1) 1 (9.1) 11 (11.3)

17F 4 (66.7) - 1 (16.7) 1 (16.7) 6 (6.2)

Others1 8 (66.7) 1 (8.3) 2 (16.7) 1 (8.3) 12 (12.4)

NT2 1 (16.7) - 2 (33.3) 3 (50) 6 (6.2)

Total 37 (38.1) 4 (4.1) 35 (36.1) 21 (21.6) 97 (100)

1includes serotypes 14 (n:3), 7F/7A (n:3), 39 (n:1), 23B (n:1), 20 (n:1), 9V/9A (n:1), 3 (n:1), 35A/35C/42 (n:1)1includes serotypes 14 (n:3), 7F/7A (n:3), 39 (n:1), 23B (n:1), 20 (n:1), 9V/9A (n:1), 3 (n:1), 35A/35C/42 (n:1)

2 NT, non-typeable strains

3Only this isolate displayed iMLSB phenotype. All other MLSB isolates expressed cMLSB phenotype.

PZR Koşulları

erm(B) mef(A) mef(E) erm(TR)

Siklus

sayısı

Başlangıç

denatürasyonu 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 1

Başlangıç

denatürasyonu 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 94 °C 4 dak 1

Denatürasyon 94 °C 1 dak 94 °C 1 dak 94 °C 1 dak 94 °C 1 dak 30

Bağlanma 55 °C 1 dak 55 °C 1 dak 55 °C 1 dak 50 °C 1 dak 30

Uzama 72 °C 1 dak 72 °C 1 dak 72 °C 1 dak 72 °C 1 dak 30

Son Uzama 72 °C 7 dak 72 °C 7 dak 72 °C 7 dak 72 °C 7 dak 1

No Serotip Fenotip

erm(TR)

erm(B)

mef(A)

mef(E) Eritromisin Azitromisin Klaritromisin Klindamisin

1 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R

2 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R ≥512 R 256 R3 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R4 23F M N N N P 1 R 8 R 2 R 0.25 S5 19F cMLSB N P N N ≥512 R 512 R 256 R 256 R

6 19F cMLSB N P N N 256 R 256 R 64 R 64 R7 23F cMLSB N P N N ≥512 R 512 R 128 R 512 R

8 39 iMLSB N N N P 8 R 8 R 16 R 64 R9 19F cMLSB N P N N ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R10 N cMLSB N P N N 128 R 256 R 128 R 64 R11 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R12 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 256 R 256 R

13 15A-F M N P N P 8 R 8 R 4 R 0.25 S13 15A-F M N P N P 8 R 8 R 4 R 0.25 S14 14 cMLSB N P N N 512 R 512 R 512 R 512 R15 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R16 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 128 R17 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R18 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R19 15A-F cMLSB N N N P 128 R 256 R 64 R 256 R20 N cMLSB N P N N 256 R 256 R 256 R 128 R21 23B cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 64 R ≥512 R22 6A/B cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R23 6A/B cMLSB N P N N 256 R 256 R 64 R 4 R24 6A/B cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 128 R 512 R25 19F cMLSB N P N N 512 R 512 R 512 R 256 R26 19F cMLSB N P N N 512 R 256 R 256 R 128 R

27 N cMLSB N P N N 256 R 128 R 256 R 256 R28 23F M N N N P 8 R 8 R 4 R 0.125 S29 N cMLSB N P N N 512 R 256 R 128 R 128 R

30 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R ≥512 R

No Serotip Fenotiperm(TR)

erm(B)

mef(A)

mef(E) Eritromisin Azitromisin Klaritromisin Klindamisin

31 N cMLSB N P N N 256 R 256 R 256 R 128 R

32 23F M N N N P 8 R 4 R 4 R 0.25 S

33 19F cMLSB N P N N 128 R 256 R 256 R 128 R

34 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R35 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 256 R36 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 512 R 128 R37 19F cMLSB N P N N 256 R 64 R 128 R 64 R

38 19F cMLSB N P N N 128 R 32 R 16 R 64 R

39 19F cMLSB N P N N 256 R 256 R 128 R 128 R

40 19F cMLSB N P N N 512 R 256 R 256 R 64 R

41 23F M N N N P 2 R 2 R 4 R 0.125 S

42 19F cMLSB N P N N 512 R 128 R 256 R 128 R42 19F cMLSB N P N N 512 R 128 R 256 R 128 R

43 6A/B cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 16 R 256 R44 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 128 R 256 R45 6A/B cMLSB N P N P ≥512 R 512 R 128 R 256 R46 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 256 R 256 R47 N iMLSB N P N N 4 R 4 R 4 R 0.125 S

48 19F cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 256 R 256 R49 6A/B cMLSB N P N P ≥512 R ≥512 R 256 R 256 R

50 19F cMLSB N P N N 256 R 32 R 256 R 128 R