dynamics of streptococcus pneumoniae in patients with chronic

277
Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease Arnau Domenech Pena ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author.

Upload: hakhue

Post on 04-Jan-2017

217 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic Obstructive

Pulmonary Disease Arnau Domenech Pena

ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestrao marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.

ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.

WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrativeaims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using orcitation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author.

Page 2: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

Arnau Domenech Pena

Page 3: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic
Page 4: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

Programa de Doctorat en Biomedicina. Línea: Metabolisme,

Senyalització Metabòlica i Patologies Associades.

Facultat de Medicina - Campus de Bellvitge

Departament de Patologia i Terapèutica Experimental

“Dynamics of Streptococcus pneumoniae in

patients with Chronic Obstructive Pulmonary

Disease”

Co-Supervisor Co-Supervisor

Josefina Liñares Louzao MD, PhD Ardanuy Tisaire PharmD, PhD

Professora Titular de la Universitat de Barcelona Facultatiu Especialista Departament de Patologia I Terapèutica Experimental Servei de Microbiología Servei de Microbiologia, Hospital Universitari de Bellvitge Hospital Universitari de Bellvitge

Student

Arnau Domenech Pena

Barcelona, �������� 2013

Page 5: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic
Page 6: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

A FabiAls pares

Page 7: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

Page 8: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��� ���������

��� ����������� ���������� ������ ��� ������ ��������� ������� �� ���

������� ��� ��� ���� !������� ��� "��#�������� $�%���������&�

!"$'�(�������������)������������*�����+�,--./0,1&� �����������

�����2�"�������'�(������������� ���3�������4����������)���������

5#������� �� )������������ 4�2��&� �� ��� 3������� *���6���� ���

*#����������5#�������7�)���������2��4�2��+�,-081��

*��������������������������������#��9������:�

Fondo de Investigaciones Sanitarias&�)������������

3�����+�����!53�-.;0.-<��

CIBERES�(4��������*#����������=������������1:�

>-?;-?;--8@�

A�

Page 9: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

A5�

Page 10: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��� ���������

*� ������� �����&� ��������� ������������ �� ���� �/

���������� ��� ����� �����&� B���#��� ��6����� ������� 7� 4�����

�����7��������&���������������������������������%��������&�

��������������������������%������������������������������������

7����� ������������������������������ ��� ��������� ������������

�6����

�� ������ ���� ���������� ���� ����� 0.� ���� 4����� ���

�%�����������=������*#����������=�������������(45>*=*31�7�

����������Epidemiologia de les infeccions bacterianes de l’Institut

d’Investigació Biomèdica de Bellvitge�(5�5>*��1��

�����������������"����������������C�����*D�������������

���#����������)�������������������>���%�����������$�%�����������

>������&���������������"��#��)������A�6��+�����������������

�����#���������� ��������� ����������������� ������ ���� ��������������

���������������������������������������/���������

�������=�������)���2� 7� �� �������� �������� ����3��%�������

)���������2�� ���� E�������� $�%��������� ��� >���%����:� ��������

#�������%�&� �%�����������&� ���������� 7� �F���&� ���� %�������

�7����������������������������������������#������

�� ��������3�����3����� 7����� B���������&� ����3��%���� ���

G�������2�� ����E��������$�%��������� ���>���%����&� ���� ���6�����

��������������������2���������*"H4�7��������������7������

��%�����������I����

�������=����"�������� ������� 5���������J���&�����3��%���

���)��������5#������������E��������$�%������������>���%����&������

����� ������� �� ��� �����7� ����� �D��������� �� ���� ������ ����

���������� ���2#������ ���� ��� ����C�� ��� ����%���������

�������������������������������

A55�

Page 11: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

����������������J��������4�����������������������������

���������������J�F����>������������5�����������3�����4������555&�

)�I�������&� )�����+� ���� ������ �� ����� ��� %����� �������� ����

����� ���2#��� 7� ���� ������������ ��� ��������� ������ ���

���������� �� #��������������� ��������&� ��������� �� ����� ���

�������������2#���������������������������������

�������*������J��2�� 7��� ������������ �%��������������

���������������)���������2��)�������������4�����3�����������

5%�����������4���2#����(43541&�)�����+��������������������

�����������I��������2������������������

����������������!������������������������=�#���������

G������� �� ��� 5�������� 4������ 555&� )�I�������&� ���� ���

������������������������������������������

��� ���� ������ >�� >��������� #���� ���� ���������� �#�

K�����7��������HD#����$�%�����7&�$�����L�����&�#�������%������

���#�������#�������������������">"���

!������&���������������������������������#���������������

��������������������� ���������=����� ��!�&���������������� �����%��

#���������������M���� ��������������������������������������

����������� ������� ���� ����� ������� ������ ����� �������� �7���

��������&����������������������������������/��������������

��������� ����C������ ����� �����������HD#���&����������������

������� ��� ��� ���� ��I����� ��������� ��� ������ �6���� ��

4�������&� ���� #����F�� ����������� ���� �#������ ������ ��� #���� ��

��������&������������������D����C����%�������#�������������N���

)�����&������������I��&����� ����� �������������������7� #�����

A555�

Page 12: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��� ���������

���>���%����&�7������� ����������������������������������7����

�������������O����#2�������

5� ��� �&� �� ��� #��2���&� ����������� ���� �����&� ���� ������

�������������������������/�����������������������������������

���������������%������

J�����������������������������������������������������������

3�����#�������7��������������7�������������������2�&������������

������������������������)����������������������

5P�

Page 13: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

P�

Page 14: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

ABSTRACT

Page 15: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

P55�

Page 16: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������

5�� ��� ���������� ����� ����� �� #� � 7����� ����� ��������%��

�������7���������(4H"�1� ������������������������������#�������

���� �����������������7������������7����������� ����4H"������

���&� �� ����� ��� ����� �D��������� ��������� (�*4H"�1&� ����7�

������ �7� ��������� ��������� ���� ��� Haemophilus influenzae&�

Streptococcus pneumoniae ��� Pseudomonas aeruginosa.

)����%��&� 4H"�� ��� ���� ���� �����7��� �������� ���������� ����

����������������������������

���������������������#���������������#���������������������

���� ���� ����� �#� �������� ��� ������ �����7/�������� ������ S.

pseudopneumoniae ��������������D��������������������

�����������4H"�����������

5�����#���������7&����������#�0QQ���������������� ������������#����

�*4H"����������������������%����4H"������������������0/

7���� �������� 3������� ���� ���������%��7� �������+� �#� ����&� S.

pneumoniae� ��� ��������� �� 80� (0?�RS1� ��������� ��� S.

pseudopneumoniae� ��.�(<�QS1�����������S. pneumoniae� �������

�����������#�������������#����Pseudomonas aeruginosa� (,Q�QS1�

���Haemophilus influenzae�(0.�@S1��

������������I�����##�������������%���%���������������#�

�������&����������� �����������7����������7���� 5����&�

���������������7�(#����,--0����,--Q1� ��#�����������������#�

������ �����7���&� ��� ������ �������� ����7���&� ���� ��##�����

��������� �#������� 3����7���� <� (3�,<@<1&� R� (4�������R/

3�,Q.1� ��� Q� (G���������Q/3�R81� ���� ���������� ����

���������� �������&� �����7���� 0� (3 ���0/3�8-?1� ��� 8�

(G���������8/3�0Q-� ��� 3�,?-81� ���� ���������� ��� �/

���������� �������&� ��� �����7���� 0?!� (3�8-0?!1&� 00�� ���

�/�7������� �������� ���� �*4H"�� ��������� ("T-�-R1��

P555�

Page 17: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

!����7&��������D������&������7���8���������� ������������

#������� ����� �#� �������� ��� ����� �D���������� �� 4H"��

���������

)����%��&� ���� ������������� �#� ��������� �I������

%����"4A@�#������������,--0���3��������������� �������

�����7� �##���%�� �� ������� �%���%�� ��������� �������� ��

������&� ��� �� ������� ��� ���� ���� ��� ���� �������� �#� �����

���������� ����� �##��� ��� ����� �����%��� ����� ��������

������������D������������������:�"4A@������7�������������

#����8.�<S�������,--0/-<�����������00�,S�������,--./0,���������

5� ��������&� ���� ���%����� �#� �����/����� ��������� �����7���� 0R��

���?4���������������7����������������7������!�������������&�

��������� ���� ��������� ������ �#� U/������� ��������� �%��� ����&�

���������� ��� �����/����� ��������� �������� ������� �����������

��������7���������

���� ������� �#� �������� �������� ���� �� ��� ��� �7�� �#�

�������%����4H"����������������������������������������I��7����

����������������7���������������������5���������������7�(0..R/

,-0-�������1&� ��� ��� #���� ������� �������#� �����������������

����� �D���������� ���� ��������� (������ �7� �� ���/�D������

�����1&� ����7� ���������� ���� �����7���� .A� ��� 0.!� (PT-�-,1��

������������������������������#������������7��������������

�������������� ����D�����&������������������������ ���������

��������� ���������������� ���� ���������������#������� 5�%�� �

�#� ������ �������&� �� ���7���� ���� ������ �#� ������������

�����������������%���������#����������������������U/

������� ��� #�������������� �� 08� �������� ���� �� ���/�����

���������� �#� �������� (�%������ ����:� RQ,� ��7�&� 3�� V8?,1��

4������ �� �������/��������� ���������� ������� (W=�=1�

P5A�

Page 18: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������

�%��%��� ��#���������������������� ����#�������7������%�����

���������� ������� �#���� #������������� ��������+� �� �%��&� ����

�������/������ ������� (">"1� �������� ���� ������� �%��� ����&�

�%�� ������� ���� ���� � �� �������� ����%��� ��������� ������� �#� U/

������ ���������� ������ �������� �������� ����� �� ��������

��������� �#� pbp ����� ��� ��������� ��� ��������� #��� ����

#�������������������7��������������������������������

�������� ���� ������ ��������7� �#� ������ ���������� ������& S.

pneumoniae� ��� �������7� ����#�������� ��� ��� ����� ��� �������

�D��������G�&���������������7������������D������������7�

�#� ��������� ���������� ����� ������ ��%�����7� ��� �����

�����%��� ����� ���� 8?� S. pseudopneumoniae ������� ���7�����

������ ������� ���� ��������� #���� 4H"�� �������&� ����7� ����

��%���� ���#�� � ���������� (Q8�8S1� ��� ������ �������������

(�7����������������7��������&��7�������������� ��������1����������

���� ������ %���������7� �#� ���� ������&� ���� �������� ���� �� �����#���

��������E� �%��&� � �/������� ��������� ��������������&� ����������

������������������#���S. pseudopneumoniae���������D����������

�#��������� ������%����4H"���

����������&� ���� �������� �� ����� ��� �����%�� ���� ����������� �#�

���� �7����� �#� S. pneumoniae� ��� S. pseudopneumoniae�

���������������������������4H"�����������

PA�

Page 19: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PA5�

Page 20: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RESUM

Page 21: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PA555�

Page 22: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=����

���H����������)������������3����&������������������������

�������� ��������%�� �M��� ()"H41� ����� ��� ������� ����� ���

�������������������������7�����������/����������������������

��� )"H4� ��� ���� ���� ��������� ���D�������� ������ (*�)"H41&�

����������� �������� ���� ���M���� ��������� ���

Streptococcus pneumoniae. ���F�����F�&����)"H4�F�������������

��������� ��� ����� ��������� ���� ��������� ��� ����M���

�����M����

*� �������� �����&� ��� %�� ���� �� ������ ������� �������� ����

����I�����������#�������������������S. pneumoniae�����������C���

S. pseudopneumoniae&����������������������&�������������

���D����������������������M����������������)"H4��

*� ��� ������� ������&� ��� %�� �������� ���������%����� ��

������ ��� 0QQ� �������� �������� ���������� ������ ���������

��*�)"H4� �� ������� ���� )"H4� �%�9��&� ������ �� �7�

���������(#������,-0-�/��#������,-001��S. pneumoniae����%���X�������

80�(0?�RS1������������S. pseudopneumoniae���.�(<�QS1�����������

S. pneumoniae� #��� ��� ������� ����� ���D�������&� �����F�� ���

Pseudomonas aeruginosa� (,Q�QS1� �� Haemophilus influenzae�

(0.�@S1��

*D�����D�� ��#��C���� ���������� �� ��� �������� �%�����

������������&���������������������������������������������

���� ������� #��&� �� ��� ����� ������� ��� %�� ������� ��� ��#�����

��������������������������� ������ �������������� ���������&���

������� ���� )"H4� ���� ��#������ �#����� �����M������

(���2����,--0/,--Q1��*� ����������D����C��&�����������8�%������

��� ����� �F�� #���Y��� ��� ����M��� �� ��*�)"H4� �� �������

����)"H4��"��M&���������������<�(3�,<@<1&�R�(4�������R/3�,Q.1���

Q� (G���������Q/3�R81� ��� %���� �������� ���� ����M���

P5P�

Page 23: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

������C���+� ���������� 0� (3 ���0/3�8-?1� �� 8� (G���������8/

3�0Q-� �� 3�,?-81� ��� %���� �������� ���� ����M��� ����

������C���������������C���+�����������������0?!�(3�8-0?!1&�

00�� �� ���� �������� �/����#������� ��� %���� �������� ����

*�)"H4�("T-�-R1��

"�������������&�����������������������������������������

%���� �I������ "4A@� ���� ��� ��� ,--0� �� *���7�&� ��� ������

�#���%�� ������� ��� ���C��� ��� ��������� �%������ �� ��� ���M�

����F��� ������&� �� ����� ��� ��� �������� ��� ������������� �#����

����F�����������%���������������������S. pneumoniae��������

��� *�)"H4&� I�� ���� ���� ���������� ������� �� ��� %���� ���

������X�� ���� 8.�<S� �� ��� ���2���� ,--0/,--<� �� 00�,S� �� ���

���2����,--Q/,-0,��"����Z����������������������&���������������

0R�� �� ?4&� ��������� ���� �����������C��� �����M���&� ���

���������������������������[�������7���"��������������&�������

��� ������ ��� ��� ������C��� �� U/�������� ��� ������ ����� �7�&� ���

������C��� �� ���M����� �� ��� �����������C��� ����� ��������

�������������������������2��������������

��� ����C��� ��� �������� ��������� ��� ������ ������������

�#������ ��� ��� ��I����� ��� ������� ���� )"H4� ��%��&� ���%��� ��

��7� ��� ���������� ��������&� #��� ���� �������� ��� �����������

������������������*�����������������(���2����0..R/,-0-1&����%��

�����%��� ���� �� ���9� ����� ��������� ��*�)"H4� ��������&� %����

��������������������������D�����&����������������������.A���

0.!�(PT-�-R1, ��������/���������������������#�����������D���

���������������������������������������������C����������������

�����������������D���������

4��� �� ����YC��� ���������� ���������&� ��� %�� ���������

��������� ���� ������������������� �� ��� ����%��������� ���

PP�

Page 24: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=����

������C��� �� U/�������� �� #�������������� �� 08� �������

���������� ���� ������� ��� ������ ����� �7�� (������ ���I�:� RQ,�

����&� �3� V8?,1�� *�� %�� �����%��� �%��� ���� #���YC��� �� ����

quinolone-resistant determining regions�(W=�=1'&����������������

������C����� #�������������&� �� ����������������������������

���� %�� ������ ��������� ���� #��������������� *� �%�&� ����

penicillin-binding protein�� (">"1'� ��� ���� ������� ����������� %��

����������������� ���� �������[�������� ��������������U/��������

����%����������������������������������������������D���������

�#��������M��������� ����pbps�F�� ��������������������������

��������C����������������%����������������������������

����������������������C��������������������������������&�S.

pneumoniae� F�� ���������� ����#�������� �� F�� ���9� �����������

��G� �D���&� ��������� �� ��� �����D�� ���M� �������

�������������� ��� ��� ��������� �����M���� �������� ��%��������

��C���� ����F� ��� %�� �����%��� ����� ���� 8?� ������� ��� S.

pseudopneumoniae� ������������ ��������� ������� ��� %���� �X�����

��� ������� ���� )"H4&� ����������� ���� ��� �%�9����

������������� ������������������(Q8�8S1���������������������������

(������������������������C���&�������C�����;�������������������1��������

��� %������������ ��C���� ����������� ������&� ����� ���� ������� %��

������ ��� ���� �%������ �2���� �������D&� ���� ���9��� �����

������� %�� ���� ��������������� ������ �� ���2���� <� �� �F�� ����&�

�����������������������M������S. pseudopneumoniae����������

����)"H4��%�9�����

*������&�����������������������������������������D�����

��� ��� ������� ��� ���� ��������� ��� S. pneumoniae� �� S.

pseudopneumoniae��������������)"H4��

PP5�

Page 25: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PP55�

Page 26: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

SCIENTIFIC PRODUCTION

Page 27: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PP5A�

Page 28: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

3����#����������

Publications in international peer-reviewed journals

0� ������� �&� �����7� 4&� 4�����7��� �&� 3����� 3&� ������ !&

J���� 5&�A���������=&������ B&�"��������=&�)�����=&� ��6����� B

(,-001�3����7�����������7�����#�Streptococcus pneumoniae

������ �������� ��� ����� �D���������� �� �������� ���

�������������%���������7����������B����������4���������

??:<Q@/.8�� The Impact Factor is 5.330 according to 2012Journal Citation Reports released by Thomson Reuters (ISI)in 2013.

,� ������� �&� �����7� 4&� >���������� �&� )����� 3&� 4�����7��� �&

��� ��� 4����� �J&� >��������� �>&� ��6����� B� (,-0,1

"������� �� ����������7� ������� ������ �������� ���

����� ����������7� ��������� B� 4��� )�������� R-:<-<@/R8�

The Impact Factor is 4.068 according to 2012 JournalCitation Reports released by Thomson Reuters (ISI) in 2013.

8� =���� �\&� 3��]��� �\&� ������� �\� !����� �&� ��6����� B&� ��

��������E&������7�4&�3O/��^��=�(,-081���������5���������#

Streptococcus� pseudopneumoniae� ��� G�/�7������� 3�

���������� "��������%��7� 5����#���� ��� ��7����� S.

pneumoniae� �� 3����� "��3� H�� Q:�R@-<@�� \� ������ �������

���������� ������7� ��� ����� ����� The Impact Factor is 3.730according to 2012 Journal Citation Reports released byThomson Reuters (ISI) in 2013.

PPA�

Page 29: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

<� ��������&������7�4&�"��������=&�J���� 5&�3�����3&���� ��

4����� �J&� ��6����� B� (,-081� 3���� ��������� �����7���

���� ����� #�������7� ���������� ���� ��������� �#� ����

�D���������� �� 4H"�� ��������� "��3� HG*� Q:� �R.-,@�

The Impact Factor is 3.730 according to 2012 JournalCitation Reports released by Thomson Reuters (ISI) in 2013.

R� ��������&������7�4&���������&�J��2�/3�������&�3����

3&���6����� B� (,-081��7������#� ������������� ���������

������ ����� �D���������� �� �������� ���� 4����

H�������%�� "������7� �������� �%��� �� � ��%�� 7���� �������� B

���������4���������(������1��The Impact Factor is 5.330according to 2012 Journal Citation Reports released byThomson Reuters (ISI) in 2013.

?� ������� �\&� "���� 4\&� )���2� 3&� 3����� 3&� !��O���� �&

4�����7��� 4&� ����� B&� �����7� 4&� ��6����� B� (,-081� 5#������

*������7��#������*D���������� ��4H"��"������� ����3�%���

���#�� �H���������� \�������������������������������7� ��� ����

����� B� 5#����� (������+� 0-�0-0?;I�I�#�,-08�-.�--81�

The Impact Factor is 5.330 according to 2012 JournalCitation Reports released by Thomson Reuters (ISI) in 2013.

PPA5�

Page 30: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

3����#����������

Poster presentations

a) International meetings

0� ��� ������&� 4�� �����7&� ��� 4�����7��&� 3�� 3����&� !�

�����&� 5�� J���&� =�� A��������&� B�� ����&� =�� "�������&� =��

)����&� B�� ��6������ 4����� ��������� �#� Streptococcus

pneumoniae� ������� ��������� #���� ������ ��� ������� ��

�������� ����4�����H�������%��"������7�����������@���

5���������� 37�������� �� "������� ���

"�����������������(53""�1&�0</0Q�)����,-0-&�����

�%�%&�5�������

,� ��� ������&� 4�� �����7&� ��� 4�����7��&� !�� �����&� B�

��6������ >��������� vs�� �/���������� ���������

������������������ ����4�����H�������%��"������7�

�������:������7�����������7�����0-���*��������������

�� ���� ��������� ������7� �#� ���� ��������&� ,8/,?�

B���,-00&����������&�����G�����������

8� ���������&�4�� �����7&�=�� "�������&� ��� 4�����7��&� 3�

3����&� B�� ��6������ "�������� �����7���� �����

�������� ��������� �#� ����� *D���������� �#� 4����

H�������%�� "������7� �������� (�*4H"�1�� R0��

5�������� 4�#����� �� ������������ ������ ��

4����������7�(54��41&�0@/,-�3���������,-00&�4�����&

$�����3������

<� ��� ������&� 4�� �����7&� ��� >���������&� ��� 4�����7��&

�J�� ��� ��� 4����&� ��� >��������&� B�� ��6����.

"������� ������ ��������� ��������� �#� ����

PPA55�

Page 31: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

�D�������������������� �������������������7��������:�

������ �������������� �#� ���������� �������� Q���

5���������� 37�������� �� "������� ���

"�����������������(53""�1&�00/08�)����,-0,&�!���

���5�����&�>�������

R� ���=���&����3��3��]��&����������&����!����&�B����6����&

E������������&�4�������7&�=��3O/��^���5����#�������#

������ S. pseudopneumoniae� ��������� �� 3����� R,�

5�������� 4�#����� �� ������������ ������ ��

4����������7� (54��41&� -./0,� 3��������� ,-0,&� 3�

!�����&�$�����3������

?� 4��"���&����������&�3���)���2&����!��O���&�3��3����&

��� 4�����7��&� 4�� �����7&� B�� ��6������ *������7� �#� ����

�D���������� �� 4H"�� �������� ���� ��%���� ���#��

����������� ,8��� *������� 4������� �#� 4�����

)���������7� ��� 5#������� ��������� (*44)5�1&� ,@/8-

)�7�,-08&�>����&�J����7�

@� ���������&�4��"���&�3��3����&�3��)����&�4�������7&�B�

��6������ 4������ 4������������� �#� "������� ���� ����

*D���������� �#� 4����� H�������%�� "������7� �������

(4H"�1�4�������7�Streptococcus pseudopneumoniae��R8��

5�������� 4�#����� �� ������������ ������ ��

4����������7� (54��41&� -./08� 3��������� ,-08&� ��%��&

$�����3������

b) National meetings

0� ��� �������� *��������� ���������� ��� ����� ��

Streptococcus� pneumoniae� �%���%��� 7� �� �%���%��

PPA555�

Page 32: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

3����#����������

��������� �� �������� �� *#�������� "�������

H�������%�� 4����� (*"H41�� 55� B������� ��� !�������

���� 45>*=*3&� )��������� ���4����� �� 5�%���&� 0R/0?�

H������,--.&�"��������)������&�3�����

,� ��� ������&� 4�� �����7&� 4�� "���&� ��� 4�����7��&� )�

������&� !�� �����&� =�� A��������&� B�� ��6������ *#�������

"������� H�������%�� 4����� (*"H41:� ��#������

���������� ��� ���������� 7� ��������� ��� Streptococcus

pneumoniae���������� �� �������� �� ����2�� �� �

�D�������� ������� P5A� 4������� ��� ��� 3������

*���6���� ��� *#���������� 5#������� 7� )���������2�

4�2���(3*5)41&�)�7�,-0-&�>������&�3����

8� 3��)����&�4��"���&����������&�3��3����&�!�������&�4�

�����7&� B�� ��6������ 4������������ ��� Pseudomonas

aeruginosa� ��������� �� �D���������� ������� ��� ��

*#��������"�������H�������%��4�����(*�*"H41��5A

B������� ��� !������� ���� 45>*=*3&� )��������� ��

4����� �� 5�%���&�H������ ,-00&�"��������)������&

3����

<� ��� ������&� 4�� �����7&� ��� >���������&� 3�� )���2&� ��

4�����7��&� ��� J�� ��� ��� 4����&� ��� >�� >��������&� B�

��6������*�������������F����������������2���#�I���������

�������� (">"1� �� �������� ���� ��������� ������

�6��� �� �������� �� �#�������� ������������� �����

PA5� ������� ��� ��� 3*5)4&� -./00� )�7� ,-0,&� >�����&

3����

R� 4��"���&����������&�3��)���2&����!��O���&�3��3����&

���4�����7��&�4�������7&�B����6������*������2����������

PP5P�

Page 33: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

��������D������������������������#����������������

��������%�� ����� (*"H41� �� �������� ���%���� PA5�

�������������3*5)4&�-./00�)�7�,-0,&�>�����&�3�����

Oral communications

�� ������&� �� ������&� �� J��2�/3�����&� et al. 5����� �#�

�����%����� �I������ %���� ("4A@1� �� ��������

���������� ������ ����� �D���������� �� �������� ����

4����� H�������%�� "������7� �������� (4H"�1'� 00���

*������� ������� �� ���� ��������� ������7� �#� ����

���������,-08&�)������

���������&����!����&�4�������7&�B��N����&�B����6����&��J��

��� ��� 4������ ������ �� �����7���� ��� ����7���� �#�

#������������/��������� �������� �� 3����� R8���

5�������� 4�#����� �� ������������ ������ ���

4����������7� (54��41&� -./08� 3��������� ,-08&� ��%��&�

$�����3�������

Invited lectures

��� �������� ��O���� ��� ���� ���������� ��� Streptococcus

pneumoniae� �� ��� *#�������� "������� H������%�� 4�����

(*"H41��PP5A�4����������)���������2���3�������*���6����

��� )���������2�&� B��7� ,-08&� E���������� ��� ���������&�

>������&�3�����

PPP�

Page 34: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

THESIS OUTLINE

Page 35: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PPP55�

Page 36: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������������

���� ����7� ����� ��� ���� �������� ���� ���� ����� �#�

Streptococcus pneumoniae� ��� �����7/�������� S.

pseudopneumoniae ����������� �� �������� ���� 4H"�. �����

������� ��I���%�� ��� ����%��� #�����7� �7� ��������� ���� ����� �#�

Streptococcus pneumoniae����S. pseudopneumoniae������������

������ �������� ��� ����� �D���������� �� 4H"�� �������&�

��������7��7����7��������������7��#�S. pneumoniae��������������

�������#��������&����������������������D�������������������

Chapter I – General introduction. ����� ������� ���%����� ��

������� �#� Streptococcus pneumoniae� ��� 4����� H�������%��

"������7��������� �� ���� ���D�� �#� ���� �������� ��������� �� �����

��������������������������������7&� ������������ ������������

���%������#���������������������������������

Chapter II – Infectious aetiology of acute exacerbations in patients with severe COPD.� ����� ������� �������� �� ��/7����

��������%�� ����7� �� ���� �������������%�� �������������#� ��������

��� #���� ������ ����� �D���������� ��� ���7����� "�������

���� ��%����� ���� � �� ������� ������ �� ���� ������ �#� �����

���������(���������D�����������������������7�������&���������

��������������1���

���������7��������������7�������������B�������#�5#����:�

Domenech A#, Puig C#, Marti C, Santos S, Fernandez A, Calatayud C, Dorca J, Ardanuy C, Liñares J. 5#�������

*������7��#������*D������������4H"��"������� ����3�%����

PPP555�

Page 37: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

���#�� �H���������� #�������������� ����������������7� ��� �����

����

Chapter III�_�Dynamics of pneumococcal populations causing disease in COPD patients. ����� ������� ������� � �� ��##�����

��������� 5� ���� #����&� �� ��������� �#� ��������� �����������

������ ����� �D���������&� ���������� �������� ��� �/

���������� �������� �� 4H"�� �������� ���� ���7���� (,--0/

,--Q�������1��5���������&���������7�������� ����D������(,--./

,-0,1&� ��� ���� ������ �#� �I������ %����� �� ���� ������������

�����������������7����������7�����������������#���������

������ ����� �D���������� ��� ���7���&� �������� ���� ,--./

,-0,�������� ��������,--0/,--<����,--R/,--Q����������

���� #����� ����7� ��� ���������� �� ���� B������ �#� ������������

4����������7&������������&� ���������������������I�����:�

Domenech A, Ardanuy C, Calatayud L, Santos S, Tubau F, Grau I, Verdaguer R, Dorca J, Pallares R, Martin R, Liñares J� (,-001� 3����7���� ��� ����7���� �#� Streptococcus

pneumoniae� ������ �������� ��� ����� �D���������� ��

�������� ���� ����� ��������%�� �������7� ��������� B�

���������4����������??:<Q@/.8���

Domenech A, Ardanuy C, Tercero A, García-Somoza D, Santos S, Liñares J� (,-081� �7����� �#� ���� ���������

����������������������D�������������������� ����4�����

H�������%�� "������7� �������� �%��� �� � ��%�� 7���� �������� B�

���������4���������(������1�

PPP5A�

Page 38: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������������

Chapter IV� _� Recurrence and persistence of pneumococcal strains. ����� ������� �������� � �� �������� �������� ��� ����

���������� �#� ��������� ������� �%��� ������ 5� ���� #����� ��&�

��##������ �� ���� ��������� ������������ ����� �������� ���

���#�������������� ��������������>������� ����������&���� �

����7����7���� ���� �������#���������������� ���������������#�

�����������������%���������#���������������������� ���

���#�������

� ������������%�����������������������������������������������

������:�

Domenech A, Ardanuy C, Pallares R, Grau I, Santos S, De la Campa AG, Liñares J (,-081� 3���� ���������

�����7���� ���� ����� #�������7� ���������� ���� ��������� �#�

������D������������4H"�����������"��3�HG*�Q:��R.-,@�

Domenech A, Ardanuy C, Balsalobre L, Marti S, Calatayud L, De la Campa AG, Brueggemann AB, Liñares J� (,-0,1�

"������� �� ����������7� ������� ������ �������� ����

���������������7����������B�4���)��������R-:<-<@/R8��

Chapter V _�S. pseudopneumoniae populations causing acute exacerbations. 5� ����� ������&� �� ���7���� ���� ������

��������������#�4H"�����������#������7����������7����������

S. pseudopneumoniae� �������� !����&� �� ��������� ���7���� �#�

PPPA�

Page 39: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

�����7����������7�������7�� ������#�������������������#�

��������/���������������������#����4H"���������&������������

��##��������S. pseudopneumoniae�#����3���������������������

��������#�����%������������������������&���������� ���������7����

�#� �%���%�� ��������/����� ������� ���� ���� ���������� �� ����

#���� �������7:�

Rolo D#, S Simões A#, Domenech A#, Fenoll A, Liñares J, de Lencastre H, Ardanuy C, Sá-Leão R�(,-081���������5��������

�#� Streptococcus pseudopneumoniae� ��� G�/�7������� S.

pneumoniae� "��������%��7� 5����#���� ��� ��7����� S.

pneumoniae� �� 3����� "��3� H�� Q:�R@-<@� (#������ ��������

����������������7�������������71��

3���&� �� ���7���� ���� ������ ��� ����������� ����� �#� ������

4H"���������� �#������7�S. pseudopneumoniae �������������#��

�#� ��������#�������� �������������������������������������������

������������

Domenech A, Puig C, Santos S, Marti S, Ardanuy C, Liñares J.� 4������ ������������� �#� �������� ���� �����

��������%�� �������7� �������� (4H"�1� �#����� �7�

Streptococcus pseudopneumoniae.

Chapter VI – Synopsis of the results and discussion. ����

�������� �������� �� �������� 55� ��� A� ���� ��������� ��� �� �����

PPPA5�

Page 40: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

TABLE OF CONTENTS

Page 41: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

PPPA555�

Page 42: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������#������

Acknowledgements A

Abstract P5

Resum PA55�

Publications and communications PP555�

Thesis outline PPP5�

A) Chapter I: Introduction

0� 4�������������%���������7�������� 8�

0�0��������D���������� @��

0�,��=�����#���������������4H"���������� 0,�

,� Streptococcus pneumoniae

,�0��E������������������ 0<�

,�,��)��������������������� 0R�

,�8����D���7������������������#������ 0?�

,�<��"��������%�������#������ 0.�

8� 4�����������������������������

8�0��4���������� 80�

8�,��"����������������� 8,�

<� "��%������#�����������#�����

<�0��"��7���������%����� 8.�

<�,��4�I�������%����� <-�

PPP5P�

Page 43: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

���������

R� ������������������������������

R�0��U/������� <R�

R�,��)��������� <Q�

R�8��!�������������� R,�

?� "�������������������7:��������#�"4A@ RR�

B) Objectives ?8�

C) Results ?@

C.1. Chapter II�

5#������� ��������7� �#� ����� �D���������� ��

�������� ���� 4����� H�������%�� "������7�

�������� ?.�

C.2. Chapter III

3����7���� ��� ����7���� �#� Streptococcus

pneumoniae� ������ �������� ��� �����

�D���������� ���������� �����������������%��

�������7��������� ��

5������#�����������I������%�������

�������� ���������� ������ �����

�D�������������������� ����4H"�� ���

P��

Page 44: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�������#������

C.3. Chapter IV

3���� ��������� �����7���� ���� �����

#�������7� ���������� ���� ��������� �#� �����

�D������������4H"����������� ����

"������� �� ����������7� ������� ������

�������� �������������������7��������� ����

C.4. Chapter V

4���������������#�S. pseudopneumoniae ������

�7������7����������7��� ����

4������ ������������� �#� �������� ���� �����

�D���������� �#� 4H"�� ������ �7�

Streptococcus pseudopneumoniae ����

D) Chapter VI

��0��37�������#�������������������� 0@0�

���,��4�������������� 0Q8�

E) References 0Q@�

P�5�

Page 45: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

P�55�

Page 46: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

CHAPTER I

Page 47: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

,�

Page 48: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

1. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD)

����7&� ����� ����������7� ��������� ���� ��� �����

��������%���������7���������(4H"�1&����������������������&�

������������������������������������������� �����(`�����

E������ H���������&� ,--R1+� ������� ���� ���� `����� E������

H���������� (`EH1� ?<� ������� ������� ��%�� ����� ��������%��

�������7� �������� (4H"�1�� ���� ������ �#� ���%������� �����

����������7����������������I�����%������##����������������7��#���#��

�#������##��������%������&������������������������������%�����

�������##������#�������&�����������������������(>��������

et al., ,--81��

4H"����������%��������#��������7��������&�������������

�7������#�� ����������%�����������������������������7���%�����������

���������� ������ �#��������7� ���������#� ���� ����� ����D�����

�����������������&�����7����������������(=����et al., ,--@1���

����>H������������������7�(>H��:�>������#�H�������%��

�����������1&� �������������������%������#� 0-�0S��#�4H"��

#��� ������JH��� 55� ��� ������&� ���� ����#���� ��##������ ��� ���

�������� (>����� et al., ,--@1�� 5� 3���&� ���� ���%����� �#� 4H"��

��� ��� ����������#� <-����Q-� ��� 0-�,S&� �������,8S� �� ������

������ ���� ?-� 7����� ()���%������� et al., ,--.1�� �#���� %�������

���������������&�4H"���������������������������#���������

������%����������������E� �%��&���������������%������#�4H"��

��� �D������ ��� ������� �%��� ���� �D�� � �� ������� ��� ������ ��#��

�D����7� ��� ���� �D������� ��� ���������� ��� �%���������

����������������+�����`EH���������������7�,-8-�4H"�� ������%��

8�

Page 49: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

������ ���� ������ ������� ����� �#� ������ ���� ���� ("���� et al.,

,--8+�`EH�������&�,--R1���

���/������D������� ��� ��������� ������ ��� ������ �D�����

��������������������������#��������&� �����������������

�������� ���������� �#� ���� ��������� ������� ��������� �7�

���������� �#� �����7���� ������� (����7����1�� ������

������������ ������ ���� ��� ����������� ��� ������ ������������

�7��������#�4H"��(�������B�������#�=���������7����4�������

4���� )�����, 0..R1�� )�7� �����&� ��#������� �#� 4H"�� ��%��

����������� ���� ������ ����7����'� ��� ����� ��������'+�

�� �%��&� ����7����� ��� �� ������������ ����� ����� ��������� ��7�

����#� ��%����� ���������� �������������������� ��4H"���������&�

��� ������� ��� ���� #��� ��������� ���� 4H"�� (J������ 5������%��

H�������%��������������������&�,-081��5������ �7&����������������

������������������������������(��#������������������������

#����������������������������7������� ��������%��7����1&� �����

��������� �������� ����7� ����� ��7� ��� ���������� ���� #�D���

���#�� � ����������� 5� #��&� ����� ��������� ����� �D����� �� ��������

���� �� ������ ���������7� ����� (J������ 5������%�� H�������%�� ����

��������������&�,-081��

)����%��&� ��� ��� ��������� ��� ��##��������� ���� 4H"�� #����

���������������������7�����������������������������������&�

���� ������ �������� ��������� ����� ��� ������ �� �������%��7�

��##����� ����������� !��� �D�����&� ����� ������� ������7� ���� ��

�������%���������7�#������������������������&�4H"����������������

��%���������7� ���� �������������� �������������� ��� ���������

(=������et al., ,--01��

<�

Page 50: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

��������� �#� 4H"�� ������� ��� ��������� �� �������� ���

��%�� �7������� �#� �� ����� ����&� ������� ��������&� �7�����

(��##����� ��� ��������� ��������1� ��� �� ������7� �#� �D������� ��� �����

#������ #��� �����������&���������7� ������������ ("�� ����et al.,

,--01��������������� ����#�������7����������7&� �������������

���� ����/������������� #����� �D�������7� %������ �� ��� �����

(!*A01���������������������#�����%����������7�(!A41�������������7&�

���� ���� �������� #��� 4H"�� �����#������ ��� �� !*A0;!A4� ������

T@-S&� ��� ���� J������ 5������%�� #��� H�������%�� ���� ���������

(JH��1���#������ �����#������ �� #���� ��������#� ����������%����7�

������������������������������&������� ���������0�("�� ����et

al., ,--01��

Table 1. Classification of airflow limitation severity in COPD (source: www.goldcopd.org).�

����� �����#������ ��� ����� #��� ��������� �#� ��������7+�

�� �%�������������������� ���!*A0&����������������7��#���#�&����

�����7�����������7� ��� ����(B����������&�,--.1��!�������� �����&�

��,-00�����JH������������������������� ������������������

In patients with FEV1/FVC < 0.70:

JH���5:������ !*A0�a�Q-S����������

JH���55:���������� R-S�T�!*A0�T�Q-S����������

JH���555:���%���� 8-S�T�!*A0�T�R-S����������

JH���5A:�%��7���%���� !*A0�T�8-S����������

R�

Page 51: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�������� ���� ���%������ ��������� ������7��#� �D������������� ����

��%����7��#��������7�������(J������5������%��#���4�����H�������%��

���� �������1�� !���� ������&� ����� �� ��� �&� ���� ������������ ���

������� ���� ����� �#� ����� �������� (��������� ���� JH���

�����#�������#����#�� � ������������� �����������#��*4H"������

7���1� ��� ���� �7�����������7� (�7����� ������� ��� ���� 4H"��

��������������&�4��1��>���#�7&��������� �����������7�����7���%��

��������������������#�� �����������(JH���5����551&� ������ �������#�

��##����� ����� �D���������� (-� ��� 0� ���� 7���1&� ��� #� ���

�7�������(�7�������7� ��������������D�����&����4��������

T0-1��J�����>� ��������������� ���� ������������ �7�����������

��� ����� �#� ��##����� �D���������� ��� ������ �������� �#� ������ �&�

����������������7�������(�������7��������4��������a0-1��5�

����� �7&� ������� 4� ��� �� ���� ���������� ���� �� ������� ���#�� �

���������� (JH��� 555� ��� 5A1&� ��� �� ������� ����� �#� ��##����� �����

�D���������� (a,����� 7���1��E� �%��&� ������4������������� �����

�7�����������7���������������������(#������01���

?�

Page 52: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

Figure 1. Association between symptoms, spirometric classification, and annual frequency of acute exacerbations (www.goldcopd.org).

1.1. Acute exacerbations of COPD (AECOPD)

��������D����������#�4H"�������#��������7����������

������� �� ����������7��7�����������7&���������7����&�����&�

��;��� �D���������&� �������� ���� ���� �������� ��������� �#� ����

������&� ���������������������������������������(�������et

al., ,--@1��"�����������������##��������������������%����7��#�

���� ��������� )���� ����� �D���������� ���� �������� ������ �#�

�������������&� ��������� �D���������� �������� ��������� ����

@�

Page 53: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�7������ �������������&� ���������� ��� ����&� ����� ��%����

�D���������� ���� #�������7� ���������� ���� ��������� ���������

(��������et al., ,-0,1��

���� ����� �D���������� ���� ��������� �%���� ����

��������������������������#� �����������&����������������������

�#� ���� ���� #������!��� ����� �����&� ���7��������������� ������

�����������������7������������7��#������������� ����4H"�&����

��������������#���������������(�������et al., ,--@1��

����������#� ��������D�����������7���������#�������&�

��������� ��� ��� Q-S� ���� ���� ��� �������&� %������&� ��� ��7�����

���������� ��%���� �#� ���� ��������� ��� ������ �%���������

�������&��������7������#���������������,-S�(��������et

al., 0.Q@1�� ���� ���� ��������� �������� ������ �*4H"�� ���

Haemophilus influenzae� (,-/8-S1&� #���� ��� �7� Streptococcus

pneumoniae����Moraxella catarrhalis�(0-/0RS�������1��5��������&�

��� ���� ���� ���������� ����� Pseudomonas aeruginosa� ���7�� ��

������������������������ ����%��7���%����4H"��(������,1��

Q�

Page 54: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

Microbe Role in Exacerbations Role in Stable DiseaseBacteria�

Haemophilus influenzae ,-_8-S��#��D���������� )�I���������

Streptococcus pneumoniae 0-_0RS��#��D���������� )����������

Moraxella catarrhalis 0-_0RS��#��D���������� )����������

Pseudomonas aeruginosa R_0-S��#��D���������&����%����� ����%������������

*��������������� 5������������%�����������&��������������#��������#����

"������7� ��������� �� ��%������������

$��#����

H. haemolyticus 5��������#�������7&�������7����� $�����7

H. parainfluenzae� 5��������#�������7&�������7������ $�����7�Staphylococcus aureus� 5���������#�������7&�������7������ $�����7�

Viruses�=���%����� ,-_,RS��#��D���������� $�����7�"����#������ %����� R_0-S��#��D���������� $�����7�5#������%����� R_0-S��#��D���������� $�����7�=���������7��77�����%����� R_0-S��#��D���������� 4����%�������4����%����� R_0-S��#��D���������� $�����7�����%����� 8_RS��#��D���������� �������#��������&����������

����#�������#���

E�������������%����� 8_RS��#��D���������� $�����7�Atypical bacteria�

Chlamydophila pneumoniae� 8_RS��#��D���������� 4�����7��������&��������������#�������#���

Mycoplasmapneumoniae� 0_,S��#��D���������� $�����7�Fungi�

Pneumocystis jiroveci� $��#���� 4�����7��������&��������������#�������#���

INT

RO

DU

CT

ION

Table 2: Microbial pathogens in COPD (source: Sethi and Murphy, 2008)

������������� �������7� �#� ���� ����� �D���������� �������

�����7� �� ���� ��%����7� ������� �#� ���� �����7��� 4H"��� S.

pneumoniae����������������������� ���������4H"��(JH���5/551&�

�����P. aeruginosa����Enterobacteriaceae�����#�������7����������

�������D�������������������� ������ ���!*A0+�JH���555/5A�(*�����

et al., 0..Q1��`������#��������H. influenzae����M. catarrhalis&���

.�

Page 55: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

���������� ���#������� ���������#�����7�������������%����7�

(*�����et al., 0..Q1��

5������������������������%������������#���0R/,RS��#�����

�#���%�� �D���������+� �� �%��&� ������ ������� ��������� ����� ���

��##����� ��� ��#��� ��� ���� #�����7� %������ ����� ���� ��������

�������� �� ���� �������� ����� #��� ������ �������� (3����� ���

)����7&� ,--Q1�� ������ #�����7���7� ��� �������������� �7� �����

��7� ����%�����������&�����%�������������7���������������������

���������(�G�����=G�������#�����1��G�%���������&�����%�������

���� ���� %������������ #�������7������������������%���������#�

����� �D���������&� #���� ��� �7� �����#������ %������� ���

�#������%������� (��������et al., ,-0,1�� 5��������&� �/�#�����

�#� %������� ��� �������� �������� ���� ��%����7� �#� ���� �����

�D���������&� ��� ��� �������� �� ,RS��#� �D���������� ���������

���������������("����et al., ,--?1��

����� �D���������� ��7� ����� ��� ������ �7� ���� ��7�����

�������� Mycoplasma pneumoniae� �� Chlamydophila

pneumoniae, ��������� ������ ��������� ����� ��� ����%������� ���

��##����� ��� ��#���� 3�%����� �������� ��%�� ���7���� ���� ����� �#� C.

pneumoniae� ���� ���� �������� %��7� ���������7&� #���� -S� ��� 8<S&�

�������� �� ���� ��������� ����� #��� ������ �������� (�������

���������#�����������7��������&�"4=����������#�����������G�&�

��� �������71� (>���7� et al., 0..0+ "�������� et al., ,--.1��

G�%���������&� M. pneumoniae� ���� �����7� ���� #���� ��� �����

�D����������(���������et al., ,--,+�3�����et al., 0.Q-1��

5�������7��������&������� �������������7����������������&����

����������������#�������������������������������������������#�

��������������������7�������E� �%��&� ��,R/R-S��#�4H"����������

0-�

Page 56: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

������ ��������� ��������� ������� ����� ������ ��� �� ���

����������7� �����&� �%�� �� ������� 4H"�� ()���� et al., 0..R+�

)����7&� ,--?1�� ���� ������� �#� �������� �������� ���� �� ���

��� �7�� �#� ������ �������� ��������� ���� ��� �7� ��� �7������

�#��������&� ���� �������� �� �������� ����������� �I��7�� �����

������&� ��������� ���� ��������� ��������7� ������&� #����������

���������������#�� ����������������&��������&������������������

�#���%���������� �������D�����������������("�����et al., ,--,+�

3��������)����7&�,--Q1������� ����� %����������&� ���� ���������

�D�������������������������������������������#�4H"����������

������ �I��7� ��� ���� ���� ������&� #���������� ��������� ����������

(#������,1��E��&���������� #�����7��#�������D������������7�

����������� ��������������������#���������������������

Figure 2. Cycle of infection and colonization in COPD

patients (source: Decramer et al., 2012).

00�

Page 57: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

���� ���������� �#� �� � � ������ �#� H. influenzae� ��� M.

catarrhalis� ���� ���� ���������� ���� �� � � �������� �#� �����

�D���������� E� �%��&� ����� ���������� ��� ��� ����� #��� ������

��������� ���� ��� S. pneumoniae �� P. aeruginosa, ��� ����

�#���������%����������������(3�����et al., ,--,1��

1.2. Role of bronchiectasis in COPD patients

>������������������������%��������������������������

�7��������������������#������������������������������������

�#������������#��������������������������%���������&� ����

�������� �� ����� ����&� ������� ��������&� ��� ��������

�#������ (>�����&� ,--,1�� �������� �� ���� ������������ ���

������������ ��������� �#� ��� �7�&� ������������ �� ���

�����#������:�7������������������&��������������7������������ �7��

����+�%������&��������������7�#�����������%�����������������

�������� ��� �7�� ����� ������� #���� ��#���� �� ���� �������� ���+� ���

7���� �����������&� ���� ����� ��%���� #���� �#� ������������

����7� ���������� ���� 47���� !�������&� ��� ������������ �7� ��

���������%�� ���������� �#� ���� ��� �7�&� ���� ���� �� ������ 7����

(=���&�0.Q?1���

��##����� ��������� ����� ��� ���� ��%�������� �#�

�����������&� ���� ��� �������� ��#���&� ����/�#������� ����&�

��� 4H"�+� �� �%��&� ���� �������7���������� ��� ������ ��� ��������

(J������ ��� �����, ,-0-1�� ����� 4H"�� �������&� �� �����

���%������#��/7�����������������������������%��&�����7�

���������� ������������/��/��%����4H"�� ("�����et al., ,--<1�� 5�

#��&�8-/R-S��#��������� ����%��7���%����4H"����� ��%������#�

0,�

Page 58: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

�����������&� ��� ��%�� ����� ��%���� �*4H"�� �D���������&�

�� ������ �7�������������������&��������������%�����#��������

�#��������7� �������� ("����&� et al., ,--<1�� 5� �������&� ��

���������� ��� ��� ��������/��/��%���� 4H"�� �������� ����

������������ ��� �� ��������� �������� ����� �#� ���/�����

��������7� ��� ���������� �� �������������� ()���2��/J��2��et al.,

,-081��

08�

Page 59: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

2. Streptococcus pneumoniae

2.1. Historical background

Streptococcus pneumoniae&� ����� �� � ����

��������'&� �������%������7�3����������3���������0QQ-&�

����������������������� ��������� �����%���3�����7��#��� ����&�

�� �� ��������� ����7� �� �������� �#� ���� ����� 7���&� ������

"������� ��� ����� ��� �������� ���� ��������� #���� ����

��������� ���� ����%�� #���� �� ����� ������ "������� ��� ���� #����� ���

�����������#�������������������#�����)�����������7��#�!����

�� B����7� 0QQ0� ("������&� 0QQ01�� 5� 0QQ<&� J���� ��%������� ����

J���� ����� �� ������ ��� #��������� ���� %������������ �#� ����

��������� �� ���� �������7� �������� ����7&� ���� J���� ��� ����

�����#�������7�����������#���������##�����������#���������(J���&�

0QQ<1��

���������#��������������������������%�����������

���� ���� ����%��7�� 5�� ��� ��������7� ������ Microbe septicémique

du salive” �7� "������&� ��� Micrococcus pneumoniae by L����

(L���&� 0QQ<1�� ����� �� � ��� Diplococcus pneumoniae

(`����������&� 0QQ?1&� ���� ������� ���&� Streptococcus

pneumoniae� ����##�����7����������0.Q-�(3������et al., 0.Q-1���

���� ��������� ���� ���� �%��%��� �� ��7� ��������

#������� 5� 0.,Q&�J��##���� ��������� ���� #����� �%����� �#� ���������

����#����������������������� ��������������/��������� ����

�� ����/������� ����������� ��������� ��������� ���� �������

�%������� �/����������� ��������� ����� ���� ��� ����

0<�

Page 60: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

�#����� �7� ���������� �������� (J��##���&� 0.,Q1�� ����

�������� ����������� #��� ����� ����� ��� ����� ����

����#������ �������'� (������ ����� �G�1� ��� ��� �����#���� �7�

�%��7� ��� �/ ������� #���� ����=���#������ 5�������� (�%��7�et al.,

0.<<1��H������������������%���������������#�����%�������������

�������� ��������������������##��7��#��������&�����������#�

�������������������� �������������������7�����&��������������7�

�#� ���7���������� ��� ����� ���������� (!����� et al., 0.RR1��

���������������������������������7��#�����������������,--0&�

�������#������%�������������#������������ �����������

(E������et al., ,--0+��������&�et al., ,--01��

2.2. Microbial characteristics

Streptococcus pneumoniae� �����J���/������%����������&�

���������� �� ������ ����&� #���� 0/,b�� �� ��������� ���� �� �%���

�����&��������������/���������������������

5��������D����%��7�������������&�#�������%��7��������&�

��� ���� ����������� ��� #��������%�� (���� ����� #���������1&�

��������� ��� �� ��� � ���������7� (>����7&� et al., 0.@<1�� E� �%��&�

���� ��������� ��� ��������� �� ����������7� #����������

��������+������������������������������ &�����������������������

�7����������������������7�����

H� ������ ����� ������&� ���� ��������� �������� �� c/

�����7���� ��� ��� ��� �������� �� �� RS� 4H,� ����������&� ��� ��

������� �#� ���� �D������� �#� ���� ����������� ��� �����

�������������� ���� ��� ���� �7������ ����D���� ��� ��������

0R�

Page 61: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

(>���������3����&�0..?1��E� �%��&�����������������������

�����������������d/�����7���������������������7���("�71�

�����(>���&�0.?.1���

���� ���7� ���������7� ������� �� ���� ������� ��� ����

��������������(`�����et al., 0..81������&����� �7����'��������#�

���� ������� ��� ��##���� ��� ������&� ���� �� ����� ����� (`����&�

0.8Q1�� E� �%��&� �/����������� ������� ��%�� �� ������ ��� ��7�

�����&� �������������#������7����8&�Q����8@���� ���������������

���������

>������� ���� ���7� ���������7&� S. pneumoniae� ����� ���

�����#���� �7� ���� ������� ������������7� ��� ����� ���������7�� >����

��������������������#���#�������������������������������

������ ������� �#� ���� Streptococcus� ����� (��� ��� S. mitis:� �����

�����%�� ��� ������� ��������&� ��� S. pseudopneumoniae:� �����

�����%������������ ��������� ��� ��� ��� �������� ����RS�4H,�

�����������������1��

2.3. Taxonomy and pneumococcal identification�

����Streptococcus������ ��D���7������������%��� ����

7�����(��� ������������4��������`�������&�0.@,+����������

����� ������ !�����&� ,--,1�� ���� ������ �����#������ ��� ������ ��

����������������&� ��������������������#������� ������������

�����7��&���7��������������������������������������

5�����Bergey’s Manual of Systemic Bacteriology&����������

Streptococcus� ��� ������� ��������� ���� ��D� ������ ������

(Aerococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Pediococcus,

0?�

Page 62: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

Staphylococcus, ��� Stomatococcus1� ��� #�������%��7� ��������

J���/������%�����(>����7�et al., 0.@<1���

���#����� (0.881� ���������� ��� �����#7� ���� �����������

������� ������ �� ���� ���7��������� ������� ������� �� ���� ����

����&� ��� ������7� �#��� ����� 3������ (0.8@1&� ��%����� ���� �����

���� #���� �7���:� �7����&� �������&� ����&� ��� %�������

(���#����&�0.88+�3�����&�0.8@1������%���������%����� �������

���� S. pneumoniae� ������� ����� ���� ������ �/� U/������7���

���������

`���� ���������������#�0?3��=G�������������&���� �

�����#������ ������ �� ��D� ������� ��� ������:� pyogenic, bovis&�

anginosus&�salivarius&�mutans���� #����7�mitis&� ���� ������� ����

����� ����� �������� ������� ��������� ���� S. pneumoniae�

(L� ������et al.&�0..R1��4������7&������������������#�������������

���������������&� ���� �������������#�����%���������������S.

sanguis (!�����&� ,--,1�� E� �%��&� ���� ��7�������� ���7����

������ �� ���� 0?3� �=G�� ���� ������� ���� ��� ��##��������� S.

pneumoniae�#�������������7����������������S. mitis����S. oralis&�

���� ���7� �D������ a..S� �������7� (`�������� et al.&� ,---1�� 5�

�������&� ���� #������� �D����� �#� ������ ��������� �7� ����������

��������#���(EJ�1���� ���������������������������������#�

� � Streptococcal� ������� ���� ��� S.� pseudopneumoniae

��������� ������ �����#������ (���� ��� ����� ������ �������� et al.,

,--<+�4���et al., ,--@���

=����7&� ���� �����D/��������� ������ ���������� ��������_

����� �#� #������ ����� ����������7� ()���5/�H!� )31� #�����������

���� ���� ����� #��� ������ �����#������ �#� ��##����� ��������� �����

����������������������##������������������7���������3���������

0@�

Page 63: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

������&� ����� ���� ����/���� ����� ������� #���� �����#������

(3�������� et al., ,-001�� G�%���������&� �� ����� ���7���� �#� ����

������;�������#����������������������������������##���������

S. pneumoniae� ��������� #���� ��������� �#� ���� �������� ������� S.

pseudopneumoniae&�S. oralis����S. mitis�������(`����et al., ,-0,+�

5��7����%��et al., ,-0,1��

�3����7���� ��� ��%������7� ����� ��� �����������

�������&������%������������������%��������������������7&�����

����� #�������7� ����� ��� ���� W������� ������&� ������ �� ����

���������� ������� ��� ��� �������� ������� ��� ����#��

����������� 4������7&� ��%����� ��������D� "4=�� ��� ����� ����/�����

"4=�����7����%��������%�������#������������#�������#����������

#������� �������� �7���� �������� ����� �������� ������

��������������(����:;; �����%;����;������;�����1��

E� �%��&������7������������##���������%��������� ����������������

�#� ���� ����� �����7��� ���� ��������7� ��#���&� ���� ������� ����

����������� �#� ���� #�����7� �#� �����7��� �D����� (4�##�7� et

al.,0..Q�1��

5� 0..@&� ���� "�������� )�������� *����������7�

G�� ����(")*G1� ��������������� �������������#����#�������������

���%������� �#� ��������/��������� Streptococcus pneumoniae�� ��

���������� �#� ���� 0?� ����� #������� �����/����� ��������� �����

���������������()J���et al., ,--01���������#��������������

������"�����!�����J���*�������������� ("!J*1�������&�)����� �����

3������ �7���� ()�3�1� ���7���&� ��� ������ "������/>�����

"������� (">"�1� #����������� (����:;; ���������7����;")*G1��

5� ,--<&� ")*G� ������� ��� ������ ��I��� �%���%�� ��������/

0Q�

Page 64: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

���������������� �������%���� ����������������������4������7�

<8�")*G���������������#�����

���� )����� ����� 3������ �7���� ()�3�1� ��� �� ���������

���������%������� ��0..Q� ( ��������1&��������� �������7����

�#� ���� ������� �������� (������<R-��1��#� ��%��������������

���� (aroE, gdk, gki, recP, spi, xpt ��� ddl1&� ������� �� ����

�������&���������� �������7/��������3���������(*���������

3�����&�0..Q1��

5������7&�)�3�� �����%����������%��������������Neisseria

meningitis. E� �%��&� ��� ��� ������7� ����� #��� ���� �����#������ �#�

����� �#� ��%����� ��������� �������� `���� ��#����� ��� S.

pneumoniae&� ������ #���� ���� �����#������ �#� ���� ��I��� �����

��������� �������������������������%�� ���� ���&� �������������

#��� ���� ��##���������� ��� ��� ���� �����7� �������� ������� S.

pneumoniae&�S. pseudopneumoniae&�S. mitis����3���������(��&�et

al., ,--.1�������� ���7�����������7���� ()����������3������

���7���+�)�3�&��������������������������#���D�)�3�������

(��������ddl1��

2.4. Pneumococcal virulence factors

S. pneumoniae ����������%����� %������� #������ ��������

��� #��������� ���������������#� �����������7D� �����������;���

����������7� ����� �� ������&� ��������7� ������ �%��� ?R� 7����� �����

������ %������� #������ ���� � ���� �������� ��� ���� ����� ��� ����

���������� �#� �������� ��������� #��� ��������� ���%�%��� ���

��������������)����%��&���%�����%�������#����������������%��%���

0.�

Page 65: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�� �����������&� ��� #��� ����� ������ ���� ������� �� ���� ���������

���#��� (B�����I��&� ,--�1�� 5� ����� �����&� ���� ����� ���������

%�������#��������������������

2.4.1. Pneumococcal capsule

"�������������������������7�����������������������

��������7� �%������ ���� S. pneumoniae� �������&� ��� ���� ��� ��

�������%�� ��7��&� ��������� ���� ��������� ���� #���� ���� �%�������

(#������ 81�� ��������� ���� ������� ����� ��� ���7� �� ����� �� ��

�������&� �%����� ��� �#��������� �� ���� ����� ()4������� ��

�����, ,--01&� ��� �������� ���� ��������� %�������

������� ��� �������� ���� �������� ������� �����7��� ������� �7�

������� ������������������� ��� ������������� ���� ���� ����7�

���������������������������#���������7�����!�������������&�

�������������������������������%�������#������

Figure 3. Electron micrograph of a pneumococcal strain, showing the capsular polysaccharide type 3

(source: Kim et al., 1999)

,-�

Page 66: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

4������� �D�������� ��� ��������� #��� ���� ���������� �#� S.

pneumoniae� ��������7��������������&� ����� ��� ����������������

5�#��&� ��������������������������/��������������������

%������� ���� %�������7� �%������� (J��##���&� 0.,Q1�� E� �%��&� �/

�������������������%��������������������#����������������������

�������� ���� 5"�� ��� ������ ���������� �#� �������� �I���%�����

(4��%�����et al., �,--81���

���� $3� ���������� #��� ���� ������� �����#������ ���

�������� �7� ���� ������ �7����&� ������ �� ������ �����%��7� ����

�������� ��� ���7����� ���������� (���&� 0.@-1�� ��� ����&� .<�

������� �������� �7���� (�����7���1� ��%�� ���� �����#���� (4���D� et

al., ,-0,1&����������#��������������������������������&��������

���� �������� ������������ �������� ��� ���� ����� ������� ���� ����

��������������������#�<?��������������%��������������+�������#�

����� ������� ��7� ��� �����7��� (�����7���� 0� ��� 81&� ��� ������

����������� ���������� �����D������7���� (����������00+������7����

00�&�00>&�004&�00�&�00*����00!1���

���������������7���������������������������#�������7����

���������� �7� ��������� ����� �#� � �� (����� �����7��� 81� ��� �����

������������&� ���� ��� �����7��� 0@�� (Q� ������������1��

�������� ���� �������� %���������7&� ���� ���� � �� �����7���� (8� ��� 8@1�

������ �������� ����7������ ���� �7�� ��� ���� �7��������� �7� ����

`�7/������������ �7�(�����&�et al., ,--0+�>����7�et al.&�,--?1��

�������������������������������������������������������

�����cps&� ������� #�������7� ���������dexB ���aliA� (J�����

��������&�0..@1������������� ����������� ��� ������� #���� #��� ����

����� �%��%��� �����7�������������7������� ������� ���������

��������(���A�7�������������&�

,0�

Page 67: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

0...1�� ���� ������� ��� �7��������� �7� ������%�� ����#������ �#�

������������ ��� �� ������ ������� ���������� ��� ���� ���������

H����������������������������#���������������������������(�7�

�� ������/���� �������������� #�������1&��������7�������� #������ ����

�������4"3&� �������������������������� ����(���������7�1��7���

�%������������(3������et al., 0..-1��!�������������&��7����8����

8@� ���� ���� �7������ �������� ���� �7&� ��������� ��7� ��

��7��7�����#����������������������������(�����������et al.&�

0..?1��

������������������ �������7�����������������������7�������

���� �7&� �������� �D�������� ��##����� �������� �7���� ��%��

�������������� ����������� �%���%����������� (������������7����

0&�R����@!1���� ���������7���� ������ �������7���������������������

�����7� #���� �������� ���� �������7D� �� ������&� ���� ���

?>&�0.!����,8!�(>���������et al.&�,--8�1���

5�� ���� ���� ���������� ����� ���� ����� ��%�����7� �#� ����

�������� �7���� ��� ���� ��� ���� ������%�� ��������� �#� ���� �����

������ �7����� (>����7� et al., ,--?1�� 5� #��&� ��%����� ���������

��������� ��7� �D����� ����� %���������7:� ���� ���������� ����

����#���(EJ�1�#���������������������#����������Streptococcal�

������&� ���� ���������� �#� �������������� ��� ������%����� �#�

���������������������(>����7�et al., ,--?1��

5� �������&� ��� ���� ���� ��������� ����� ��������� �#� �����

�����7���� ���� ��� �����7��� 0� ���� ���������� ���� �� � ������

��%�����7� (>������������3�����, ,--8�1� ����� ������ �����7����

���� ��� �����7��� 0.�� ���� �D�������� �7� ��%����� ����7���&�

��� ��� ������������ ��� ��������� %��������� (�������� et al.,

,-001��)����%��&�����������#���%����������(����7���1��D��������

,,�

Page 68: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

��##��������������7����������������D������#���������������7�

EJ�+����������� ���� ��������� �����'&���� ���#��������������

� �� ������� ���� (4�##�7� �B� et al., 0..01�� E� �%��&� ���� ����

���������� �#� ���� @/%����� ��������� �I������ %����

("4A@1&������7���� �����������������#������������������� ��

���/�D������ ����� �D�������� "4A@� �����7���� ��� ������ ����

%���/������ ������7� �7� ��������� �������� ����� �#� �� �/

"4A@������7������������������7�������������������������� ������

����7�����7����������� ����%���������7���<� (3�?.R1&� ����

� ��D�����������/"4A@������7���0.���������(>���������

et al., ,--@1������������#���������� ��������������������

��������� �� ������ ��� ��� +� �� �%��&� ��� ��7� ��� ������%��7�

����&����������D���������#���� ������7����7�����������#�����

��������������������#������##�����������������%����(4�##�7�

et al., 0..Q�+�4�##�7�et al,,0..Q�1���

2.4.2. Pneumococcal cell wall

���� ���� ���&� ����� ��� ���� ��������� �����7���&� ���

������� ���� � ���� ������� ��� ������� �#� �� ���������7�� ����&�

���������� G/���7����������� ��� G/���7�������� ����

��������&��������7�d/0e<������(�������A������et al., 0..R1��5��

��������%�����7�����������������7������������ ���� �������

���� (`��1� (�������� et al., ,-0,1�� 4���� ���� ��� ���� ��������

�����7�������(4`"31����� ���������%�������#������� 5��������

��� ���� �������� ���7��������&� ����� �����D� ������ �� ��������

�f�������� ��� ����� �����#���� �#����� ���� ��������������

5� ����� �7&� ���� �I������#� ����#���� ���� ���� �������������������

�����&����������

,8�

Page 69: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�������������������(�������et al., 0.QR�+��������et al.,

0.QR���!��"��������������1��������������������� ��������������� ��

��I��� ������� �#� ��������� ���/���#��� �������:� ���� �����/

����������������������������#��"D�J/����������#�����������

(#������<1��

Figure 4. Pneumococcal virulence factors (source: Kadogliu et al., 2008)

2.4.3. Choline-Binding Proteins (CBPs)

"�������7������� ��� �� ��������� ������� �#� ����

��������� ���� ���&� ��������� �7� �������� �#� ���� �����

����� �������7����� (>���������E�����������&� ,--?1�� 5��

������������������������������#����7��#��������������4�����/

,<�

Page 70: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

>�����"�������������#����7���������#���������������������������

���� ��� S. pseudopneumoniae� (������ et al., ,--?1&� S. mitis�

(E������� et al�&� ,--.1� ��� S. oralis� (=������ et al., ,-001��

#����4>"�����������7�����%������ ���S. pneumoniae����S.

mitis&� ������� ���� %������/���������� "���� ��� "��4� ����

����#�����������������������������%���#�������������������

����������� �#� ����� �������� 4>"�� ��������� ����g���7� ��� ����

�7��������� ��� ������������ ���#��� ������������� �#�

�������� ��� ���7� ��7� #��������� ���� �������� ��� ����� �����

��������7��������������g&���7���������� ����������(3 ������

et al., ,--,1��

"������� �� ������� ��� ��� 0R� ��##����� 4>"�&�

������������������������������/���������������� ��������

��� ���� ��������7������� �#� ���� ���� ���� �/�%�����7� ����������

�����/������������(���������J����&�,--<+�E�������������&�

,--.1�����������(G1/����������������%��7� ����7&������������

�������#���������#�����%�������#�������##�������������(B�����I���)B&�

,--01��

Autolysins. ����� ������ �#� ������ �7���������

������������ �� �� ����� %�����7� �#� #��������� ���������� #�����&�

����������� �����7������&������������#�������������&����������

����#�������� ("���� et al., 0..81�� ���� �7��� ������&� �� G/

���7�������7�/�/������ �������&� ��� ��������� ���� ��I���

��������� �����7��&� ��� ��� ��������� #��� ���� ��������7/������

�����7���� �7����� �#� ��������� �7��� ���� ���� ���� #���� ��

�����7�������������������(������et al., ,--?1��������������%�����

�#� ���7������� ������� ������� #���� ����������� �%���� ����

����������� ����� �#� ��������� ���������� ��������������

,R�

Page 71: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

()�������et al., ,-0-1��������7����������������#��7�����������&�����

��� ��7� �������� ���� �������� �#� ������7��&� ��� �#� ���� ��I���

%�������#�������#��������&����������D������������%�������

(����et al.&�0..,1��

� �� ������ �����7���&� �7�>� ��� �7�4� ���� ����� ������� ��

�������+� �7�>� ��� ����� �������7� �� G/���7���������������

������� �#� ��������� �����/������� ���� ����&� ��� �����

����������� �� ���� ���������� (���������J��2�&� ,--<1�� �7�4� ��� ��

��������� �7���7��� ���� ���� ��7���������� ����� ������� ��� ���

�����������

Pneumococcal surface protein A (PspA). ����� ��� ��

?R���� ������&� ���� ����#����� ���� ���� ��������� �7����&� �7�

������ ��� ����#����� (E������������ et al., 0...1�� ����#�����

���7�� �� ��������� ����� �� ����� ������7&� ��� ������ ���������

��������� ���� ��������� ������� 48� �� ���� ���������

���#��� ��� �������� ����������� (��� et al., 0...1�� 5� �������&�

"������7��������������������������#��������%����������

���� ���������&� ���� ��7� ��������� ������� ��������� %�������

�������� (E������������ et al., 0...1�� "���� ������� ������

pspA�������%���������%������������������������()������et

al., 0.Q@1�E� �%��&������D�������������7� ����"�����#����

%��������������#���7������������

"���� ��������� ��##���� #���� ����� �#� �����7����� 5�� ���� ������

����������������:���G/��������#���������������������������&�

�����������7���������/���������&� �����#����#��D������7&�#��������

4� �������� �����/������ �����&� ���� ����� ��� ����

��������7������� �#� ���� ���� ���� (B�����I��&� ,--01�� "���� ���

�D���������7�������#� ���������� ����������#�S. pneumoniae (=���

,?�

Page 72: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

et al., ,--.1+� �� �%��� ��� ��� �����7� %�������&� �%�� ����� ���������

������������������������(4����et al., 0..-+�E�����������et al.,

,---1�� >����� �� ���� G/�������� ������&� "���� �� ��� ��������

���� ������ #�������� ���&� �� ���&� �� ��� ��%����� ���� ��D� ��##�����

������(E�����������et al., ,---1��

Pneumococcal surface protein C (PspC).� "��4�

������� ��� �� �����#������� 4>"� �#� �������&� ����� �� � ���

4���&�3�������"����5������������������(=���� �������&�0..@1&�

�7��������������������� �%������#����������������� (K�������

���&� ,---1�� 5� #��&� "��4� ������� ��� ��� �� ������� ������7� #���

�������7���������������(=���� �������&�0..@1��������������

�������7��#�"��4��������������7����������������������#�������������

����5����������7�#������&�48�������������#�����E&��%������

����������������%�����(E������������������&�0..@1��3����������

"���&� ��������� �#� "��4� �������� ��� ��� �� ����� %���������7�

���� ��� ������ ���������&� ��� �� ��� ��%����� ���� � �� ����������

�������(5������!�et al., ,--,1��

3�%����� �7�����#������/���������#����������&���������7�

"��4� ��� "���&� ���� ��������� #��� �� ��%������ ���������

%���&� ��� ���� ������7� ����� �%�����������=����7&� �%���%��

�������� ��� ����� ���������� ���� ���%����� �#���� �����/

������"�������������%����������������(L���et al., ,-081���

��� ������&� ��� �#� ���� �������� ���� �����%��� ��� ������

������/ ���� ��������� ������������ ��������� �#� ��������

������� ��� ��������� �� #������ ������� %���� ����������&� ����

����������%����������������#��������������������%����������%��

����%���7�����������������(�����et al., ,-001���

,@�

Page 73: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

2.4.4. LPxTG-anchored pneumococcal proteins

3�%����� ��������� ���/���#��� �������� ���� �%�����7�

������ ��� ���� ��������� ���� ���� �������� �� �������� �������������&�

���� ��������� ���� ����/���� ������� �"D�J� ( ����� D'�

��������7���������� �������1�� 5�� ��� ���������� ����� ��� ���,-�S.

pneumoniae ��������������������7����"D�J�����#+�����7������#�

�������%���������������� �����������&���������� ��������������7�

��� ������� ���#���� (�h#���� et al., ,-001�� ����� ������ ������� ����

������������&������������������������/�����������(3==1�

���������

Neuraminidases. G������������&� ����� �� � ���

����������&� ���� ��7���� ����� ���%�� ������ ���� ��������� #����

�������� ��������� ��� #���� ����� �������� (>������ ���

E�����������&� ,--?1�� S. pneumoniae ������ ��� ������ ������

����������������:�nanA&�nanB ���nanC&������������7�G���

�����������"D�J�����%���������D���������7��������������

������� (��� ��� ����� �#� ���� ���� �����1��>����G�>����G�4�����

������#�����������7�����������������������������("������� �

et al., ,--?1�� �� ����� �#� ���� ������������� G��� ��� G�>� ����

���� ���������� �� ����������� (������ ��������� ��� ��� �� ��I���

�������� �� ���%�%��� �� ���� ����������7� ����� ��� ������������

()��� et al., ,--?1�� ���7� ���� ����� �%��%��� �� ���#���� #��������

(���������� et al., ,--.1�� 5�� ���� ���� ���������� ����� G�4� ���� ��

������/����#�� ����&� ���� ��� ��� ����� ����� �� ��������� #����

������������#����������������������������("������� �et al., ,--?1��

Pneumococcal Pilus. �����������#�����������������

%���������##���� �������������������� ������� (L�������7���et

al., ,-001�� 5��������&� � ����##����� �7���� �����������&� ����

,Q�

Page 74: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

#�������������������,--?�(>������et al., ,--?1������������5�("5/01�

���������������#�����7�������������7��������#�0,����(�����rlrA1&�

���� ������� ��%�� ����:� rlrA ������ �� �������������

���������&� rrgA&� rrgB ��� rrgC ������ �������� #��� ������������

������������������ �������srtB&�srtC ���srtD ������ ����������/

����#����������� ������������������������������ ����(>������et

al., ,--?+��h#����et al., ,-001������rlrA�������������������#� �������

8-S��#�����������������������������������

���� "5/0� �����&� ��� ����g���7� ���� =���� ������&� ���������

����������� �������������������� in vitro, ��� ������� �����������&�

�����������������#��#�����(>������et al., ,--?+�G�����et al.,�

,--@1��E� �%��&������������������������������������/����������

������� =���� ��������� �����7������ �7� ���� ����� � ����%���

����������&� �������������������������������������8�������

���������������7������������������������&������������������

������#������������������������������ �������������(H�������et

al., ,-0,1���

����������7&���������������7���("5/,1�����������������&� ����

������#�%������:�� ��������������������("�������"��>1&���������

���������/����� ������� 3���� ��� � �� ��������� 3��J0� ��� 3��J,�

(>������ et al., ,--Q1�� ����� ������ ��� ������� �� ��������

��������� �����7���� ��� �� ����� ����� ����� ������� ����

��������#��D�������������"5/0����"5,�(>������et al., ,--Q1��

Glycosylated serine-rich repeat (SRR) proteins. ����

����� ��������� 3==� ������� ��� ������ "��"&� �� ������%�� ��7��7��

����#������ (3��%�������et al�&� ,--.1��"��"� ���� �� ������� ��������

��� ���7�� �� ����� �� �������� ��� ����� ����&� ���#���� #�������� ���

���������� �� �� �������� ������ ������ (=���� �� et al., ,--Q+�

,.�

Page 75: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

3�����et al., ,-0-1+��� �%��&���%�������������������#���##�����

�����7��������������������()�6��/��������et al., ,-0-1���

2.4.5. Pneumolysin

"�����7�����������������#����7��#�����������/��������

7���7���&� #���� �� %�������7� ���� ��������� ��������� ���� �����

��������� �����������%�������� ��� ��������� (L���������et

al., ,--Q1�� "�����7��� ��� �������� ��� �� R,���� �������� �������

����� ������������� �� ������������ �#� ������� ����� ��� #������ ������

���/������� ������������ ������ ���� ����� ��� ,?-i� �� ���������

���������������#������D������7�<-����������������(�����7�et

al., ,--R1�� "�����7��� ��� �� ���/������ %������� #����� ����

�� �7��� �7� �����7���� ���� ���� ����������� �� ���� �������&�

������� ���� �����7� ������� �� ����������7� ����������&� ������� ����

�����7��� ����������7� ������ ��� ����� 7������ �7�������

(L��������et al., ,--<1��

8-�

Page 76: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

3. Colonization and pneumococcal diseases

S. pneumoniae �� ������#� �����������������������#� ����

������ ����������7� ����&� ��� ������� ���� ����� ��������� ���� ���

��������%�������������� ������&��������H. influenzae&�S. aureus,

M. catarrhalis, ��� %������ ������7�� Streptococci�� ����

��������� ������� ������� ��� �������� ��������� ���� �����������

��7� �������� #��� ��%����� ������ ��7�����������7� (J��7&� et al.,

0.Q-1��E� �%��&� ��������� ��� ��������� ��� �#� ���� �������

��������� ������ �#� ��������7� ��� ��������7� ���� ���&� �����

����������� #��� �� ���� %�����7� �#� �%���%�� ��� �/�%���%��

��������������������������#��������������������������7����

������&� ���� ������7&� ��� �������� ���� �����7��� �������� ���

�������#����������

3.1.�Colonization

"�������� ���������� ����� ������7� �#���� ������ �� �/

��%������� �������&� ��������� �� �������������� �������� ��� �����

������ �� ��#�� (�������&� 0.Q?1�� �� ������ ������ �� �������� �� ����

�������7D� #��� �������������&� ��� ��� ���� �������� �7� ������

�������� ���� ���������� ������ �������� ���%�� R-S� �����

������������R�7����&������������������7���������#������������

�����������7D��#���������������(=���������et al., ,--.&�`����et

al., ,-0,1�� 5� #��&� �7� ���� ���� �#� � �&������ ���� .-S��#� �������

��%�������������� ������������D���##����������7��������7������

(J��7�et al., 0.Q-1��!�������������&������������7D��#�����������

���������������I��������%�����#�S. pneumoniae��

80�

Page 77: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

5�������&�����#�����7��#�����������#����������#����8S����

,-S&� ����� ������� �� ������7� ������� ��� �������� ���� �����

����������7����������(���7�/*%���et al., 0..?1��

"�������� ��� �����7� ������������� �7� ������ ����� ���

����������������&���� #����7��D����������7���� ��������� ��������

� ��7������#����&� ������������#� #����7������(E������et al., ,--,1��

*D��������#������������7�����������(�441���������7�����������

�������������������&����������##���%��������������������

��������������7������������������#����������(����&�et al. 0..?+�

�����et al., ,--01��

G�������7����� ���������� ���%����� �� ��������� ��7� ��� ����

�������#� ��������� ����������� ���� ���%������4����������

�7�S. pneumoniae �����������������������������������������#�����

����������7� ������E� �%��&� ������� �#�������� ��� �%�������� ������ ����

��������� �#� �������� ���� ���� ����� ��� ���� �%������ �#�

����������������������

3.2. Pneumococcal disease

������� ��� ����`�����E������H���������&� ��,---�������

0R� ������� ��������� �#� �������� ��������� �������� �������

���� ���&� ��������� �� ������ Q--&---� ����� ������� �� �������

����� ��� ��� R� 7������ "�������� ��������� ���� ���������� ����

����#���� ��������7� ��� ��������7&� ������ �� ����� ������ ���

������� ����� #��� ������� ���� �7������ ���� ����� 5� ��%�������

�������&� ��������7� ���������� ���� S. pneumoniae&� �������

����������� (������ #���� T0� ��� 8-S1� �������� ������������

8,�

Page 78: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

������������������7������������������������7��������������

���� �����7��� �������� �#� ���� ��������� ����&� ���� ������ �#�

��������� �������� ��� ������� �� ������� ��� ��� ���� ���� �#� � ��

7������������������%���?R�7���������("����������������, ,--,1��

� S. pneumoniae�������7��������������������7D��#�7����

������&����� �����7���������7� �%���� ���� ����&����������������

����&� ������ ��%���� �#������ (E������##� et al.&� ,--R+� ���

�����������������&�,--,1��3�������&��I���%����&�������������

�����&� ����� �D���������� �#� 4H"�� ��� �/����������

����������������������/�%���%����������&��������7�����

�������� ���������� (��� ����� ��������� #����������� �D������1&�

��� ������7� ����� ����� �������� ������� (>������� et al., ,--<1��

5%���%�� ��������� �������� ������� ��������&� ����������

�������� ��� ������ ������������ �#�����&� �� ����

�������� ��� ��������� #�������������������������7������������7�

#�������������������������#�������

3.2.1. Acute otitis media (AOM)

������%���������#��H)� ����������D���������������� ��

���� �������7D&� ���� ��� ������ ��� ���� ������� ���� �7� ����

*���������������H)����������������� �#���������������������� ��

�������� �#� #����� �� ���� ������� ���� ��� ���������� ����� ���

�7�������7������� (�����������et al.&�,-081�� 5�� �������#� ���������

��������������������#�����#�%��7������#� ��#��(������et al., 0.Q.1��

���� ���� ������ #������ ���� �����������7&� #�%��&� ������&� ��� ��

��7������%������&����������������������

88�

Page 79: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

� �� ������ ��������� �#� �H)� ����� ��� %����+� �� �%��� S.

pneumoniae� ��� ���� ����� ����� ��������� �������� �����������

#���������������&� ����������#���8-/<-S��#�����:�G�/�7�������

H. influenzae� (,0S1� ��� M. catarrhalis� (0,S1� ���� ����� #�������

�������#��H)�(L�����et al., ,--01��)��������������� �������� ����

���������&� ����������7� ���D�����&� ���� ��� ������� ��%�����

����� ��� �� �������� �#� ��������� ���� ��� ���� ���������� �#�

��������� �I������ %����� ("4A1&� ���� ��������7� �#� �H)�

����������������%��������("�������&�,-081���

4���������7��������������������H)�����������7�����

����� �����7���� ���� ����� ������ �#� �������7D� ���������&�

����7�?�&�?>&�0<&�0.�&�0.!&����,8!�(3�����et al., ,-001��

�3.2.2. Pneumonia

���� ��������� �#� �������� ��� ���������� ���� �� ������

�������#���������������������������&�������������������

�#������� #���� �� �/�#������� ��������7� #��� �������7� �#���������

��7� ��� ��##������ )����%��&� ���� ������ ����������� �#� �7�������

��������������������������������������#����������������&�

������ ������&� ��� �����7��� �������&� ���� �� ������&� ��

�������� �������� ��� ��������� ��� #�%��&� ����7������ ���

������������ #������ (� � �#��������� �� ����� ����������71� ����

����������

4������7/�������� �������� (4�"1� ��� ��#���� ���

�������������������������������%��������5�����������������

8<�

Page 80: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

��##��������� ��� #���� ��������� ��� ���������� �������&� ����

���������������������������##�������

5� ������� ���� �������&� S. pneumoniae� ����� ���7�� ��

��������� ����&� ������ 8@S� �#� �%������ ��������&� ����� ��D���

�#����� (��������� ��� %������1� ��� �����%��� �� 8-S� �#� ��������

(B�%��et al., ,---1��5��������������� ����4�"& S. pneumoniae� ���

���� ����� �����7� �����#���� ��������� �������� ������� ���

��������������� (L���� ��� ������&� 0.Q81+� ������ 8-S� �#�

������������������������������������������������������

4H"�� ��� ���� ����� #������� �����7��� ������� �����

������ �������� ���� 4�"&� ��������7� �� �������� ���� ��������

��������� �������&� �#� ���� 8Q�<S� ���� 4H"�� (J����/

A�����et al., ,--.1�� 5��������&� ��������������������� ����������

4H"�� �������� ���� ��%���� ���#�� � ���������&� >""� ��7� ���

���������� ���� �� �� ��� ��������7� ��� ��%����� ����� ��&� ���&�

���� �� �� ��� ����� �#� ������ ���� �������� ���� >""� ��� �� 4H"��

(4�����et al., ,--.1��

3.2.3. Meningitis

4�������7��������#����������������������������������

������ ���� ������ ��������� �����&� ������� #�%��&� �������� ���

������##���&�������������#����������#���������������%�����

������������ �������������&� ������������)����������7������

���������� �#� �� ����� ������� �����&� �� ���������� #������&� ��� ��

�����������������

8R�

Page 81: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

� )���������������7��������7����������������%���������&�

���� ��� S. pneumoniae (<@S1� ��� Neisseria meningitidis (0<S1��

���� ���������� �#� ���� %���� ������� H. influenzae� �7��� ��

���������7��������������������������7��������������(3 ����&�

,--<1���

���� ��I����7� �#� �������� ���� ��������� ��������� ��%�� �����

�������� ����������&� ��� ��� ��� R-S� �#� ���%�%���� ��##��� ���������

���� ��� ���� ��������� ���� ��&� ��� ���� ��� ����������� ����������

�������������������(3������et al., 0..@1�� �

3.2.4. Bacteraemia

������ Q-S� �#� ����� ��������� ����������� ���

���������� ��������������������������������E� �%��&� ��

������&�������7���������������������(�����������#����

�����#���1����#������&��������������<RS��#�������������������

���������#�� ���

G�D�� ��� ��������&� ����������� ������� ���� ��������

��������/����������������7��������������������%����7��5�������&�

��������7� ���� ���� ���������� ���� �������� �%��� ?R� 7����� ���&�

���������������&� ��������� �������� �#�����&� �������������

�����������������������������������7�����������("��������

et al., 0..R1��

"������� ��7� ����� ������ ����� #������� ���� �� �����

����������%���%������������3�%������D����������:���������������&�

����������&� ������ ���������&� ��������������&� ����������� ���

������������

8?�

Page 82: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

4. Prevention of pneumococcal infection

5����� ������ �������������7�������������������������I���

%������� #����� �#� �������&� ��������� �������� #����

�����7�������!�������������&��������������%������%��������

��� #��� ��%�� ������� ����#���� �������� ���7����������� ������

������� ���� �����7� ��������� ��� ���� ���������� ���������

���������������#����� ������������������������7���(>�������et

al., ,--<1���

���� #����� ���������� �#� ��������� �#� ���������

���%�����������#����0.00&��%����#���������������������#� ����

����������7� �#� ���� ��������� �������� ���7���������� 3���

�������� *�� `������ ��� ���� ���������� ��%������� �� %����

���������#� �������������������� ��� ��������3������#����

����� �����&� �� ���������� ������ ���� ����� ������ �#�

��������� �#������ (`������ et al., 0.0<1�� $#��������7&� �����

%���� #��������������#� �������������������� ���� ��������#�

��7�� ����������������7�����

5�0.,?&�!��������>����7������������������������#���������

���7���������&� ����� ���� ������������������ �� �������� ����#��

�������'�� 5������������� ������������ ����� �%����&���� ��

0.8@�!������� ����������������� �#� �7���� 5&� 55&�A����A5� ��������

�����#���7����������������������#�����������������������������

��`��������(3�������et al., 0.8Q1��

�#����`�����`���55&�� ����D�%��������7���������%�����

�����������������$�����3�������E� �%��&� �������� ����������

�#� �������� ��� ���#�������� #��� ���� ��������� �#� ���������

8@�

Page 83: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�������������������7��������������&�����%����� ���� ������ �

#�����������������0.R<�������������#�������(�������&�0.Q01��

� E� �%��&�������0.?-�&�������������������������������&�

�������� ���� �������� �##���%����� �#� �������� ��������� in vitro&�

��������� �������� ������ ����� ������� �� ������� ����

�7� ������ �#������� ��������� ���7� ������� ����� �������� ���

������ ��� ������ ���� ���%����� �#� ��������� �����������

(�������� ��� J���&� 0.?<1�� 5� �������&� �� 0.?@� ���7�

��%������� �������%����� � %���� � ������� � ���� ���7����������

�������� � �#� � ���� �#� � ���� � 0<������ � ����� ����������

�����7���&� ���� ������ ����� Q-S� �#� ����� �#� ����������

��������(0&�,&�8&�<&�?�&�@!&�Q&�.G&�0,!&�0<&�0Q4&�0.!&�,8!����,R1��

5�� ��� ������� �� 0.@@� �� $����� 3������� ����� %���� ���

�D������ �� 0.Q8� ��� �� ,8/%����� %���&� ��� ���� �� �����������

�%�������#�aQ-S��#��������������������#����������������

����7&� ��%����� ������������� ��������� %����� ����

�%�������&� ���� ������������� �(#������R1��

Figure 5. Timeline of the introduction of pneumococcal vaccines in Spain

8Q�

Page 84: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

4.1. Polysaccharide vaccines

��� ������&� ��7� ��� ���7��������� %���� ��� �%�������&�

���� ,8/%����� %���� (""A,81� ���� ��� ������� #��� ������� ���

������������a,�7���������(=���������3������&�0.Q81�������

������������7���������%����("����%�Dj&�)����k�4���

5G41� �������,8�����#���� �������� ���7�����������������#� ����

��������������7����0&�,&�8&�<&�R&�?>&�@!&�Q&�.G&�.A&�0-�&�00�&�

0,!&�0<&�0R>&�0@!&�0Q4&�0.�&�0.!&�,-&�,,!&�,8!����88!��

���� %���� ���� ���� ��� � ��� ��� ��#�� ��� ���

���������� #��� ����������� ��� ����� �#� �������� ���������

�������� ���� ��� ���� ���������������&� ������7� ��������

��##�����������������7�������������4H"�&������������ ����

����������������������(3�������et al., 0..01��

���� ������ �������� �������� �7� ���� ��������

���7��������� ��� �� �/���� ��������� �������&� ��� ���/

��������� ������7� ��������� �7� ������� >/�7����7���� ���

����������E��&� ������������#���������� ��� ����������������#� ����

�������#������7�>�������!�������������&���������� �������������

����������7��#���7��#��������7�����������������������,8/

%�����%���&������%�����������##���%�����������T,�7���(!�&�

,--<1�������#���&������%����������������������������������#�

��������&� ��� #����� ��� ���%��� ���� ������� �#� ���������

�������������������������������������(>�������et al., ,--<1��

� � 5���������%���,�7������#������������������%������������#�

?R&� ���� ,8/%����� %���� ���� ���%��� �##���%�� �� ���%�����

����������� ��� ������� ���� ����� �#� 5"��� E� �%��&� ����

�##���%����� �� �������� ���� 4H"�� ��� ������ �� ������� �#� ������:�

8.�

Page 85: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

4H"������������������##�����7�#������������������������������&�

���� ��� ������ ��������� ������7� �������� ��� ���� %���&� ����

�����������#� ���� �� ��� ����������7� ����&���� ���� #������������#�

���������������������(3������et al., ,--Q1��5�#��&�� �������

��%�� �� �� ���� �##��7� �#� ""A,8� �� �������� ���� �����

����������7� ��������� ���� ��� 4H"�� ���� ��� ���%���� ����� ��������

(`������� et al., ,-0-+� A���/4������� ��� H���/J����&� ,-0,1��

��������� ���7� �������� �� ��������� ��������� �#� ""A,8� �������

��������7� �� 4H"�� �������&� �� ����#���� ��������� �� �7�

������� ���� ��� &� ������� ���� ����� ������ �#� �����

�D��������������������������������(`�������et al., ,-0-1�

� G�%���������&�����������#������7����#��� ����������������

�������� ��� ���� �##��7� �� ��������� ������� 5"�� ���� ���� ��� ����

������������������%����7�4����������#�5����������"�������

(�35"1����������%������� ����""A,8���������� ���������

���� ��������� ���� ��� 4H"�� (��%����7� 4��������� �#�

5����������"������&�,-081��

4.2. Conjugate vaccines

4�I������ %����� ���� ������ �� ���� �%����� ������ �#�

�������� ���7���������� ��� ������� �������&� ���� �������� ����

����������7� �#� ���� �������� ����� ������ ���� %���� �����

�����D��������7� ���������&����#��� ����� �����������������#�

�������� ���7���������� ������� ��� �� ���� E� �%��&� ������

""A,8&� ������ %����� ���� �##���%�� �� �#���� ��� �������

����������7��������������������������������/����������������

<-�

Page 86: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

��� ��� ��%����� ���� ���7��������/����#�� >� ����� ���� �����7�

�����(*���������������&�0...+�!�&�,--<1���

���� 7-valent pneumococcal conjugate vaccine� ("4A@+�

"��%���j� @&� "#����1� ��� ���� #����� ���������� �I������ %����

������� �� ����$�����3������ ��!������7�,---����B���,--0� ��

3�����5���������������%�����������������7�������������#����

�%���%�� ��������� �������� �� ������� ����� ?� 7����� ���� (<&�

?>&� .A&� 0<&� 0Q4&� 0.!� ��� ,8!1� �� ����$�����3������� ���� �������

������������ ������/��D��%�������#��������������D���&�4=)0.@1&�

��� ���� ���������� ������7� %������� �������� ��� ������

�����&����������������(���,&�<&�?����0,/0R��������#����1��"4A@�

���������������������������������������%����������������#�

��7����������������������4����&�$L����J���7��E� �%��&�

�� 3���� ���� �%������ �#� "4A@� �����7���� ��� ���������� ��� ���

������@-S���� �������������������%��������������&� ����

�D�������#� ����Comunidad Autonoma de Madrid, ���� �������

��%������ %������� #��� ������� ����� T,� 7����� ��� ���

G�%������,--?����B���,-0,��

"4A@��������%��������7��##���%������������������#�7����

�������������� 5"��� 5� #��&� �� ����$�����3�����&� ����4������ #���

�������� 4������ ��� "��%������� ���%�� >�������� 4����

3��%������� (�>4�1� ��������� �� �������� ������ �#� %����

�����7����������5"����������������TR�7������������7����,--0�

(`�����E������H���������&�,--R1��5��������&������������#�"4A@�

�����7���� ��� ����� �����%��� �� ���� ������ ���������� �����

�%���%�� ��� �/�%���%�� �������� (`����7� et al., ,--8+�

L7� �et al., ,--?; !�����et al., ,-0,1��������������������������

<0�

Page 87: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

��%����#��������������� �����������������%����������������&�

�������������#��������������������������������#�%���������7����

(A41���%��������������(Hl>����et al., ,--@1��

3�����7� �#���� ���� ���������� �#� "4A@&� �� ������� ��

���������#�����������/%���������7����(GA31����������

��������%��&���������������5"����� ����(E����et al., ,--@1��

����������� ������������������#��������������������������7���

������������������#�������������D�������#����/�D������GA3�����&�

���� ��� ���� �������� �#� �����/����� ��������� �������� �#�

�����7���0.������7���������5�#��&������7���0.������� �����

��������� ��� ��� �#� ��������� #������� ����� �#� 5"�� ()���� et al.,

,--Q+� �����7� et al., ,--.�+� A�� ���� ����� et al., ,-081�� ����

�������������� ��� ������������� �������#�����7���� ��������

���A3��������������������#�GA3�cps ����&���������� ��������

,�<�0��

5� ������� ,--.&� J��D�3����L���� ������������� �� 10-valent pneumococcal conjugate vaccine� ("4A0-1� �� 3����

(37#����Dm&� J��D�3����L���1�� ����� %���� �D����� ���� "4A@�

�%�����&��������������������������������������7����(0&�R�

��� @!1�� 5� ������� ��� ���� ������ �I������ %����&������ �#� ����

�������� ���7���������� ������� �� "4A0-� ���� �I������� ���

������� �� #���� �/�7������� Haemophilus influenzae�� E��&� ���

�������� ������� 5"�� ��� �������7� ������� ����� ������� �����&� ��

���� G�E�� ���7�� �� ��������� ����� ��� �� ������%�� �����

(J�������� et al., ,-001�� E� �%��&� �� ����� ����7� ��� ��� ��

��##���������##����#�"4A0-���������������������7�����G�E��

������������������7��������������,�7������#������������� ����

"4A@�%��������������(A�����>�����et al., ,-081��

<,�

Page 88: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

5�3���&�����"4A@�%���� ������������7�����13-valent pneumococcal conjugate vaccine�("4A08+�"��%����08j&�"#����1�

�� B��� ,-0-�� ����� %���� �##���� �%������ ������� "4A@�

�����7���� ����� ��D� � � �����7���� (0&� 8&� R&� ?�&�@!� ��� 0.�1�� 5�� ���

�D������ ��� ���%���� �������� ��������� ������� ���������

�#����+� �� �%��&� ������ ��� �� ��������� ����� ����� �/"4A08�

�����7���� ��7� �������� 5� �������&� ����� %���� ��� �����

�����%��� #��� ������ ��������� �� ,-00&� ��� ��� �����7� �7� �����

���� �%�������� �� ���� �##��7�� �� ������ ������ �������� 4�"5���

(4������7���������"������� 5���������������� ��������1� ���

����� �7�������������������##��7��#�"4A08�����������������(E���

et al., ,--Q1�� G�%���������&� ��� ���� ���� ��������� ����� "4A08� ���

������##���%�����������%�������"4A@&����%�����0-?�---�5"��

����� ��$�����3�����&���%���n00�?���������%�����0-/7�����������

(3�������et al., ,-0,1��

�35"� ��������� "4A08� %������� #��� ������� ����� 0.�

7����� ��� ������ ���� ���������������� ��������� 5� �������&�

�35"� ����� ��������� �� ����� �#� "4A08� �� ������

���������������� �������&� ��� ��%�� ����%��� ��� ��� �����

������ �#� ""A,8� ��� ������ �� 7���� ��#���� (��%����7� 4��������� �#�

5����������"������&� ,-081�� "4A08� ��� ������� #��� ������� ��

G�%������,-00��

<8�

Page 89: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

5.�Antimicrobial resistance in pneumococci�

5� ���� ���/��������� ���&� ���� ��������7� �#� ����������

������������������#����� ���������@@S�(�������&�et

al.&� 0.8@1�� E� �%��&� �#���� ���� ���������� �#� ���#�������� ���

�������� �� ���� #����� ���#� �#� ���� � ������� ����7&� ��������7� ��

�������� ���� ��������� �������� ��������� ���������7�

(�������� ��� J���&� 0.?<1�� !��� <-� 7����� �#���� ���� ���������� �#�

���������� �� ���� 0.<-�� ��������� ������� ���� ���������

����������������������������E� �%��&���������#����������������#�

�������� �����/�����������7��������� ���������� (E�����

��� >����&� 0.?@1&� ��������� ��� U/������� ��� ������ ������������

������� ����������������%������� �����(B�����et al., 0.@Q+ `�����

et al., 0..81�� ���� 0.Q-�� ������� ���� ������� �#� ���� ���� �#�

��������� ���������� ��������� (��������� ��� ����� ���� � ��

������� �#� ������������1�� )��������� ��������� ������� �����&�

��� �7� ���� 7���� ,---� ����7� ���#� �#� ���� ����� �#� �%���%��

�����������������(5"�1�������$����� �������������������������

��� ������������ ����&� ��� ��������� ����� ���� ��������� ���

�������� ���� �����7� ��� ��� ��������� ��� ��������� ������ ������

(`����7�et al., ,---1���

G� ���7�&���������� ����������#� ������������� �#������

������� �� ���� ���%����� �#� ��������� ������� �� ����

������������ ����� ��� ���� ���� �#� �#������ U/������� ���� ����

��������� �#� ����+� �� �%��&� �� ����� �#� ������7� ��� �� ��������

���� �� ����� ���%����� �#� U/������ ��������&� ���� ���� �#�

���������� (��������7�� ��� ���������7�1� ��� � � ���������

(��%�#��D��������D�#��D��1�������������

<<�

Page 90: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

5.1. �-lactams�

����U/����������� ������������������������� ���������

������#�����������������������������������#��#�����������������

U/������� ���� ���%�� ������� �� ���� %�����7� �#� �������� �������

J���/�����%�� �������&� ���� ��� Escherichia coli ��� Neisseria

meningitidis, ��� J���/������%�� �������� ���� ��� Staphylococcus

aureus, ���S. pneumoniae�����7�������%�����������U/������

��������������������������

���� U/������ #����7� ��������� ���� ��������&� ���� ����/

��������� (����� ��������&� ���D������ ��� ��������1&� ����

���������� (����� �������&� ��������&� ��������1&�

���������� (��������1&� ���� ������������ �����&� ������7�

��%���������#����/�(�������������1&�����/�(������#���D���1&������/�

(����� �#���D���&� �#����D��&� �#��������1� ��� #�����/���������

(����� �#�����1&� ��� ���������� �#� ��������� ���� U/���������

���������� (����� ���D�����;��%����� ���&� ����������;����������

�����������;��������1��

U/�������������������7�����������&� ���� ���7� ������� ����

���������7�� �7������� �#� ���� ��������� ���� ���� �7� ������

����%������7�����������%��������#������������/��������������(">"1&�

������� ��� ��������� ���� �7����7���� (`�D��&� et al., 0.Q81�� ����

��������� ���� ��D� �7���� �#� ">"� (">"0�&� ">"0>&� ">",�&�

">",>&� ">",P� ��� ">"81&� ���� ����7��� ���� ������� ������ �#�

������ ����7������&� ����/������ ���������7�� ��������� �� ����

������������� ����(E������&�et al.&�0...�1������">"������%���

������ ���%�� ����� ������&� 3��/P/P/�7�&� 3��/P/��� ��� �7�/

���;3��/J�7&��������������������������������##������������������

���������������� ����������������

<R�

Page 91: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

� 5� �������&� d/������ ��������� ������� ��� ��

�������� �#� ���� �D�������� �#� ����#���� ">"�&� ���� ������

���� �##���7� #��� ����d/������&� ���%����� ���� ������ ��� ���� ���%��

����� �#� ���� �������� (4�##�7&� et al., 0..R1�� ���� ������� �#� d/

��������������������������������S. pneumoniae �����������

5�������&��������������#�����">"���#�����d/�����������������

��������� ���� �����7� ����%���� 5� ������&� ���� ���� ����� �#�

��������� ������� ��%������ ���� ������� �#� ������ ����������

���������7��G�����������������7�����������������������

��������������������� ������������Streptococci (�� ��&�et al.

0..-1� 5� #��&� �� ���������� ��� ��� ���� ������� �#� ��%������ �#�

���������������� ����������� ��������7���������� ()541��#�

d/������������������������(J�����&�et al. ,--?1������������� ��

���������� ">"�� ���� ����� ��������� ������ ���� �������� ���

����������#���##�����d/��������!��������&������������">",>�

��� ">",P� �#��� �� � ��%���� �#� �������� ��������&� ��� ����

�������������� #��� ����� ��%��� d/������ ��������&� ��������� �7�

���������� ����������� �� ">"0�� (E������&� et al., 0...�+� 3�����

���L�����&�0..Q1��5������ �7&��������������">",P����">"0��

������#��������������������/�������������������������

� >����pbp1a� ���pbp2x���������� ������� #������ ����cps

�����(�����D������7�Q���������������@����� ��������#�����cps

����� �������%��71�� 5� ����� ����&� ���� ����������� #�������

�������������������������#�����������&��������������������������#�

�� � � �������� �7��� ��� ���� ���������� �#� � � ">"� �����

(>���������et al&�,--.+�)�����et al.�,--@1�� 5�� ��� �����7� ����� ����

������������� �#� � � �I������ %����� ���� #�%���� ��������

� ���� %������� ���� ���������� �#� � � pbp ����� ����� �#������

<?�

Page 92: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

�������������������7���d/�������(`7����et al., ,-081�E� �%��&����

����������������������������������pbp�����������������������

�������������#���������&�����������������������������������

�#� ������ ����� �� ������7� ��� ������� �� ���������� #������

(���������H���&�et al., ,-001��

�����������7&� ���� ���������� �#� �������� �/������������7�

���)54�o-�0,�b�;��&�������������� ��������� �������������

)54� ��%�� ���� ���������� ���� ��������� #������� �� �������� ����

������������������ (!�������� ��� L�����&� 0..,1�� ����� ���

�D������� �7� ���� �� � �����������7� ��� �������� �#� ���� �����/�����

�������&� ���%����� ���� ����%����� �#� ����� ��%���� �#� ��������� ��

����������������#�����(43!1&� �����������##���������������������

�#����� ��������� ���� ����� ����� ���� ���� �����/���������

�����������&� ����� �/����������� ����������� ���� )54�

a0��;��("��������������&�0..R1��E� �%��&���������������������������

�#� ������������7� ��������#���� �� ,--Q&� ��������� ���� ������ �#�

�#���������������#��������������(4���������������7�3��������

5�������&� ,--Q1�� ����������� �������� �/����������� ����������

�������������#������������#������()54�o-�0,�b�;��1&������

� � ���������� ()54� a<� b�;��1� ��� ������� �7� �/��������

�#������ ���� ��� �������&� ���� ����� ������ �#� ����%�����

�������������� ��� �##���%�� ("�������� et al., 0..R+� "�������� et al.,

0..@1��

"�������� ������� ���� ��������� ������������7� ���

�������� ���� #����� �����#���� �� ���������� �� ���� 0.?-�� (E�����

��� >����&� 0.?@1&� ���� �� ������� �� ���%����� �� ��7�

������������������0.Q-�����0..-��(L�����&�0..-+���6�����et

al., 0..,+�B�����et al., 0..@+�!�����et al., 0..Q+�!���������et

<@�

Page 93: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

al., ,--R1�� 5�3���&� �������#����������/������������7� ��������

#����,<�.S����8-�,S���0..,����,--0&��������%��7�(��6�����et al.,

,-0-1�� E� �%��&� �� ������� �������� �� ���� �������� �/

����������� ������(,0�8S� ��,--0����0?�8S� ��,--Q1� �����������

�#���� ���� ������������� �#� ���� ��������� �I������ %����

"4A@� #��� ������&� ��� ��������� �� ������ �������� (L7� � et al.,

,--?+���6�����et al., ,-0-1��

3������� ������ ���� #���� �7� ���� ���D����� "��I��� ��

!���&� J����� ��� $3�&� ����� �� J����7� ��� $L&� ���������

������ �������� ���� � RS� ������ ����� ������� (!��������� et al.,

,--R+� B����� et al., ,--Q1�� 5� ������&� ���� "=H�*L�� ����7�

��� ��� ������� ������ �� 3����� �#���� (@RS1&� !��� *���� (?8S1� ���

R<S�������)������*��� (B�����et al., ,--Q1��

E� �%��&� �� �� ����� ����7� ���#������ �� <8�$3� ���������&�

���� �������� #���� �� �����������7� ����#���� ������� �� ����

��������� �#� �������/������������ �������� ()54� o-�0,�

��;�1;��:�#����88S���0..._,---����8.S���,-0-_,-00+��T-�--0�

(=������et al.&�,-081�������������������������������� ���������/

�������������������7����0.�����?4��

5.2. Macrolides

)��������� ���� �� ������ �������� ����� �#� ������������

������ ����� ���%�� ������� J���/������%�� ��������� !��� ��%�����

7��������7���%��������������������������������%�����U/������&�

�������7�����������%��7��/��D�����������+��� �%��&� �����������

<Q�

Page 94: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

�#����������������� ���� ��������� ����������������� ��������

����������(�����&�et al., ,--?1���

)��������� ���� ������������ �7� ���� ������� �#� ��

����7��� ������ ���� ��������&� ����� ��� �#� 0<� ������

(��7�����7�� ��� ���������7�1&� 0R� ������ (��������7�1� ��� 0?�

������(I����7�1������ #�������������� ��������� ��������������

�����7�����7�&�����������7�0.R-����

)��������� ������� ������� �7������� �7� ������ ��� ���� R-3�

������������������#��������������������&����%������������

���� ����������� �#� ���� ��� ��� �������� ��� �����7�� ����#������

���%��7���������##�������������7�������������+��� �%��&���������

���������������������&��������������������&��������������������

��������� ������� �� ���� �#����� ����&� ���� ��������� �##���

��������������������

)�������� ��������� ��S. pneumoniae ����������������7�

�7� � �� ��������&� ���������� ���� ��##����� �����7����� ����

)�3>� �����7��� �������� #���� ���� ������� �#� ������7����� ����

��������������������������0</&�0R/����0?/������������������&�

��� ������������������(������������7�1�����������������>�

(`�������&�0..R1����������7������������7���� ���������7��� ����

���/������/����7�������#������������������,83��=G�&�������

�7�����#����7 �# erm�������)��������,-���##���������7��������%��

���� ��������+� �� �%��� �� S. pneumoniae ���� ���%������

����7������������erm(>1�(`�������&�0..R1�������������������

����7���������#������S. pneumoniae� ���erm(�1�(3���p�p�et al.,

0..Q1�� =�������� ��� )�3>� ������������� ��7� ��� ��������%�� ���

�������� �� ��������� ���������� ���� erm ���� (`�������&� 0..R+�

4�����7���et al.&�,--@1��

<.�

Page 95: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�������������)������7��&����������������7�#��������

���������� �#� ���� mef(*1� ���� (��� ����� �����7� ���� mef(�1�

����7��1&��#������������� ���0</����0R/������������������&�

�������������������#����##��D������ ��������%����������������

#���� �������������(����������4���%���&�,--,1��E� �%��&�������

������� ���� ����������� ��� 0?/������������������&� �����������

����������������>��

������� ����� #������� �������� ����� �������� ���

������������#�������������<�����,,����������������������,83�

�=G�&� �������%�������������������#�����������������������������

(`�������&�0..R1��

>�������������erm����mef����������������7��������

�� �� ���� %�����7� �#� �I�����%�� ����������� ������ ����������

���������������G���������� �����%�������������(5=�1���������

���������&� ���� ������������#�����������#��� �����������&�

���� ���� �� ���� ������������ �� ���� ����� ��������� ��� �� ���

����#������ �7� �I������� ��� ������� ��������� (3��7���� et al.&�

0..R1��

���� ����� #������� ���������� ���7��� ���� erm(>1� ����

������������ �������Tn916� #����7������ ���� �����������#� �����#����7&�

����%�� #���� ����Tn916� ��������&� ����������� ���� tet()1����&�

�#������ �����7���/��������� q#������ ?r� (!����� ��� 4�� ���&�

0.Q01��!�����������&�����mef(*1��������������7���������7���������

������� ����� ����&� ���� ��������� �������� ������ �� ����

��������� ������ (���� J������ et al., ,--,+� J�7� ���

3������&�,--01��

R-�

Page 96: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

Figure 6. Chart of conjugative erm(B)-containing transposons detected in S. pneumoniae strains (from Varaldo et al., 2009).

)�������� ��������� ��� ��������� �� 4����� �� 0.?@+�

�� �%��&���������������0.Q-��������������������������� �(T8S1��

�#���� ���� ���������� �#� ���� ���#/��#�� ���������� ���� ���

��������7��������������7�&������� ������������#���������/

��������� ������ ��� �������� ���� ���� (L�����&� 0..-+� ��6����&�

0..,1��

G� ���7�&����������������������������������������

�� ������� ���&� ��������� ������ ���%����� %������ ������� ���

�����������������������������������������=�����%��7�#����

TRS���4����=����������>�������&����08S������������������

�%���8-S���!�������$3�(4����������et al., ,--<+�!���������

et al., ,--R+� B����� et al., ,--Q1�� ���� ��� ���� ����� ���������

R0�

Page 97: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

��������� ������&� ��������� ����������������� ����Q-S�(3���

et al., ,--<1�� 5� 3���&� �%������ ��������� ��������� ������ �����

�%���%�� �������� �������� ���� � RS� ����� 0.Q?&� ���� ����

�����������#�"4A@�#������������B���,--0���������I���������

�� ��������� ��������&� ���� ��� ���� �����7��� ����������� ����&�

����� �%���%�� ���������� �������&� �� ����#���� ������ ��

��7�����7�� ��������� ��� �����%��&� #���� <,�.S� �� ,--8� ���

,-�QS� �� ,--?� (!����� et al., ,--.1�� 5� ������&� ���������

��������� ������ ����� ������ �%���%�� �������� ��������

������� �%��� ����&� ��� ������ ,RS� (!����� et al., ,--.1�� �������

���������� #����� ��� ���� ������� �� ������ �#� �/��������� ���

�������� ��� ���������� #���� 8�@� ��� 0@S� ������ ���� ,---��

(!���������et al., ,--R1��

5.3. Fluoroquinolones.

���� ��������� ���� �� �����/�������� #����7� �#� �7������

�������������� ���� ��I����7� �#� ��������� ����� #��� ������

��������&������������#��D��&���%�#��D��������D�#��D��&���%��

�������������������#���#���������������������7�����7��������

4?� ���4@� �������������� ������� ��� �� ���� ���� #���������������

���������%��7� �������������&� ���� ���7����%����G���7��������7�

��������� �#� �G�� �7����� ��� �������������� 5A� (`��#��� ���

E�����&�0.Q.1��

5� �������&� ��������� ��� #�������������� ��� ����7�

��������� �7� ���������� �#� ������ ������������ ����� �������&� �����G��

�������������� 5A� (������7� ������1� ��� �G�� �7����� (������7�

������1�� =�������� ��� �������� �7� ����� ��������� ��� ���� ��� �7�

R,�

Page 98: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

��������#�� ��� ��������#�� ������������ ���� ������

Streptococcal� ������� (!�������� et al., ,---+� 3������� et al.,

,--R1��

����������� �� ������� "��4� ��� "��*&� �������� �#�

��������������5A&��#������������������������7�������#��D����

���������� ������ /��%�����������&��������#�����##��������������

������7�������� �������������������������� ��� ��%�#��D��������

���� ������ ����������������� ��� �� ������#� ���&� ���� �������

���� #����/����������������������� �����������������������������

������������J7�����������#������G���7����&��#�������������

��%��� �#� #������������� ��������� ���� ��� �������� ��� ���������

#���������������������#����������������#������������������%��/

�D���������#��##��D�����&��������7�����PmrA�����(J����et al.,

0...1��

� G� � ���������� �#� #�������������� (��%�#��D��� ���

��D�#��D��1� ��%�������� �������������������%��� ��� ������ ���

�������� �#� ��������� ��� ������ ������������&� ��������7� ������

��������� �������� ���������� 4������7&� ������ �#�

��������� #������������� ��������� ������ �� � �� ��7�

������&� ���� ���� �D������ �#� !����� (?�?S1&� 5���7� (@�,S1� ���

�������������������(!����������� &�,--R+�=������et al., ,--@1��

E� �%��&� ���� �������� ���� �#� ������ ������������� ���� ����

���������� ���� ���� �������� �#� ��������� �� S. pneumoniae

(4���et al., 0...1�� 5�3���&� ��������� �������#� �������� ���

����#��D��� ����������������%��� ���� ����� ������ (,�?S� ��,--,�

���,�8S���,--?1&������������������������#�"4A@�(������4�����

et al., ,--<+� ��� ��� 4����� et al., ,--.1�� )����%��&� ��������

���������#�����������������a?R�7�������� ���������������%�����

R8�

Page 99: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

�#� ����#��D��� ��������&� �������7� ��#������ ��������

#������������� ���� �� ����� ������ �#� ��������� !��� �����&�

�������� ���������#�����/�%���%��������� ���������������

������#�����%���%����������(��6�����et al�&�0...1��

=�������� ��� #�������������� �� �%��%�� ������7� ������

��������&� ��� ������ ���� �������� �������� �#� ��������� #��������

�������������#�#��������������������������#������������

�7� ������� ���� #����/�������������� (!������ ����� &�,--R1��������

������������������������������������������7����#������4H"����������

��� ������������� ��������� ����� ����� ��� �D������� �7� ����

#���������������������������������������� �������(a0-?�

4!$;��1� �����%��� �� ���� �� ��� ��� �7�� �#� �������� ����4H"�����

�����������&� ������7� ������ #��� ����������������� ��� ����

W=�=���#�S. pneumoniae �������(��%�����et al., ,--,1��

R<�

Page 100: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

6. Epidemiology of pneumococcal disease: impact of PCV7

5%���%�� ��������� �#������ ��%�� �� ��I��� �������

�����������������&��������������������������������#�������

�� �������� ��� �� �������� �#� ���� ������������� �#� "4A@� ��

������� �������������������� �� ��%����� �������&� �� ����� ��

���� �����������7� �#� ��������� �������� ���� ���� �����%����

����� %���� ���� �� ������� ������ �� ���� ������������ �#� �����7���

�����������������������7���&���� ����������������������/

���������(`����7�et al., ,--8+�L7� �et al., ,--?1��

3�%�� 7����� �#���� ���� ���������� �#� "4A@� �� ���� $�����

3�����&� ���� �������#� 5"�� �������� �� ��� ���� �������/%����

������&� ���� �� <RS� �������� #��� ���� ���� ������� ��� �� @?S�

�������� #��� ������� ����� TR� 7����� ("�����%���� et al., ,-0-1��

E� �%��&� ������������� �����������7��##�����7����� ���������5"��

������ �7� �/"4A@� �����7���� ��� �7� ���� �������� �#�

������������ ����� ���� ������� �#� �����/����� ��������� �����7���

0.�� ���� ���� ��� ���������7� ������&� #�������7� ���������� ����

#����������������������(>�����et al�&�,--?+�E����et al.,�,--@1��

���������������#�"4A@�����������������������������7�

�#� �������� ������� �7� ������7� �������� ����&� ����� �����

�%���%��"4A@� �����7���� ���� ��� ?>&� 0.!����,8!� ���� ����� ���

�������� �� ���� �������7D� �� ������� #��� ���� �������� �#� �����

��#���� ���� ���������� �#� "4A@� (>��������� et al., ,--8�1&�

��%����������������������������������������#�"4A@��������������&�

������7� �� ��� ���� RS� (E����� et al., ,-0-+� =��������� et al.,

,-0,+�`����et al., ,-081��E� �%��&����������������#������7���0.!�

�� ������7� ������� #���� "�������&� J����� ��� G�� �7&� ����7� ��

������ �#���� "4A@� ���������&� ��� ���������� (A��������� et al.,

RR�

Page 101: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

,-0-+� J��%��� et al.,� ,-00+� =��������� et al., ,-0,1�� ���� � �7�

%����������������� ���������7�#�������7��/%���������7���&�

����7�0.�&�?4&�0R>;4&�8&�,8�&�,8>����8R>�(E�����et al., ,-0-+�

=��������� et al., ,-0,+� `���� et al., ,-081�� 5� ������� ��� 5"��

������ �� ������&� �%������ �������� ������ ������ ������� �� ����

$����� 3������ ��� ���� $����� L������ (E����� et al., ,-0-+�

����%�� et al., ,-001+� �� �%��&� �� �� ����� ����7� ���#������ ��

4������&�"�������&����%��������������#����?0S���,--@����R0S�

��,--.� ��������%���(=���������et al.,�,-0,1��H��������������&�

�������� ���� �����7��� ���������&� ���� ������������ ���������

������ �#� �������� �������� ���� �������7D� �#� ������7�

������� �������� ������� �#����"4A@� ���������� (3������et

al., ,-001���

��� ����������%�&� ��3����"4A@� ������ ��������� ��

�����������������%��������������+��� �%��&�������������������

���%���� ������&� ��� �7� ,--?� ���� %���� ������� ���� �������

<RS/R-S� �#� ������� T,� 7����� ���� (J����� ��� �����I�� ��� ���

"��������=��������7�"�����������A����&�,--?1��������������

%��������������������� &��������������#�"4A@������7�������

���� �����7��� ���������� �������� ��� ����� �����%��� �� ����

����7� ����� ������� ���� 5"�� ()�6��/�������� et al., ,--Q1��

����� ��� �D������� �7� ���� ����� ��������&� �� #���� �#� �������

��������� #��� ���%������� ��� ��%�� ��� ����%��� ���� %���� ���

��%�������%�������������7����%������7�"4A@������

E���������������7������������������������������������

������������ !��� �����&� �� ������ �#� "4A@� �� ��������

����������� ������ 5"�� ��� �/5"�� �� ������� ����7� �%��� ?R�

7��������� �������������%���(�����7�et al., ,--.�+�!�����et al.,

R?�

Page 102: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

,-0,1� �%�� ������� ����� %���� ��� ��� ������� #��� ���� ������

�����������

���� ������� ���7�� �� ��������� ����� �� ���������

�������&� ��� #��� ����� �����&� ���� ��##������ �� ������������ �#�

�����7���� ������ 5"������/�%���%����������� �#������

�� ������� ����7� �� ��##����� ��%��� �#� ����� ��������� �7� "4A@�

(�����7� et al., ,--.�+� !����� et al., ,-0,1�� !��� �D�����&�

��##������ �� ���� ������ �#� "4A@� �����7���� ������ 5"�� ����

����� �����%��� ����� 7���� ������� ��� ������� �%��� ?<� 7����� ����

(�����7� et al., ,--.�+� J���� et al., ,-0,1�� ���� ������������

������� �#� ���� �������� ��� ����� ���������� ��##������ �� ����

������������ �#� �����7���� ������ 5"�� ���� �����%��� �� 7����

�������(0Q/?<�7��������1:� ���������7�������� ������������ ����

������� ����������������&��������#�����7��#������7����0&�@!����

R� (��� ������� �� "4A@1� ��� �����%��� ����� ������7� ������&�

������&� �����7���� 0.!� ��� ,8!� ���� ����� #�������7� #����

������������ �����������������(J����et al., ,-0,1��

3����7���0.�����������������������������7������������#�

�/5"�� �������� ���������#����"4A@� ���������� (�����7�et al.,

,--.�+�!�����et al., ,-0,1&� ��� ������8� ��� ���!����������&� ������

�����7���� ���� ��� 0R�&� 0-�� ��� ?4� ����� ��� � �� ����#����

������� ����� �/�%���%�� �#������ �� ���� ������ ����������

(!�����et al., ,-0,1��

R@�

Page 103: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I Table 3. Variation in percentages of pneumococcal

serotypes causing non-IPD in adult patients, between the pre- and post-PCV7 periods (source: Fenoll et al., 2012)

RQ�

Page 104: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5

INT

RO

DU

CT

ION

>�� ��� ���� 0.@-�� ��� 0..-�&� �� ����� ���%����� �#�

������������ ��������� ����� �������� ��� ���������

���� ���&� ��� �� ������� �#� �������� ������������ ���������

(B����� et al., 0.@Q+� L������ L"&� 0..-+� )����� B� et al., 0.Q8+�

!�������et al., 0..0+�����������et al., 0..,+��� ��*�et al., ,--R1���

�������������#������������� ��������� �������������

�������������������#������7������#�������&� �������������

���� ���������� �#� ����/��������� �������� ��#���� ����

�����������#�"4A@������������&�����7����������� ����"4A@�

�����7����.A&�?>&�0.!����,8!&� �����������������7�����")*G���

0..@� (��������� �� ������� 5&� ������ ,�81&� ���� ����� ���������

����� ����� 3���,8!/3�Q0� (")*G01&� 3���?>/3�.-� (")*G,1&�

3���.A/3�0R?� (")*G81&� *����0</3�.� (")*G.1&� ��� �0.!/

3�,8?�(")*G0<1&���� �,8!/3�,<,�(")*G0R1����"����?>/3�80R�

(")*G,-1� ()J��� et al., ,--01�� ������ ����� �#��� ��� ��� ��

������� ��������� ��� ����� ���� ��� �����������:� U/������

���������(���������������������">"�1&���������/&������7���/�

��� ������������/��������� (���� ��� ���� ������� �#�

���������� ���7��� ����������� �#� ��������1� ��;��� �������

��������� ��� �/�����D������ ()J��� et al., ,--0+� ��6����� et al.,

,-0-1�� E� �%��&� ���� ���%����� �#� ��������� ���������

��������� ��##���� ���������7� ����� �������� (��6����� et al.,

,-0-1��

������ �#� ������ �����#��� ����� (3���,8!/3�Q0&�3���?>/

3�.-����3���.A/3�0R?1� ���� #����� �����#���� ��3���� ()�6���et

al., 0..0+� 4�##�7� et al., 0..?1�� E� �%��&� ���7� ���� ����7�

������������ ����������� ���� ����&� ��� ���� ��������� �� $�����

3������()�6���et al., 0..0+�A������%��et al., 0..81&�3������������

R.�

Page 105: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

(4����6����et al., 0..Q1&������%�����*����������������������

!���&�$�����L�����&� 5���7����J����7�(��#C%���et al., 0..R+�

)�������et al., 0..Q+�=����� et al., ,--R1�� 5� ����$�����3�����&�

3���,8!/3�Q0� ������ <-S� �#� ���� �����7� �������/���������

�������� (4����� et al., 0..Q1&� ����� �����D������7� @RS� �#�

�����/����������������������#������������#�5�������������

��� *����0</3�.� (L��������� LJ&� 0..R1�� ����� ���&� ����������

���� mefA� ���� �#� ��������� ��������&� ������� �� ���� $�����

3�����&����*��������������������������$L&�J����7&�J�����

���5���7�(E����et al.,�0..?+�)����et al., ,--R+�)*���������et al.,

,--R+�%�����������et al., 2007; ��6�����et al. ,-0-1��5�������&�

�� 3���&� �����7��� 0<� ��� ������7� ���������� ���� ���� 3���.A/

3�0R?������

5� ���� $����� 3������ ��� ���� ����&� ���� ���������� �#�

"4A@� ��������� ���� �� �������� �� ������������ ���� ����

���������� ���� �� �������� �������� �� �%���%�� ���������

�#�������������7������7��������������7������%����(`����7�et

al., ,--81��5��������&�������#�����������������/��������������

�� 5"�� ��� ����� �����%��&� ��� �� �������� �#� ���� ������ ��

�����/�������������� ���������7�������������"4A@�(L7� �et al.,

,--?+� ����� ��� L�����&� ,--Q+� ��6����� et al., ,-0-1�� �����

�������� ���� ���� ��������7� ������� #��� ����� 3���,8!/3�Q0&�

3���?>/3�.-� ��� *����0</3�.+� �� ������&� 3���.A/3�0R?�

(�����7���� .A� ��� 0<1� ���� ���� ��I��� ����� �#� 5"�� �� ��7�

�������&��������#��������#���� ���� �����������#�"4A@�(%������

�����et al., ,--@+������7�et al., ,--.�+�K����et al., ,--.1. �

�E� �%��&��������/������##���%������#�"4A@�����������&�

��������������������������������������#��/"4A@������7�����

?-�

Page 106: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5 IN

TR

OD

UC

TIO

N

5� #��&� � � �������� �����7���� ��%�� ���� �������� �� ���� �����

"4A@� ������� �� ���� $����� 3������ (E���� et al.&� ,--@1�� 4������

�����%����������7����������7������������������%��������������

��� ���� �������� � ������ �������� ��;��� ���� �����7���

���������� �������� �7� �D������ �#� ���/�D������ ����� ���

�������������#�� ������(>7�����et al., ,--R+�>���������

et al., ,--@1����

����� ��� �� ������� ����� �#� ���� ������� ����� �#� ����

�������� �����7���&� ���� ��� 0.�&� ?4� ��� 0R�&� ���� ������7�

���������� ���� �����/����� ���������� 5� �������&� �����7���� ?4�

��� 0R�� ���� ��� ��������� �7� �7� �#� ���� ������ ���������

�I������ %������ H�� �D������ ��� ���� ���� ���� ��������

���%����� �#� �����/����� ��������� �����7��� 0.�&� �����%��� �� ����

$�����3�����&�*��������������()�����et al., ,--Q+������7�et al.,

,--.�+������et al., ,--.; )��I���/)������!�et al., ,--.+��������

et al., ,-0-+�E��et al., ,-001������� �����7���������������������

���� ���� ���� ���� ������� �#� 448,-&� �� ������/����� %������ �#�

��� �0.!/3�,8?�()�����et al., ,--Q+������7�et al., ,--.�+�E��et

al., ,-001����������� �����������������#� �������������#������

���������������������&����7��������ermB����mefE�����&����

����������������7�����������������������(tetM1+������������

��%�� ���� �������� ��� ���� ��������� ������� �,-0-&� ���� ���

������� �� ����� ���������/��������� ��������� �#� �����7��� 0.�� �#�

����������D�8,-�(����J������et al., ,--@1��������������������

�� ����������������������%��� �������*��������������&� ����

��I��� �����7��� 0.�� ���� �� *������ ��� 3�,@?&� �������� ���

������0</3�,8-� ()��I���/)������ !� et al., ,--.&� ������� et al.,

,-0-+�J��������et al., ,-0,1��

?0�

Page 107: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

5��������

CH

AP

TE

R I

������������7��� ������������������������������������

���������7���������������7���?4������������7�����������#�������

����������������������������������(B�����et al., ,--.1��5�3���&�

� ����I�������� ����#�������������� ���������7����?4�(=����et

al., ,-001�� ���� #����� ��&� 44,,<&� �������7� ��7� ��� ��� �������

������������7�����������&����������7�����������������%����������

��������/��������� ������������ ����� ���� ��� ���� �����

#�������7�����������3���&�����������������#��������������

�#� 5"�� �� ������ �������� �#� *������ ��� $����� 3������

( ��������+�J�����et al., ,-0-+�=����et al., ,-001������ �����

���&� 448Q?&� ��� �� ������� ����� %������ �#� "����?>/3�80R&� ���

����������3������,--@&����������� �����������������������&�

��������&� ��� �����7����� !� � ����� ���� �%�������� ������ ����

������������ �#� ����� ���� �� ������ �������� ��� �� ����� �#�

��������� �������+� �� �%��&� ��� ���� ���� #���� ��������

������7����������"��������(G����et al., ,--.1��

3 ���0R�/3�?8� ��� ������� �� ���� ")*G� (")*G,R1�

�������� ��� �� �������� �#� ���� ���� ���� ������� ��� ����

���������� ���������������������7�����������������������

������������7�������������E� �%��&�����#�����7������������#�5"��

��� �� � ��� ��� �������� ������7� ��������� ���� �������7D� �#� ������7�

������� ��� #���� ������� �������� �� ������ �������� ���� �/

�%���%����������(!�����et al., ,--.+�3������et al., ,-001�����������

���� 3 ���0R�/3�?8� ���� ��� ������7� �� ��������� �� ���� ���/

"4A@����&�������������#����������� ���� �����

?,�

Page 108: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

OBJECTIVES

Page 109: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

?<�

Page 110: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

H�I���%��

0� ��� ����7� ���� ��������� ��������7� �#� ����� �D���������� �

�������� ���� ��%���� 4H"�� ���� ��##����� #�����7� �#� ����

���������(,-0-/,-001�

,� ��� ���7��� ���� �7����� ��� ���������� ���������� �#� S.

pneumoniae� ������� ������ ����� �D���������� ��

�������� (��������������/���������1� ���������� ���

4H"�&�#����,--0����,--Q�

8� ��� �%������� ���� ������ �#� "4A@� �� ���� ��������

�����������������������D���������&�#����,--0����,-0,��

<� ��� ���������� ���� #�����7� ��� ������������ �#� �������

������ �������� ��������:� �������� vs�� ���#����� ��������

(0..R/,-0-1�

R� ��� �%��������� ������������� ���������� �� ���� ����������7

����� �#� 4H"�� �������&� ��� ���� ��� ���� ������ �#� �����������

��������� �� ���� ��%�������� �#� ������������ ��������

(0..R/,-0-1�

?� ��� ����������� S. pseudopneumoniae ������ ������ ����

�D���������� �7� �����7��� ��� ����7��� �������� (,--0/

,--.1��

@� ��� ���7��� ���� ������ ��� ����������� ������������� �#

4H"�����������#������7�S. pseudopneumoniae (,--0/,-0,1�

?R�

Page 111: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

??�

Page 112: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RESULTS

Page 113: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

?Q�

Page 114: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

CHAPTER II: 5#���������������7�

�#�������D��������������������

������%����4H"��

Objective 1: ��� ����7� ���� ��������� ��������7� �#�

����� �D���������� �� �������� ���� ��%���� 4H"��

���� ��##����� #�����7� �#� ����� ��������� (,-0-/

,-001��

��������&�"����4&�)�����3&�3�����3&�!��������&�4�����7���

�&� ����� B&� �����7� 4&� ��6����� B�� 5#������� *������7� �#� �����

*D���������� ��4H"��"������� ����3�%�������#�� �H����������

3������������B�������#�5#�����

Page 115: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

Page 116: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������55�

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

@0�

Infectious etiology of acute exacerbationsin severe COPD patients

Arnau Domenech a,b,d, Carmen Puig a,b,d, Sara Martı a,b,Salud Santos b,c, Anabel Fern�andez a, Laura Calatayud a,b,Jordi Dorca b,c, Carmen Ardanuy a,b, Josefina Li~nares a,b,*

aDepartment of Microbiology, Hospital Universitari de Bellvitge, IDIBELL, University of Barcelona,Barcelona, SpainbCIBERES (Ciber de Enfermedades Respiratorias), ISCIII, Madrid, SpaincDepartment of Respiratory Medicine, Hospital Universitari de Bellvitge, IDIBELL,University of Barcelona, Barcelona, Spain

Accepted 3 September 2013Available online 20 September 2013

KEYWORDSChronic obstructivepulmonary disease;Acute exacerbation;Pseudomonasaeruginosa;Streptococcuspneumoniae;Haemophilus influenzae

Summary Objectives: Since the new GOLD guidelines were implemented no data have beenpublished about the etiology of acute exacerbations (AECOPD) in severe COPD patients with adifferent frequency of annual episodes.Methods: One hundred and eleven COPD patients (FEV1 < 50%) were prospectively followed upfor a year. Good-quality sputum samples recovered during AECOPD were processed, includingquantitative culture and PCR detection of atypical bacteria.Results: A total of 188 sputum samples were obtained from AECOPD episodes. Forty patientshad a single episode, and 71 patients had �2.

In 128 episodes a single pathogenwas isolated,while 42 episodeswere polymicrobial (�2 path-ogens). Overall, themost frequent pathogen isolatedwas Pseudomonas aeruginosa (nZ 54), fol-lowed by Haemophilus influenzae (n Z 37), Streptococcus pneumoniae (n Z 31), Moraxellacatarrhalis (n Z 29) and Staphylococcus aureus (n Z 12). P. aeruginosa was the most frequentin both groups of patients (35% and 27% in those with 1 and �2 AECOPD, respectively). H. influ-enzae was associated with patients with a single annual AECOPD (33% vs. 16%; PZ 0.006), whileEnterobacteriaceae were associated with frequent exacerbators (0% vs. 12%; P < 0.044).Conclusion: Overall, P. aeruginosawas the most frequent pathogen isolated from exacerbations.However, different bacterial etiologywas observed depending on the number of annual episodes.ª 2013 The British Infection Association. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

* Corresponding author. Department of Microbiology, Hospital Universitari de Bellvitge, Feixa Llarga s/n, 08907 L’Hospitalet de Llobregat,Barcelona, Spain. Tel.: þ34 932607930.

E-mail addresses: [email protected], [email protected] (J. Li~nares).d These authors contributed equally to this work.

0163-4453/$36 ª 2013 The British Infection Association. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2013.09.003

www.elsevierhealth.com/journals/jinf

Journal of Infection (2013) 67, 516e523

Page 117: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

@,�

Introduction

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a cause ofhigh morbidity and mortality in developed countries.1 Ac-cording to the latest World Health Organization (WHO)report, 64 million people had COPD in 2004, and 3 millionof them died (http://www.goldcopd.org). In Spain, theprevalence of COPD among people aged between 40 and80 years is 10.2%, reaching 23% in those older than 60.2

Acute exacerbations of COPD (AECOPD) contribute tothe progress of the disease, are indicators of poor prog-nosis, and are associated with enormous health care costs.2

Up to 80% of AECOPD are caused by microbial pathogens,including bacteria, viruses, atypical bacteria, and fungi.Air pollution and other environmental conditions probablyaccount for the remaining 20%.3,4

AECOPD exacerbations are mainly caused by bacteria,with Haemophilus influenzae being the most frequently iso-lated, followed by Streptococcus pneumoniae and Morax-ella catarrhalis. However, the bacterial pathogen alsovaries according to the severity of the illness, with Pseudo-monas aeruginosa being particularly common in patientswith advanced disease.4e6 Notably, little information isavailable about AECOPD caused by more than one poten-tially pathogenic bacterium.6

AECOPD can also be caused by viruses, fungi, andatypical bacteria such as Mycoplasma pneumoniae andChlamydophila pneumoniae, although their pathogenicrole is controversial.7,8 Several studies have analyzed therole of C. pneumoniae in exacerbations, with conflicting re-sults and considerable variability (from 0% to 34%) depend-ing on the detection techniques used.8

Patients with severe and very severe COPD, classified bythe Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease(GOLD) as degrees III and IV, usually have several AECOPDper year.9,10 However, a recent method based on the indi-vidual patient’s history of exacerbations assesses the riskof symptomatology and poor outcomes, classifying patientsinto four groups, AeD, with groups C and D being those withthe highest risk of suffering AECOPD (www.goldcopd.org).

It should also be noted that patients with frequentexacerbations receive multiple courses of antimicrobialtherapy which select resistant microorganisms. The optimaltherapy is a multidisciplinary choice that remains controver-sial, with variations among different guidelines.9 Choosingthe most suitable antimicrobial is therefore important in or-der to avoid the acquisition of resistance, especially in poly-microbial exacerbations. In this context, the acquisition offluoroquinolone resistance in isolates of P. aeruginosa, H. in-fluenzae, and S. pneumoniaehasbeenwidely described.11e14

Since the new GOLD guidelines were implemented therehave been no reports based on data gleaned from sputumcultures of COPD patients with a low or high frequency ofannual AECOPD. Therefore, the present study aimed todetermine the microbial etiology of AECOPD in 111 patientswith advanced airway obstruction and who suffered mod-erate or severe AECOPD episodes. In addition, and with theaim of contributing more specific knowledge for patientmanagement, we also analyzed the microbial etiologyaccording to whether patients had a single episode orfrequent exacerbations during the study period.

Methods

Ethical statement

This study and publication of the results were approved bythe “Comite �Etic d’Investigacio� Clınica de l’Hospital Uni-versitari de Bellvitge (HUB)”. Sputum samples and bacterialstrains were recorded in an anonymized database.

Patient selection

Sputum samples were prospectively collected from allpatients with severe COPD (FEV1 < 50% and baseline dys-pnea CFIII-IV according to Medical Research Councilcriteria) who were seen in the specialist COPD consultingroom of the Respiratory Medicine Department at HUB be-tween February 2010 and February 2011.

COPD was assessed with chest radiography and CT scanat recruitment to ensure the absence of other significantrespiratory disease. Patients with high comorbidity (Charl-son index �5), immunodeficiency, terminal malignancy, orother chronic respiratory diseases (evidence of bronchiec-tasis not associated with COPD, asthma, or bronchialinterstitial lung disease) were excluded.15 In addition, AE-COPD episodes related to cardiac failure of the patient orother non-infectious causes were also excluded from thestudy.

Following the criteria set out in the new GOLD guide-lines, patients were assigned to one of two groups based onthe number of acute exacerbations suffered during thestudy period. Thus, those with fewer than two AECOPDepisodes were classified as patients with infrequent exac-erbations, while those with two or more episodes during thestudy period were considered as frequent exacerbators.2,10

An acute exacerbation episode was defined as any sus-tained increase in respiratory symptomatology comparedwith the baseline situation that required a modification ofregular medication and, possibly, hospital treatment.Hence, acute exacerbations were considered as eithermoderate (not requiring hospitalization) or severe (requiringhospitalization). In those patients with more than oneAECOPD a new episode was only considered when theinterval between episodes was more than four weeks andthe second episode occurred after a successful outcome.

Sputum collection and bacterial load detection

Sputum samples were recovered during the AECOPD epi-sodes, before the antimicrobial treatment, if it was neces-sary. Only good-quality sputum samples were considered(<10 squamous cells and >25 leukocytes per low-powerfield),16 and all samples were cultured within 4 h of beingcollected. Briefly, samples were homogenized with dithio-threitol (Sputolysin), and after performing serial dilutions(1:10�1, 1:10�2, and 1:10�3) they were plated onto bloodagar, chocolate agar, and MacConkey agar before being incu-bated overnight at 37 �C in a 5%-CO2 atmosphere (blood andchocolate agar) and ambient air atmosphere (MacConkeyagar). After incubation, colony-forming units (cfu/ml) werecalculated and sub-cultured for bacterial identification by

2 A. Domenech et al.

Page 118: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������55�

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

@8�

standard methods.17 Only isolates with a count �106 cfu/mlwere considered. If P. aeruginosa, H. influenzae, M. catar-rhalis, or S. pneumoniae was present, up to 8 individual col-onies of each bacterial species were isolated and saved asfrozen stocks at �80 �C.

Mass spectrometry analysis

Isolates classified as Corynebacteriaceae, as well as the iso-lates of the genus Candida, were further identified by massspectrometry analysis in order to identify the species.Briefly, a single bacterial colony was placed on a polishedsteel MSP 96-target plate (Bruker Daltonics GmbH, Bremen,Germany), overlaid with 1 ml of formic acid, and dried atroom temperature. The samples were covered with 1 mlof matrix solution (a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid in50% acetonitrile-2.5% trifluoroacetic acid) and were driedagain at room temperature. Identification was performedusing the MALDI Biotyper version 3.0 software (Bruker). Cor-rect identification to the species level was accepted whenthe score was �2.

Atypical bacteria detection

The possible presence of atypical bacteria C. pneumoniaeand M. pneumoniae was analyzed in all the sputum samplesby real-time PCR. DNA was extracted using a magnetic par-ticles protocol (Sample Preparation Systems RNA and DNA,Promega, Abbott, USA). Upon DNA extraction from thesputum samples, two different monoplex real-time PCRwere performed, as described previously.18 Commerciallyavailable DNA controls were used in each run (Vircell, Gran-ada, Spain).

Antimicrobial susceptibility, serotyping, andmolecular typing

The antimicrobial susceptibility to the frequent antibioticsused for the treatment of each bacterial pathogen wastested by microdilution and/or the disk diffusion method,following the Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI)recommendations.19

Serotyping of H. influenzae strains was performed usingthe latex agglutination kit Phadebact� Haemophilus Test(Bactus AB, Huddinge, Sweden), while S. pneumoniae iso-lates were determined by means of a multiplex PCR proto-col using previously described methodology.20

Molecular typing of H. influenzae, S. pneumoniae, P.aeruginosa, and M. catarrhalis was performed by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Genomic DNA embeddedin agarose plugs was restricted with SmaI (S. pneumoniaeand H. influenzae) or SpeI (P. aeruginosa and M. catarrha-lis), and fragments were separated in a CHEF-DRIII appa-ratus (Bio-Rad), as previously described.21

Statistical analysis

Statistical analyses were carried out using SPSS version18.0, using Chi-square or Fisher’s exact tests to compareproportions. Two-sided P values less than 0.05 were consid-ered statistically significant.

Results

During the study period a total of 224 AECOPD episodesoccurred in 111 COPD patients seen at the MonographicCOPD consulting room. A sputum sample from each wassent to the laboratory. Of these, 36 low quality sputumsamples (�10 epithelial cells per low-power field) wereexcluded from the analysis.

Table 1 shows the clinical characteristics of patients.The mean age was 70 years, and the majority of them(95.5%) were men. Clinical data of patients were comparedbased on the frequency of acute exacerbations sufferedduring the study period. This revealed no differences be-tween the two patient groups (infrequent vs. frequent ex-acerbators) as regards lung functional and analyticalcharacteristics. The presence of bronchiectasis not associ-ated with COPD was an exclusion criterion. However, as aresult of the severity of the patients included in the presentstudy, nearly a half of them developed bronchiectasis, as itis shown in Table 1. This comorbidity was associated withpatients with more than one AECOPD episode (P Z 0.007).

All patients were continuously treated with inhaledcorticosteroids, long-acting beta-agonists, and anticholin-ergics for COPD management.

One half of AECOPD episodes (n Z 94) required hospitali-zation of the patient. However, the presence of more thanone potential pathogen in the sputum sample was not associ-ated with higher rates of hospitalization (P Z 0.642).Regarding thebacterial distribution, nopathogenwas relatedto the need for hospitalization, although Streptococcus pseu-dopneumoniae was associated with those moderate acuteexacerbations that did not require hospitalization, a findingthat could explain their limited pathogenic role (P < 0.02).

Isolation of potentially pathogenic bacteria

Among the 188 good-quality sputum samples that wereprocessed and obtained from 111 patients, significantbacterial counts were observed in 170 (90.4%) episodes(Table 2). Of these, 42 (22.3%) showed more than one po-tential pathogen (Table S1). In the remaining 18 episodes(9.6%) no microorganisms were detected with >106 cfu/ml, and they were therefore considered episodes withnormal oral microbiota.

The most frequent pathogen isolated was P. aeruginosa(28.7%), followed by H. influenzae (19.7%), S. pneumoniae(16.5%), and M. catarrhalis (15.4%). Notably, at least one ofthese four pathogenswas isolated in 125 (66.5%) of theoverallepisodes studied. Other less widely reported pathogens werealso frequently recovered in our study (Table 2): Staphylo-coccus aureus (n Z 12, 6.4%), S. pseudopneumoniae (n Z 9,4.8%), and some species of the Enterobacteriaceae (n Z 19,10.1%) and Corynebacteriaceae (n Z 10, 5.3%) families.

In all but one of the polymicrobial episodes (n Z 42), atleast one of the following pathogens was recovered: P. aer-uginosa, H. influenzae, S. pneumoniae, or M. catarrhalis.The most frequent combination was S. pneumoniae plusH. influenzae (11.9%).

Fig. 1 shows the distribution of the main bacteriaisolated from patients with a single AECOPD episode(n Z 40 patients/episodes) and the remainder (n Z 71)

Infectious AECOPD in severe COPD patients 3

Page 119: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

@<�

Table 1 Clinical and demographic characteristics of the 111 COPD patients included.

Total (n Z 111)a Patients with asingle episode (n Z 40)

Patients with �2 acuteexacerbations (n Z 71)

p-Value

Gender, men 106 (95.5%) 40 (100%) 66 (93.0%) 0.198Age, years 70.1 � 6.7 67.7 � 5.9 70.5 � 6.9 0.055BMI, kg/m2 26.6 � 5.1 27.1 � 6.3 26.4 � 4.6 0.527Current smoker, n (%) 20 (18.0%) 12 (30.0%) 8 (11.3%) 0.020

Number of exacerbations 188 40 148 e

AECOPD requiring hospitalization 94 (50.0%) 22 (55.0%) 72 (48.6%) 0.674Long-term oxygen therapy 59 (53.2%) 16 (40.0%) 43 (60.6%) 0.076Lung functional and analytical characteristics (average % � SD):

FEV1, L 0.94 � 0.3 0.98 � 0.3 0.92 � 0.3 0.283FEV1, % 35.8 � 11.1 34.7 � 10.3 36.5 � 11.6 0.441FVC, L 2.34 � 0.7 2.35 � 0.6 2.31 � 0.7 0.774FVC, % 68.9 � 20.5 66.6 � 18.0 70.0 � 21.9 0.431FEV1/FVC, % 41.7 � 11.4 43.5 � 12.6 41.0 � 10.8 0.316

Underlying conditions (number of patients, %):Bronchiectasisb 46 (41.4%) 10 (25.0%) 36 (50.7%) 0.007

56 (50.5%) 22 (55.0%) 34 (47.9%) 0.56911 (9.9%) 4 (10.0%) 7 (9.9%) 1.00022 (19.8%) 11 (27.5%) 11 (15.5%) 0.3494 (3.6%) 0 (0.0%) 4 (5.6%) 0.12937 (33.3%) 13 (32.5%) 24 (33.8%) 0.8907 (6.3) 5 (12.5%) 2 (2.8%) 0.248

Systemic arterial hypertensionObesityAlcohol abusersCirrhosisCardiovascular diseasePulmonary cancer developmentDiabetes mellitus 28 (25.2%) 13 (32.5%) 15 (21.1%) 0.203

Definition of abbreviations: BMI Z body mass index; FEV1 Z forced expiratory volume in 1 s; FCV Z forced vital capacity. Bold valuesmean statistically significant differences (P < 0.05) between both groups of patients.

a The overall 111 patients were divided in patients with low frequency of AECOPD (a single episode) and high frequency of AECOPD(�2 episodes).

b Bronchiectasis associated with COPD, observed in high-resolution computed tomography scan.

Table 2 Microbial pathogens isolated among 188 acute exacerbation episodes analyzed, with >106 cfu/ml of sputum sample.a

Total number ofepisodes (n Z 188)

No. of episodes witha single pathogen (n Z 128)

No. of episodes with �2pathogen (n Z 42)

Potential pathogen bacteria

54 (28.7%) 33 (25.8%) 21 (50.0%)37 (19.7%) 24 (18.8%) 13 (31.0%)31 (16.5%) 13 (10.2%) 18 (42.9%)29 (15.4%) 14 (10.9%) 15 (35.7%)12 (6.4%) 10 (7.8%) 2 (4.8%)

Pseudomonas aeruginosaHaemophilus influenzaeStreptococcus pneumoniaeMoraxella catarrhalisStaphylococcus aureusb

Enterobacteriaceae 19 (10.1%) 15 (11.7%) 4 (9.5%)Escherichia coli 8 (4.3%) 6 (4.7%) 2 (4.8%)

7 (3.7%) 7 (5.5%) 0Proteus mirabilisCorynebacteriaceae 10 (5.3%) 3 (2.3%) 7 (17.1%)

5 (2.7%) 1 (0.8%) 4 (9.5%)2 (1.1%) 1 (0.8%) 1 (2.4%)

C. striatumC. pseudodiphteriticumC. propinquum 2 (1.1%) 1 (0.8%) 1 (2.4%)

Other bacteria

9 (4.8%) 4 (3.1%) 5 (11.9%)2 (1.1%) 1 (0.8%) 1 (2.4%)

Streptococcus pseudopneumoniaeStenotrophomonas maltophiliaAlcaligenes xylosoxidans 2 (1.1%) 1 (0.8%) 1 (2.4%)

Fungi

Candida albicans 4 (2.1%) 2 (1.6%) 2 (4.8%)5 (2.7%) 5 (3.9%) 0Aspergillus fumigatus

Normal oral microbiota 18 (9.6%)a Only pathogens detected in more than two sputum samples were detailed in this table.b A half of the S. aureus isolated were caused by a meticillin-resistant isolate (MRSA).

4 A. Domenech et al.

Page 120: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������55�

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

@R�

who presented frequent exacerbations (n Z 148 episodes).P. aeruginosa was the most frequent pathogen isolated inboth groups. The presence of H. influenzae was associatedwith patients with a single AECOPD (P Z 0.006), while En-terobacteriaceae species were only isolated from patientswith a high frequency of exacerbations (P < 0.05).

Antimicrobial susceptibility of the main bacterialpathogens

Table 3 shows the in vitro antimicrobial susceptibility of thefour main pathogens isolated. P. aeruginosa strains showedhigh susceptibility to carbapenems (around 90%) and anti-pseudomonal cephalosporins (80e90%). However, suscepti-bility rates were lower with respect to ciprofloxacin (50%)and aminoglycosides (42.6% for gentamicin, 74.1% for to-bramycin, and 66.7% for amikacin).

H. influenzae isolates were highly susceptible to all theantimicrobials tested, and only two isolates harbored abeta-lactamase. By contrast, all M. catarrhalis isolates car-ried a beta-lactamase that conferred penicillin and ampi-cillin resistance but which were 100% susceptible to theremaining antimicrobials studied.

All S. pneumoniae isolates were susceptible to fluoroqui-nolones and beta-lactams (according to non-meningealbreakpoints of CLSI), but susceptibility rates were low formacrolides, tetracycline, and co-trimoxazole (61.3%, 67.7,and 74.2%, respectively).

Serotyping and molecular typing of the mainbacterial pathogens

The most frequent serotypes of S. pneumoniae isolateswere 6C (n Z 5), 15A (n Z 4), 3 (n Z 3), and 9V (n Z 3).All 37 H. influenzae isolates were non-capsulated (non-typ-ables by latex agglutination).

Seventeen of 111 patients had two or more consecutiveAECOPD episodes caused by the same bacterial species:

nine patients with P. aeruginosa, four with S. pneumoniae,two with H. influenzae, and two with M. catarrhalis.

The molecular typing analysis of the P. aeruginosa stud-ied (n Z 54 from 37 patients) revealed different PFGE pat-terns (unique PFGE pattern per patient).

Inorder todetectpersistent strains themolecular typingofthese isolates was compared, showing differences by species.For instance, all P. aeruginosa strainswerepersistent, as illus-trated by the identical PFGE profile observed among all iso-lates collected from the same patient in consecutiveAECOPD episodes. One of two patients with H. influenzaehad an identical PFGE pattern in all episodes (persistence),as did one of four patients with S. pneumoniae. No persis-tence was detected among M. catarrhalis isolates.

Atypical bacteria and fungi detection

DNA detection of C. pneumoniae was positive in 84 (44.7%)samples, 77 of which were detected in samples in which atleast one other pathogen was isolated. In the remainingseven samples, C. pneumoniae was the only potential path-ogen detected. When patients with one annual AECOPDepisode were compared with patients with �2 episodes,rates of C. pneumoniae positive samples were similar(42.5% vs. 45.3%).

M. pneumoniae was only detected in two AECOPD epi-sodes of two patients. In both cases, �2 pathogenic bacte-ria were isolated from the same sputum sample.

Regarding fungi isolation, Aspergillus fumigatus growthwas observed in five samples, all with negative bacteriagrowth, while Candida albicans was isolated in four cases,two of them as a single pathogen.

Discussion

The microbial etiology of COPD patients has been analyzedin several studies, often including patients with differentdegrees of severity.5,6,22 However, few data have been

Figure 1 Distribution of the main bacteria isolated from patients with a low frequency (black bars) and high frequency (whitebars) of acute exacerbations. *Significant differences between groups (P < 0.05).

Infectious AECOPD in severe COPD patients 5

Page 121: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

@?�

reported since publication of the GOLD guidelines for bet-ter patient management, and this lack of information isespecially notable as regards patients with advanced dis-ease (http://www.goldcopd.org). Our study, based onsputum culture and real-time PCR, evaluates the etiologyand microbial load of 188 AECOPD that occurred in 111COPD patients with advanced airway obstruction, andwho suffered moderate or severe AECOPD. During the studyperiod (one year) we also analyzed microbiological differ-ences between patients who suffered just one AECOPDepisode and those with a high frequency of AECOPD. Theclinical and demographic data showed that these twogroups of patients were very similar, since all patientswere elderly and had similar lung functionality and under-lying conditions (Charlson index <5).

Overall, our study identified potential pathogens in90.4% of AECOPD episodes, with 22.3% of episodes beingcaused by more than one pathogen. These rates are higherthan previously described.6,22,23 The fact that AECOPD epi-sodes related to cardiac failure of the patient or other non-

infectious causes were excluded from our study may ac-count for the increased proportion of samples with poten-tial pathogens.

In contrast to all previously published data, P. aerugi-nosa was the most frequent pathogen isolated from AECOPDin our series.3e6,22,23 This confirms the important roleplayed by P. aeruginosa as a cause of AECOPD in patientswith advanced disease. In fact, a third of our patients suf-fered an AECOPD caused by this pathogen at any time. Themolecular typing analysis ruled out the possibility of cross-infection between patients attended in our ConsultingRoom, because all P. aeruginosa isolates studied haddifferent PFGE patterns (unique PFGE pattern per patient).

The presence of P. aeruginosa has been associated withthe presence of bronchiectasis.3e5 In the present study, weexcluded patients with evident bronchiectasis not associ-ated with COPD (bronchiectasis found in CT previous todevelopment of COPD); however, nearly a half of patientsdeveloped bronchiectasis associated with the severity ofthe COPD. Nevertheless, among the 37 patients with

Table 3 A: In vitro activity of eleven antimicrobials against H. influenzae, S. pneumoniae and M. catarrhalis isolated fromsputum samples during acute exacerbation episodes of patients with severe COPD. B: In vitro activity of eleven antimicrobialsagainst P. aeruginosa isolates.

A

Antimicrobial Susceptibility (%)

S. pneumoniae (n Z 31)a H. influenzae (n Z 37) M. catarrhalis (n Z 29)

100% NT 0%100% 94.6% 0%100% 100% 100%NT 97.3% 100%100% 100% 100%67.7% 97.3% 100%61.3% NT 100%71.0% NT NT74.2% 83.7% 100%100% 100% 100%

PenicillinAmpicillinb

Amoxicillin/clavulanic acidCefuroximeCefotaxime/CeftriaxoneTetracyclineErythromycinClindamycinCo-trimoxazoleCiprofloxacinChloramphenicol 96.8% 100% 100%

B

Antimicrobial Susceptibility (%)

P. aeruginosa (n Z 54)

88.9%88.9%83.3%81.5%81.5%87.0%90.7%50.0%42.6%74.1%

TicarcillinPiperacillin/tazobactamCeftazidimeCefepimeAztreonamImipenemMeropenemCiprofloxacinGentamicinTobramycinAmikacin 66.7%

NT Z Not tested.a For S. pneumoniae non-meningeal CLSI breakpoints for parenteral drugs were used: penicillin (susceptible �2 mg/L), ampicillin (sus-

ceptible �2 mg/L) and cefotaxime/ceftriaxone (susceptible �1 mg/L).b A beta-lactamase was detected in 2 H. influenzae isolates (5.4%) and all 29 M. catarrhalis isolates (100%).

6 A. Domenech et al.

Page 122: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������55�

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

@@�

AECOPD caused by P. aeruginosa, only a half of themshowed evidence of bronchiectasis (P Z 1.000). In thisway, bronchiectasis were only found in two of the nine pa-tients who were persistently colonized by P. aeruginosa.

The high frequency of P. aeruginosa found in this studyis important because GOLD guidelines recommend aninitial empirical treatment with an aminopenicillin withor without clavulanic acid, macrolide or tetracycline,which are not active against P. aeruginosa. For this reason,in severe COPD patients an empirical anti-pseudomonaltreatment should be taken into account, irrespective ofthe number of annual exacerbation episodes. The antimi-crobial choice should be based on the local bacterial resis-tance pattern. In this way, the high rates of resistance tociprofloxacin among P. aeruginosa isolates found precludethe empirical use of fluoroquinolones in our geographicalarea.

The frequencies of H. influenzae, S. pneumoniae, andM. catarrhalis as etiological agents of AECOPD were similarto previous reports,3e6,22,23 and their antimicrobial suscep-tibility was fairly consistent with published findings.24e26 Inour series, only 5.4% of H. influenzae isolates harbored abeta-lactamase, which coincides with the importantdecrease observed in Spain over the last decade.25 Howev-er, all M. catarrhalis produced beta-lactamase, this beingsimilar to what was found among isolates recovered fromthe general population in the USA, although it is muchhigher than the rate reported (54.5%) in a study performedin Hong Kong among isolates recovered from AECOPD.6

In the present study the frequency of S. aureus and En-terobacteriaceae species was also similar to previous re-ports.6 However, few data are available about thepathogenic role of S. pseudopneumoniae and Corynebacter-iaceae species. Indeed, the clinical relevance of S. pseu-dopneumoniae has not been clearly established, althoughsome authors have shown a possible association withCOPD.27 Among our patients, in a half of AECOPD with pres-ence of S. pseudopneumoniae, it was isolated as a singlepathogen, suggesting it may have a role as a causativeagent of moderate episodes that do not require the pa-tient’s hospitalization. Corynebacteriaceae species havebeen recognized as opportunistic pathogens, although un-der specific circumstances they can cause disease.28 Inour series, a high bacterial load of Corynebacteriaceae spe-cies was detected in 10 episodes of AECOPD, and in 3 ofthem it was a single potential pathogen. The most frequentspecies found, Corynebacterium striatum and Corynebac-terium pseudodiphteriticum, have been previously re-ported as etiological agents of respiratory infections.28

A correlation between deterioration of lung function andthe distribution of microbial etiology has been reported.6,22

However, our study revealed that even among patients withidentical airflow obstruction, H. influenzae was associatedwith patients with a low frequency of AECOPD episodes,while Enterobacteriaceae species were only detected in pa-tients with frequent exacerbations. It could be explainedby the frequent treatment with amoxicillin-clavulanicacid and fluoroquinolones due to the multiple AECOPD epi-sodes (data not shown), but also by the presence of bron-chiectasis associated with COPD in two thirds of thesepatients. No differences were observed among the distribu-tions of the remaining pathogens.

Notably, C. pneumoniae was detected in almost 50% ofAECOPD episodes, a higher frequency than previously re-ported.8 The fact that we used PCR to detect this speciesin sputum samples could have led to an overestimate ofits frequency, although one previous study showed a highcorrelation between PCR detection in respiratory samplesand serological methods.29 In addition, a study performedin the chinchilla model of otitis media demonstrated thatpurified DNA was quickly cleared from the respiratory tract,suggesting that bacterial DNA present in respiratory sam-ples such as sputum indicates the presence of viable bacte-ria.30 Further studies using both serological and molecularmethods are needed in order to elucidate the pathogenicrole of this species in patients with an advanced airwayobstruction.

To conclude, the present study confirms that P. aerugi-nosa plays an important role in causing AECOPD in patientswith an advanced airflow obstruction. It should also benoted that a fifth of the exacerbations in our patientswith severe COPD were polymicrobial. Although the fre-quency of bacteria causing exacerbations is known todepend in part on the severity of airflow obstruction, ourresults also suggest that the bacterial etiological agentsalso depend on the number of annual episodes in patientswith identical airflow obstruction. This fact, togetherwith the high number of polymicrobial infections, shouldbe taken into account when assessing how best to managethese patients, not least so as to prevent symptom progres-sion and improve their quality of life.

Funding

This work was supported by grants from the Fondo deInvestigaciones Sanitarias de la Seguridad Social [PI0901904] and by CIBER de Enfermedades Respiratorias, CI-BERES; [CB06/06/0037], run by the Instituto de Salud CarlosIII (ISCIII), Madrid, Spain.

AD and CP were supported by two grants from Formaci�onde Profesorado Universitario (FPU; Ministerio de Educaci�on,Spain). SM was supported by a “Sara Borrell postdoctoralcontract CD10/00298” from the Instituto de Salud CarlosIII (ISCIII), Madrid, Spain.

Transparency declarations

None to declare.

Acknowledgments

We wish to thank Jordi Niub�o and Dolors Garcıa-Somoza ofthe Microbiology Laboratory and Maria Jose Manuel of theRespiratory Medicine Department of the Hospital Universi-tari de Bellvitge for their contributions to this project on adaily basis.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data related to this article can be foundonline at http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2013.09.003.

Infectious AECOPD in severe COPD patients 7

Page 123: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

@Q�

References

1. Buist AS, McBurnie MA, Vollmer WM, Gillespie S, Burney P,Mannino DM, et al. International variation in the prevalenceof COPD (the BOLD Study): a population-based prevalencestudy. Lancet 2007;370:741e50.

2. Miravitlles M, Ferrer M, Pont A, Zalacain R, Alvarez-Sala JL,Masa F, et al. Effect of exacerbations on quality of life in pa-tients with chronic obstructive pulmonary disease: a 2 yearfollow up study. Thorax 2004;59:387e95.

3. Sethi S, Murphy TF. Infection in the pathogenesis and course ofchronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2008;359:2355e65.

4. Decramer M, Janssens W, Miravitlles M. Chronic obstructivepulmonary disease. Lancet 2012;379:1341e51.

5. Eller J, Ede A, Schaberg T, Niederman MS, Mauch H, Lode H.Infective exacerbations of chronic bronchitis: relation betweenbacteriologic etiology and lung function. Chest 1998;113:1542e8.

6. Ko FW, Ip M, Chan PK, Fok JP, Chan MC, Ngai JC, et al. A 1-yearprospective study of the infectious etiology in patients hospi-talized with acute exacerbations of COPD. Chest 2007;131:44e52.

7. Lieberman D, Lieberman D, Ben-Yaakov M, Shmarkov O,Gelfer Y, Varshavsky R, et al. Serological evidence of Myco-plasma pneumoniae infection in acute exacerbation of COPD.Diagn Microbiol Infect Dis 2002;44:1e6.

8. Papaetis GS, Anastasakou E, Orphanidou D. Chlamydophilapneumoniae infection and COPD: more evidence for lack of ev-idence? Eur J Intern Med 2009;20:579e85.

9. Anzueto A, Sethi S, Martinez FJ. Exacerbations of chronicobstructive pulmonary disease. Proc Am Thorac Soc 2007;4:554e64.

10. Hurst JR, Vestbo J, Anzueto A, Locantore N, M€ullerova H, Tal-Singer R, et al. Susceptibility to exacerbation in chronicobstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2010;363:1128e38.

11. De la Campa AG, Ferrandiz MJ, Tubau F, Pallares R, Manresa F,Li~nares J. Genetic characterization of fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae strains isolated during cip-rofloxacin therapy from a patient with bronchiectasis. Antimi-crobial Agents Chemother 2003;47:1419e22.

12. Domenech A, Ardanuy C, Balsalobre L, Marti S, Calatayud L, Dela Campa AG, et al. Pneumococci can persistently coloniseadult patients with chronic respiratory disease. J Clin Micro-biol 2012;50:4047e53.

13. Bastida T, Perez-V�azquez M, Campos J, Cortes-Lletget MC,Rom�an F, Tubau F, et al. Levofloxacin treatment failure in Hae-mophilus influenzae pneumonia. Emerg Infect Dis 2003;9:1475e8.

14. Livermore DM. Multiple mechanisms of antimicrobial resistancein Pseudomonas aeruginosa: our worst nightmare? Clin InfectDis 2002;34:634e40.

15. Charlson M, Szatrowski TP, Peterson J, Gold J. Validation of acombined comorbidity index. J Clin Epidemiol 1994;47:1245e51.

16. Ros�on B, Carratal�a J, Verdaguer R, Dorca J, Manresa F,Gudiol F. Prospective study of the usefulness of sputum Gram

stain in the initial approach to community-acquired pneumoniarequiring hospitalization. Clin Infect Dis 2000;31:869e74.

17. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH. Manual of clinical microbi-ology. 8th ed. Washington, DC: ASM Press; 2003.

18. Welti M, Jaton K, Altwegg M, Sahli R, Wenger A, Bille J. Devel-opment of a multiplex real-time quantitative PCR assay todetect Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila andMycoplasma pneumoniae in respiratory tract secretions. DiagnMicrobiol Infect Dis 2003;45:85e95.

19. Clinical Laboratory Standards Institute. Performance standardsfor antimicrobial susceptibility testing. Eighteenth Informa-tional Supplement M100-S18. Wayne, PA, USA; 2008.

20. CDC. PCR deduction of pneumococcal serotypes. http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm; July 2012 [date lastaccessed 20.12.12].

21. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE,Persing DH, et al. Interpreting chromosomal DNA restrictionpatterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteriafor bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995;33:2233e9.

22. Sethi S, Evans N, Grant BJ, Murphy TF. New strains of bacteriaand exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. NEngl J Med 2002;347:465e71.

23. Papi A, Bellettato CM, Braccioni F, Romagnoli M, Casolari P,Caramori G, et al. Infections and airway inflammation inchronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.Am J Respir Crit Care Med 2006;173:1114e21.

24. Domenech A, Ardanuy C, Calatayud L, Santos S, Tubau F,Grau I, et al. Serotypes and genotypes of Streptococcus pneu-moniae causing pneumonia and acute exacerbations in pa-tients with chronic obstructive pulmonary disease. JAntimicrob Chemother 2011;66:487e93.

25. Garcıa-Cobos S, Campos J, Rom�an F, Carrera C, Perez-V�azquez M, Aracil B, et al. Low beta-lactamase-negative ampi-cillin-resistant Haemophilus influenzae strains are best de-tected by testing amoxicillin susceptibility by the brothmicrodilution method. Antimicrobial Agents Chemother 2008;52:2407e14.

26. Pfaller MA, Farrell DJ, Sader HS, Jones RN. AWARE CeftarolineSurveillance Program (2008e2010): trends in resistance pat-terns among Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influen-zae, and Moraxella catarrhalis in the United States. Clin InfectDis 2012;55:S187e93.

27. Keith ER, Podmore RG, Anderson TP, Murdoch DR. Characteris-tics of Streptococcus pseudopneumoniae isolated from puru-lent sputum samples. J Clin Microbiol 2006;44:923e7.

28. Bernard K. The genus corynebacterium and other medicallyrelevant coryneform-like bacteria. J Clin Microbiol 2012;50:3152e8.

29. Blasi F, Damato S, Cosentini R, Tarsia P, Raccanelli R,Centanni S, et al. Chlamydia pneumoniae and chronic bron-chitis: association with severity and bacterial clearancefollowing treatment. Thorax 2002;57:672e6.

30. Post JC, Aul JJ, White GJ, Wadowsky RM, Zavoral T, Tabari R,et al. PCR-based detection of bacterial DNA after antimicrobialtreatment is indicative of persistent, viable bacteria in thechinchilla model of otitis media. Am J Otolaryngol 1996;17:106e11.

8 A. Domenech et al.

Page 124: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������55�

INFEC

TIOU

S AETIO

LOG

Y OF

AEC

OPD

IN

SEVERE

CO

PDPA

TIENTS

@.�

������30���������������������������������7��#�<,��*4H"������������������7�� �����������������������������

Microbe No. of episodes (n=42) R�

<�

8�

8�

8�

8�

8�

,�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

0�

S. pneumoniae + H. infuenzae S. pneumoniae + P. aeruginosa H. influenzae + M. catarrhalis S. pneumoniae + P. aeruginosa + M. catarrhalis P. aeruginosa + M. catarrhalis P. aeruginosa + C. striatum S. pseudopneumoniae + P. aeruginosa S. pneumoniae + M. catarrhalis S. pneumoniae + H. infuenzae + M. catarrhalis S. pneumoniae + M. catarrhalis + S. aureus S. pneumoniae + K. pneumoniae + C. albicans S. pneumoniae + E. coli H. influenzae + C. pseudodiphteriticum H. influenzae + P. fluorescens H. influenzae + B. bronchiseptica P. aeruginosa + S. aureus + K. pneumoniae P. aeruginosa + S. maltophilia P. aeruginosa + M. non-liquefaciens P. aeruginosa + C. albicans P. aeruginosa + C. propinquum M. catarrhalis + E. coli A. xylosoxidans + C. argentoratense S. pseudopneumoniae + H. influenzae S. pseudopneumoniae + M. catarrhalis 0�

Page 125: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

��������7��#��*4H"������%����4H"����������C

HA

PTER

II

Q-�

Page 126: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

CHAPTER III: �7����� �#�

��������� ����������� ������

����������4H"����������

Objective 2: ��� ���7��� ���� �7����� ���

���������� ���������� �#� S. pneumoniae� �������

������ ����� �D���������� ��� ��������

(���������� ��� �/���������1� �� �������� ����

4H"�&�#����,--0����,--Q��

��������&������7�4&�4�����7����&�3�����3&�������!&�J����5&�

A��������� =&� ����� B&� "�������� =&� )����� =&� ��6����� B� (,-001�

3����7���� ��� ����7���� �#� Streptococcus pneumoniae� ������

�������� ��� ����� �D���������� �� �������� ���� �����

��������%���������7����������J Antimicrob Chemother��??:<Q@/

.8�

Page 127: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

Q,�

Page 128: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

Q8�

Serotypes and genotypes of Streptococcus pneumoniae causingpneumonia and acute exacerbations in patients with chronic

obstructive pulmonary disease

Arnau Domenech1,2, Carmen Ardanuy1,2*, Laura Calatayud1,2, Salud Santos3, Fe Tubau1,2, Immaculada Grau2,4,Ricard Verdaguer1,2, Jordi Dorca2,3, Roman Pallares2,4, Rogelio Martin1 and Josefina Linares1,2

1Microbiology Department, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain; 2CIBER de Enfermedades Respiratorias, Institutode Salud Carlos III, Madrid, Spain; 3Pneumology Department, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain; 4Infectious

Diseases Department, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain

*Corresponding author. Microbiology Department, Hospital Universitari de Bellvitge, Feixa Llarga s/n, 08907 L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Spain.Tel: +34-93-260-7930; Fax: +34-93-260-7547; E-mail: [email protected]

Received 4 August 2010; returned 14 September 2010; revised 18 November 2010; accepted 21 November 2010

Objectives: This study aimed to compare the antibiotic susceptibilities, serotypes and genotypes ofpneumococci causing pneumonia or acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease (AECOPD)in patients with COPD.

Methods: A total of 611 pneumococci collected from 487 COPD patients with pneumonia (n¼255, 94bacteraemic pneumonia) or AECOPD episodes (n¼356), from 2001 to 2008, were analysed. Antibiotic suscep-tibility was studied by microdilution. Serotypes (PCR or Quellung) and genotypes (PFGE and multilocus sequencetyping) were determined.

Results: Pneumococci isolated from AECOPD episodes were significantly more resistant to co-trimoxazole andchloramphenicol than those isolated from pneumonia episodes (39.0% versus 29.7% and 13.8% versus 8.2%,respectively, P,0.05). Comparing serotypes of isolates causing bacteraemic pneumonia, non-bacteraemicpneumonia and AECOPD, serotypes 4, 5 and 8 were associated with bacteraemic pneumonia (P,0.05), sero-types 1 and 3 were associated with bacteraemic and non-bacteraemic pneumonia (P,0.05) and serotypes 16Fand 11A and non-typeable pneumococci were associated with AECOPD episodes (P,0.05). The genotypesrelated to serotypes 3 (Netherlands3-ST180 and ST2603), 1 (Sweden1-ST306), 5 (Colombia5-ST289) and 8(Netherlands8-ST53) were isolated more frequently in pneumonia episodes (P,0.05), whereas genotypeST3016F (serotype 16F) was more frequently recovered from AECOPD episodes.

Conclusions: In our experience, serotype 3 pneumococci (Netherlands3-ST180 and ST2603 genotypes)commonly cause pneumonia and acute exacerbations in COPD patients. Pneumococci of serotypes 1(Sweden1-ST306), 4 (ST2474), 5 (Colombia5-ST289) and 8 (Netherlands8-ST53) were more often associatedwith pneumonia. Non-typeable pneumococci may play an important role in acute exacerbations.

Keywords: S. pneumoniae, COPD, Streptococcus pseudopneumoniae

IntroductionChronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a cause of highmorbidity and mortality in developed countries. The BOLD inter-national study (where BOLD stands for Burden of ObstructiveLung Disease) estimated a mean prevalence of 10.1% of COPDfor stage GOLD II or higher (where GOLD stands for Global Initiat-ive for Chronic Obstructive Lung Disease), with significant differ-ences between countries.1 In Spain, the prevalence of COPDbetween 40 and 80 years old is 10.2%.2 Acute exacerbations of

COPD (AECOPD) contribute to the progress of the disease; theyare indicators of poor prognosis and are associated with highhealthcare costs.3,4

In patients with COPD, Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis are themain pathogens causing AECOPD episodes.3 Furthermore, arecent study showed that 30% of patients with recurrentcommunity-acquired pneumonia had COPD as the main under-lying disease, S. pneumoniae being the most frequent causativemicroorganism.5

# The Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved.For Permissions, please e-mail: [email protected]

J Antimicrob Chemother 2011; 66: 487–493doi:10.1093/jac/dkq480 Advance Access publication 29 December 2010

487

Page 129: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

Q<�

The worldwide spread of penicillin- and multidrug-resistantS. pneumoniae is a cause for concern. In Spain, the global rates ofinvasive penicillin non-susceptible isolates (MIC≥0.12 mg/L) havefallen in the last decade, from 32.1% (1999) to 21.1% (2008) inadults, and from 48.4% to 27.4% in children, especially since theimplementation of the paediatric 7-valent pneumococcal conju-gate vaccine (PCV-7).6,7 Rates of macrolide resistance among inva-sive pneumococci remained stable in adults (21.9% in 1999 and20.7% in 2008), but fell significantly in children from 39.6% to26.6%.6,7 Antibiotic-resistant pneumococci have been associatedwith patients with underlying diseases including COPD.8

The capsular polysaccharide is the most important knownvirulence factor of S. pneumoniae and has been related to theinvasive potential of pneumococci. Currently, 93 different sero-types have been identified, which are defined by differences intheir polysaccharide capsule.9 Although serotypes causing inva-sive pneumococcal disease or colonizing healthy children havebeen extensively analysed, information on serotypes and geno-types causing pneumonia or acute exacerbations in patientswith COPD is scarce.

The aim of the study was to compare the antibiotic suscepti-bilities, serotypes and genotypes of S. pneumoniae isolatescausing pneumonia (including bacteraemic and non-bacteraemic isolates) or AECOPD in patients with COPD.

Methods

Hospital setting and study periodThis laboratory-based study was carried out between 2001 and 2008 atthe Hospital Universitari de Bellvitge in the south of Barcelona. Pneumo-cocci isolated from clinical samples (invasive and non-invasive) were pro-spectively collected in our laboratory. Pneumococcal susceptibility andclinical data of patients were prospectively recorded in a database.Only sputum samples of good quality were considered (,10 squamouscells and .25 leucocytes per low-power field).10

Computerized medical records of patients with pneumococci isolatedfrom blood and/or respiratory specimens were reviewed in order to deter-mine the COPD status according to the international GOLD criteria.11

Patients with high co-morbidity (Charlson index ≥5), immunodeficiency,terminal malignancy and other chronic respiratory diseases (bronchiecta-sis, asthma or bronchial interstitial lung disease) were excluded.12 More-over, clinical charts were reviewed to define each episode as pneumoniaor AECOPD. An acute exacerbation of COPD was defined as any sustainedincrease in respiratory symptomatology compared with the baseline situ-ation requiring an increase in regular medication and hospital treatment.An episode of pneumonia was considered when fever, leucocytosis andradiological findings (new infiltrates on chest radiography) were detected.

Bacterial isolates and antimicrobial susceptibilityPneumococcal isolates were identified by optochin susceptibility andlatex agglutination with specific antisera (Phadebactw). Isolatesshowing a negative PCR for cps loci genes were tested for susceptibilityto optochin in ambient and CO2 atmospheres and for bile solubility(2% sodium desoxycholate solution).

Antimicrobial susceptibility to penicillin, cefotaxime, erythromycin,clindamycin, tetracycline, chloramphenicol, co-trimoxazole, ciprofloxacinand levofloxacin was tested by microdilution (SensititreTM) following theCLSI methods and criteria.13 S. pneumoniae ATCC 6303 and S. pneumo-niae ATCC 49619 were used as control isolates.

Serotyping and molecular typingSerotyping of blood isolates was performed by Quellung reaction at theSpanish Reference Laboratory for Pneumococci (SRLP) in Majadahonda,Madrid. Respiratory isolates were first serotyped by a multiplex PCR pro-tocol using methodology previously described.14 Respiratory isolates non-serotyped by PCR were typed by Quellung reaction at SRLP.

Molecular typing was performed by PFGE. Genomic DNA embedded inagarose plugs was restricted with SmaI or ApaI (New England BioLabs)and fragments were separated by PFGE in a CHEF-DRIII apparatus(Bio-Rad) as described previously.15 PFGE patterns were compared withrepresentative international pneumococcal clones of the PneumococcalMolecular Epidemiology Network.15 Band patterns were visually com-pared following the criteria described by Tenover et al.16 Major clusterswere defined as those that included three or more pneumococcal iso-lates. In order to assess the identity with global pneumococcal clones,at least one representative isolate of each major cluster was analysedby multilocus sequence typing (MLST) as described previously.17 Allelenumbers and sequence types (STs) were assigned using the pneumococ-cal MLST web site.18

Statistical analysisStatistical analyses were carried out using SPSS for Windows (version18.0) and EpiInfo (version 6.0, CDC). We used x2 or Fisher’s exact testto compare proportions of serotypes and genotype distribution in COPDpatients with pneumonia and acute exacerbations. The odds ratios(ORs) and 95% confidence intervals (CIs) were calculated. Two-sidedP values ,0.05 were considered statistically significant.

Results

Bacterial isolates and antimicrobial susceptibility

From 2001 to 2008, 3364 pneumococci (one per episode) wereisolated from blood and/or respiratory specimens in 2942 adultpatients. Computerized medical records were available in 3115(92.6%) episodes in order to review the COPD status. Sevenhundred and ten pneumococci (22.8%) were recovered from551 COPD patients (18.7% of the total). The COPD status accord-ing to the GOLD criteria was available in 336 patients (61%); 13patients were identified as GOLD I for COPD disease, 73 as GOLDII, 89 as GOLD III and 161 as GOLD IV. The remaining 215patients were classified as COPD patients according to the clinicaldiagnosis without a spirometric evaluation.

Eighty-one pneumococci were excluded from the analysisbecause they were isolated from patients without clinical symp-toms suggestive of respiratory disease, in whom the situation ofCOPD disease was considered to be stable. Eighteen isolatesshowed a negative PCR for cps loci genes; they were susceptibleto optochin in an ambient atmosphere and resistant in CO2, andthey were bile insoluble. These 18 isolates probably belong to therecently described species Streptococcus pseudopneumoniae andwere excluded from the analysis.

Six hundred and eleven pneumococci were finally analysed;356 pneumococci (all of them from sputum samples) were iso-lated from AECOPD episodes and 255 were isolated from pneu-monia episodes (149 from sputum, 94 from blood, 7 frompleural fluid, 4 from bronchoalveolar lavage and 1 from trans-thoracic needle aspiration). Among patients with pneumonia,the mortality rate was 10.4%. Two hundred and thirty-seven(92.9%) of the 255 pneumonia episodes occurred in men, andthe mean age was 70+9.8.

Domenech et al.

488

Page 130: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

QR�

Among AECOPD episodes (336/356, 94.4% men; mean age71+9.3), pneumococcus was the single isolated pathogen in215 episodes (60.4%), whereas a second pathogen was recov-ered from the sputum samples in 39.6% of cases; H. influenzae(n¼74, 20.8%), M. catarrhalis (n¼28, 7.9%), Pseudomonasaeruginosa (n¼24, 6.7%) Haemophilus parainfluenzae (n¼4),Stenotrophomonas maltophilia (n¼4) Corynebacterium pseudo-diphtheriticum (n¼2), Staphylococcus aureus (n¼2), Acinetobac-ter baumannii (n¼1) and Enterobacteriaceae (n¼2).

In the respiratory specimens collected from 161 pneumoniaepisodes, pneumococcus was the single isolated pathogenicmicroorganism in 112 (69.6%) episodes and was recoveredwith a second pathogen in the remaining episodes, mainlyH. influenzae (n¼18, 11.2%), M. catarrhalis (n¼12, 7.5%) andP. aeruginosa (n¼7, 4.3%). In contrast, only in four of 94episodes (4.3%) of bacteraemic pneumonia was a co-infectionobserved and in all four episodes the pneumococcus was iso-lated together with H. influenzae.

Table 1 shows the activity of nine antimicrobials against pneu-mococci isolated from pneumonia or acute exacerbation epi-sodes of patients with COPD. Pneumococci isolated in AECOPDepisodes had higher antimicrobial resistance rates than thoseisolated from pneumonia episodes, but this difference reachedstatistical significance only for co-trimoxazole (39% versus29.7%, P,0.05) and chloramphenicol (13.8% versus 8.2%,P,0.05).

Serotyping and molecular typing

Figure 1 shows the serotype distribution of pneumococci isolatedfrom bacteraemic pneumonia, non-bacteraemic pneumonia orAECOPD episodes.

The most frequent serotypes among bacteraemic pneumoniaepisodes were 3 (n¼17, 18.1%), 1 (n¼8, 8.5%), 5 (n¼8, 8.5%),19A (n¼7, 7.4%), 4 (n¼6, 6.4%) and 8 (n¼6, 6.4%), whichaccounted for 55.3% of the total.

The most frequent serotypes among non-bacteraemic pneu-monia episodes were 3 (n¼24, 14.9%), 19F (n¼19, 11.8%),23F (n¼10, 6.2%), 11A (n¼10, 6.2%), 6B (n¼9, 5.6%), 1(n¼8, 5.0%), 19A (n¼7, 4.3%) and 14 (n¼7, 4.3%), whichaccounted for 58.4% of the total. Among AECOPD isolates themost frequent serotypes were 3 (n¼30, 8.4%), 19A (n¼23,6.5%), 19F (n¼21, 5.9%), 23F (n¼19, 5.3%), 11A (n¼19,5.3%), 14 (n¼18, 5.1%), 16F (n¼14, 3.9%), 23A (n¼13, 3.7%)and 31 (n¼12, 3.4%) and non-typeable isolates (n¼20, 5.6%),which accounted for 53.1% of the total.

Serotypes of bacteraemic pneumonia isolates were comparedwith those causing non-bacteraemic pneumonia and with thosecausing AECOPD. The ORs and 95% CIs were calculated and areshown in Table S1 (available as Supplementary data at JACOnline). Comparing serotypes of isolates causing bacteraemicpneumonia, non-bacteraemic pneumonia and AECOPD, sero-types 4, 5 and 8 were associated with bacteraemic pneumonia(P,0.05), whereas serotypes 1 and 3 were associated with bac-teraemic and non-bacteraemic pneumonia (P,0.05) and sero-types 16F and 11A and non-typeable pneumococci wereassociated with AECOPD episodes (P,0.05). Serotypes 19F and6B were associated with pneumonia, especially non-bacteraemicpneumonia (P,0.05). Ta

ble1.

Invitroactivityofnineantimicrobialsagainstpneumococciisolated

from

pneumoniaoracuteexacerbation

episodesofpatientswithCOPD

Antibiotic

Pneumonia(n¼2

55)

Acuteexacerbations(n¼3

56)

MIC50(mg/L)

MIC90(mg/L)

MICrange

(mg/L)

%S

%I

%R

MIC50(mg/L)

MIC90(mg/L)

MICrange

(mg/L)

%S

%I

%R

Penicillin

≤0.03

1≤0

.03to4

73.0a

19.2

7.8

≤0.03

2≤0

.03to4

65.4a

22.8

11.8

98.8b

1.2

097.5b

2.5

0Cefotaxime

≤0.03

0.5

≤0.03to2

91.8c

7.1

1.1

≤0.03

1≤0

.03to2

87.4c

11.2

1.4

98.8d

1.2

098.7d

1.3

0Ciprofloxacine

≤0.5

2≤0

.5to

.32

96.5

—3.5

≤0.5

2≤0

.5to≥3

293.8

—6.2

Levofloxacin

≤0.5

1≤0

.5to

.32

98.1

0.5

1.4

≤0.5

1≤0

.5to≥3

296.2

0.3

3.5

Tetracycline

≤2.32

≤2to

.32

71.8

2.0

26.2

≤2.4

≤2to

.32

69.4

3.1

27.5

Erythromycin

≤0.25

≥32

≤0.25to

.32

71.0

029.0

≤0.25

≥32

≤0.25to

.32

68.3

031.7

Clindam

ycin

≤0.25

≥32

≤0.25to

.32

74.5

025.5

≤0.25

≥32

≤0.25to≥0

.569.7

0.6

29.7

Chloramphenicol

≤2≤2

≤2to≥1

691.8

—8.2

8≤2

≤2to≥1

686.2

—13.8

Co-trim

oxazole

≤0.5/9.5

4/76

≤0.5/9.5to

.4/76

70.3

4.9

24.8

≤0.5/9.5

≥2/38

≤0.5/9.5to≥2

/38

61.0

5.3

33.7

aPenicillinoralbreakpoints:susceptible(S),≤0

.06mg/L;intermediate(I),0.12–1mg/L;andresistant(R),≥2

mg/L.

bPenicillinparenteral(non-m

eningitis)breakpoints:susceptible,≤2

mg/L;intermediate,4

mg/L;andresistant,≥8

mg/L.

c Cefotaxime(meningitis)breakpoints:susceptible,≤0

.5mg/L;intermediate,1mg/L;andresistant,≥2

mg/L.

dCefotaximeparenteral(non-m

eningitis)breakpoints:susceptible,≤1

mg/L;intermediate,2mg/L;andresistant,≥4

mg/L.

eNon-susceptibilitytociprofloxacinbreakpoint,≥4

mg/L;andsusceptiblebreakpoint,≤2

mg/L.19

Streptococcus pneumoniae in COPD

489

JAC

Page 131: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

Q?�

The serotypes included in the pneumococcal 23-valent poly-saccharide vaccine (PPS23v) accounted for 79.6% of all pneumo-nia isolates (blood and respiratory isolates) and for 61.0% ofAECOPD isolates. The serotypes included in PCV-7 accountedfor 28.2% of all pneumonia isolates and for 23.6% of AECOPDisolates. The coverage of the new 10-valent (PCV-10) and13-valent (PCV-13) conjugate vaccines in all pneumonia isolatesis 40.8% and 65.1%, respectively, whereas coverage in AECOPDisolates is 26.1% and 43.0%, respectively.

The GOLD status was available in 336 patients—too few for acomparison of the groups according to GOLD status to have suf-ficient statistical power. Interestingly, however, in patients withGOLD I and II 48.6% of pneumococci were isolated from pneu-monia episodes and belonged mostly to serotypes 1, 3, 5 and24F; in patients with GOLD III and IV pneumococci were isolatedmainly from AECOPD episodes (67.2%) and the predominant ser-otypes were 7F, 14, 16F and 19A and non-typeable pneumococci.

Six hundred (98.2%) pneumococci were available for PFGEstudy (246 pneumococci from pneumonia and 354 fromAECOPD). These isolates were classified into 246 PFGE patterns.Thirty-four PFGE patterns accounted for ≥3 isolates and wereconsidered major lineages. These major lineages were relatedto 28 different STs.

Table 2 shows the distribution of major lineages amongpneumococci causing pneumonia (bacteraemic and non-bacteraemic) or AECOPD episodes. The genotypes related to sero-types 3 (Netherlands3-ST180 and ST2603), 1 (Sweden1-ST306), 5(Colombia5-ST289) and 8 (Netherlands8-ST53) were isolatedmore frequently in pneumonia episodes (P,0.05), whereas gen-otype ST3016F (related to serotype 16F) was isolated significantly

more frequently in AECOPD episodes. All non-typeable isolateshad different PFGE patterns, showing a high genetic diversity.

Nine genotypes showedmore than one serotype: Spain9V-ST156(serotypes 9Vand 14); Spain23F-ST81 (serotypes 23F, 19A and 19F);ST42 (serotypes 23A and 23F); Sweden15A-ST63 (serotypes 15A,15F, 19A and 19F); Denmark14-ST230 (serotypes 24F, 19A and7F); ST1201 (serotypes 19A and 19F); ST558 (serotypes 35Band 35F); Tennessee14-ST67 (serotypes 14, 9N and 9V); andColumbia23F-ST338 (serotypes 23F and 23B).

DiscussionS. pneumoniae plays an important role in both pneumonia andacute exacerbations of patients with COPD. Moreover, in patientswith recurrent pneumonia, COPD has been shown to be the mainunderlying disease.5,20 However, little information is available oncapsular types and genotypes in pneumonia and acute exacer-bations in COPD patients.

The present study analyses the differences in antibiotic sus-ceptibility rates, serotypes and genotypes of pneumococci iso-lated from pneumonia episodes and acute exacerbations.

It is well known that invasive isolates are more susceptible toantibiotics than those isolated from non-invasive sites, such assputum samples.21 In this study, isolates causing pneumoniawere isolated from invasive and non-invasive sources, whereasthose causing AECOPD were all from sputum. The difference inthe sources of pneumococci may explain the higher susceptibilityrates of pneumonia episodes.

The new fluoroquinolones are widely used to treat respiratorytract infections, especially in patients with COPD. Although our

3

2

0

4

6

8

10

12

14

16

Perc

enta

ge o

f iso

late

s

18

20

1 5 4 8

19A

19F

12F

24F

23F 7F 14 35B

33F

17F 31 22F 6C NT

16F

23A 6B11A9V 6A

Serotype

Figure 1. Distribution of serotypes of pneumonia and AECOPD S. pneumoniae isolates isolated from adult patients with COPD (2001–08). Black bars,blood isolates from pneumonia episodes; white bars, respiratory isolates from pneumonia episodes; diagonally striped bars, AECOPD isolates.

Domenech et al.

490

Page 132: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

Q@�

study shows a low rate of ciprofloxacin resistance (3.5% in pneu-monia and 6.2% in AECOPD isolates), it was higher than ratesfound in a recent study also performed in Spain (3.3% amongnon-invasive pneumococci and 1.3% among invasive isolates).22

The high consumption of quinolones in this group of patientscould explain the higher resistance rate. The differences observedin the rates of susceptibility to ciprofloxacin and to levofloxacin aredue to isolates with first-step mutations in the quinolone resist-ance-determining regions (data not shown). These isolates (cipro-floxacin resistant and levofloxacin susceptible) may becomehighly resistant under selective fluoroquinolone pressure and areassociated with treatment failure when quinolones are used.23

Using classical criteria, the rates of penicillin and cefotaximeresistance of pneumococci isolated from patients with COPD arehigh.13 However, pneumococci with penicillin or cefotaxime/cef-triaxone MICs ≥4 mg/L have rarely been described in our area.Using the revised non-meningeal CLSI breakpoints, more than98% of pneumococci isolated from COPD patients were penicillinand cefotaxime susceptible, so b-lactam antibiotics should con-tinue to be first-line therapy for pneumococcal pneumonia.8

The second main finding of our study is the differencesobserved between serotypes detected in pneumonia andAECOPD episodes. Serotypes 1, 3, 4, 5 and 8 were more fre-quently associated with pneumonia (mainly among bacteraemicpneumonia) than with AECOPD. Some serotypes, such as 1, 5and 7F, were considered primary pathogens when they wereanalysed in nasopharyngeal and invasive pneumococci isolatedfrom children.24

Although the invasive potential of serotype 3 is reported to below,24 it was the most frequent cause of bacteraemic and non-bacteraemic pneumococcal pneumonia in COPD patients in ourstudy and the second most frequent cause of AECOPD. Amongpneumonia isolates, serotype 3 accounted for 18.1% (n¼17/94) of bacteraemic pneumonia episodes and 14.9% (n¼24/161) of non-bacteraemic episodes, suggesting that the patient’sunderlying condition plays a key role in the development of bac-teraemia, as other authors have proposed previously.20,25,26

It was striking that non-typeable pneumococci, a commoncause of AECOPD, were only rarely found causing pneumonia.The absence of a capsule in these isolates may reduce their

Table 2. Major lineages of pneumococci isolated from pneumonia and AECOPD episodes

ST Related PMEN clone No. of isolates

Serotypes isolated from pneumonia or AECOPD

pneumonia (no. of isolates)a AECOPD (no. of isolates)

ST180 Netherlands3-31 36 3 (21)b 3 (15)ST156 Spain9V-3 32ST81 Spain23F-1 28ST62 26

14 (5), 9V (5)23F (5), 19F (2), 19A (1)11A (10)

14 (13), 9V (9)23F (12), 19F (4), 19A (4)11A (16)

ST260 26ST42 19ST63 Sweden15A-25 19

3 (17)b

23A (4), 23F (2)15A (3), 19A (1), 19F (5)

ST88 15ST30 14ST433 14

19F (7)16F (1)22F (7)

3 (9)23A (12), 23F (1)15A (7), 19F (3), 15F (1)19F (8)16F (13)b

22F (7)ST306 Sweden1-28 13 1 (13)b

ST191 Netherlands7F-39 12ST230 Denmark14-32 11

7F (6)24F (4), 19A (3)

7F (6)24F (2), 19A (1), 7F (1)

ST90 Spain6B-2 10 6B (6)ST289 Colombia5-19 9ST1201 9

5 (8)b

19A (4), 19F (1)

6B (4)5 (1)

19A (4)ST558 8ST989 8

35B (3), 35F (3)12F (4)

ST247 7

35B (2)12F (4)4 (5)

ST53 Netherlands8-33 7ST97 7

8 (6)b

10A (1)ST717 7

4 (2)8 (1)

10A (6)33 (4)

ST67 Tennessee14-18 633 (3)9N (2), 9V (1) 9N (2), 14 (1)

ST110 6ST338 Colombia23F-26 6 23F (2)ST202 4 19A (1)

18C (6)23B (4)19A (3)

ST224 3ST1046 3 34 (1)

6C (3)34 (2)

PMEN, Pneumococcal Molecular Epidemiology Network.aOverall pneumonia isolates were considered (isolated from blood or respiratory samples).bStatistically significant differences between lineages of pneumonia and AECOPD isolates.

Streptococcus pneumoniae in COPD

491

JAC

Page 133: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

QQ�

invasiveness. Some non-capsulated and atypical pneumococcihave recently been identified as a new species of Streptococcus,S. pseudopneumoniae, whose role in COPD is unknown.27,28

Although several pneumococcal vaccines are available, onlyPPS23v is currently licensed for use in adults. The proportion ofserotypes included in this vaccine was high in our COPD popu-lation. Unfortunately, although this vaccine can protect againstinvasive disease in healthy adults, its protective efficacy inCOPD populations is controversial.29,30 Pneumococcal conjugatevaccines with enhanced immunity potential may play an impor-tant role in the prevention of pneumonia and AECOPD in COPDpatients. PCV-7, which includes 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F and 23F,has been shown to increase the immune response in COPDpatients.30 A new formulation of this vaccine that adds serotypes1, 5, 7F, 3, 6A and 19A (PCV-13) has recently been commercia-lized for children and it will be licensed for adults in the next2 years. Our study suggests that this vaccine may play an impor-tant role in preventing pneumococcal pneumonia in COPDpatients, with coverage of 65.1% of pneumonia isolates.

Our study shows that genotypes Netherlands3-ST180 andST2603 (both related to serotype 3), Sweden1-ST306 (serotype1), Colombia5-ST289 (serotype 5) and Netherlands8-ST53 (sero-type 8), were isolated significantly more frequently in pneumoniaepisodes. These results reflect the clonal composition of themajor genotypes among pneumonia isolates. In contrast, allnon-typeable isolates had different PFGE patterns and showeda high genetic diversity, as reported previously.28

The main limitation of our study is that it is retrospective andthat some data were not recorded (for instance the GOLD statusof COPD patients). Thesemissing data hampered a powerful analy-sis of serotypes by GOLD status. Another limitation of our study isthat it was conducted at a single medical centre. However, to ourknowledge it is the largest study of pneumococcal serotypes andgenotypes in pneumonia and AECOPD episodes of recently recov-ered patients with COPD. The differences we have found shouldbe evaluated in a prospective, multicentre study that also includesthe vaccination status of the patient. The third limitation is the dif-ficulty of analysing the role of S. pneumoniae in episodes withsamples yielding more than one pathogen. Further studies areneeded in order to establish the role of each pneumococcal sero-type in AECOPD and pneumonia episodes of patients with COPDand to assess the impact of the new conjugate vaccines in prevent-ing pneumococcal disease in these patients.

AcknowledgementsWe acknowledge the use of the Streptococcus pneumoniae MLST web siteat Imperial College London, funded by the Wellcome Trust. We wish tothank all the staff of the Microbiology Laboratory of HospitalUniversitari de Bellvitge who contributed to this project on a daily basis.

FundingA. D. was supported by a grant from Formacion de Profesorado Universi-tario (FPU; Ministerio de Educacion, Spain). This study was supported bygrants from the Fondo de Investigaciones Sanitarias de la SeguridadSocial (PI0901904, PI081922 and PI060647) and by CIBER de Enferme-dades Respiratorias (CIBERES; CB06/06/0037), run by the Instituto deSalud Carlos III (ISCIII), Madrid, Spain.

Transparency declarationsNone to declare.

Supplementary dataTable S1 is available as Supplementary data at JAC Online (http://jac.oxfordjournals.org/).

References1 Buist AS, McBurnie MA, Vollmer WM et al. International variation in theprevalence of COPD (the BOLD Study): a population-based prevalencestudy. Lancet 2007; 370: 741–50.

2 Miravitlles M, Soriano JB, Garcia-Rio F et al. Prevalence of COPD in Spain:impact of undiagnosed COPD on quality of life and daily life activities.Thorax 2009; 64: 863–8.

3 Sethi S, Murphy TF. Infection in the pathogenesis and course of chronicobstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2008; 359: 2355–65.

4 Soler-Cataluna JJ, Martinez-Garcia MA, Roman SP et al. Severe acuteexacerbations and mortality in patients with chronic obstructivepulmonary disease. Thorax 2005; 60: 925–31.

5 Garcia-Vidal C, Carratala J, Fernandez-Sabe N et al. Aetiology of, andrisk factors for, recurrent community-acquired pneumonia. ClinMicrobiol Infect 2009; 15: 1033–8.

6 Fenoll A, Granizo JJ, Aguilar L et al. Temporal trends of invasiveStreptococcus pneumoniae serotypes and antimicrobial resistancepatterns in Spain from 1979 to 2007. J Clin Microbiol 2009; 47: 1012–20.

7 Linares J, Ardanuy C, Pallares R et al. Changes in antimicrobialresistance, serotypes and genotypes in Streptococcus pneumoniae overa 30-year period. Clin Microbiol Infect 2010; 16: 402–10.

8 Pallares R, Linares J, Vadillo M et al. Resistance to penicillin andcephalosporin and mortality from severe pneumococcal pneumonia inBarcelona, Spain. N Engl J Med 1995; 333: 474–80.

9 Calix JJ, Nahm MH. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variablyinactivated wcjE gene. J Infect Dis 2010; 202: 29–38.

10 Roson B, Carratala J, Verdaguer R et al. Prospective study of theusefulness of sputum Gram stain in the initial approach tocommunity-acquired pneumonia requiring hospitalization. Clin InfectDis 2000; 31: 869–74.

11 Pauwels RA, Buist AS, Calverley PM et al. Global strategy for thediagnosis, management, and prevention of chronic obstructivepulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic ObstructiveLung Disease (GOLD) Workshop summary. Am J Respir Crit Care Med2001; 163: 1256–76.

12 Charlson M, Szatrowski TP, Peterson J et al. Validation of a combinedcomorbidity index. J Clin Epidemiol 1994; 47: 1245–51.

13 Clinical Laboratory Standards Institute. Performance Standards forAntimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational SupplementM100-S18. CLSI, Wayne, PA, USA, 2008.

14 CDC. PCR Deduction of Pneumococcal Serotypes. http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm (5 April 2010, date last accessed).

15 McGee L, McDougal L, Zhou J et al. Nomenclature of majorantimicrobial-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined bythe Pneumococcal Molecular Epidemiology Network. J Clin Microbiol2001; 39: 2565–71.

16 Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV et al. Interpreting chromosomalDNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233–9.

Domenech et al.

492

Page 134: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

Q.�

17 Enright MC, Spratt BG. A multilocus sequence typing scheme forStreptococcus pneumoniae: identification of clones associated withserious invasive disease. Microbiology 1998; 144: 3049–60.

18 Multi Locus Sequence Typing (MLST). http://spneumoniae.mlst.net (4June 2010, date last accessed).

19 Chen DK, McGeer A, de Azavedo JC et al. Decreased susceptibility ofStreptococcus pneumoniae to fluoroquinolones in Canada. CanadianBacterial Surveillance Network. N Engl J Med 1999; 341: 233–9.

20 Calbo E, Valdes E, Ochoa de Echaguen A et al. Bacteraemicpneumococcal pneumonia in COPD patients: better outcomes thanexpected. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009; 28: 971–6.

21 Linares J, Pallares R, Alonso T et al. Trends in antimicrobialresistance of clinical isolates of Streptococcus pneumoniae inBellvitge Hospital, Barcelona, Spain (1979–1990). Clin Infect Dis 1992;15: 99–105.

22 de la Campa AG, Ardanuy C, Balsalobre L et al. Changes influoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae after 7-valentconjugate vaccination, Spain. Emerg Infect Dis 2009; 15: 905–11.

23 Fuller JD, Low DE. A review of Streptococcus pneumoniae infectiontreatment failures associated with fluoroquinolone resistance. ClinInfect Dis 2005; 41: 118–21.

24 Brueggemann AB, Peto TE, Crook DW et al. Temporal and geographicstability of the serogroup-specific invasive disease potential of

Streptococcus pneumoniae in children. J Infect Dis 2004; 190:1203–11.

25 Alanee SR, McGee L, Jackson D et al. Association of serotypes ofStreptococcus pneumoniae with disease severity and outcome inadults: an international study. Clin Infect Dis 2007; 45: 46–51.

26 Sjostrom K, Spindler C, Ortqvist A et al. Clonal and capsular typesdecide whether pneumococci will act as a primary or opportunisticpathogen. Clin Infect Dis 2006; 42: 451–9.

27 Arbique JC, Poyart C, Trieu-Cuot P et al. Accuracy of phenotypic andgenotypic testing for identification of Streptococcus pneumoniae anddescription of Streptococcus pseudopneumoniae sp. J Clin Microbiol2004; 42: 4686–96.

28 Simoes AS, Sa-Leao R, Eleveld MJ et al. Highly penicillin-resistantmultidrug-resistant pneumococcus-like strains colonizing children inOeiras, Portugal: genomic characteristics and implications forsurveillance. J Clin Microbiol 2010; 48: 238–46.

29 Schenkein JG, Nahm MH, Dransfield MT. Pneumococcal vaccinationfor patients with COPD: current practice and future directions. Chest2008; 133: 767–74.

30 Dransfield MT, Nahm MH, Han MK et al. Superior immune response toprotein-conjugate versus free pneumococcal polysaccharide vaccine inchronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2009;180: 499–505.

Streptococcus pneumoniae in COPD JAC

Page 135: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

.-�

Page 136: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

CHAPTER III: �7����� �#�

��������� ����������� ������

����������4H"����������

Objective 3: ����%������������������#�"4A@�������

��������� ����������� ������ �����

�D���������&�#����,--0����,-0,��

��������&������7�4&���������&�J��2�/3�������&�3�����3&�

��6����� B�� �7����� �#� ��������� ���������� ������ �����

�D���������� �� �������� ���� 4����� H�������%�� "������7�

�������� �%��� �� � ��%�� 7����� �������� 3��������� ��� B������ �#�

������������4����������7��

Page 137: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

.,�

Page 138: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

.8�

��������� �������������������� ������������ ��������� ������� ��� �� ���������� ��� ���

������������������� ��!�"#����������� ����! ���$��%���& ���'�����%#�

������� ����������� � ���� ���������������

����� �������� ������

����� ���������� ������������ ��

����������������������������� ����

!�������"��������������� ������ �#������$�%�������&��'������������(�'����)���(*""#���������#�!�����$�%�������&��'������������(�'����)���(*""#��� ������������ ���#������$�%�������&��'������������(�'����)���(*"")!�(*+*�)(�� �����&��'������#��,�� ��)����-�#������$�%�������&��'������������(�'����)���(*"")!�(*+*�)(�� �����&��'������#��������#�����$�%�������&��'������������(�'����)���(*"")!�(*+*�)(�� �����&��'������#��"�.����#���������$�%�������&��'������������(�'����#��� ���������

/��0�����!�1�#�������� � �������������#�� �����2� ���������#���������#�,�������#�'� ����

��

3������������0���������0���������������������������������������'��0#��������4��������������������)"���5�

����� ����������������

Journal of Antimicrobial Chemotherapy: ���������� �����������������

Journal of Antimicrobial Chemotherapy

Page 139: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

.<�

Dynamics of the pneumococcal population causing acute exacerbations in � patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (2009-2012).

� Comparison with 2001-2004 and 2005-2008 periods.

� ����� ������0&,&� 4����� �����70&,&� ����� ������0&,&� ������� J��2�/

� 3�����0&,&�3�����3����,&8&�B���#�����6����0&,�

� 0)���������7� ���������&� E�������� $�%��������� ��� >���%����/5�5>*��/>�������

� $�%�����7&�>������&�3�����,45>*=*3�(4��������*#����������=������������1��

� 534555��)�������3����� 8�����������#�=���������7�)�����&�E��������$�%���������

���>���%����/5�5>*��&�>������&�3����

� *Corresponding author:

������������"���

� Address:�)���������7����������&�E��������$�%������������>���%�����

� !��D����������;&�-Q.-@���E����������������������&�>��������3����

� e-mail:������s����%����������������

� Phone: t8<.8,[email protected]

� FAX: t8<.8,?-@R<@�

�� Running title:����������������D���������

� Key words: ��������������� ��������������������%���������7��������&�

�� ������D��������&��I������%����&������7��&�����7����

Page 140: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

.R�

�� ���������7� �����������7�����������������P5�*�������)������������)��������

� >�����7��#�����"���������)�7�,-08&�)�����&�3���'�

��

�� Abstract.

�� Background.� "������� ���� �� ��������� ����� �#� ����� �D���������� ��

�� �������� �����������������%���������7���������(4H"�1�� 5� ���� ����������&�

�� ��������������������������������&�����7������������ �����������#� ����

�� @/%������I������%����("4A@1��

� Methods:� `�� ���7���� ���� ������������ ������������7� (�����������1&� �����7���

�� ("4=1��������7���("!J*;)�3�1��#���������������������D����������

�� �����������������,--./0,��=������� ������������ ����� �����%�����7�����������

� ����������������(,--0/-<����,--R/-Q1��

�� Results:����������#�,-?��������� ������������#����0?,�4H"���������� ����

�� ������D�����������4�������� �������%������������&� ������#���� ������ ��

�� ���� ����� �#������/����� ��������� ���� �����%��� (8?�RS� �� ,--0/-<� ��� 88�RS� ��

�� ,--./0,��������+��u-�?<<1��

�� ��������� #������������7���� �� ����,--./0,�������� ���:�0R�� (.�,S1&�8� (@�QS1&�

� 0.!� (?�8S1&� 00�� (R�QS1� ��� ?4� (R�8S1&� ���� ������� #��� 8<�RS�� �� �������

�������� �� "4A@� �����7���� ��� �����%��� ����������� ���� ����7� ������� (#����

� 8.�<S� �� ,--0/-<� ��� 00�,S� �� ,--./0,+� �T-�--01+� �/"4A08� �����7����

� ��������#����<R�8S����@,�8S&���������7�0R��(#����,�,S����.�,S1����?4�(-S�

���R�8S1�q�T-�-Rr��

� ���� ����� #������� ����7���� (4����� 4�����D��&� 44�1� �� ���� ,--./0,� �������

� ���:� 44?80R�&0.!&0R!� (Q�@S1&� 440Q-8� (<�<S1&� 44?,00�� (8�.S1&� 44.@0-�� (8�.S1&�

� 448Q??4� (8�<S1&� 44,?-8� (8�<S1&� ���448-0?!� (8�<S1�� 3����7���� 0.!&� 0.�&� ?��

� ���?4� ������������7���%������

� Conclusions: "4A@/�����7������%���������������������7��5���������&�� ���/

�� "4A@� �����7���� (0R�� ��� ?41&� ��� ������ �������� ����7���� (44?80R�� ���

� 3�8Q??41���� ���������#��������������������������������������������������

�� ����������%�������&������/������������������������������

��

Page 141: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

.?�

� Introduction.

�� 4�������������%���������7���������(4H"�1���������������������#���������7�

�� ��� ��������7� �� ��%������� �������&0� ����7� ���� ��� ���� �������� �#� �����

�� �D������������������ ������������������������������#��������������)����%��&�

�� ������D�������������� ����������#� �������������������%����������������

�� ������������������������,��

�� 5�� ������������� �������������������� ������ ��� ����������� #���������0RS��#�

� ����� �D���������� ������ �7� ��������� ���������8� 5��� ������� ��� ���� �����

�� ����������� �%�������#����&����������������������������%���%������������#�

�� �������+��������&�.<���##����������������7������������%�����������#����< �

� $���� ���� ���������� �#� �I������ %����� �� ,---&� ���� ���%����� �#�

�� ��������� ��������� ��� ������ �� ���� ���� �#� ���� ,8/%����� ���������

�� ���7���������%����(""3A,81&� �������������,8�������#����������7����

�� �#������� ������(0&�,&�8&�<&�R&�?>&�@!&�Q&�.G&�.A&�0-�&�00�&�0,!&�0<&�0R>&�0@!&�

�� 0Q4&�0.�&�0.!&�,-&�,,!&�,8!����88!1�������%���� ��������������0.Q8����

�� ������7� ��� ���������� #��� ������� �%��� ,� 7����� �#� ���� ��� ���� ��� ��

�� �����������7� �������� ����� �#� ��%������� ��������� �#����:�

� 5������������ ������� ���� ����� ������ �������+� ����� ���� �������&�

�� ��������� ��������+� ������������ #����� �����+� ��� ������� ������+� ������� ����

�� ������� ��� #������� �������+� ������� ���� ���������������� ��������

� �������E5A� �#����&� ����� ����� #�������������������7������������������

�� ���������� ������������� ������������������%��������R�5��������&�""3A,8����

�� ���������������#�������������������?R�7������������������������7����������

�� ���� ?R� 7����� ���� ����� ���� �������� (������� 4H"�&� ����7����&� ���

�� ������1+�����������%���������������+���������������7����������� ������

�� �����������7� �������� ����� �#� ��%������� ��������� �#�����R� ���� E������

Page 142: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

.@�

�� ���������� �#� ���� 4�������� ��%������ � ����� ��������� %������� ����

� ""3A,8� �� ������� ���� ����� ���� ��������� ���� ��� 4H"��

�� ( ��������;�����;��������1��E� �%��&������##���%����������%�������������7�

�� �����������7����������� ��������������#��������������?�5�3���&��������

� ��� �%�������� ������ ���� ������� ������ �#� ""3A,8� %������� �� ������ �������+�

�� �� �%��&� �������� ���#������ �7� ���� ��������� ��������� ��� ��������� �� ������ ��

�� �� ���������4�)!541��������������������������� ���%�������������������

�� @-/Q-S��#�4H"����������(����:;;�����������#����;��#;��������,0vR���#1��

�� 3��� ,---&� ���������� ���� �#� ���� @/%����� ��������� �I������ %����

�� ("4A@1�#��������������������������������#����������������������������

�� �������� @&Q� � 5�������&� ������##��� ��� ���������� ��������#�%������+�����������#�

� �/%������� ������� ��� ������&� �� � ��� ���� ����� �##��'&� �������� #����

�� ��������������7��������������#�"4A@������7����(<&�?>&�.A&�0<&�0Q4&�0.!����

�� ,8!1� �� ���� %������� ����������@� ���� ���� �#� "4A@� ���� ����� �����������7�

� ������������������#����������������������%���%�����������������������

�� �����������%���?R�7������#�����.�

�� ��������� "4A/@� ��� ��������� ���� ���� ��������� %������� ���������� �#�

�� ��7� �������� ���� ��� ���� $����� 3�����&� 4����� ��� ���� $����� L�����&� ��

�� 3���� (B��&�,--01� ��� ������ ������� �� ����%������������������E� �%��&�

�� ���� A���� ��%����7� 4��������� �#� ���� 3������ "��������� ����������

�� ��������������������������������T,�7����&� �������������,&�<&�?����0,/0R�

� �����&� ��� ������� ����� ,/R� 7����� ���� ����� ������� ��������

�� (����:;; ���������1���

�� 5����������������������(4�������1&���7����%�������������������������������

� ����������"4A@&� ������������#����7���������5�������/������������������

�� ����7����#������������3������#�4�������&�<R�0S��#������������%���������������

Page 143: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

.Q�

�� ����� �#� "4A@&� ������ ���� ,--,/,-00� �������0-� A������� ������� ��������

�� ���������%��7��#����"4A@��������������������������#��������%������� ���

�� 0Q�RS� ���� ������ ,--,/-8� ������&� 8Q�?S� �� ,--</-R� ��� ?,�RS� �� ,--?/-@��

�� E� �%��&�������������������������R-�QS�������,--Q/-.��������0-���������

� � ��� ��I������%����&�"4A0-����"4A08&���%�����������������3����

�����7�#���������������T,�7����+�"4A0-&� ������������"4A@������7���������0&�

� R� ��� @!� ��� ��������� �� G�%������ ,--.+� ��� "4A08&� ������� "4A0-�

� �����7���� ����� 8&� ?�� ��� 0.�&� ��� ��������� �� B��� ,-0-&� �������� "4A@��

"4A08� �������� ������� #���������� ��H������,-0,� ��3�����������������������

� ������%����������������������#������%�����������������������������

� 5� ������ ��� ���7��� ���� ������ �#� �I������ %����� �� �������� ���� 4H"��

� ��##����� ��������� ����� �D���������&� �� �������� ���� ���������

� ������������7� ��� ���� �7����� �#� �����7���� ��� ����7���� �#� ��� ��� ������

� ��������� ������ ����� �D��������� ��������� �� �������� ����4H"�� ������ ����

�� �������,--0/0,��

Page 144: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

..�

�� Materials and methods.

�� Ethical statement.

� ����� ����7� ��� ���������� �#� ���� �������� ���� �����%��� �7� ���� 4����F� w���

�� ��5%���������4�2�������E��������$�%������������>���%����'�������� ��������������

�� �#����������� ���������������������7&�������������������#����������

�� ��������� �����7�������

�� Hospital setting and study period

�� ����� ���������7/������ ����7� ��� ������� ���� ��� ��� ,--.� ��� ,-0,� ��� ����

�� E�������� $�%��������� ��� >���%������ H��� �������7� ������ ��������� ��� ������� �� ����

� �������� ����� �#�>������� ��� ���%��� �� ���������� �#� ������ ?--&---� ������&�

�� ��� ��� ����� �� ����� �#� ��#����� �������� ����� ,�������� ������� �#� ���� ��������

�� ����������������� �������������������������������#�������������������7��

� 5�����������D�����������������#�����������%������� �����I������%�������

�� ������������ ������������7� ��� �����7��� ��� ����7��� �����������&� ���� �������

�� ,--./0,� ��� �������� ���� ,--0/-<� ��� ,--R/-Q� ��������� 3����7���� ���

�� ����7���� ���#������ #���� ,--0� ��� ,--Q� ���� ���������� ���%�����7� �� �� ����7�

�� �������� ��������� �����7���� ��� ����7���� ���%����� #���� �����

�� �D���������� �������������������#�����������������/�����������������

� �����������4H"����������00�

���� ������� �������� �#� ���� �������� ��%�� ���� ��������� ���%�����7&00� ��� ����

� JH�����������#�������������( �����JH���������#���J������5������%��#���4�����

� H�������%�������������1� �������������������� ��� ���� �����������JH���

��������0,���������D����������#�4H"�� �����#��������7�����������������

� �� ����������7� �7�����������7� �������� ���� ���� �������� ��������� ����

Page 145: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0--�

� ��������� �� ������� �� �������� ��������� ��� ��������� ���������� H�7� �����

� ������7���������������� �������������(T0-������������������a,R������7����

� ���� �� /�� ��� #����1�08� 5� ������ �������� ��������� ���� ��� ����� �D���������

� �������&� ��7� ������ ������%�� ����� �D���������� ���� ������� #��� ��� ���

�� #���� �����������7���� ���������������������7�

� Bacterial strains and antimicrobial susceptibility

�� "�������� ������� ��������� #���� ,--.� ��� ,-0,� ���� �����#���� �7� �������

�� ������������7&� ����� ���������7� ��� ����D� ������������ ���� ����#�� ��������

� ("�������j1��

�� ������������������������7� �����������7��������##���������������������������&�

�� �� ������� ���� *������� 4��������� �� ������������ 3�����������7� �������

�� (*$4�3�1� ������������� �#� ,-08� ( ����������1�� ���� #���� ���

�� ������������� ���� ������:� �������&� �#���D���&� ��7�����7�&� �����7�&�

�� �����7���&� ������������&� �/�����D�����&� ����#��D��� ��� ��%�#��D���� ���

�� ��� ������ ��44� ?8-8� ��� ��� ��� ������ ��44� <.?0.� ���� ����� ��� ������

� ��������

�� Serotyping and molecular typing

�� �� �������#�0.@� (.R�?S1��#�,-?��������� ���������������,--./0,�������� ����

� �%�������� #��� �����7���� ��� ��������� �7����� 3����7���� ��� ���#������ �7�

�� ��������D� "4=&� ����� �� �������� ��������� ���� �����0<� "������� ����

�� �����7������������7�������7���������D�"4=� ���������7�����7�W��������������

�� ��� ����3������=�#��������������7� #���"������� (3=�"1� ��)�I�������&�

�� )������0R� G�/���������� ��������� ���� �� ������������7� ��� ������� �� �������

�� ����������������������� ��4H,�����������&� ��������� �����������%�� ����� #���

�� ��������������7�(,S�����������D7��������������1� �����D�������

Page 146: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0-0�

� J���7���� ��� ���#������ �7� "����� !����� J��� *�������������� ("!J*1� ���

�� ��������� ���%�����7�00� "!J*� �������� ���� �������� ���� �����������%��

�� �������������������������(�����0_,?1��#�����"��������)��������

� *����������7� G�� ���� (����:;; ���������7����;")*G1�� Q<� �����������%��

�� ��������� �������������7������������������ �7���&0?�������� ��� ���� #���� ���

�� �������:�01�����������#������������#��������"!J*������������������������

�� ��� ��������&� ,1� ��� ������ ������ ��������� #��������"!J*�������� �������o�0-�

�� ��������&� 81� #��� ������ �����7���� (?�&� ?4&�0.�� ���0.!1� ���������� ���� �� �����

�� ��������%�����7�( ������%�����������������1&���������������������#��������"!J*�

�� ������� ��� ���7����� ������� ������ ��� ������� �7���� (3��1� ���� ��������

� ������������������)�3�� ��������(����:;; ��������1��

�� Statistical Analysis

�� 3�������������7���� ��������������������3"33�#���`��� ��(%������0Q�-1����

� =� (���� =� !�������� #��� 3���������� 4�������1� %������ ,�0R�-�� `�� ����� 4��/

�� ������� ��� !�����l�� �D��� ������ ��� ������� ����������� �#� ������������

�� ������������7���������7����������7�����������������4H"���������� ���������

�� �D��������� ���������� � �/������ "/%������ ����� ���� -�-R� ���� ���������

�� �����������7�����#������

��

Page 147: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0-,�

�� Results.

� �� ������ �#� ,-?� �������� ���� ���%����� #���� ,--.� ��� ,-0,� ������ �����

�� �D���������� �� 4H"�� ��������� ���� ���� ���� (3������� ��%�����1� �#� ����

�� �������� ���@-�,�(3�V�Q�@1&����������#������(.?�0S1� ��������������������#�

� ���#�� ����������� ����%����������0@Q�(Q?�<S1��#��������&� �����������������

�� JH����������� ���������#������:�JH���5�(u,��������1&�JH���55� (u881&�JH���

�� 555� (u<01� ��� JH��� 5A� (u0-,1�� ���� �������� ,Q� �������� ���� �����#���� ���

�� 4H"�� �������� ������� ��� ������ ��������� ������� �� ����������� �%���������

�� )�����#� ������������(u08R;,-?1����������������������������D���������

�� ����������������������7�������+�0Q�������������,�������������������������.�

��� ������������8��������������������

�� ���������������#� ����� ������#����#��� �������7���:�,--0/-<��������(����7/"4A@�

��� ������1&� ������� 08Q� (,<�?S1� ��������+� ,--R/-Q� ������� (����� "4A@� ������1&�

��� ������� ,0Q� (8Q�QS1� ��������+� ��� ,--./0,� ������&� ������� ,-?� (8?�?S1�

�� ���������� ������ ���� �� �����������7� ����#���� ��##������ �� ���� ���������� �#�

��� JH���������������#���������������������������(����������� 1��

��� Serotypes. ����� ���� ,--./0,� ������&� �� ������ �#� 8Q� ��##����� �����7���� ����

��� �������+� �� �%��&� ���%�� �#� ����� ������� #��� RQ�@S� �#� ���� ���������

��� ����� �D���������:� �����7��� 0R�� (u0.&� .�,S1&� 8� (u� 0?&� @�QS1&� 0.!� (u� 08&�

��� ?�8S1&�00��(u0,&�R�QS1&�?4�(u00&�R�8S1&�0.��(u0-&�<�.S1&�,8>�(u.&�<�<S1&�

�� ,8��(u.&�<�<S1&�0-��(uQ&�8�.S1&�8R>�(u@&�8�<S1����0?!�(u@&�8�<S1��

� ������0���� �������7������#������7�����%�����������7�������&���������%������

�� �#� ��������� �I������ %����� �� ���� ������� �#� ������ �� �����������7�

�� ����#���� �������� �� "4A@� �����7���� ��� �����%��� ����������� ���� ����7�

� ������&� #���� 8.�<S� �� ���� ,--0/-<� ������� ��� 0@�-S� �� ���� ,--0/-R� �������

�� (�T-�--01� ��� 0-�@S� �� ���� ,--./0,� ������� (�T-�-01�� 5� ����� ������&� "4A0-�

�� ��� ��� �� �������� �������� ��� "4A@� (#���� 8.�.S� ��� ,-�?S� (�T-�--01� ��� ���

Page 148: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0-8�

�� 08�0S+��T-�-01&�������������������D���������7����������������"4A@�(0&�R����

�� @!1� ������������ ���� �� � #�����7��"4A08���� �������������%������ �� ����

�� #����� ������� (R<�8S1+� �� �%��&� ����� �%������ ��������� �� ���� �������� ,--R/-Q�

��� (8.�-S1����,--./0,�(,@�@S1&��u-�--?�����T-�--R&��������%��7���

�� H� ���� ������ ���&� �����7���� ��� ������� �� "4A08� �������� ����������7�

��� ����������� ��������7�������� (,Q�8S� ��,--0/-<&�<0�@S� ��,--R/-Q����R-�.S� ��

��� ,--./0,1�� ���� ������� �� �����7���� 0R�� ��� ?4� ��� ����������7� ������&�

�� ��������7�������#�����������(#����,�,S����.�,S&����#����-�-S����R�8S&���-�-00�

��� ��� �u-�--<&� �������%��71�� !����7&� �����7���� ������� �� ""3A,8� ��� ��� ��

��� �����������7� ����#���� ������ #���� @0�QS� �� ,--0/-<� ��� RQ�8S� �� ,--R/-Q�

��� (�T-�--01�������<.�-S���,--./0,�(�T-�--01��

��� Pneumococcal genotypes.

��� �� ������ �#� Q<�"!J*��������� ���� �����#���������� ����,--./0,�������&� �#� ����

��� ������ ��������� 8� ��� ����� ���������� ����� ���� Q<� �#� ,-?� ���������

�� �������������7�)�3�&����������#�<8���������7����(3��1� ����#��������������

��� #�����������7����(��#�����������������D��&�441� ���:�44?80R�&0.!&0R!�(u0Q&�

��� Q�@S1&�440Q-8�(u.&�<�<S1&�44?,00��(uQ&�8�.S1&�44.@0-��(uQ&�8�.S1&�44,?-8�

�� (u@&� 8�<S1&� 448-0?!� (u@&� 8�<S1&� 448Q??4� (u@&� 8�<S1&� 440R?.A&0<&00�� (u?&�

��� ,�.S1&�448,-0.�� (u?&� ,�.S1&�4488Q,8>� (uR&� ,�<S1&�44<,,8�� (uR&� ,�<S1� ���

��� 44@0@88!�(uR&�,�<S1���

��� ������,���� �������������������#�����8,�����7���� ��������8�������������������

��� �7� �������� �#� ����&� ��� ������ �������� �����7����� ������ ����7���� ���������

��� ����������� ���� ����7�������:�440R?.A&0<&00�� (#����0,�8S� ���,�.S� �� ����,--./0,�

� � ������&���-�--01&�44Q0,8!&0.�&0.!�(#����Q�@S���,--0/-<�����������-�RS������������

� ������&���-�--01����4400-0Q4�(#����,�.S����-�-S&��u-�-,R1��H��������������&�

� � ����7����44?80R�&0.!&0R!����448Q??4���������������#�����������(#����8�,S����

� � Q�@S&��u-�-,,+����#����-�-S����8�<S&��u-�--?1���

Page 149: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0-<�

� Antibiotic susceptibility. ������ 8� ��� �� ���� ��� ���������%��7� �#� .� �������������

� � ����������������������������������8�����7�����������������������7�����#����

� � ��������#�������������7� ��� �#���D���;�#����D��� ��������%��� ����������� ����

� � ����7� ������� (#���� @.�?S� �� ,--0/-<� ������&� ��� .-�QS� �� ,--R/-Q� ������&� ���

� � .8�,S� �� ,--./0,� ������1�� 5� ������&� ������������7� ��� ������������� ��� �/

� � �����D����������������������������������7���������H��������������&������� ����

��� ������� �� #���������������������� ��������%��&����� ��������##������ ����

�� ��� �����������7� ����#���� (�a-�-R1�� 5� ����� ������&� �/������������7� ���

��� ��7�����7�&������7����������7�����������������������,--R/-Q�������&�

��� ������� ���� ���� ���������� �#� "4A@+� �� �%��&� �� ����#���� ������� ��

�� ��7�����7�� ��������� ����������� �� ����,--./0,�������&� ���������� ������

��� �������������������������������7�����7������������������������7��

��� ()������7��1��

��� H%�����&�,,?�(<-�,S1���������� ���������������������������������������������&�.8�

��� (0?�?S1� ���� ��������� ��� ��� ������������ ����� ��� @0� (0,�?S1� ��������� ����

��� ��������� ��� � �� ������������ �������� �����7&� 0@,� �������� (8-�?S1� ����

��� �����/����� ��������&� ��#���� ��� �/����������� ��� ��� ������ ������ ������������

�� �������(������<1��4������������#�����7��#������/�����������������������7�

��� �������&��������������7�����#������������ ��������%���#����,--0/-<����,--R/-Q�

��� (8?�RS����,<�8S+��u-�-0@1+�E� �%��������/�������������� �������� �� ����#����

�� ������&� ������� 88�RS� (�u-�-<,1�� !��� ����� �����&� ��##������ �� �����/�����

��� ��������� �����%��� ��� ��� ���� #����� ��� ����� �������� ���� ��� �����������7�

��� ����#���� (�u�-�?<<1��)����/��������� ���aR��������������������������������7�

��� ����������� ���� ����7� ������&� #���� ,,�?S� �� ���� ,--0/-<� ������� ��� .�,S� �� ����

��� ,--./0,� ������� (�T-�--01�� E� �%��&� �����/����� ��������� ��� 8� ��� <�

��� ���������������� ��������� ������������������������������7�������&�����������

��� ��##������ ������������������7�����#���� (�u-�8R.�����u-�-R@&� �������%��71��

Page 150: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0-R�

�� ������������ �������������� ���� �����7������#� ��������7���&� ��������7�

��� ������ ����7���� �D�������� "4A@� �����7����� ����&� #���� ����7����

��� (44Q0,8!&0.�&0.!&�440R?.A&0<&00�&�44.-?>����44QQ0.!1� �����������������������

�� ��� �����/��������� �� ���� ,--0/-<� ������� (u� ,8� �#� R-� �����/����� ���������

��� �������1��`������&�������#������������������������7������/��������������

��� �����7���� 0R�&� 0.�&� ?4&� ��� ,8�� ��� �����%��&� ��������7� ���������� ����

��� ����7����44?80R�&0.!&0R!&�448Q??4&�448,-0.�&�44<,,8�&��������%��7�(u�8R;?.1��

Page 151: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0-?�

��� Discussion

��� 3���������������������#�"4A@&����������������������5"���������7�"4A@�

�� �����7���� ���� ���� �����%��� ��� ��7� �� ������&� ���� ����� �� �������@/.&0@/0Q�

��� E� �%��&�#� �����������%������������������������������������7����������

��� �/�%���%���������������������������������I������%��������0.������������

�� ����7� ��������� ������ �� ���� ������������ ������������7� ������ ��� �����7����

��� ��� ����7���� �#� �������� ������ ����� �D���������� �� 4H"�� �������&�

��� �%�������� ��%��7����������� ���������������������������������������3����

��� �#�"4A@��

��� ""3A,8� ��������������3������0.Q8&�����������������������Q-S��#�4H"��

��� ��������� ������ ���� ����7� ������&� ���� �����7��� �%������ �#� ""3A,8� ���������

��� �%��� �����(#����@0�@S����<.�RS1+��� �%��&� ������������� ������������#� ����

�� "4A@������ ������7&���������"4A@������7��������������%������7�""3A,8�� 5�

��� #��&� ���� �������������7���� ������� ��""3A,8�������������7��������������

��� �����������������&�����%���������&�������������7���0@!�(�T-�--01��5��������&�

�� <0��#�@R���������%������� ����""3A,8� �����#������7������7�������������

��� ����� %���� (����� ��� ��� 1�� ������ #���� ��������� ���� ����� ����� ������

��� �##���%����� �%������ ��������� �#������ �� 4H"�� �������� ��

��� ����%�������,-� E� �%��&� ��7��� ����� �7���������� �%�����&� ��� ���� ����

��� ���������� �� ��������� ��������� �#� ����� %���� ������� ���� ��������7� �#� ������

��� �������&� ��� #��� ����� ������%������� ����""3A,8� ��� ������ ����������R� 5�

��� ����������&�""3A,8�%������������ �����7��%�������� #����,-0-� ���,-0,&����

�� ����%������� ����� ��� �� ��� (u@R��#�0<.��������&�R-�8S1� ������������������

��� ���#�����������������(����:;;�����������#����;��#;��������,0vR���#1���

��� H��������������&�"4A@� ��������������3����#������������,--0&����������

�� ����������������,--?/-@�(?,�RS1�0-���������������#�"4A@������������7&���

��� �����������������#������7����0<&�.A&�?>����0Q4� ��������%��&������������

Page 152: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0-@�

��� �D���������� �#� 4H"��� 5� ��������&� ����7���� �D�������� ������ �����7���:�

��� 440R?� (�D�������� �����7���� 0<� ��� .A1� 4400-� (�����7��� 0Q41� ��� 44.-�

��� (�����7���?>1&���������������7�����������5�������&���������������7����0.!����

��� ,8!���� ��������������%���������&� ����� �����7���� ��������Q�@S��#� �%������

�� ���������������,--./0,���������3����7���0.!� ������������� �����������������

� ��%�����7:� �����������,--0/-<����������� �������7����������������7����3���,8!/

�� 3�Q0����44QQ0.!&�������������������#�3���,8!/3�Q0�(��������������� ��������

�� ���������#������7���,8!1� ��������%��&� ����������� ����� ��������#�440@@0.!�

� ���� �� ���� ������������� 5���������&� �������������#������7���0.!���������

�� ���������������������������������������&�������������"��������,0&,,�

�� 3�����7��#����"4A@����������&�����������#��/"4A@������7���� ��������%���

�� ���� ����@&Q&0@�5�����������������������������#����������/�������������������7���

�� 0.�� � ��������� ���� ���� (����7� ���������� ����44,@?� �� *������ ���448,-�

�� ��� ���1&� ���������#� �%���%������/�%���%�� �#���������������������

��� �������,8/,R� 3���������7&� �� ���� ����7� ���� #�����7� �#� �����7��� 0.�� ��������

�� ������� ������ ���� ,--R/-Q� ������&� ��� ��������� ������ ���� ����� �������� �����

��� �����7��� �������7����������� ����44Q0,8!&0.�&0.!���,--0/-<�������+��� �%��&���

��� ����������� ��������#����������/���������448,-0.�� ���� ��������%���������

�� ���� ,--./0,� ������&� ������ #����� ����� 0.�� �����7��� ���������� G�%���������&�

��� �����7���0.��������������"4A08&� ���� ��������������3������B���,-0-�

��� #���������������,-0,�#�������������

��� ��������� ��� ��� ���� ����7� ��� �%������� ���� ������ �#� � � �I������ %�����

��� ��������� #��� ������� �� 3���� ("4A0-� �� ,--.� ��� "4A08� �� ,-0-1� �� �/

��� ����#��������������"4A08������7����������������"4A@�(0&�8&�R&�?�&�@!����

��� 0.�1� ��������%���������,--./0,���������=��������"4A0-&������%������������

�� ���� ����7� ������� ��� �������� ���� "4A@&� ������� ���� ������ �D���� �����7����

��� ������� �� "4A0-� (0&� @!� ��� R1� ���� ������7� ���������� ���� ���������

Page 153: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0-Q�

��� �%���%�� �������,?&� ��� ���� �������� �� �� �� � #�����7� ������ �����

�� �D�����������

��� 5� ��������� ���� ���� �������&� �� ����� �����/����� ����7� ���#������ �� $�����

��� 3������ ( ����� "4A08� ��� ������� ��)���� ,-0-� ��� ����� �#� ������� ���������

��� ����������1� #���� �� ������� �������� �� ���� ������%�� ������ �#� �����7��� 0.��

��� ������ �%���%�� ��� �/�%���%�� �������&� ���� "4A08� ���������� (,-0-/00�

��� ������1�,@�`������&���������#������#����7����������%������#������7���8&� ����

� � ���%������#�������#����"4A08� ���������&����������#� �%���%������/�

� �%���%�� ��������,@� 5� ���� ������&� �����7��� 8� ��������� 0�<S� �� ���� ����� ��������

� � E� �%��&� ��� ����� ������� ��� ��%����� �� ,--./0-� ��� ,-00/0,� �������� ��

� � ��������#�����7��#������7���8� ��������%���(u0-;0,?&�@�.S����u?;Q-&�@�RS+�

� �������%��71��E��&��������#�����������7���������,-08/,-0<�����������7�������

� � ����� �� ������ ��� ������ ���� �##���%����� �#� "4A08� ������� ���������

� � �#������ ������ �7� �����7��&� ������� ����� �D���������� �#� 4H"�� �����

� � �����7���8����������������������

� � H%������"4A08��%�������#����������������D��������������������,--./�

� � 0,� ������� ��� �� � (,@�,S1�� E� �%��&� 4H"�� ��� ���� ���� �����7��� ��������

��� ���������� ���� ��������� �%���%�� ��������+� %������� �#� ������ ��������

�� ����� �����%�� ������ ������7� �#� ��#�&� �%������ ��%����� ��������� �%���%�� ���

��� �/�%���%������������5������������&�������7����#��������3�������7��������

��� �%������ �#� "4A08� #��� ������� �%��� ?R&� #���� �� ����� �%������ �#� ����� %����

�� (R.�8S�#�����������%���?R�7����&����?<�@S��%���R-1�,Q�

��� ���� ���������� �#� "4A@� ���� ����� ���� �� ������ �� ������ �#� �����������/�

��� ��������� �������� ������ ����� �D����������� ����&� �� �����%��� ��

��� ����#����������������������������#���������� ����������������������������7����

��� �����������������,--R/-Q�������&����������#��������������������������������

��� ������������ �� 4�������&� #���� ?�R?� ����7� ������ ���� 0---� ���������� ��� ��7�

Page 154: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0-.�

��� (�5�1� �� ,--0� ��� Q�Q@� �5�� �� ,--Q�,.&8-� ������ ���� ����� ������&� ��������

�� ������������7� �������7� ��������&� ����� ���������� ������������ �������� �������

��� (Q�R,��5����,-001�,.&8-�

��� 5� ������&� �� ����#���� ������� �� ��������� ��������� ��� �����%��� �� ����

�� ,--./,-0,� ������&� �� ������ �#� ��������� ��������� �� ���� ������������ �����

��� ��������� #���� 0�Q<��5�� �� ,--.� ��� 0�?Q��5�� �� ,-00�,.&8-� ���� ������� �� �/

��� ��������������������������������������������������&����������D��������������

��� �7������D�������#����������/��������������44?80R�&0.!&0R!�����������������#�

��� � � �����/����� ��������� ����7���� 448,-0.�� ��� 448Q??4&� ���� ���� ����

��� �������������������������������������

��� ��������� ����������� ����7� �������������� ������������������&� �������������

�� ����� ����������������7����������7��� �����&���� ������� �������/�����

��� ����������������������������������������D���������� �� ���������#�

��� �I������%������5��������������������������������"4A@������7�������������

�� �������� ����7���&� � �������/����� ��������� ����&�44?80R�&0.!&0R!� ���448Q??4&�

��� ��������������#��������������������

��� !����������%����������������������������������������������#�"4A08����#������

��� �I������%��������������%������#������������������������������������

���

Page 155: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

00-�

��� Acknowledgements

��� `�� ��� ������ ���� ���� �#� ���� ������������ ��� ������ )�3�� ��� ����� ���

�� 5��������4�����������&�#������7�����`��������������`�� ��������������������

��� ���##� ��� ���� )���������7� ���������7� �#� E�������� $�%��������� ��� >���%����� ���

��� ���������������������I�����������7��������

�� Funding

��� ���������7� ��������������7�������#��������!�������5%�����������3���������

��� ��� ��� 3��������� 3����� q"5� -.;-0.-<� ��� "5� 00;--@?8r� ��� �7� 45>*=� ���

��� *#���������� =������������� (45>*=*3� /� 4>-?;-?;--8@1&� ��� �7� ���� 534555� /�

��� 5�����������3�����4������555&�)�����&�3����

��� Transparency declarations

��� 4�����B����%������%���#�����#����"#����&����������������������������7������

�� ������������������������#������#����������

���

Page 156: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

000�

��� =�#��������

�� 0�� `����� E������ H���������� (,-0,1� 4����� ��������%�� �������7� ���������

!�� ����� G�� 80R� �%�������:���

����:;; � �����;���������;#��������;#�80R;��� ������� 0,� B����7����

,-08����

��� ,�� 3����/4�����6�� BB&� )���2��/J��2�� )�&� =��O� 3O���� "� ��� ���� 3�%����

����� �D���������� ��� ��������7� �� �������� ���� ����� ��������%�����

�������7�����������������,--R+�60:�.,R/80�� ��

� 8�� 3����� 3&� )����7� �!�� 5#����� �� ���� ������������ ��� ������ �#� �����

��������%���������7���������� �!�"��#�����,--Q+�359:�,8RR/?R�� ��

�� <�� 4���D�BB&�"�������=B&�>���7��)��������>��������&������&���������������

���������������#� � �������������7������������������������ ������ �

�� 3����7���,-�������:�����%��7��#���� ���������������7����#�$������� �

,-0,+�287:�,@QQR/.<�� ��

�� R�� �45"�������5����������`����J��������%����7�4�����������5����������

"������� (�45"1� ���������� ����������� �������� #��� ������� ����� 0.� ��

�� 7�������������//$�����3�����&�,-08����%&���������� �,-08+�62�3�����

0:�./0.� �

?�� `������� B�&� 3����� 3&� "����� "� ��� ���� 5I������� %����� #��� ���%�����

��������� �#����� �� �������� ���� ����� ��������%�� �������7� �

������������������'���(����)��&���,-0-+�11:�4�--08.-�� �

@�� `����7� 4J&� !����7� ))&� E������ B���� ���������� �� �%���%�� ���������

���������#�������������������#�������/���7����������I������%����� � �

!�"��#�����,--8+�348:�0@8@_<?�� �

Page 157: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

00,�

� Q�

��D��� 4�&� �7#����� =&� ������ =� ��� ���� 4������ �����������7� �#� �%���%�

��������� �������� ����� ������ ������� �� ���� ���� �#� ��������

����������I������%�����#*�*�,--R+�294:�,-<8_R0� �

�� .�� L7� � )E&� �7#����� =&� 3��##��� `� ��� ���� *##��� �#� ���������� �#� ����

��������� �I������ %���� �� ����/��������� 3���������� �

�� ���������� �!�"��#����+�,--?+�354:�0<RR/?8��*������� �:� �!�"��#�����

,--?+�355:�?8Q�� ��

� 0-�� A����4��������&�H����J�����H&�J���F�����"F�����&��������*%��������#�����

������������ %������� �%������ ����� ������� �� ���� ������ �#� ��

��������&�3���&�,--,/,-00��&���!��������(�����,-0,+�86:�?8@/<8� ��

�� 00�� ������� �&� �����7� 4&� 4�����7��� �� ��� ���� 3����7���� ��� ����7���� �#�

������������ ��� ������ ������ �������� ��� ����� �D���������� �� ��

�� �������� �����������������%���������7����������#�*��� ����(���� ������

,-00+�66:�<Q@/.8�� ��

� 0,�� "�� ����=�&�>������3&�4��%����7�")��������J�������������7�#���������������&�

��������&� ��� ���%����� �#� ����� ��������%�� �������7� ��������� ��

�� GE�>5;`EH�J������ 5������%�� #���4�����H�������%�������������� (JH��1�

`��������������7��* �#�&�������������������,--0+�163:�0,R?/@?�� �

�� 08�� =����>&�4���������B&�A���������=��������"�������%������7��#��������#������

�#� ������� J���� ����� �� ���� ������� �������� ��� ������7/�������� ��

��������������������������������������,�-����'��,---+�31:�Q?./@<�� ��

�� 0<�� "4=����������#�"��������3����7�����4������#�����������4���������

"��%������ ����:;; �����%;����;������;�����;������� (<� !������7� ��

,-08&�����������������1�� �

Page 158: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

008�

0R�

!������&����������&�A������)���������3����7������������������������������7

�#���������������� ���������������#������������#�������3����#����0..@���

,--Q��*��� ����(�*"������� ������,-0-+�54:�R8Q@/.-� �

0?�� *������ )4&� 3������ >J�� �� ���������� ������� �7���� ������ #���

������������ ��� �����:� �����#������ �#� ����� ���������� ���� �������� �

�%���%����������������(����")�0..Q+�144:�8-<./?-�� �

� 0@�� �����7� 4&� ������ !&� "�������� =� ��� ���� *����������7� �#� �%���%��

��������� �������� ����� ������ �������� �� >������� ��#���� ��� �#���� �

� ��������� @/%����� ��������� �I������ %���� ���������&� 0..@/,--@��

�����,�-����'��,--.+�48:�R@/?<�� ��

� 0Q�� !����� �&� J������ BB&� �������� �� ��� ���� ��������� ������ �#� �%���%��

��������������� �����������7�������������������������������������� ��

3����#����0.@.����,--@��#�����������(����,--.+�47:�0-0,/,-�� ��

� 0.�� !����� �&� �������� �&� J��F��� )B� ��� ���� A��������� �� �����7���� ���

������������7� �#� ������ �/�%���%�� ������������ ��� ������ ��������� ��

��

��

��� ��� ��������������#���� ()�7�,---/)�7�,--01����0-� 7������#���� ()�7�

,-0-/)�7�,-001� �����������#��I������%�����#�������� ����������� ��

3�����,���#�*��� ����(�*"����,-0,+�40:�0Q/,8�� ��

�� ,-�� A���/4��������&�H���/J�����H��"��������%�������������������

�������������������7���������:��������������%��%�� ��!������&���.������� ��

,-0,+�11:�,,0/8?�� �

�� ,0�� E������/>���3&�J����/J�����BB&�J����&��������"������������������

������� �������� �� ��������� ���������� ���� �� ���� ���� �#� ��������� ��

�I������%�������>��������'��"�������(����,�-����'��,-0,+�74:�,RQ/?,�� �

Page 159: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

00<�

�� ,,�

��

��

��

=��������� !&� !������ �&� 4�������� !&� ��� ���� "��������%�� ������ �

������������������������������������7������"���������#����?�7����

�#����������I������%����������������� �#���������������������%���

�����7���� ���� �� ��� ���������� ��� ������ �� ��%�����7��.������� ,-0,+� 30:

8.R0/?� ��

�� ,8�� "��� =&� )����� )=&� "�����%���� �&� ��� ���� "���%���� ������ ��������� �#�

��������������� �����������7���0.��#�����������������$�����3�������#� �

,�-����'��,--R+�192:�0.QQ_.R�� ��

�� ,<�� �����7�4&�=�����&�!��������������*��������#������������/�������������

(3�8,-1� ����� �%���%�� �����7��� 0.�� �������� �� 3�����#� *��� ����(� �

��� ������,--.+�64:�R-@/0-�� ��

�� ,R�� "�������� )*&� 4���7� B=�� *������� �#� �� �������������� �����7��� 0.��

��������� ������ ��� ������� �� ���� @/%����� �I������ %���� ��� �� ��

���������������������#*�*��,--@+�298:�0@@,/Q�� ��

�� ,?�� >��������� �>&� "���� �*&� 4����� �`&� ��� ���� ��������� ��� ����������

��������7��#��������������/����#���%���%��������������������#������������� ��

��� ����������������#�,�-����'���,--<+�190:�0,-8/00�� �

�� ,@�� =������33&�E������L"&������4�&��������"�������������7������#����

��� �#���� ���������� �#� �I������ %����&� $����� 3�����&� 0.../,-00�� ��

! ��"�,�-����'���,-08+�19:�0-@</Q8�� �

�� ,Q�� �����7� 4&� )������ B)&� 4�����7��� �&� ��� ���� *����������7� �#� �%���%��

����������������������������������3����(,--@/,--.1:� �����������#��� ��

#������%��������������������/���0����,-0,+�7:��<8?0.�� ��

Page 160: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

00R�

�� ,.�

��

�����4&�4����B)&�J������)B����������������������������%������������0?�7����:

#� ����������������� ������������ �������������!�� #�����������(���� ,�-���

'��,--.+�28:�Q.8/@� ��

� 8-�� 4����7��� �������M���� �� ������ ��� ����� �� ��������� �� 4�����7���

����:;; ,-��������;���;��������;E���S,-4���S,-3����;"��#����� ��

��

���;=������;>��������v��v�����;"=H)H45Hv5v"=H�*445Hv�*v��v3��

$�;>*4v>�������v������������v��v4�����7�;,-0,;��D���;��v���v,-0,��

�#�(0@�)�7�,-08&�����������������1�� ��

Page 161: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

00?�

����

�7����

�G����#���

���

���

(uR?,1

�����

�0��!��

���7

��#�����

��

����

���

�7����

�����

����#��

���

���

��D�

���

����

��

����

���������

��,

--0/,

-0,��

����

� �� ��

,--R/-

Q����

,--.

/0,�

�����

���

,--0

/-<����

,--./0

,��

�������

,--0/-

<�(

u08Q1

,--R/-

Q�(u,0Q

,--./0

,�(

u,-?1

�����

���

�����

��

��

�������&

�S"

�%���

��

�����

��

��

�������&

�S"

�%���

��

�����

��

��

�������&

�S"

�%���

00<�(,-�8

18.�0

�0@�-

�00�,

�-2

2.1

<0.0

01

/R�Q

�-�-

0-

-27.

9<0

.00

� 8<�(?�0

10-�.

�,�Q

�?�8

�-8

.20.

002

8�?

�� -�0

--

/<�?

�-�0

R.

1 �"

4A

@��

���

�7����

0.!\�

,8!\�

� ,R�(<�R

1?�?

�R&-

�,�<

�/0

�?�

-�R

<<

/,�?

�� -�,

-<

/<�,

��� -

�-.,

� ,0�(8�@

1?�?

�<�?

�0�-

�/,

�-�

� -�<

0.

-3.6

� 0.03

7-5

.6� 0

.009

� 0Q�(8�,

1Q&-

�,�8

�0�-

�-5

.7� 0.

011

/0�8

�-�<

R0

-7,0

0.00

10<\�

.A

\�

?>

\�� ?

�(0�0

18�?

�-�R

�-�-

�-3

.20.

034

/-�R

�� 0�-

--

-3.6

0.01

00Q4

\� ?�(0�0

1,�.

�-�.

�-�-

�/,

�-�

-�?

Q.

/-�.

�� 0�-

--

-2.9

0.02

5� <�(-�@

1-�@

�-�.

�-�R

�-�,

�� 0�-

--

/-�<

�� 0�-

--

/-�,

�0�-

--

<\�

"4

A0-��

���

�7����

�0,@�(,,�?

18.&.

�,-&?

�08&0

�-1

9.3

� <0.0

01

/@�R

�� -�-

R,

-26.

8� <0

.00

100�(,�-

1-�@

�8�,

�0�R

�,�R

�-�0

R.

/0�Q

�� -�8

<-

-�Q

�-�?

R,

� 0�(-�,

1-�-

�-&-

�-�R

�-�-

�� 0�-

--

-�R

�� -�<

Q?

-�R

�� 0�-

--

@!\�

0\�

R\�

� 0�(-�,

1-�-

�-�R

�-�-

�-�R

�� 0�-

--

/-�R

�� 0�-

--

-&-

�� 0�-

--

"4

A08��

���

�7���

�,0@�(8Q�?

1R<&8

�8.&-

�,@&@

�-1

5.3

� 0.00

6-1

1.3

� 0.01

8-2

6.6

� <0.0

018\�

<?�(Q�,

1@�8

�.�,

�@�Q

�0�.

�-�?

.?

/0�<

�-�@

,Q

-�R

�� 0

�---

0.�

\�� 88�(R�.

1?�?

�?�<

�<�.

�/-

�0�

� -�.

R?

/0�?

�� -�R

88

/0�@

�� -�?

80

?�

�� 00�(,�-

1-�@

�,�Q

�0�.

�,�-

�� -�,

R?

/-�Q

�� -�@

R,

0�,

�� -�?

R,

�/"

4A

08��

���

�7����

� 8<R�(?0�?

18.&0

�<<&R

�R?&Q

�R�<

�� -�8

,<

12.3

� 0.01

217

.7� 0.

001

00�

\�8<�(?�0

1@�8

�R�R

�R�Q

�/0

�Q�

� -�R

-R

-�8

�0�-

--

/0�R

�-�?

R?

0R�

�� ,Q�(R�0

1,�,

�,�Q

�.�,

�-�?

�� 0�-

--

6.5

� 0.00

67,

0� 0.

011

,8�

�� ,,�(8�.

1,�.

�<�0

�<�<

�0�,

�� -�R

RR

-�,

�0�-

--

0�R

�-�R

@<

0?!�

� ,,�(8�.

1R�0

�8�@

�8�<

�/0

�<�

� -�R

0,

/-�8

�� 0�-

--

/0�@

�� -�R

@.

?4

�� ,-�(8�?

1-�-

�<�0

�R�8

�4.

1� 0.

014

0�,

�� -�?

<.

5.3

� 0.00

4,8>

�� 0.�(8�<

18�?

�,�8

�<�<

�/0

�<�

-�R

0Q

,�0

�� -�,

Q8

-�Q

��-

�@Q.

80�

� 0Q�(8�,

1,�.

�<�0

�,�<

�0�,

�� -�R

RR

/0�@

�� -�<

0.

/-�R

�� 0

�---

8R>

�� 0Q�(8�,

1,�,

�8�@

�8�<

�0�R

�� -�R

<-

/-�8

�� 0�-

--

0�,

�� -�@

<?

,,!\

� 0Q�(8�,

1,�,

�<�0

�,�.

�0�.

�� -�8

Q8

/0�,

�� -�?

-8

-�@

��� -

�@<R

� 0-�

\�� 0@�(8�-

10�R

�8�,

�8�.

�0�Q

�� -�<

.0

-�@

�� -�@

.?

,�<

�� �-

�8,?

88!\

� 0@�(8�-

1<�<

�,�8

�,�.

�/,

�0�

� -�8

<Q

-�?

�� -�@

??

/0�R

�� -

�RR<

� 8R!�

� 0,�(,�0

10�R

�8�,

�0�R

�0�Q

�� -�<

.0

/0�Q

�� -�8

<-

-&-

�� 0�-

--

,0�

� 0-�(0�Q

10�R

�0�Q

�0�.

�-�<

�� 0�-

--

-�0

�� 0�-

--

-�<

�� 0�-

--

0@!\

� .�(0�?

1-&-

�0�<

�,�.

�0�<

�� -�,

Q@

0�R

�� -�8

,@

2.9

� 0.08

5� ,

<!�

� .�(0�?

1-�@

�0�<

�,�<

�-�?

�� 0�-

--

0�0

�� -�<

.8

0�@

�-�<

-Q

.G

\�� @�(0�,

1-�@

�0�<

�0�R

�-�?

�� 0�-

--

-�0

�� 0�-

--

-�Q

�� -�?

R,

,--0

/-<�

%���,

--R/

-Q�

�����

����

#����

��(S

1�

Page 162: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

00@�

8<�

?��(0�0

1�-&-

�0�Q

�0�-

�0�Q

�-�8

-8�

/-�.

�� -�?

Q?�

0&-

�� 0�-

--�

8Q�

R�(-�.

1�-&-

�,�8

�-�-

�,�8

�-�0

?0�

/,�8

�-�-

?,�

-&-

�0�-

--�

,-\�

R�(-�.

1�-�@

�-�.

�0�-

�-�,

�0�-

--�

-�0

�0�-

--�

-�8

�0�-

--�

�/�7�

���

���

<�(-�@

1�-�

-�

0�.

�-�-

�0�.

�0�-

--�

0�.

�-�R

0Q�

0R4

�,�(-�<

1�-�

-�

0�-

�-�-

�0�-

--�

0�-

�-�,

8?�

0�-

�0�-

--�

8@�

,�(-�<

1�-�

-�R

�-�R

�-�R

�0�-

--�

-�-

�0�-

--�

-�R

�0�-

--�

0R!�

0�(-�,

1�-�@

�-�

-�

/-�@

�-�8

QQ�

-�-

�0�-

--�

/-�@

�-�<

-0�

,@�

0�(-�,

1�-�@

�-�

-�

/-�@

�-�8

QQ�

-�-

�0�-

--�

/-�@

�-�<

-0�

<,�

0�(-�,

1�-�@

�-�

-�

/-�@

�-�8

QQ�

-�-

�0�-

--�

/-�@

�-�<

-0�

0-!�

0�(-�,

1�-�

-�

-�R

�-�

0�-

--�

-�R

�0�-

--�

-�R

�0�-

--�

08!�

0�(-�,

1�-�

-�

-�R

�-�

0�-

--�

-�R

�0�-

--�

-�R

�0�-

--�

8R!�

0�(-�,

1�-�

-�

-�R

�-�

0�-

--�

-�R

�0�-

--�

-�R

�0�-

--�

Q\�

0�(-�,

1�-�

-�R

�-�

-�R

�0�-

--�

/-�R

�0�-

--�

-�-

�0�-

--�

\""

3A

,8��

���

�7���

8,Q�(RQ

�<1�

@0�@

�RQ�8

�<.�R

�-1

3.4

0.01

2�-8

.8-�-

Q-�

22.2

<0.0

01�3

�%�

��

��

�����

����

���

����

�%�

�����

��

#���

����

�7���

���

7���

�(8

�����

��

��

#���

�,-

-0/-

<&�

@�

#���

�,--R

/-Q�

���

.�

#���

�,--

./0

,1�

�����

�0�(4

HG

�1�

0,!\

@�(0�,

1-�@

�0�Q

�0�-

�0�0

�-�?

R8

/-�.

�-�?

Q?

-�8

�0�-

--

� 0R>

\�� @�(0�,

1-�@

�-�.

�0�.

�-�,

�� 0�-

--�

0�-

�� -�<

8Q

0�,

�� -�?

R,

Page 163: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

00Q�

�����

�,��J

��

�7����

����

�����

�8��

���

���

����

���

���

����

����#��

���

���

��D�

���

����

���

�����

,--

0/,

-0,��

�����

��

4��

���4

��

���D&

�4

4�

3���

#����

G����#

�����

����

(S1�

����

�7���

����

���

��(G

����

#���

���

���1

,--0/-

<�

(u08Q1�

,--R/-

Q�

(u,0Q1�

,--./0

,�

(u,-?1�

�/%

���

���

#��������

�0�

���,

�/%

���

���

#��������

�,�

���8

�/%

���

���

#��������

�0�

���8

44

0R?�

8<�(?�-

1�0@�(0,�8

1�00�(R�-

1�?�(,�.

1�0.

013

-�8

,8�

<0.0

014

4?8�

80�(R�R

1�@�(8�,

1�0Q�(Q�@

1��-

�R@8�

0.02

2�-

�08R�

44

?,�

,@�(<�Q

1�0-�(<�?

1�Q�(8�.

1�-�<

@8�

-�Q

0,�

-�8

0<�

44

0Q-�

,R�(<�<

1�.�(<�0

1�.�(<�<

1��-

�@.<�

0�-

--�

-�@

.Q�

44

Q0�

,0�(8�@

1�Q�(8�@

1�0�(-�R

1��-

�-RQ�

0.03

8<0

.001

44

8-�

,0�(8�@

1�Q�(8�@

1�@�(8�<

1��-

�@Q<�

0�-

--�

�-�@

@R�

44

<,�

,-�(8�?

1�00�(R�-

1�R�(,�<

1�-�<

,,�

-�,

-<�

0�-

--�

44

,?-�

0?�(,�Q

1�@�(8�,

1�@�(8�<

1��-

�<.0�

0�-

--�

�-�8

,<�

44

.@�

0R�(,�@

1�Q�(8�.

1�-�@

00�

-�<

-?�

-�8

,?�

44

QQ�

00�(,�-

1�8�(0�R

1�-�,

@-�

0�-

--�

-�,

@R�

44

RRQ�

0-�(0�Q

1�<�(0�.

1�0�-

--�

0�-

--�

0�-

--�

44

<88�

0-�(0�Q

1�,�(0�-

1��-

�0RQ�

-�0

@@�

0�-

--�

44

8RQ<�

0-�(0�Q

1�<�(0�.

1�-�<

00�

0�-

--�

-�?

R,�

44

88Q�

0-�(0�Q

1�R�(,�<

1�-�?

<8�

-�,

@8�

�-�@

-?�

44

0.0�

.�(0�?

1�8�(0�R

1�-�<

0,�

-�@

,R�

-�?

R,�

44

@0@�

3�0R?&�3

�Q8Q&�3

�?R,0�

3�?8&�3

�,808&�3

�,0--�

3�?,&�3

�<8-R�

3�0Q-&�3

�,80<�

3�Q0�

3�8-&�3

�R@-�

3�<,&�3

�@.0?�

3�,?-&�3

�0,,-�

3�.@�

3�QQ&�3

�Q@�

3�RRQ�

3�<88�

3�0@??&�3

�@Q--�

3�88Q�

3�0.0�

3�@0@&�3

�0-0,�

.�(0�?

1�8�(0�R

1�-�8

Q-�

-�,

@8�

0�-

--�

44

<8,�

Q�(0�<

1 �,�(0�-

1�0�-

--�

-�?

Q?�

0�-

--�

44

.Q.�

@�(0�,

1�,�(0�-

1�-�?

R8�

-�?

Q?�

0�-

--�

44

,8-�

3�<8,�

3�.Q.�

3�,8-�

@�(0�,

1�8�(0�R

1�-�0

?0�

0�-

--�

-�,

@@�

44

8,-�

8�(-�R

1�?�(,�.

1�0�-

--�

-�-

?0�

-�-

QR�

44

8Q?�

@�(0�,

1�@�(8�<

1�0�-

--�

0.00

60.

045

44

00-�

?�(0�0

1�-�(-�-

1�-�,

0,�

-�R

--�

0.02

54

40,-0�

?�(0�0

1�,�(0�-

1�0�-

--�

0�-

--�

0�-

--�

44

?@�

R�(-�.

1�,�(0�-

1�-�R

?,�

-�?

0<�

0�-

--�

44

0@@�

R�(-�.

1�<�(0�.

1�0�-

--�

-�-

RR�

�-�?

R,�

44

8.,�

R�(-�.

1�<�(0�.

1�0�-

--�

-&,

-<�

�-�0

R,�

44

.-�

<�(-�@

1�-�(-&-

1�-�8

-8�

0�-

--�

-�-

?<�

44

?.QQ�

8�(-�R

1�0�(-&R

1�-&0

R-�

0�-

--�

-�R

?@�

44

,<@�

8�(-�R

1�

.A

�(0?1&�0

<�(0R

1&�0

0�

�(81��

0R�

�(,?1&�0

.!�(<1&�0

R!�(01�

00�

�(,@1�

8�(,R1�

,8!�(0,

1&�0

.��(R1&�0

.!�(<1�

0?!�(,0

1�

,8�

�(0@1&�0

<�(01&�0

.�

�(01&�,

8!�(01�

8�(0?1�

0-�

�(0R1�

0.!�(00

1�

8R>

�(@1&�8

R!�(81�

,,!�(0-

1�

80�(0-1�

,8>

�(Q1&�,

8!�(01�

@!�(.1�

88!�(Q1�

,0�(Q1�

0,!�(@1�

,<!�(<1&�0

R�

�(01&�0

.��(01&�@

!�(01�

0.�

�(@1�

?4

�(?1&�?

��(01�

0Q4

�(?1�

0.�

�(?1�

.G

;��(<1&�0

<�(01�

0.!�(R1�

0R!�(R1�

?>

�(<1�

,8>

�(81�

<�(81�

0�(-&R

1�0�-

--�

0�-

--�

0�-

--�

44

R08R�

8�(-�R

1�0�(-&R

1�0�-

--�

0�-

--�

0�-

--�

44

,,<�

8�(-�R

1�-�(-&-

1�-&,

Q?�

-�,

<.�

0�-

--�

44

<8.�

3�8,-&�3

�,8Q8�

3�8Q?&�3

�<Q,R�

3�00-�

3�0,-0�

3�?@�

3�0@@&�3

�R0��

3�8.,�

3�.-��

3�?.QQ�

3�,<@�

3�R08R�

3�,,<�

3�<8.&�3

�,8@,�

8�(-�R

1�

8R>

�(81�

,8>

�(81�

,8>

�(81�

?�(<�8

1�

.�(?�R

1�

@�(R�0

1�

0,�(Q�@

1�

?�(<�8

1�

<�(,�.

1�

,�(0�<

1�

,�(0�<

1�

R�(8�?

1�

,�(0�<

1�

0�(-�@

1�

0�(-�@

1�

,�(0�<

1�

0�(-�@

1�

8�(,�,

1�

,�(0�<

1�

0�(-�@

1�

-�(-�-

1�

-�(-�-

1�

-�(-�-

1�

<�(,�.

1�

0�(-�@

1�

,�(0�<

1�

0�(-�@

1�

-�(-�-

1�

8�(,&,

1�

,�(0&<

1�

0�(-&@

1�

0�(-&@

1�

-�(-&-

1�

-�(-&-

1�

R�(,�8

1�

8�(0�<

1�

<�(0�Q

1�

@�(8�,

1�

R�(,�8

1�

,�(-�.

1�

R�(,�8

1�

,�(-�.

1�

<�(0�Q

1�

<�(0�Q

1�

<�(0�Q

1�

0�(-�R

1�

-�(-�-

1�

,�(-�.

1�

8�(0�<

1�

0�(-�R

1�

-�(-�-

1�

0�(-�R

1�

0�(-&R

1�

-�(-&-

1�

0�(-&R

1�

0�(-&R

1�

8�(0&<

1�

0�(-&R

1�,�(0&-

1�0�-

--�

-�?

0<�

�-�R

0Q�

Page 164: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

00.������

�8��4

�������

���

#�����

���

���

�����

�����

����7

��#���

��

��

���

����

�����

�����

���

�����

��#���

���

����

D��

������

��

��4

H"

���

����

��

��

,--0/-

<��

����

��(

u08

Q1�

,--R/-

Q��

����

��(

u,0

Q1�

,--./0

,��

����

��(

u,-

?1�

)54

R-�

��;�

�)

54.-�

��;�

�3

&�S

�=

&�S

�)

54R-

��;�

�)

54.-�

&�S

��(

��;�

�3

&�S

�=

)54

R-�

��;�

�)

54.-

��;�

�3

&�S

�=

&�S

�� �

�� �

,�

R<�@

�Q�-

�T-�-

8�0�

@,�R

�-�R

�<0

.001

T-�-

8�0�

?R�-

�0�R

�-�0

0?�

-�-

@-�

0�

@.�?

�-�-

�T-�-

8�-�R

�.-�Q

�-�-

�0.

004

T-�-

8�-�R

�.8�,

�0�R

�-�8

@.�

<0.0

01/�

,�

�R�0

�T-�R

�/�

�@�Q

�-�8

.-�

T-�R

�/�

�Q�8

�0�-

--�

-�,

Q.�

.?�<

�8�?

�T-�R

,�

0�

.R�.

�<�0

�0�-

--�

T-�R

?8�R

�8?�R

�T,�

T,�

0�

0�

a<�

.,�,

�@�Q

�-�0

<Q�

?@�R

�8,�R

�-�-

?@�

-�0

?@�

-�<

Q?�

?R�-

�8R�-

�T-�,

R�T-�,

R�a8,�

?-�@

�8.�8

�0.

007

-�<

,.�

?R�@

�8<�8

�T-�,

R�

a<�

@R�@

�,<�8

�0.

016

a8,�

@8�<

�,?�?

�-�-

.@�

a8,�

@?�0

�,8�.

�0.

038

T-�,

R�a8,�

?.�<

�8-�?

�-�0

,@�

-�<

Q0�

T0�

a<�

a8,�

a8,�

Q�

Q0�,

�0Q�8

�T,�

Q�

.0�@

�Q�8

�0.

007

T,�

<�

.<�,

�R�Q

�-�8

R-�

<0.0

01

"��

����

�(�

/�

��

����

�1�

4�#�

��D�

���;�4

�#��

��D�

��

4��

��#��

D��

��%�

#��D�

��

�����7

��

��

*�7

����

�7

��

4��

���

7�

4���

���

���

����

4�/����

�D�

����

T-�-

8�

T-�-

8�

T-�R

T-�R

T,�

T-�,

R�

T-�,

R�

T,�

T-�R

;.�R

�a<;@

?�?,�-

�8Q�-

�T-�R

;.�R

�a<;@

?�?.�?

�,Q�R

�-�0

?<�

T-�R

;.�R

�a<;@

?�@?�@

�,0�<

�-�0

,8�

0.00

5

3&���

���

���

���

�����

������

����7

+��=

&���

�������

����

��

���� G

��#��

D��

�����

���

���

����

������

���

���

����#������

����

����

��#��

���

���

���

���

�������

����

���

����

� ���

������

���

#��D�

���)

54T�

��$%

���

����

�&�

$���"

���

"��

&���

���

&���*

+,-

���

����

/��

$�&0

����

��,�

1�/�

�����

��&0

�&0��

����

,���

/����

���� +

,-�

����

��/

��$�

����

,���

/����

���

�&0�&0

����

��,�

��/�

�����

�� +,-

���

���

�/

��$�

&0��

����

,�1�

�/��

����

��&0

�&0��

����

,���

/����

���

Page 165: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

�����

�<��!��

���

7��

#����

��/��

������

����

���

��

��

��

������

����#��

���

���

��D�

���

����

�&

��7�

������

��#��

�����

,--0/-

<�

(8?�,

S&�

R-;0

8Q1�

,--R/-

Q�

(,<�8

S&�

R8;,

0Q1�

,--./0

,�

(88�R

S&�

?.;,

-?1�

����

�7���

�(G

����

#���

�����

�1�

3��(G

����#���

���

���1

� �

=���

����

����

�8��

���

���

�����

����

���

(u8,

1�?�(<�8

1�00�(R�-

1�0R�(@�8

1�

44

?8&����

����

��"

*G

&�*

=5�&�

*��(u,1�

"*

G&�*

=5&�3

P��(u01�

���

����

��

"*

G&��*

�&�3

P��(u,1�

44

Q0&����

����

��

"*

G&�3

P�&�4

5"�(u01�

-�(-�-

1�-�(-�-

1�,�(0�-

1�0R�

�(01&�G

��(01�

-�(-�-

1�0�(-�R

1�-�(-�-

1�0<�(01�

-�(-�-

1�,�(-�.

1�-�(-�-

1�0.�

�(,1�

0�(-�@

1�-�(-�-

1�-�(-�-

1�.A

�(01�

44

0R?�

*=

N&�4

�5&��

*��(u0?1�

,�(0�<

1�<�(0�Q

1�0-�(<�.

1�?�

�(81&�8

8!�(,1&�0

R>

�(,1&�0

.!�(,1&�0

R�

�( �01&�,

8�

�(01&

0.�

�(01&�?

4�(01&�0

<�(01&�0

R4

�(01

&�0�(01

44

8Q?&�4

4?8&�4

4@0

@&�4

4<,&

�44

0@@&����

����

��

*=

N&�4

�5&�4

5"�(u<1�

,�(0�<

1�0�(-�R

1�0�(-�R

1�88!�(,1&�0

.�

�(01&�0

?!�(01�

*=

N&�4

�5&�3

P��(u,1�

-�(-�-

1�,�(-�.

1�-�(-�-

1�0?!�(,1�

*=

5&��

*�&�3

P��(u01�

-�(-�-

1�-�(-�-

1�0�(-�R

1�,8!�(01�

�*

�&�4

E�&�3

P��(u81�

0�(-�@

1�0�(-�R

1�0�(-�R

1�,8�

�(01&�0

,!�(01&�8

�(01�

44

@0@&�4

4<,&�4

48-

44

8-�

44

,<,�

44

<,&�4

4.Q.&�4

40Q

-;,

80<�

=���

���

����

�<��

���

���

�����

����

���

(u?R

1�08�(.�R

1�0@�(@�Q

1�8R�(0@�-

1�

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*��(u�<

-1�

@�(R�0

1�Q�(8�@

1�,R�(0,�0

1�0R�

�(0.1&�,

<!�(R1&�?

4�(<1&�0

.�

�( �<1&�?

>�(,1&�0

0�

�(01&

?�

�(01&�0

R!�(01&�0

.!�(01&�G

��(01

-�(-�-

1�-�(-�-

1�0�(-�R

1�0.!�(01�

"*

G&�*

=5&�4

�5&�4

5"�(u

�01�

"*

G&�*

=5&�4

�5&�3

P��(u�8

1�0�(-�@

1�0�(-�R

1�0�(-�R

1�0<�(01&�?

��(01&�G

��(01�

-�(-�-

1�-�(-�-

1�8�(0�R

1�0.�

�(81�

"*

G&�*

=5&��

*�&�3

P��(u�8

1�

"*

G&��*

�&�4

E�&�3

P��(u�0

1�-�(-�-

1�0�(-�R

1�-�(-�-

1�,8!�(01�

*=

5&�4

�5&��

*�&�4

E��(u�.

1�<�(,�Q

S1�

<�(0�Q

1�0�(-�R

1�0.�

�(<1&�0

?!�(81&�,

8��(,1�

*=

5&�4

�5&��

*�&�3

P��(u�R

1�0�(-�@

1�8�(0�<

1�0�(-�R

1�00�

�(01&�0

<�(01&�,

<!�(01&�?

��(01&�0

.�

�(01�

*=

5&�4

�5&��

*�&�4

5"�(u�8

1�-�(-�-

1�-�(-�-

1�8�(0�R

1�,-�(01&�8

8!�(01&�G

��(01�

44

?8&�4

48Q?&�4

4,8

-&�4

40,-

0&�4

48,-&�4

4<,

&��

����

����

44

?8;,

0--

;,80

8�

44

?@&����

����

��

44

8,-�

44

Q0�

44

0,-0&�4

48-&

�44

<,&�4

4,-,

&����

����

��

44

?,&�4

4,8-&�4

48,

-&�4

48,@

&�4

4<,�

44

@0@&����

����

��

=���

���

����

�R��

���

���

�����

����

���

(u@R

1�80�(,,&?

1�,R�(00&R

1�0.�(.&,

1�

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*�&�4

5"�(u�@

1�0�(-�@

1�0�(-�R

1�R�(,�<

1�

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*�&�4

E�&�3

P�&�4

5"�(u�<

1�,�(0�<

1�,�(-�.

1�-�(-�-

1�

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*�&�4

E�&�3

P��(u�,

01�

0R�(0-�.

1�<�(0�Q

1�,�(0�-

1�

0R�

�(<1&�0

.!�(01&�8

8!�(01&�8

0�(01�

0.!�(,1&�,

8!�(,1�

,8!�(Q1&�0

.�

�(?1&�0

.!�(R1&�0

<�(01&�?

>�(01�

44

?8&�4

4@0@&��

��

����

��

44

Q0&�4

4QQ�

44

Q0&�4

4QQ&�4

40R?

&�4

48,-&

�44

.-&����

����

��

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*�&�3

P��(u�,

<1�

00�(Q�-

1�.�(<�0

1�<�(0�.

1�0.!�(00

1&�?

>�(81&�0

R��(,1&�0

<�(,1&�,

<!�(,1&�@

!�(01&�

?4

�(01&�0

.�

�(01&�,

8!�(01�

44

QQ;Q

@&�4

4.-

&�4

4?8&�4

4,8

-&�4

40R?;Q

8Q&�4

48,

-&�4

48Q

?&�

44

Q0&����

����

��

44

Q0�

���

����

��

0�(-�@

1�-�(-�-

1�-�(-�-

1�

-�(-�-

1�0�(-�R

1�0�(-�R

1�

-�(-�-

1�-�(-�-

1�0�(-�R

1�

-�(-�-

1�0�(-�R

1�-�(-�-

1�

0.!�(01�

88!�(,1�

0?!�(01�

,8�

�(01�

"*

G&�*

=5&��

*�&�4

E�&�3

P��(u�0

1�

"*

G&�*

=5&�4

�5&��

*�&�3

P�&�4

5"�(u�,

1�

*=

N&�4

�5&�4

E�&�3

P�&�4

5"�(u�0

1�

*=

5&�4

�5&��

*�&�3

P�&�4

5"�(u�0

1�

*=

5&�4

�5&��

*�&�4

E�&�3

P��(u�0

81�

*=

5&�4

�5&��

*�&�4

E�&�3

P�&�4

5"�(u�0

1�

0�(-�@

1�?�(,�Q

1�?�(,�.

1�

-�(-�-

1�0�(-�R

1�-�(-�-

1�

,8�

�(?1&�0

?!�(<1&�0

.��(01&�,

8!�(01&�G

��(01�

0?!�(01�

44

8-�

44

<,�

44

<,&�4

48-&�4

4,-,

44

8-�

Page 166: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������555�

DYN

AM

ICS O

F PNEU

MO

CO

CC

AL PO

PULA

TION

S C

AU

SING

DISEA

SEIN

CO

PDPA

TIENTS

0,0�

� ��g

����

���/�

��

�����

����7

�����

����

���

�����

���

���

���

���

���

���

���

�4�#�

��D�

��;4

�#����D�

��

���

���

���

����

���

��

���

����

����

���

����

����

��

���

���

���

���

���

���

����

���

����

(����

���

��

�1� !

�����

���

��

�������

&���7

���

��#��

D��

���

���

����

���

��#��

�����

���

���

����

��� 3

����

������

��

�����"

!J

*�

����

���

� ���

�8��

���

���

������

����

���

�������7

�����

7�)

�3

��

���

���

����

����

��

��

����

����

�����

%�����

�:

�"*

G:����

����

&�*=

5:��

�7��

���

7�

&�4

�5:�

�����

7�

&��*

�:���

���7

��

�&�4

E�:�

���

���

����

��&�

3P

�:��

/����

�D�

����

&�4

5":�

����

#��D�

���

Page 167: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

�7������#�����������������������4H"����������C

HA

PTER

III

0,,�

Page 168: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

CHAPTER IV: =������� ���

�����������#�����������������

Objective 4: ��� ���������� ���� #�����7� ���

������������ �#� �������� ������ ��������

��������:� �������� vs.� ���#����� ��������� (0..R/

,-0-1��

������� �&� �����7� 4&� "�������� =&� J���� 5&� 3����� 3&� ��� ���

4������J&� ��6����� B� (,-081�3������������� �����7���� ����

�����#�������7����������� ��������������#�������D������������

4H"�����������"��3�HG*�Q:��R.-,@�

Page 169: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

0,<�

Page 170: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

0,R�

Some Pneumococcal Serotypes Are More FrequentlyAssociated with Relapses of Acute Exacerbations inCOPD PatientsArnau Domenech1,2, Carmen Ardanuy1,2*, Roman Pallares2,3, Immaculada Grau2,3, Salud Santos4,

Adela G. De la Campa2,5,6, Josefina Linares1,2

1Department of Microbiology, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL-Barcelona University, Barcelona, Spain, 2CIBERES (Ciber de Enfermedades Respiratorias). ISCIII,

Madrid, Spain, 3Department of Infectious Diseases, Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL-Barcelona University, Barcelona, Spain, 4Department of Pneumology,

Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELL, Barcelona, Spain, 5Centro Nacional de Microbiologıa, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, Spain, 6Consejo

Superior de Investigaciones Cientıficas, CSIC, Madrid, Spain

Abstract

Objectives: To analyze the role of the capsular type in pneumococci causing relapse and reinfection episodes of acuteexacerbation in COPD patients.

Methods: A total of 79 patients with 116 recurrent episodes of acute exacerbations caused by S. pneumoniae were includedinto this study (1995–2010). A relapse episode was considered when two consecutive episodes were caused by the samestrain (identical serotype and genotype); otherwise it was considered reinfection. Antimicrobial susceptibility testing(microdilution), serotyping (PCR, Quellung) and molecular typing (PFGE/MLST) were performed.

Results: Among 116 recurrent episodes, 81 (69.8%) were reinfections, caused by the acquisition of a new pneumococcus,and 35 (30.2%) were relapses, caused by a pre-existing strain. Four serotypes (9V, 19F, 15A and 11A) caused the majority(60.0%) of relapses. When serotypes causing relapses and reinfection were compared, only two serotypes were associatedwith relapses: 9V (OR 8.0; 95% CI, 1.34–85.59) and 19F (OR 16.1; 95% CI, 1.84–767.20). Pneumococci isolated from relapseswere more resistant to antimicrobials than those isolated from the reinfection episodes: penicillin (74.3% vs. 34.6%,p,0.001), ciprofloxacin (25.7% vs. 9.9%, p,0.027), levofloxacin (22.9% vs. 7.4%, p = 0.029), and co-trimoxazole (54.3% vs.25.9%, p,0.001).

Conclusions: Although the acquisition of a new S. pneumoniae strain was the most frequent cause of recurrences, a third ofthe recurrent episodes were caused by a pre-existing strain. These relapse episodes were mainly caused by serotypes 9Vand 19F, suggesting an important role for capsular type.

Citation: Domenech A, Ardanuy C, Pallares R, Grau I, Santos S, et al. (2013) Some Pneumococcal Serotypes Are More Frequently Associated with Relapses ofAcute Exacerbations in COPD Patients. PLoS ONE 8(3): e59027. doi:10.1371/journal.pone.0059027

Editor: Lorenzo Aguilar, School of Medicine, Univ. Complutense, Spain

Received December 19, 2012; Accepted February 8, 2013; Published March 11, 2013

Copyright: � 2013 Domenech et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding: This work was supported by grants from the Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social [PI 0901904], by grants [BIO2008-02154 andBIO2011-25343] from Plan Nacional de I+D+I of Ministerio de Ciencia e Innovacion, and by CIBER de Enfermedades Respiratorias, CIBERES; [CB06/06/0037], run bythe Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid, Spain. A. D. was supported by a grant from Formacion de Profesorado Universitario (FPU; Ministerio de Educacion,Spain). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.

* E-mail: [email protected]

Introduction

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major

cause of morbidity and mortality in developed countries [1].

Approximately 50% of acute exacerbation episodes of COPD are

caused by bacterial pathogens, mainly Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis [2]. The development

of an acute exacerbation episode caused by S. pneumoniae is thought

to be associated with the acquisition of a new strain, although

scarce information is available [3].

Capsular type, the principal pneumococcal virulence factor, had

been related to the ability of pneumococci to cause invasive disease

or colonization [4]. However, the aetiological role of pneumococ-

cal serotypes in relapse episodes of COPD patients remains to be

determined.

The aims of this study were to analyse the relationship between

serotype and genotype and the ability to cause relapse or

reinfection episodes in patients with COPD. In addition, we have

explored the influence of previous antimicrobial therapy in this

occurrence.

Results

Epidemiological and clinical dataA total of 79 COPD patients were included in the study. Their

mean age was 69 (SD 66) years, and 77 (97.5%) of them were

males. In terms of COPD severity there was 1 patient with mild

PLOS ONE | www.plosone.org 1 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59027

Page 171: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

0,?�

(1.3%), 14 patients with moderate (17.7%), 18 patients with severe

(22.8%) and 39 patients with very severe (49.4%) airflow

obstruction. The GOLD status of the remaining 7 patients was

not available.

Fifty-two patients had $1 reinfections (caused by pneumococci

with different serotype and genotype), 16 had $1 relapses (caused

by the same pneumococcus), and the remaining 11 patients had

both relapses and reinfections. No differences were observed as

regards the age of patients with relapse or reinfection (69.969 vs.70.569, respectively), nor in terms of COPD severity (GOLD II:

71.7613 vs. 69.268, respectively, GOLD III: 66.467 vs.70.6611, respectively; and GOLD IV: 69.169 vs. 69.468,

respectively).

Finally, a total of 116 recurrent episodes from the 79 patients

were studied; of these, 35 (30.2%) were relapses and 81 (69.8%)

reinfections. The mean time between episodes was 166696 days,

being shorter among relapses (133689 days) than among

reinfections (181696 days; P= 0.020). Table 1 shows the

distribution of the episodes based on the mean time between

episodes. When the consecutive episodes occurred during a period

#120 days, significantly higher frequency of relapse episodes was

observed (57.1% vs. 35.8%, P= 0.033). Whereas, when the period

of time between episodes was higher than 240 days the frequency

of reinfection episodes was higher (14.3% vs. 30.9%, P= 0.061).

In 13 of the 35 (37.1%) relapses and in 31 of the 81 (38.3%)

reinfections, pneumococcal strains were isolated together with

other potential pathogens.

However, P. aeruginosa was more frequently isolated from

relapses than from reinfections (17.1% vs. 7.4%, respectively;

P= 0.108), whereas H. influenzae was more closely associated with

reinfections (2.9% vs. 23.5%; P= 0.006).

Serotyping and genotypingFour of the 31 serotypes detected caused 60.0% of relapses.

These serotypes were 9V (17.1%), 19F (17.1%), 15A (14.3%) and

11A (11.4%). The most frequent serotypes isolated from reinfec-

tions were 15A (8.6%), 16F (7.4%), 3 (6.2%) and 33F (6.2%).

Statistically significant differences were only observed in two

serotypes associated with relapses when compared with reinfec-

tions: 9V (OR 8.0; 95% CI, 1.34–85.59) and 19F (OR 16.1; 95%

CI, 1.84–767.20) [Table 2].

Serotypes included in the polysaccharide pneumococcal 23-

valent (23vPPV) accounted for 74.3% (n = 26) of relapses, and

56.8% (n = 46) of reinfections. Whereas, the coverage of the 10-

valent (PCV-10) and 13-valent (PCV-13) pneumococcal conjugate

vaccines in all relapses were 40.0% (n = 16) and 54.3% (n = 19),

respectively; and the coverage of reinfections were 23.5% (n = 19)

and 34.6% (n = 28), respectively.

Seventeen PFGE patterns (related with 14 sequence types) were

observed among the relapses, with the most frequent clonal

complexes (CC) being CC1569V (22.9%), CC6315A,19F (17.1%),

CC8819F (11.4%), CC8119A,19F (8.6%) and CC2603 (5.7%).

Among reinfections, 56 different PFGE patterns were observed,

and the most frequent clones were CC6315A (7.4%), CC3016F

(7.4%), CC71733F (4.9%), CC1569V (4.9%), CC4223A,23F (3.7%),

CC6211A (3.7%), CC9710A (3.7%), CC1917F (3.7%) and CC2603

(3.7%).

Only the CC1569V genotype was associated with relapses (OR

5.8; 95% CI, 1.61–20.73). Serotype 19F was genetically hetero-

geneous [CC8819F (6.2%), CC8119F (2.9%), and CC6319F (2.9%)].

Antimicrobial consumption and susceptibilityTable 3 shows the activity of nine antimicrobials against

pneumococci isolated from relapses and reinfections. Resistance to

betalactams, fluoroquinolones and co-trimoxazole was higher

among the strains that caused relapses than among those causing

reinfections (P,0.01).

Table 1. Distribution of the number of relapses and reinfections based on the time between episodes.

Time between episodes (days) Relapses (n =35) Reinfections (n =81) P-value

#120 20 (57.1%) 29 (35.8%) 0.033

121–240 10 (28.6%) 27 (33.3%) 0.613

.240 5 (14.3%) 25 (30.9%) 0.061

doi:10.1371/journal.pone.0059027.t001

Table 2. Serotypes causing relapse and reinfection episodesof acute exacerbations in COPD patients.

serotype relapses (n =35)reinfections(n =81) OR 95%CI

9V 6 (17,1%) 2 (2.5%) 8.00 1.34–85.59

19F 6 (17,1%) 1 (1.2%) 16.11 1.84–767.20

15A 5 (14,3)% 7 (8.6%) 1.75 0.41–7.01

11A 4 (11.4%) 3 (3.7%) 3.32 0.53–23.95

3 3 (8.6%) 5 (6.2%) 1.42 0.21–7.82

6C 2 (5.7%) 0 infinite 0.44–infinite

22F 2 (5.7%) 3 (3.7%) 1.57 0.13–14.36

19A 2 (5.7%) 4 (4.9%) 1.17 0.10–8.59

35B 1 (2.9%) 1 (1.2%) 2.33 0.03–186.68

33F 1 (2.9%) 5 (6.2%) 0.45 0.01–4.24

23F 1 (2.9%) 2 (2.5%) 1.16 0.02–22.99

23A 1 (2.9%) 2 (2.5%) 1.16 0.02–22.99

14 1 (2.9%) 4 (4.9%) 0.57 0.01–6.03

16F 0 6 (7.4%) 0 0.00–1.93

7F 0 4 (4.9%) 0 0.00–3.51

38 0 4 (4.9%) 0 0.00–3.51

31 0 4 (4.9%) 0 0.00–3.51

Non-typeable 0 4 (4.9%) 0 0.00–3.51

6B 0 3 (3.7%) 0 0.00–5.63

10A 0 3 (3.7%) 0 0.00–5.63

35F 0 2 (2.5%) 0 0.00–12.39

23B 0 2 (2.5%) 0 0.00–12.39

Other serotypes 0 10a

aSerotypes 1, 5, 9N/L, 12F, 15B/C, 17F, 18C, 24F, 29 and 34 were detected in onlyone reinfection episode.doi:10.1371/journal.pone.0059027.t002

Relapse Pneumococcal Episodes of AECOPD

PLOS ONE | www.plosone.org 2 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59027

Page 172: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

0,@�

The most frequent antimicrobials consumed by these patients

during the episode prior to reinfection or relapse (n = 116) were

beta-lactams (49.2%), fluoroquinolones (25.9%) or both (5.2%).

Consumption of fluoroquinolones during the previous episode was

higher in relapses than in reinfections (40.0% vs. 19.8%,

respectively; P= 0.02), whereas, no differences in the betalactams

consumption was observed (25.7% of relapses and 27.1% of

reinfections; P= 0.872).

Discussion

Capsular type is known to play an important role in the

invasiveness of pneumococcal strains [4]. Thus, some serotypes

have been associated with invasive pneumococcal disease or with

acute exacerbations of COPD [5]. Although the isolation of a new

pneumococcal strain has been associated with a significantly

increased risk of a new acute exacerbation [2], little information is

available about the persistence of S. pneumoniae isolates.

Our results agree with other reports in which reinfection

through acquisition of a new strain was the most frequent cause of

acute exacerbation episodes [3]. However, our study shows that a

third of these recurrences were caused by a persistent pneumo-

coccal strain, suggesting that in COPD patients the persistence of

the same strain could be underestimated.

Although in 12 of 35 relapses S. pneumoniae was isolated together

with another pathogen (P. aeruginosa, H. influenzae, M. catarrhalis or

Staphylococcus aureus) the role of S. pneumoniae in causing the acute

exacerbation episodes is supported by the high predominance of

Gram positive diplococci in the Gram stain of a good quality

sputum sample.

Our results show that serotypes 9V and 19F were associated

with relapses, suggesting that serotype could play an important

role in the persistence of pneumococcal isolates. In addition,

differences in genotype distribution were also detected. All isolates

that expressed the serotype 9V belonged to the Spain9V-CC156;

hence, this clone was associated with the relapse episodes. In

contrast, several genotypes expressed the serotype 19F and none of

them was significantly associated with relapses. These results

suggest that capsular type, rather than genetic background, may

play an important role in the persistence of pneumococci among

COPD patients.

Most of the patients included in the study had severe or very

severe COPD, suffering frequent episodes of acute exacerbation

and they received multiple antibiotic courses [6]. Although there

were no differences in the betalactam consumption among groups,

the betalactam resistance rates were higher among relapse

episodes. This finding could be explained because relapse episodes

were caused by few multi-resistant clones (mainly CC156 and

CC88). Whereas, strains causing reinfection episodes showed a

higher genetic diversity including penicillin-susceptible and -

resistant clones. However, we found an association between

fluorquinolone consumption and development of resistance. In

fact, the development of fluorquinolone resistance during or after

an antimicrobial course has been largely described in the literature

[7–8].

The proportion of serotypes covered by the 23vPPV vaccine

was high, especially those causing relapses. Unfortunately,

vaccination data of patients included in the present study was

not available; however, its protective efficacy in COPD popula-

tions is controversial since COPD adults respond differently than

the general adult population, due to their impaired antibody

response to the vaccine, the colonization of the lower respiratory

tract, or the frequent use of inhaled corticosteroids [9]. In the

other hand, conjugate vaccines (PV10 and PCV13) vaccine, which

have an enhanced immunity potential, could prevent the 40% and

a half of the overall relapse episodes, respectively.

The major limitations of our study are the low number of

relapse episodes, and also that it is a retrospective study.

Nonetheless, our study provides new data about the association

of certain serotypes with the persistence of pneumococci and the

ability to some clones, especially Spain9V-CC156, to cause relapse

episodes. In addition, our study suggests that new episodes that

occurred within the first 3 months after a previous one, had higher

probability to be caused by the same pneumococcal strain and this

fact could help to give an adequate empirical therapy.

Table 3. In vitro activity of nine antimicrobials against pneumococci isolated from relapses and reinfections

Relapses (n =35) Reinfections (n=81) P-valuef

AntibioticMIC50(mg/L)

MIC90(mg/L)

MIC range(mg/L) % S % I % R

MIC50(mg/L)

MIC90(mg/L)

MIC range(mg/L) % S % I % R

Penicillin 0.5 4 #0.03–4 25.7a 45.7 28.6 0.06 0.5 #0.03–2 65.4a 28.4 6.2 0.000

82.9b 17.1 0 98.8b 1.2 0 0.003

Cefotaxime 0.12 1 #0.03–2 68.6c 28.6 2.9 0.05 0.5 #0.03–1 92.6c 7.4 0 0.001

97.1d 2.9 0 100d 0 0 0.302

Ciprofloxacine 1 .32 #0.5–.32 74.3 – 25.7 #0.5 1 #0.5–.32 90.1 – 9.9 0.027

Levofloxacin #0.5 .32 #0.5–.32 77.1 2.9 20.0 #0.5 1 #0.5–.32 92.6 0 7.4 0.029

Tetracycline #2 .32 #2–.32 54.3 2.9 42.8 #2 .32 #2–.32 70.4 0 29.6 0.205

Erythromycin #0.25 .32 #0.25–.32 57.1 0 42.9 #0.25 .32 #0.25–.32 67.9 0 32.1 0.266

Clindamycin #0.25 .32 #0.25–.32 57.1 0 42.9 #0.25 .32 #0.25–.32 65.4 0 34.6 0.396

Chloramphenicol #2 .8 #2–.8 88.6 – 11.4 #2 8 #2–.8 93.8 – 6.2 0.081

Co-trimoxazole 2/38 .4/76 #0.5/9.5–.4/76 45.7 5.7 48.6 #0.5/9.5 .4/76 #0.5/9.5–.4/76 74.1 1.2 24.7 0.000

Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) breakpoints: aPenicillin oral breakpoints: susceptible #0.06 mg/L, intermediate 0.12–1 mg/L and resistant $2 mg/L.bPenicillin parenteral (non-meningitis) breakpoints: susceptible #2 mg/L, intermediate 4 mg/L and resistant $8 mg/L. cCefotaxime (meningitis) breakpoints:susceptible #0.5 mg/L, intermediate 1 mg/L and resistant $2 mg/L. dCefotaxime parenteral (non-meningitis) breakpoints: susceptible #1 mg/L, intermediate 2 mg/Land resistant $4 mg/L. eNon-susceptibility to ciprofloxacin breakpoint MIC $4 mg/L and susceptibility breakpoint #2 mg/L. fP-value comparing susceptible strains.doi:10.1371/journal.pone.0059027.t003

Relapse Pneumococcal Episodes of AECOPD

PLOS ONE | www.plosone.org 3 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59027

Page 173: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

0,Q�

Further studies with a high number of recurrent episodes are

now needed to investigate not only the role of capsular type in

relapses of acute exacerbations, but also whether the pneumococ-

cal conjugate vaccine 13 could be beneficial for COPD patients.

Methods

Study designPneumococci and other potential pathogens isolated from

sputum samples were prospectively collected into our laboratory

between 1995 and 2010, and were frozen at 280uC for further

analysis. Only pneumococci isolated from good quality sputum

were considered (,10 squamous cells and.25 leucocytes per low-

power field), with a predominance of Gram positive diplococci.

All COPD patients (n = 79) with two or more acute exacerba-

tion episodes and seen at the Bellvitge University Hospital during

the study period were included, after retrospective review of their

computerized medical charts. Only those consecutive acute

exacerbations which lasted for between four weeks and one year

were included in the study.

The severity of airflow obstruction was categorized according to

the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease

(GOLD) criteria [10].

An acute exacerbation of COPD was defined as any sustained

increase in respiratory symptomatology compared with the

baseline situation requiring an increase in regular medication

and hospital treatment. A ‘relapse’ episode was defined as two or

more consecutive acute exacerbations caused by the same

pneumococcus (identical serotype and genotype). When the

consecutive episodes were caused by pneumococci with different

serotype and Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) pattern they

were defined as ‘reinfection’.

Ethical statementThis study and publication of the results were approved by the

‘Comite Etic d’Investigacio Clınica del Hospital Universitari de

Bellvitge’ and the written or oral informed consent was considered

not necessary, because the source of bacterial isolates was

anonymized and the study was retrospective.

Serotyping and genotypingSerotyping was performed by multiplex PCR, using a previously

described methodology [11]. All isolates were genotyped by

PFGE. Multi Locus Sequence Typing (MLST) was performed on

all relapse isolates in order to confirm the identity of the isolates

[12–13].

Antimicrobial susceptibilityAntimicrobial susceptibility was tested by microdilution

(STRHAE, SensititreTM), following the Clinical Laboratory

Standards Institute (CLSI) criteria [14]. The ciprofloxacin MIC

of resistant strains (MIC $4 mg/L) was confirmed by E-test. S.pneumoniae ATCC49619 was used as the control strain.

Statistical analysisStatistical analyses were carried out using SPSS 18 for

Windows. The odds ratios (OR) and 95% confidence intervals

(CI) were calculated, and Fisher’s exact test was used when

appropriate. Two-sided P values ,0.05 were considered statisti-

cally significant.

Acknowledgments

We acknowledge the use of the Streptococcus pneumoniae MLST web site at

Imperial College London, funded by the Wellcome Trust. We wish to

thank all the staff of Microbiology Laboratory of Hospital Universitari de

Bellvitge who contributed to this project on a daily basis.

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: AD JL RP CA. Performed the

experiments: AD. Analyzed the data: AD SS IG RP AC. Contributed

reagents/materials/analysis tools: JL. Wrote the paper: AD CA JL.

References

1. World Health Organization (2012) Chronic obstructive pulmonary disease. Fact

sheet No. 315 Available: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs315/

en.Accessed 2012 June 6.

2. Sethi S, Murphy TF (2008) Infection in the pathogenesis and course of chronic

obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 359: 2355–2365.

3. Sethi S, Evans N, Grant BJ, Murphy TF (2002) New strains of bacteria and

exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 347:

465–471.

4. Brueggemann AB, Griffiths DT, Meats E, Peto T, Crook DW, et al. (2003)

Clonal relationships between invasive and carriage Streptococcus pneumoniae and

serotype- and clone-specific differences in invasive disease potential. J Infect Dis

187: 1424–1432.

5. Domenech A, Ardanuy C, Calatayud L, Santos S, Tubau F, et al. (2011)

Serotypes and genotypes of Streptococcus pneumoniae causing pneumonia and acute

exacerbations in patients with chronic obstructive pulmonary disease.

J Antimicrob Chemother 66: 487–493.

6. Domenech A, Ardanuy C, Balsalobre L, Marti S, Calatayud L, et al. (2012)

Pneumococci can persistently colonize adult patients with chronic respiratory

disease. J Clin Microbiol 50: 4047–4053.

7. De la Campa AG, Ferrandiz MJ, Tubau F, Pallares R, Manresa F, et al. (2003)

Genetic characterization of fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniaestrains isolated during ciprofloxacin therapy from a patient with bronchiectasis.

Antimicrob. Agents Chemother 47:1419–1422.

8. Davidson R, Cavalcanti R, Brunton JL, Bast DL, de Azavedo JC, et al. (2002)Resistance to levofloxacin and failure of treatment of pneumococcal pneumonia.

N Engl J Med 346: 747–750.9. Schenkein JG, Nahm MH, Dransfield MT (2008) Pneumococcal vaccination for

patients with COPD: current practice and future directions. Chest 133: 767–

774.10. Pauwels RA, Buist AS, Calverley PM, Jenkins CR, Hurd SS, et al. (2001) Global

strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructivepulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive

Lung Disease (GOLD) Workshop summary. Am J Respir Crit Care Med 163:1256–76.

11. Centers for Disease Control and Prevention (2012) PCR Deduction of

Pneumococcal Serotypes. Available: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm.Accessed 2012 July 5.

12. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, et al. (1995)Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel

electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 33: 2233–

2239.13. Enright MC, Spratt BG. (1998) A multilocus sequence typing scheme for

Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasivedisease. Microbiology 144: 3049–3060.

14. Clinical Laboratory Standard Institute (2011) Performance Standards forAntimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-first Informational Supplement.

Wayne, Pa: Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI/NCCLS

document M100-S21. Vol 31.

Relapse Pneumococcal Episodes of AECOPD

PLOS ONE | www.plosone.org 4 March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e59027

Page 174: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

CHAPTER IV: =������� ���

�����������#�����������������

Objective 5: ��� �%��������� ���� ���������

��������������������������7�������#�4H"���������&�

��� ������������������#������������������������

���� ��%�������� �#� ������������ ��������� (0..R/

,-0-1��

��������&������7�4&�>�����������&�)�����3&�4�����7����&�������

4������J&�>����������>&���6�����B�(,-0,1�"���������

����������7���������������������� �������������������7����������

B�4���)��������R-:<-<@/R8��

Page 175: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

08-�

Page 176: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

080�

Pneumococci Can Persistently Colonize Adult Patients with ChronicRespiratory DiseaseA. Domenech,a,b C. Ardanuy,a,b L. Balsalobre,b,c S. Marti,a,b L. Calatayud,a,b A. G. De la Campa,b,c,e A. B. Brueggemann,d andJ. Liñaresa,b

Microbiology Department, Hospital Universitari de Bellvitge—Universitat de Barcelona, IDIBELL, Barcelona, Spaina; CIBERES (Ciber de Enfermedades Respiratorias), ISCIII,Madrid, Spainb; Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, Spainc; Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, UnitedKingdomd; and Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid, Spaine

Streptococcus pneumoniae plays an important role in causing acute exacerbations in patients with chronic respiratory disease.However, few data are available regarding pneumococcal persistence in adult patients with chronic respiratory diseases. Fiftypneumococci recovered from sputum samples (1995 to 2010) from 13 adult patients with>3 episodes of acute exacerbation orpneumonia, with the same serotype and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) pattern, were studied. Multilocus sequence typ-ing (MLST) loci, penicillin-binding protein (PBP) genes (pbp2x, pbp1a, pbp2b), and the quinolone-resistant determining regions(QRDRs) of parC, parE, and gyrAwere PCR amplified and sequenced. The average time between the first and last episode was582 days (standard deviation [SD],�362). All but two patients received multiple courses of�-lactam treatment, and all persis-tent strains were resistant to penicillin; however, the PBP sequences were stable over time apart from one variable nucleotide inpbp2x, observed among pneumococci isolated from three patients. In contrast, 7/11 patients treated with fluoroquinolones hadfluoroquinolone-resistant pneumococci. In three patients, the initially fluoroquinolone-susceptible strain developed resistanceafter fluoroquinolone therapy, and in the remaining four patients, the persistent strain was fluoroquinolone resistant from thefirst episode. QRDR changes involved in fluoroquinolone resistance were frequently observed in persistent strains after fluoro-quinolone treatment; however, the PBP sequences andMLST genotypes of these strains were stable over time.

Patients with chronic respiratory disease, such as chronic ob-structive pulmonary disease (COPD) and bronchiectasis, are

often persistently colonized by respiratory pathogens (27, 32).Airway colonization, mainly by Pseudomonas aeruginosa,Haemo-philus influenzae, and Streptococcus pneumoniae, contributes toprogressive pulmonary damage, increasing the morbidity and therisk of death of these patients due to frequent and recurrent epi-sodes of acute exacerbations (27).

Most of the acute exacerbations caused byP. aeruginosa are dueto a preexisting strain which colonizes the lower airway. Often,these strains are hypermutable (strains with defects in genes in-volved in DNA repair) and have been related to an increase ofantimicrobial resistance due to a stepwise accumulation of pointmutations (28). In contrast, when S. pneumoniae has been recov-ered during an acute exacerbation, this has generally been associ-ated with the acquisition of a new strain, and the high prevalenceofmultidrug-resistant pneumococci associated with acute exacer-bations has been related to the consumption of antimicrobials thatthese patients receive as empirical treatment (18, 26). The role ofpneumococcal hypermutable strains is unclear and could be re-lated to the persistent strains that colonize among 15 to 17% ofCOPD patients at any time (12, 32).

Antimicrobial treatment for acute exacerbations includes�-lactams, macrolides, and fluoroquinolones, and the high ratesof antimicrobial resistance to these classes of antimicrobials inpatients with respiratory diseases are a cause of concern (18).Among pneumococci, resistance to �-lactams is the result of al-terations in the penicillin-binding proteins (PBPs), most impor-tantly PBP1A, PBP2B, and PBP2X (7). Macrolide resistance ismediated by two main mechanisms, target site modification bymethylases encoded by the erm(B) or erm(TR) genes (referred toas the MLSB phenotype) and an efflux pump encoded by the

mef(A) gene (referred to as the M phenotype) (5). In S. pneu-moniae, macrolide resistance is frequently associated with tetracy-cline resistance due to the presence of the Tn916 family of trans-posons, which can result in the spread of resistance to bothantimicrobials (29). Fluoroquinolone resistance is caused mainlyby changes in the quinolone-resistant determining regions(QRDRs) of DNA topoisomerase IV subunits (ParC and ParE)and the DNA gyrase (GyrA) subunit (10).

Data describing the antimicrobial susceptibility, serotype, andpulsed-field gel electrophoresis (PFGE) pattern of a large collec-tion of over 600 pneumococci isolated from COPD patients wererecently reported (13). However, little information is availableabout the evolution of pneumococci associated with multipleacute exacerbation episodes over a long period of time in a patientwith chronic respiratory disease. In the present work, we charac-terized 50 pneumococci isolated from 13 patients with chronicrespiratory disease who had 3 or more episodes of acute exacerba-tions caused by the same pneumococcal strain (as defined by thesame serotype and PFGE pattern). Isolates were genotyped bymultilocus sequence typing (MLST); pbp2x, pbp1a, pbp2b, parC,parE, and gyrA were PCR amplified and sequenced; and erm(B),erm(TR), mef(A/E), and tet(M) were detected by PCR. We hy-pothesized that the pneumococcal strains that persistently colo-

Received 12 August 2012 Returned for modification 7 September 2012Accepted 24 September 2012

Published ahead of print 10 October 2012

Address correspondence to C. Ardanuy, [email protected].

Copyright © 2012, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

doi:10.1128/JCM.02056-12

December 2012 Volume 50 Number 12 Journal of Clinical Microbiology p. 4047–4053 jcm.asm.org 4047

Page 177: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

08,�

nize and are associated with multiple episodes of acute exacerba-tion in these patients would acquire changes in the resistancedeterminants of �-lactams, macrolides, and fluoroquinolonesover time: if so, this has important relevance for the clinical man-agement of these patients.

(This study was presented at the 8th International SymposiumonPneumococci andPneumococcalDiseases, Foz do Iguazu, Bra-zil, 2012 [13a].)

MATERIALS AND METHODSThis study and publication of the results were approved by the “ComitéÈtic d’Investigació Clínica del Hospital Universitari de Bellvitge.”

Study setting, bacterial strains, and antimicrobial susceptibility.Pneumococci isolated from clinical samples (invasive and noninvasive)were prospectively collected in our laboratory. All patients with 3 ormorepneumococcal episodes of acute exacerbations detected between 1995 and2010were analyzed to identify persistent colonization, defined as the sameserotype and PFGEpattern. A new episodewas consideredwhen the rangeof time between episodes was more than 4 weeks, which occurred after asuccessful outcome. Only sputum samples of good quality (�10 squa-mous cells and �25 leukocytes per low-power field) in which the diplo-coccus Gram-positive bacteria were the most frequently detected werecultured (24). Pneumococci were identified by optochin susceptibilityand bile solubility. Serotyping was performed by Quellung reaction at theSpanish Reference Laboratory.

An acute exacerbation of COPD or bronchiectasis was defined as anysustained increase in respiratory symptomatology, compared with thebaseline situation that required an increase in regular medication andhospital treatment. An episode of pneumonia was considered when fever,leukocytosis, and radiological findings (new infiltrates on chest radiogra-phy) were detected. The COPD status was defined according to the inter-national Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)criteria (23).

Antimicrobial susceptibility, serotype, and PFGE pattern of six pneu-mococci isolated from two patients (patients 7 and 10) have been pub-lished previously among 611 pneumococci isolated from pneumonia andacute exacerbation episodes of COPD patients (13).

Susceptibility to 22 antimicrobials (MIC) was tested by the microdi-lution method (STRHAE1; Sensititre, West Sussex, United Kingdom),following the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recom-mendations (6). The ciprofloxacin MIC of resistant strains (MIC � 4�g/ml) was confirmed by Etest. S. pneumoniae ATCC 49619 was used asthe control strain.

PBPdetection and sequence analysis.DNAwas extracted frompneu-mococcal strains using the DNeasy tissue kit (Qiagen). pbp1a, pbp2x, andpbp2b were amplified and sequenced, using primer sets and conditionsdescribed previously (4). Sequences were assembled and edited usingPregap4 and Gap4 (Staden Package, http://staden.sourceforge.net/).Once assembled, sequences of PBPswere compared between strains of thesame patient.

Gene detection of macrolide and tetracycline resistance. Macrolideresistance genes [erm(B), erm(TR), and mef(A/E)] and the tetracyclineresistance determinant tet(M) were studied by PCR as described previ-ously (5).

Characterization of quinolone resistance. The parC, parE, and gyrAgenes were amplified as described previously (22). Restriction fragmentlength polymorphism assay (RFLP) of PCR products was performed todetect point mutations at the main QRDR positions involved in quino-lone resistance: S79 and S83 of parC, D435 of parE, and S81 and E85 ofgyrA. Briefly, S79 and D83 mutations in the parC gene (using HinfI andSfaNI enzymes, respectively), a D435 mutation in the parE gene (usingHinfI enzyme), and S81 and E85 mutations in the gyrA gene (using HinfIand MboII enzymes, respectively) were detected (2, 22).

Point mutations were confirmed by sequencing. The oligonucleotidepairs parE398/parE483, parC50/parC152, gyrA44/gyrA170, and gyrB376/

gyrB512 were used to amplify and sequence parE, parC, gyrA, and gyrBQRDRs, respectively (11).

Molecular typing.Genotyping was performed by MLST, as describedpreviously (15). Allele numbers and sequence types (ST) were assignedusing the pneumococcal MLST website (http://spneumoniae.mlst.net/).

RESULTSPatients, pneumococcal strains, and antimicrobial resistance.During the study period (1995 to 2010), 231 adult patients wereidentified who had 3 or more episodes of acute exacerbation, andS. pneumoniaewas isolated. A total of 218 of these 231 patients hadS. pneumoniae strains that differed by serotype and/or genotype.Thirteen (6.1%) patients had at least 3 different episodes duringwhich the same strain was isolated (i.e., with the same serotypeand PFGE pattern) and were selected for this study. Eleven of thethirteen patients had chronic respiratory diseases: 8 had COPD (1patient with GOLD II status, 2 patients with GOLD III status, and3 patients with GOLD IV status; the GOLD status of two patientswas not available), and 3 had bronchiectasis. The remaining twopatients had an endotracheal prosthesis implanted due to a post-tracheostomy stenosis.

A total of 50 pneumococci isolated from the 13 patients wereanalyzed. The average time between episodes was 210 days (range,30 to 531 days), and the average time between first and last epi-sodes was 582 days (standard deviation [SD],�362). All 50 pneu-mococci analyzed were nonsusceptible to penicillin using oralbreakpoints and also showed resistance to at least one other anti-microbial class. Strains from 11 patients were multidrug resistant(�3 antimicrobial classes; Table 1). All pneumococci examinedfrom the same patient had the identical ST as defined by MLSTgenotyping, with the exception of patient 7, who had 8 pneumo-coccal isolates, 5 of which expressed serotype 15A (ST63) and 3 ofwhich expressed serotype 35B (ST558). Moreover, antimicrobialMICs for all strains were conserved over time apart from those ofthe fluoroquinolones. All macrolide-resistant strains possessederm(B) and tet(M) genes, and no acquisition or loss of macrolideor tetracycline resistance determinants was observed. Addition-ally, we analyzed six transient pneumococcal strains collectedfrom patients 5 (Sp10A and SpNT), 6 (SpNT), 7 (Sp35F), and 10(Sp23F), whose serotypes were different from the persistent one(Fig. 1). These transient isolates also were fully susceptible to allantibiotics tested and had a different PFGE type from that of thepersistent strain.

Finally, the same pbp1a and pbp2bDNA sequences were main-tained in each persistent strain over time (Table 1). The sequenceof pbp2x was maintained in all but 3 patients (3, 6, and 11) whosestrains had a single nucleotide polymorphism (SNP) that was notinvolved in an increase of the �-lactam MICs. These resultsstrengthen the suggestion that these were persistent strains in all13 patients (Fig. 1).

All but two patients (8 and 9) received multiple courses of�-lactam therapy (amoxicillin-clavulanic acid and ceftriaxone).All persistent strains from these 11 patients were susceptible toceftriaxone and cefotaxime, whereas 5 persistent strains (patients3, 4, 5, 6, and 13) were amoxicillin-clavulanic acid resistant. Sevenpatients had macrolide-resistant strains, but previous macrolideconsumption could be documented in only one of them (patient7). Furthermore, all but 3 patients (2, 6, and 13) received at leastone course of fluoroquinolone treatment between acute exacerba-tion episodes. In three cases (patients 3, 10, and 12), the persistent

Domenech et al.

4048 jcm.asm.org Journal of Clinical Microbiology

Page 178: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

088�

TABLE 1 Antimicrobial MICs, characteristics of the 13 patients, and molecular characterization of the persistent pneumococcal strainsa

Patient no.(age, gender)

MLSTgenotype

Episode no.(day/mo/yr)

�-lactam MIC (�g/ml)PBP1A/2B/2Xalleleb

FluoroquinoloneMIC (�g/ml)

Aa substitutionsin ParC/GyrA

MIC(�g/ml)d

PEN A/C CTX-CRO CIP LEV MOX ERY TET

1 (58, male) ST1569V 1st (19/10/1995) 2 2/1 1 A/A.1/A.1 8 2 �0.25 S79F/none �0.25 �22nd (29/11/1995) 2 2/1 1 A/A.1/A.1 8 2 �0.25 S79F/none �0.25 �23rd (28/04/1996) 2 2/1 1 A/A.1/A.1 8 2 �0.25 S79F/none �0.25 �2

2 (46, male) ST1569V 1st (24/07/1995) 2 1/0.5 1 A/A.1/A.1 2 1 �0.25 None �0.25 �22nd (07/11/1995) 2 1/0.5 1 A/A.1/A.1 2 1 �0.25 None �0.25 �23rd (17/03/1996) 2 1/0.5 1 A/A.1/A.1 2 1 �0.25 None �0.25 �2

3 (76, male) ST8389V 1st (06/11/2002) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 2 1 �0.25 None �0.25 �22nd (08/05/2003) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 2 1 �0.25 None �0.25 �23rd (24/09/2003) 2 8/4 1 A/B.1/A.2c 12 �0.25 None �0.25 �24th (17/04/2004) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 2 1 �0.25 None �0.25 �2

4 (77, female) ST8389V 1st (11/08/2007) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 >32 32 4 S79F/S81F �0.25 �22nd (24/01/2008) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 >32 32 4 S79F/S81F �0.25 �23rd (16/06/2008) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 >32 32 4 S79F/S81F �0.25 �2

5 (62, male) ST8389V 1st (29/10/1997) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 >32 32 4 S79Y/S81F �0.25 �22nd (20/10/1998) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 8 2 �0.25 S79F/none �0.25 �23rd (03/04/2000) 2 8/4 1 A/B.1/A.2 >32 32 4 S79F/S81F �0.25 �2

6 (60, male) ST652111A 1st (21/05/2009) 2 8/4 1 A/B.2/A.2 2 1 �0.25 None �0.25 �22nd (25/10/2009) 2 8/4 1 A/B.2/A.2c 12 �0.25 None �0.25 �23rd (14/03/2010) 2 8/4 1 A/B.2/A.2c 2 1 �0.25 None �0.25 �2

B/C/B 2 2 �0.25 None >32 >4B/C/B 2 1 �0.25 None >32 >4B/C/B >32 32 4 S79Y/S81F >32 >4B/C/B >32 32 4 S79Y/S81F >32 >4

7 (75, male) ST6315A 1st (09/11/2008) 0.25 �0.5/0.25 0.122nd (28/12/2008) 0.25 �0.5/0.25 0.123rd (29/01/2009) 0.25 �0.5/0.25 0.124th (15/04/2009) 0.25 �0.5/0.25 0.126th (16/06/2009) 0.25 �0.5/0.25 0.12 B/C/B >32 32 4 S79Y/S81F >32 >4

ST55835B 5th (10/05/2009) 1 2/1 1 C/D/C 1 1 �0.25 None �0.25 �27th (16/03/2010) 1 2/1 1 C/D/C 1 1 �0.25 None �0.25 �28th (05/06/2010) 1 2/1 1 C/D/C 1 1 �0.25 None �0.25 �2

8 (59, female) ST6315A 1st (25/10/2005) 0.25 �0.5/0.25 0.12 B/C/B 2 1 �0.25 None >32 >4B/C/B 4 2 �0.25 D78N/none >32 >4B/C/B 4 2 �0.25 D78N/none >32 >4B/C/B 4 2 �0.25 D78N/none >32 >4

2nd (02/05/2006) 0.25 �0.5/0.25 0.123rd (07/12/2006) 0.25 �0.5/0.25 0.124th (06/11/2007) 0.25 �0.5/0.25 0.125th (02/06/2008) 0.25 �0.5/0.25 0.12 B/C/B 4 2 �0.25 D78N/none >32 >4

D/E/D.1 1 1 �0.25 None >32 >4D/E/D.1 >32 32 4 S79F/S81Y >32 >4

9 (78, male) ST8819F 1st (24/12/1999) 0.25 �0.5/0.25 0.52nd (24/12/2000) 0.25 �0.5/0.25 0.53rd (28/04/2002) 0.25 �0.5/0.25 0.5 D/E/D.1 >32 32 4 S79F/S81Y >32 >4

10 (64, male) ST8719F 1st (26/10/2007) 1 2/1 0.5 E/F/D.1 1 1 �0.25 None >32 >42/1 0.5 E/F/D.1 1 1 �0.25 None >32 >42/1 0.5 E/F/D.1 1 1 �0.25 None >32 >42/1 0.5 E/F/D.1 1 1 �0.25 None >32 >42/1 0.5 E/F/D.1 1 1 �0.25 None >32 >42/1 1 E/A.2/D.2 >32 32 4 S79Y/S81Y >32 �22/1 1 E/A.2/D.2c >32 32 4 S79Y/S81Y >32 �22/1 1 E/A.2/D.2c >32 32 4 S79Y/S81Y >32 �22/1 1 F/G/A.1 2 1 �0.25 None >32 >42/1 1 F/G/A.1 2 1 �0.25 None >32 >42/1 1 F/G/A.1 2 1 �0.25 None >32 >48/4 1 G/B/E 1 0.5 �0.25 None >32 >48/4 1 G/B/E 1 0.5 �0.25 None >32 >48/4 1 G/B/E 1 0.5 �0.25 None >32 >4

2nd (23/01/2008) 13rd (19/09/2008) 14th (09/12/2008) 15th (25/12/2010) 1

11 (73, male) ST210019F 1st (08/01/2008) 22nd (28/04/2009) 23rd (19/10/2009) 2

12 (38, male) ST27619A 1st (12/12/2007) 22nd (22/12/2008) 23rd (18/03/2009) 2

13 (65, male) ST16246B 1st (19/06/2006) 42nd (20/03/2007) 43rd (22/08/2008) 44th (06/10/2009) 4 8/4 1 G/B/E 1 0.5 �0.25 None >32 >4

a PEN, penicillin (susceptible: MIC� 0.12 �g/ml); CTX-CRO, cefotaxime-ceftriaxone (susceptible: MIC � 1 �g/ml); A/C, amoxicillin-clavulanic acid (susceptible: MIC� 4/2 �g/ml); CIP, ciprofloxacin (susceptible: MIC� 4 �g/ml); LEV, levofloxacin (susceptible: � 2 �g/ml); MOX, moxifloxacin (susceptible: � 1 �g/ml); ERY, erythromycin (susceptible:� 0.25 �g/ml); and TET, tetracycline (susceptible: � 2 �g/ml). Boldface font indicates resistant isolates.b Capital letters were used to define different alleles of each PBP, and numbers were used to differentiate small differences among sequences with identical capital letter (for detailsof the amino acid substitutions, see Fig. 3).c Acquisition of an SNP in the PBP2X with respect to the first episode of the same patient.d Gene erm(B) was detected only in ERY-resistant strains; gene tet(M) was detected only in TET-resistant strains.

Streptococcus pneumoniae in Chronic Patients

December 2012 Volume 50 Number 12 jcm.asm.org 4049

Page 179: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

08<�

strains remained fluoroquinolone susceptible over time, whereasstrains of 4 patients (1, 4, 5, and 11) were ciprofloxacin resistantfrom the first episode, and pneumococci isolated from another 3patients (7, 8, and 9) became ciprofloxacin resistant after fluoro-quinolone therapy.

Sequence type, serotype, and mechanisms of resistance. Thepbp2x, pbp1a, and pbp2b sequences of the persistent strains werecompared to those of the susceptible pneumococcal R6 strain (Fig.2). The pbp2b gene was the most conserved; this gene has beendescribed to be involved in amoxicillin-clavulanic acid resistance.The pbp1a and pbp2x genes possessed mosaic blocks that con-ferred amino acid substitutions in their transpeptidase domains,which have been associated with a reduction in the affinity forpenicillin and cefotaxime (16). Those amino acid substitutions inPBP1A, PBP2B, and PBP2X that were related to �-lactam resis-tance are shown in Fig. 3.

The most frequent serotype was 9V, expressed by pneumo-cocci isolated from 5 patients, and all 16 pneumococci were eitherST156 (Spain9V-ST156 Pneumococcal Molecular Epidemiology

Network [PMEN] clone) or ST838, a single locus variant (SLV) ofST156 (Table 1). These 16 pneumococci had the same pbp1a allele,one of two pbp2b alleles, and the same pbp2x allele, albeit withsome minor nucleotide changes in a few isolates. Pneumococci ofpatient 6 expressed serotype 11A and were ST6521, which is anSLV of ST838, and shared the pbp1a, pbp2b, and pbp2x sequenceswith ST8389V isolates, with the exception of an amino acid substi-tution in the PBP2X (P504L) in the isolates recovered from the2nd and 3rd episodes.

The persistent strain of patient 1 (ST1569V) was ciprofloxacin re-sistant (mutation S79F) from the first episode and after a previousciprofloxacin course (Fig. 1). All three isolates of patient 4 (ST8389V)were ciprofloxacin resistant due to changes in ParC(S79F) andGyrA(S81F). All four isolates (ST8389V) from patient 3 remainedfluoroquinolone susceptible throughout the period studied, in spiteof one courseof ciprofloxacin in the third episode. Finally, ananalysisof theQRDRsof isolates collected frompatient 5waspreviously pub-lished, describing the acquisition of low-level and subsequent high-level fluoroquinolone resistance (9).

FIG 1 Number of acute exacerbation and pneumonia episodes of each patient, bacterial pathogen isolated, and courses of antimicrobial treatment. Horizontallines are proportional time lines between the first and the last episode analyzed. Vertical lines mean infection episodes (acute exacerbation, continuous lines;pneumonia, dotted lines). Pathogens isolated were Sp, Streptococcus pneumoniae; Hi, Haemophilus influenzae; Mc, Moraxella catarrhalis; Pa, Pseudomonasaeruginosa; Sa, Staphylococcus aureus. Pneumococcal serotypes are superscripted (NS means nonserotyped isolate, and NT means nontypeable isolate). Thosepneumococci examined in detail are in boldface font. Colored dots indicate the course of antimicrobial therapy: fluoroquinolone, black; amoxicillin-clavulanicacid, green; ceftriaxone, yellow; and macrolide, white. Abbreviations of the QRDR substitutions are showed in red color (no abbreviation means no changes inthe QRDRs).

Domenech et al.

4050 jcm.asm.org Journal of Clinical Microbiology

Page 180: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

08R�

Strains of patients 7 and 8 expressed serotype 15A and wereST63, PMEN clone Sweden15A-ST63. Both persistent strains de-veloped mutations at QRDRs over time after levofloxacin andciprofloxacin courses, respectively. The persistent strain of patient8 showed a new ParC change (D78N) in the 2nd episode, and inthe case of patient 7, the persistent strain acquired andmaintainedhigh-level ciprofloxacin resistance at the third episode, due tochanges in ParC (S79F) and GyrA (S81F). Patient 7 also had 3episodes caused by a serotype 35B, ST558 (SLV of Utah35B-ST377clone) persistent strain. The first strain of ST55835B was detectedbetween the fourth and the fifth episode of the former ST6315A

persistent strain; thereafter, two new episodes were caused by theST55835B strain. Since these two last episodes occurred in 2010and the sputum sample was available, the DNA was extracted andan attempt was made to detect serotype 15A by PCR, but the PCRwas negative (data not shown).

The persistent strains of patients 9, 10, and 11 all expressedserotype 19F, although the genotypes were different (ST88, ST87,and ST2100). The strain of the 2nd episode of patient 9 (ST8819F)developed high-level ciprofloxacin resistance (ParC-S79F andGyrA-S81Y mutations) after a levofloxacin course, and the strain

was also recovered during the 3rd episode. Persistent strains ofpatient 10 belonged to ST87 (SLV of ST88) and remained stableover time. Finally, the isolates from patient 11 were ST210019F

(SLV of ST63). The strain from the 2nd episode acquired anamino acid substitution in the PBP2X (L600S). After multiplecourses of moxifloxacin, the pneumococci isolated from the firstacute exacerbation episode was high-level ciprofloxacin resistant(mutations S79F in ParC and S81Y in GyrA) and persisted overtime. Finally, all isolates from patient 12 were of the same sero-type, ST, and susceptibility pattern over time; the samewas true ofall isolates from patient 13.

DISCUSSION

Once S. pneumoniae causes an acute exacerbation episode in pa-tients with chronic respiratory disease, the isolate is usually re-placed by another S. pneumoniae strain with a different serotype/genotype or by a different bacterial species, such as P. aeruginosa,H. influenzae, orM. catarrhalis (26, 27, 32). However, in the pres-ent study, we showed, based on stability in capsular type, ST,PBPs, and other resistance determinants, that pneumococci canpersist over a long period of time, colonizing and causing acute

FIG 2 Schematic of themosaic genes encoding penicillin-binding proteins (PBPs) 1A, 2B, and 2X of the persistent strains. Alleles of each PBP are shown as bars.Mutations associated with resistance to �-lactams are indicated at the top of each PBP. The PBP sequences of the susceptible pneumococcal R6 strain were usedas the reference. Blocks showing the percent sequence divergence from the corresponding regions of R6 are indicated. White boxes, regions highly conserved(�1.5%divergence); striped boxes, regions that differed by 1.6 to 9.0%; black boxes, regions that differed by�9.0%. Percentage value indicates rate of divergenceof each allele with respect to the R6-susceptible sequence.

Streptococcus pneumoniae in Chronic Patients

December 2012 Volume 50 Number 12 jcm.asm.org 4051

Page 181: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

08?�

exacerbation or pneumonia episodes in patients with chronic re-spiratory disease.

Persistent bacterial colonization in patients with bronchiecta-sis and/or severe COPD is frequently associated with P. aeruginosabut rarely with pneumococci. In fact, in the present study, thesame strain was recovered from only 13 of 213 (6.1%) patientswith multiple pneumococcal episodes.

Persistence of P. aeruginosa in COPD is often associated withhypermutable strains that dramatically speed up resistance devel-opment due to the acquisition of point mutations during expo-sure to antimicrobial agents (20, 28). In contrast, our study showsthat among this collection of isolates, most pneumococcal genesinvolved in antimicrobial resistance were stable over time, withthe exception of parC and gyrA, which were associated with thedevelopment of fluoroquinolone resistance after treatment.

Several factors could explain the persistence of pneumococcalstrains in patients with COPD or bronchiectasis. First, it is wellknown that these patients have several impairments in innate lungdefenses, facilitating the permanent colonization by microorgan-isms (27). Second, the persistence of the strains could be related totheir serotype and/or genotype. The capsule is the main virulencefactor of S. pneumoniae, since it prevents the opsonization bymac-rophages (19). An association between capsular type polysaccha-ride, susceptibility to neutrophil-mediated killing, and carriageprevalence has been demonstrated, and the serotypes expressed byseveral persistent strains of the present study (19F, 6B, 11A, 19A,and 9V) are able to avoid neutrophil-mediated killing (30).

Ten out of 14 strains belonged to three clonal complexes(CC156, CC88, and CC63), suggesting a major role of the geneticbackground on persistence. In agreement with this finding, a ma-jor genotype (related to CC177) was recovered from children at-tending day care centers, and prolonged colonization was ob-served in 22%of children (25). Genetic characteristics could favorthe colonization over time of these clonal complexes, such as thepresence of biofilmor adhesins such as PspCor PspA and/or pilus,which can facilitate the adhesion to the epithelial cells (14, 17).The presence of pilus has been shown to be a clonal property, andwhen the type I pilus was analyzed, it was detected only in persis-tent strains belonging to both genotypes CC156 and CC90 (datanot shown), as was documented previously (21).

Third, possible biofilm formation (by S. pneumoniae or an-other pathogen) in the respiratory tract of these patients may pre-

vent the appropriate diffusion of antibiotics and therefore mayresult in a decrease in the bacterial load but not bacterial eradica-tion. This might explain why the persistent, amoxicillin-clavu-lanic acid-susceptible (MIC � 2 mg/liter) strains of 6 patientscould persist over time in spite of multiple courses of this antibi-otic.

On the other hand, it is well known that pneumococci canacquire �-lactam resistance by acquisition of exogenous DNA attheir PBPs from either �-lactam-resistant pneumococci or com-mensal streptococci, such as Streptococcus oralis or Streptococcusmitis (31). Surprisingly, in spite of the amoxicillin-clavulanic acidpressure on the six persistent pneumococci resistant to amoxicil-lin-clavulanic acid, neither new recombination events nor pointmutations in the pbp2b of the resistant strains were observed.These results suggest that an optimal combination of pbp genes ismaintained to compensate for the fitness cost imposed by addi-tional changes in these genes, either by point mutation or recom-bination, as has previously been shown (1).

In contrast, the development of fluoroquinolone resistancewas observed among the persistent strains isolated from 3 of 6patients after receiving single or multiple courses of fluoroquin-olone treatment. The frequency of mutation to ciprofloxacin re-sistance in S. pneumoniae has been shown to be in the range of10�8 to 10�9; hence, it is possible that the fluoroquinolone pres-sure on the high pneumococcal inoculum (�106 CFU/ml) ob-served in patients with COPD or bronchiectasis could select forspontaneous mutants at the QRDRs (8). The persistence of fluo-roquinolone-resistant isolates could be related both to an inade-quate treatment and to the fitness cost of the mutations. Somepatients with chronic respiratory disease are colonized by P.aeruginosa and H. influenzae and sometimes receive multiplecourses of fluoroquinolones, usually empirically. Furthermore,the mutations found in these persistent strains are not related to adecrease in bacterial fitness [fitness has been associated only withthe amino acid changeGyrA(E85K), which is not present in any ofthe persistent resistant isolates] (3). Overall, our study demon-strates the risk of the development of fluoroquinolone resistanceamong persistent pneumococci after fluoroquinolone therapy.This fact should be considered before starting a new empiricalfluoroquinolone treatment in order to avoid therapeutical fail-ures.

The analyses of the sequences determined in this study (7

FIG 3 Amino acid substitutions in PBP1A, PBP2B, and PBP2X, compared to those PBPs of the susceptible pneumococcal R6 strain. Highlighted positionsindicate changes related to�-lactam resistance. Dots are placed when amino acids are identical to R6. Allele differences between sequence types, i.e., alleles A andB of PBP2B and alleles A and D of PBP2X, are divided into two alleles (e.g., A1 and A2), and differences are shaded. See also Table 1.

Domenech et al.

4052 jcm.asm.org Journal of Clinical Microbiology

Page 182: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������5A�

REC

UR

REN

CE A

ND

PERSISTEN

CE

08@�

housekeeping genes, QRDRs of parC, parE, and gyrA; pbp1a,pbp2b, pbp2x), together with the analyses of macrolide and tetra-cycline determinants, suggests that a pneumococcal strain can col-onize the respiratory airways for an extended period of time.Moreover, the low clonal diversity observed among these persis-tent strains also suggests that some pneumococci are successfullyadapted to persist over a long period of time in patients withchronic respiratory disease and thus potentially cause multipleacute exacerbation episodes.

ACKNOWLEDGMENTS

Weacknowledge the use of the Streptococcus pneumoniaeMLSTwebsite atImperial College London, which is funded by the Wellcome Trust. Wethank all the staff of theMicrobiology Laboratory of Hospital Universitaride Bellvitge who contributed to this project.

A.D. was supported by a grant from Formación de Profesorado Uni-versitario (FPU; Ministerio de Educación, Spain). A.B.B. is a WellcomeTrust Career Development Fellow.

There are no transparency declarations to make.This work was supported by grants from the Fondo de Investigaciones

Sanitarias de la Seguridad Social (PI 0901904), by grants (BIO2008-02154and BIO2011-25343) from Plan Nacional de I�D�I of Ministerio deCiencia e Innovación, and by CIBER de Enfermedades Respiratorias,CIBERES (CB06/06/0037), run by the Instituto de Salud Carlos III(ISCIII), Madrid, Spain.

REFERENCES1. Albarracin Orio AG, Pinas GE, Cortes PR, Cian MB, Echenique J.

2011. Compensatory evolution of pbp mutations restores the fitnesscost imposed by beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae.PLoS Pathog. 7:e1002000. doi:10.1371/journal.ppat.1002000.

2. Alonso R, Galimand M, Courvalin P. 2004. An extended PCR-RFLPassay for detection of parC, parE and gyrA mutations in fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae. J. Antimicrob. Chemother. 53:682–683.

3. Balsalobre L, Ferrandiz MJ, De la Campa AG. 2011. Nonoptimal DNAtopoisomerases allow maintenance of supercoiling levels and improve fit-ness of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 55:1097–1105.

4. Brueggemann AB, Pai R, Crook DW, Beall B. 2007. Vaccine escaperecombinants emerge after pneumococcal vaccination in the UnitedStates. PLoS Pathog. 3:e168. doi:10.1371/journal.ppat.0030168.

5. Calatayud L, et al. 2010. Serotype and genotype replacement amongmacrolide-resistant invasive pneumococci in adults: mechanisms of resis-tance and association with different transposons. J. Clin. Microbiol. 48:1310–1316.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008. Performance stan-dards for antimicrobial susceptibility testing: 18th informational supple-ment. CLSI document M100-S18. CLSI, Wayne, PA.

7. Coffey TJ, et al. 1991. Horizontal transfer of multiple penicillin-bindingprotein genes, and capsular biosynthetic genes, in natural populations ofStreptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 5:2255–2260.

8. Davidson R, et al. 2002. Resistance to levofloxacin and failure of treat-ment of pneumococcal pneumonia. N. Engl. J. Med. 346:747–750.

9. De la Campa AG, et al. 2003. Genetic characterization of fluoroquin-olone-resistant Streptococcus pneumoniae strains isolated during cipro-floxacin therapy from a patient with bronchiectasis. Antimicrob. AgentsChemother. 47:1419–1422.

10. De la Campa AG, et al. 2004. Fluoroquinolone resistance in penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae clones, Spain. Emerg. Infect. Dis. 10:1751–1759.

11. De la Campa AG, et al. 2009. Changes in fluoroquinolone-resistant

Streptococcus pneumoniae after 7-valent conjugate vaccination, Spain.Emerg. Infect. Dis. 15:905–911.

12. Del Campo R, et al. 2005. Population structure, antimicrobial resistance,andmutation frequencies of Streptococcus pneumoniae isolates from cysticfibrosis patients. J. Clin. Microbiol. 43:2207–2214.

13. Domenech A, et al. 2011. Serotypes and genotypes of Streptococcus pneu-moniae causing pneumonia and acute exacerbations in patients withchronic obstructive pulmonary disease. J. Antimicrob. Chemother. 66:487–493.

13a.Domenech A, et al. 2012. Pneumococci causing multiple episodes ofacute exacerbations in patients with chronic respiratory disease (AECRD):genetic characterization of persistent strains, poster P449. 8th Int. Symp.Pneumococci Pneumococcal Dis., Foz do Iguazu, Brazil, 2012.

14. Domenech M, Garcia E, Moscoso M. 2012. Biofilm formation in Strep-tococcus pneumoniae. Microb. Biotechnol. 5:455–465.

15. Enright MC, Spratt BG. 1998. A multilocus sequence typing scheme forStreptococcus pneumoniae: identification of clones associated with seriousinvasive disease. Microbiology 144:3049–3060.

16. Hakenbeck R, et al. 1999. Penicillin-binding proteins in beta-lactam-resistant Streptococcus pneumoniae. Microb. Drug Resist. 5:91–99.

17. Kreikemeyer B, et al. 2011. Genomic organization, structure, regulationand pathogenic role of pilus constituents inmajor pathogenic streptococciand enterococci. Int. J. Med. Microbiol. 301:240–251.

18. Liñares J, et al. 1992. Trends in antimicrobial resistance of clinical isolatesof Streptococcus pneumoniae in Bellvitge Hospital, Barcelona, Spain(1979–1990). Clin. Infect. Dis. 15:99–105.

19. Magee AD, Yother J. 2001. Requirement for capsule in colonization byStreptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 69:3755–3761.

20. Montanari S, et al. 2007. Biological cost of hypermutation in Pseudomo-nas aeruginosa strains frompatients with cystic fibrosis.Microbiology 153:1445–1454.

21. Moschioni M, et al. 2010. Prevalence of pilus-encoding islets amongacute otitis media Streptococcus pneumoniae isolates from Israel. Clin. Mi-crobiol. Infect. 16:1501–1504.

22. Pan XS, Ambler J, Mehtar S, Fisher LM. 1996. Involvement of topo-isomerase IV and DNA gyrase as ciprofloxacin targets in Streptococcuspneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 40:2321–2326.

23. Pauwels RA, et al. 2001. Global strategy for the diagnosis, management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHOGlobal Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Work-shop summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163:1256–1276.

24. Rosón B, et al. 2000. Prospective study of the usefulness of sputum Gramstain in the initial approach to community-acquired pneumonia requiringhospitalization. Clin. Infect. Dis. 31:869–874.

25. Sá-Leão R, et al. 2008. High rates of transmission of and colonization byStreptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae within a day carecenter revealed in a longitudinal study. J. Clin. Microbiol. 46:225–234.

26. Sethi S, Evans N, Grant BJ, Murphy TF. 2002. New strains of bacteriaand exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J.Med. 347:465–471.

27. Sethi S, Murphy TF. 2008. Infection in the pathogenesis and course ofchronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 359:2355–2365.

28. Valderrey AD, et al. 2010. Chronic colonization by Pseudomonas aerugi-nosa of patients with obstructive lung diseases: cystic fibrosis, bronchiec-tasis, and chronic obstructive pulmonary disease. Diagn. Microbiol. In-fect. Dis. 68:20–27.

29. Varaldo PE, Montanari MP, Giovanetti E. 2009. Genetic elements re-sponsible for erythromycin resistance in streptococci. Antimicrob. AgentsChemother. 53:343–353.

30. Weinberger DM, et al. 2009. Pneumococcal capsular polysaccharidestructure predicts serotype prevalence. PLoS Pathog. 5:e1000476. doi:10.1371/journal.ppat.1000476.

31. Willems RJ, Hanage WP, Bessen DE, Feil EJ. 2011. Population biologyof Gram-positive pathogens: high-risk clones for dissemination of antibi-otic resistance. FEMS Microbiol. Rev. 35:872–900.

32. Zalacain R, et al. 1999. Predisposing factors to bacterial colonization inchronic obstructive pulmonary disease. Eur. Respir. J. 13:343–348.

Streptococcus pneumoniae in Chronic Patients

December 2012 Volume 50 Number 12 jcm.asm.org 4053

Page 183: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=���������������������#�S. pneumoniae�C

HA

PTER

IV

08Q�

Page 184: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

CHAPTER V: S.� pseudopneumoniae�

�����������������������D����������

Objective 6: ��������������S. pseudopneumoniae�

��������7������7����������7�����������(,--0/

-.1��

=���� �x&� 3� 3��]��� �x&� ������� �x&� !����� �&� ��6����� B&� ���

�������� E&� �����7� 4&� 3O/��^�� =� (,-081� �������� 5�������� �#�

Streptococcus pseudopneumoniae� ��� G�/�7������� S.

pneumoniae�"��������%��7�5����#���������7�����S. pneumoniae���

3�����"��3�H��Q:�R@-<@�(#������������������������������7����

����� ���1��

Page 185: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0<-�

Page 186: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

0<0�

Disease Isolates of Streptococcus pseudopneumoniaeand Non-Typeable S. pneumoniae PresumptivelyIdentified as Atypical S. pneumoniae in SpainDora Rolo1,2., Alexandra S. Simoes3,4., Arnau Domenech1,2., Asuncion Fenoll5, Josefina Linares1,2,

Hermınia de Lencastre3,6, Carmen Ardanuy1,2, Raquel Sa-Leao3,4*

1 Institut d’Investigacio Biomedica de Bellvitge, Hospital Universitari de Bellvitge, Microbiology Department, Universistat de Barcelona, Barcelona, Spain, 2Centro de

investigacion en red de enfermedades respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain, 3 Laboratory of Molecular Genetics, Instituto de Tecnologia Quımica e

Biologica, Universidade Nova de Lisboa, Oeiras, Portugal, 4 Laboratory of Molecular Microbiology of Human Pathogens, Instituto de Tecnologia Quımica e Biologica,

Universidade Nova de Lisboa, Oeiras, Portugal, 5National Center for Microbiology, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain, 6 Laboratory of Microbiology, The

Rockefeller University, New York, New York, United States of America

Abstract

We aimed to obtain insights on the nature of a collection of isolates presumptively identified as atypical Streptococcuspneumoniae recovered from invasive and non-invasive infections in Spain. One-hundred and thirty-two isolates werecharacterized by: optochin susceptibility in ambient and CO2-enriched atmosphere; bile solubility; PCR-based assaystargeting pneumococcal genes lytA, ply, pspA, cpsA, Spn9802, aliB-like ORF2, and a specific 16S rRNA region; multilocussequence analysis; and antimicrobial susceptibility. By multilocus sequence analysis, 61 isolates were S. pseudopneumoniae,34 were pneumococci, 13 were S. mitis, and 24 remained unclassified as non-pneumococci. Among S. pseudopneumoniaeisolates, 51 (83.6%) were collected from respiratory tract samples; eight isolates were obtained from sterile sources. Highfrequency of non-susceptibility to penicillin (60.7%) and erythromycin (42.6%) was found. Only 50.8% of the S.pseudopneumoniae isolates displayed the typical optochin phenotype originally described for this species. None harboredthe cpsA gene or the pneumococcal typical lytA restriction fragment length polymorphism. The Spn9802 and the specific16S rRNA regions were detected among the majority of the S. pseudopneumoniae isolates (n = 59 and n= 49, respectively).The ply and pspA genes were rarely found. A high genetic diversity was found and 59 profiles were identified. Among the S.pneumoniae, 23 were capsulated and 11 were non-typeable. Three non-typeable isolates, associated to international non-capsulated lineages, were recovered from invasive disease sources. In conclusion, half of the atypical pneumococcal clinicalisolates were, in fact, S. pseudopneumoniae and one-fourth were other streptococci. We identified S. pseudopneumoniae andnon-typeable pneumococci as cause of disease in Spain including invasive disease.

Citation: Rolo D, S. Simoes A, Domenech A, Fenoll A, Linares J, et al. (2013) Disease Isolates of Streptococcus pseudopneumoniae and Non-Typeable S. pneumoniaePresumptively Identified as Atypical S. pneumoniae in Spain. PLoS ONE 8(2): e57047. doi:10.1371/journal.pone.0057047

Editor: Eliane Namie Miyaji, Instituto Butantan, Brazil

Received December 5, 2012; Accepted January 16, 2013; Published February 21, 2013

Copyright: � 2013 Rolo et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Funding: This work was supported by a grants from the Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (PI060647 and PI090104), Plan Nacional deI+D+I of Spain’s Ministerio de Ciencia e Innovacion (BIO2008-02154), Centro de investigacion en red de enfermedades respiratorias (CB06/06/0037) run by theInstituto de Salud Carlos III (Madrid, Spain), Fundacao para a Ciencia e Tecnologia, Portugal (PDTC/BIA-MIC/64010/2006, PTDC/BIA-BEC/098289/2008 and Pest-OE/EQB/LA004/2011). DR was supported by a grant from Institut d’Investigacio Biomedica de Bellvitge. ASS was supported by a grant from Fundacao para a Ciencia ea Tecnologia (SFRH/BD/27325/2006). AD was supported by a grant from Formacion de Profesorado Universitario (Ministerio de Educacion, Spain). The funders hadno role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Competing Interests: HL is an editor for this journal. This does not alter the authors’ adherence to all the PLOS ONE policies on sharing data and materials.

* E-mail: [email protected]

. These authors contributed equally to this work.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an important human

pathogen worldwide responsible for systemic diseases such as

meningitis, pneumonia, and bacteraemia. [1,2] Culture-based

identification methods usually rely on colony morphology,

optochin susceptibility, bile solubility, and agglutination by the

Quellung reaction. [3] However, exceptions have been described

and include pneumococci that are optochin-resistant, [4,5] bile-

insoluble, [6] and do not have a specific agglutination in the

Quellung reaction due to lack of capsule. [7,8] This latter group is

generally called non-typeable pneumococci and is often found in

colonization. [7,9] Although sporadically, non-typeable pneumo-

cocci have also been associated with disease such as conjunctivitis

(including large outbreaks), [10,11] acute otitis media, [12] acute

exacerbations in patients with chronic obstructive pulmonary

disease (COPD), [13] and more recently in invasive disease. [14].

Pneumococcal isolates displaying odd properties in the assays

described above have been collectively named atypical pneumo-

cocci and are often difficult to identify. On the other hand,

sporadic isolates of closely-related species that have one or more

properties typically associated with pneumococci have been

described. [9,15,16].

In 2004, Arbique and colleagues identified some of these

atypical pneumococci as a new species – Streptococcus pseudopneumo-

niae. [17] Although similar to pneumococci, they were character-

PLOS ONE | www.plosone.org 1 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 187: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0<,�

ized by being bile insoluble and optochin-resistant when incubated

under a 5% CO2 atmosphere but optochin–susceptible when

incubated under ambient atmosphere. S. pseudopneumoniae have

been identified among colonizing children and respiratory

samples. [15,18] Although, their clinical relevance has not been

clearly established, S. pseudopneumoniae have been associated with

COPD, [19] and its disease potential has been demonstrated in

mice models of peritonitis and sepsis. [20].

As biochemical tests are often insufficient to distinguish atypical

S. pneumoniae from S. pseudopneumoniae or other closely related

streptococci several molecular assays have been proposed. The

construction of phylogenetic trees using six concatenated multi-

locus sequence typing (MLST) alleles, called Multilocus Sequence

Analysis (MLSA), is considered a good approach to differentiate S.pneumoniae from closely related species. [15,21] In addition, several

other assays have been developed most of which are PCR-based

and target specific pneumococcal virulence factors, such as

autolysin A (lytA), pneumolysin (ply), pneumococcal surface protein

A (pspA), or the capsular polysaccharide biosynthesis gene A (cpsA).

[6,15] Unknown putative genes, specific intergenic DNA sequenc-

es, or specific regions of the 16S rRNA, have also been proposed

to be pneumococcal species-specific. [22,23] However, the

occurrence of Streptococcus mitis isolates harbouring genes encoding

S. pneumoniae virulence factors has been reported and whether the

genetic assays recently proposed universally distinguish pneumo-

cocci from the closely related species remains to be seen.

[15,24,25,26,27].

In this study, we aimed to characterize a large collection of

invasive and non-invasive disease isolates obtained in Spain, which

had been identified as atypical pneumococci. We have combined

MLSA with a panel of phenotypic and molecular assays in order to

gain insights on the nature of such isolates.

Materials and Methods

Ethics StatementThis study and publication of the results were approved by the

‘‘Comite Etic d’Investigacio Clınica del Hospital Universitari de

Bellvitge’’ and written or oral informed consent was considered

not necessary, because data were analyzed anonymously.

Bacterial IsolatesA total of 132 clinical isolates classified as non-(sero)typeable or

atypical pneumococci collected at two Spanish laboratories were

included in the study. There were no duplicates within or between

the two sets studied.

The first set comprised 56 isolates collected at the Spanish

Reference Pneumococcal Laboratory (Centro Nacional de Micro-

biologia, ISCIII, Madrid, Spain), which receives pneumococcal

disease isolates from 190 hospitals throughout the entire country.

The isolates were obtained between 2004 and 2009, and were

mostly (44 out of 56) from non-sterile sites. This set represented

7.7% (56 out of 728) of the total non-(sero)typeable or atypical

pneumococci S. pneumoniae isolated during that period which, in

turn, corresponded to 4.6% of all pneumococcal isolates identified

in the same period. This set included: i) 44 specimens with atypical

pneumococcal identification [optochin resistant in CO2 atmo-

sphere, bile negative, and AccuprobeTM positive (Gen-Probe, San

Diego, California)] of which 43 had been isolated from non-sterile

sites; and ii) 12 non-typeable pneumococci (optochin susceptible in

CO2 atmosphere, and showing no agglutination in the Quellung

reaction), of which eight were invasive isolates.

The second set comprised 76 isolates collected at the tertiary

adult Hospital Universitari de Bellvitge (Barcelona, Spain)

obtained between 1991 and 2009 and were mostly (63 out of 76)

from non-sterile sites. This set represented 43.9% (76 out of 173) of

the total non-(sero)typeable or atypical pneumococci S. pneumoniaeisolated during that period which, in turn, corresponded to 5.1%

of all pneumococcal isolates identified in the same period. This

collection also include two groups of isolates: i) 35 specimens with

atypical pneumococcal identification [reduced optochin suscepti-

bility in CO2 atmosphere, positive SlidexH pneumo-Kit aglutina-

tion test (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, France)] of which 30 had

been isolated from non-sterile sites; and ii) 41 non-typeable

pneumococci (optochin susceptible in CO2 atmosphere and

showing no agglutination in the Quellung reaction), of which

eight were invasive isolates.

In the total collection invasive isolates were obtained from blood

(n = 11), bronchoalveolar lavage (n = 7), transthoracic needle

aspiration (n = 1), cerebrospinal fluid (n = 1), bronchoscopic-

protected catheter brush (n = 1) and ascitic fluid (n = 1). Non-

invasive isolates were obtained from sputum (n = 75), bronchial

aspiration (n = 23), conjunctiva swab (n = 4), and others (n = 8).

Optochin Susceptibility

Optochin susceptibility was tested by disk diffusion, using

commercially available optochin disks (5 mg; 6 mm; Oxoid,

Hampshire, England) applied onto blood agar plates (trypticase

soy agar supplemented with 5% sheep blood), which had been

inoculated with a 0.5 McFarland standard suspension of the

culture to be tested. Plates (two per isolate) were incubated in

parallel overnight at 37uC in a 5% CO2 and ambient atmosphere

as described by Arbique et al. to differentiate S. pneumoniae from S.pseudopneumoniae. [17] Isolates were considered to be resistant to

optochin if they displayed inhibition zones smaller than 14 mm.

[17].

Bile Solubility TestThe bile solubility assay was performed according to standard

procedures described by Rouff et al. [3].

Antimicrobial Susceptibility TestingAntimicrobial susceptibility against penicillin, cefotaxime,

erythromycin, clindamycin, cotrimoxazole, tetracycline, ciproflox-

acin, levofloxacin and chloramphenicol was performed by disk-

diffusion and microdilution method, following the recommenda-

tions and definitions of the Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI). [28] In particular, for penicillin, pneumococcal

oral penicillin V breakpoints were used (S:#0.06, I:0.12-1, R:$2);

for cefotaxime, pneumococcal meningeal breakpoints were used

(S:#0.5, I:1, R:$2). For ciprofloxacin, an MIC$4 mg/L was

considered resistant.

Capsular TypingFor pneumocccal capsular detection, isolates were serotyped by

the Quellung reaction, and/or by a PCR-based assay following the

protocols described by the CDC. [29,30] Isolates for which a

capsule could not be assigned were probed against Omniserum

(Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark), a serum that

contains antibodies to all known pneumococcal types.

Multiplex PCR for Detection of lytA, cpsA and aliB-likeORF2

A multiplex PCR assay was used to distinguish S. pneumoniaefrom closely related species as previously described. [9] This

multiplex PCR detects internal fragments of cpsA (a conserved

pneumococcal capsular polysaccharide gene); lytA (the major

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 2 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 188: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

0<8�

pneumococcal autolysin); aliB-like ORF2 (a gene described as

frequently present in the capsular region of non-capsulated

pneumococci); [8] and 16S rRNA (positive internal control).

PCR Screening for Additional Putative SpecificPneumococcal Signatures - pspA, Spn9802 and 16S rRNA

Screening for the presence of pspA (the gene that encodes for the

pneumococcal surface protein A), Spn9802 (a genetic region which

encodes for a protein of unknown function that has initially been

described as a specific target for S. pneumoniae), and a 16S rRNA

allele that has been described as pneumococcal-specific, was done

as described. [22,23,31].

lytA RFLP SignaturesThe lytA gene was amplified by PCR and RFLP signatures

characteristic of typical pneumococcal lytA or atypical (non-

pneumococcal) lytA were determined by digesting the amplification

product with BsaAI and separating the fragments by agarose gel

electrophoresis, as published. [16].

ply and mly PCR Detection and RFLP SignaturesThe presence of ply (encoding pneumolysin, a cholesterol-

dependent pneumococcal citolysin) or mly (a ply homologue

identified in some S. mitis isolates), [32] was screened by digesting

the amplification product with BsaAI and separating the fragments

by agarose gel electrophoresis, as published. [15].

Multilocus Sequence Typing (MLST)The amplification of internal fragments of seven housekeeping

genes (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, and ddl) and allele assignment

were carried out essentially as described in the international

pneumococcal MLST database. [33] Sequencing was performed

at Macrogen, Inc. (Seoul, Korea) and the sequencing analysis was

conducted with DNAStar (Lasergene). For non-pneumococcal

isolates allele assignment was done internally using arbitrary

numbers following the same principles of the published MLST

schemes. The eBURST algorithm [34] was used for determining

the population structure of the S. pseudopneumoniae isolates. Two

strains were considered in the same clonal complex when at least

four of the six alleles were identical (the ddl allele was not

systematically determined for these isolates and was thus excluded

from the analysis). Nucleotide sequences were submitted to the

GenBank database (submission grp 3980184) and are also

available from the corresponding author.

Multilocus Sequence Analysis (MLSA)Phylogenetic analysis using MLST data was done by concat-

enating the sequences of all MLST loci except ddl to obtain one

single sequence of 2,758 bp. [21] MLST allele sequences of S.

pneumoniae, S. mitis, S. pseudopneumoniae, and S. oralis previously

described were used as controls. [15,35,36,37] Phylogenetic and

molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA

version 4 as previously described. [15,38].

Results and Discussion

To obtain insights on the nature and characteristics of 132

Spanish isolates presumptively identified as atypical pneumococci

recovered from invasive and non-invasive disease sources, we

performed several phenotypic and genotypic assays.

For species assignment MLSA was performed as described

previously using the study isolates as well as the collections

previously described by Chi et al. and Simoes et al. [15,35] For 22

isolates one or more MLST alleles could not be obtained despite

repeated attempts using various primers and several different

amplification conditions. For this reason, these isolates were not

fully characterized. For the 110 remaining isolates MLSA was

performed and identified 61 isolates as S. pseudopneumoniae, 34 as S.pneumoniae, and 13 as S. mitis; within the S. pneumoniae branch two

outliers closer to the root of the tree were noted and these

remained unidentified (Figure 1). Isolates which are clearly closely

related to S. pneumoniae but for which species assignment is not

obvious have also been described by others. [39].

Overall, the 22 invasive isolates were identified as 12 S.pneumoniae, 8 S. pseudopneumoniae, 1 S. mitis, and 1 unidentified

isolate. The 110 non-invasive disease isolates were identified as 53

S. pseudopneumoniae, 22 S. pneumoniae, 12 S. mitis, and 23 unidentified

isolates. In all groups sporadic alleles associated in the MLST

database with typical pneumococci were noted (Table S1). The

phenotypic and genotypic characteristics of each group of isolates

are summarized in Table 1 and are discussed below.

S. pseudopneumoniaeA total of 61 S. pseudopneumoniae were identified by MLSA and

were further analyzed. The clinical sources of the S. pseudopneu-moniae isolates were: sputum (n = 32), bronchial aspirate (n = 17),

bronchoalveolar lavage (n = 4), blood (n = 2), conjunctiva (n = 2),

nasal swab (n = 1), bronchoscopic-protected catheter brush (n = 1),

pharyngeal swab (n = 1), and ascitic fluid (n = 1). The majority

(88.5%) of the S. pseudopneumoniae were isolated from adults, and

the male gender was predominant (68.9%) (data not shown).

Antimicrobial non-susceptibility rates were high against peni-

cillin (60.7%) and erythromycin (42.6%), as shown in Table 2.

Among the 26 macrolide-resistant isolates, the MLSB phenotype

and the M phenotype were equally distributed. Only nine S.pseudopneumoniae isolates were fully susceptible to all antimicrobials

tested. High macrolide-resistance rates have been described

among isolates recovered from respiratory samples from New

Zealand, [40] and France. [18] Fluoroquinolone resistant isolates

have also been described. [41] The high antimicrobial resistance

rates together with the confirmation of the ability of this

microorganism to cause invasive diseases raises this pathogen as

a real clinical concern.

The 61 S. pseudopneumoniae isolates displayed heterogeneous

profiles regarding several of the phenotypic and genotypic

characterization assays that were performed (Table 1). In

particular, 16.4% of the isolates were susceptible to optochin in

a 5%CO2-enriched atmosphere and 63.9% were susceptible in

ambient atmosphere. Only 50.8% of the S. pseudopneumoniae isolates

displayed the typical phenotype originally described for this species

(optochin-resistant in CO2 but susceptible in O2 atmosphere).

Also, 36.1% of the isolates were bile soluble. Although these

biochemical traditional identification tests are the first step for

phenotypic identification of S. pseudopneumoniae, in the present study

we observed that these characteristics were frequently diverse

among the isolates of this species, as previously shown. [42].

Screening for genetic markers described by others as species-

specific for S. pneumoniae – specific 16S-rRNA, Spn9802, pspA and

ply - revealed their presence in some S. pseudopneumoniae isolates in

contrast with previous publications. [22,23,43] No S. pseudopneu-moniae isolates harbored the pneumococcal lytA nor the cpsAcapsular gene. The aliB-like ORF2 was present in all isolates. The

lack of cpsA was in line with previous observations that suggest S.pseudopneumoniae lacks a pneumococcus-like capsule. [44].

A high clonal diversity was found as 59 allelic profiles were

detected by MLST (Figure 2 and Table S1). By e-BURST seven

clonal groups were identified and each contained only two allelic

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 3 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 189: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0<<�

profiles. On two occasions, pairs of isolates were found to have the

same allelic profile. No association between isolates sharing a same

allelic profile or being in the same clonal group was obvious.

S. pneumoniaeOut of 34 S. pneumoniae identified in this collection, 23 isolates

previously identified as non-(sero)typeable pneumococci were in

fact capsulated when reanalyzed; the other 11 were confirmed as

non-typeable. Several explanations could be put forward to justify

why isolates previously identified as atypical pneumococcal were

found to be capsulated upon reanalysis. For example, differences

in the quality of the antisera, lack of capsular production due to

passage of isolates on agar plates, and human error.

The clinical sources of the capsulated isolates were sputum

(n = 14), bronchoalveolar lavage (n = 2), blood (n = 5), transtho-

racic needle aspiration (n = 1), and umbilical swab (n = 1). The

majority were isolated from adults (87.5%), and the male gender

was predominant (75.0%). The clinical sources of the non-

capsulated isolates were blood (n = 4), sputum (n = 4), conjunctival

Figure 1. Genetic relationships of the strains determined by MLSA. The symbols indicate: grey triangle, non-invasive disease strains; blackcircle, invasive disease strains; white square, strains described in other studies. [15,17,35,36,37].doi:10.1371/journal.pone.0057047.g001

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 4 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 190: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

0<R�

swab (n = 2), and nasal swab (n = 1). The majority (90%) were

isolated from adults, and 40% were males (data not shown).

Among the capsulated isolates, the most frequent serotypes were

38 and 6B (3 isolates each, Table 3). Interestingly, these serotypes

were also frequently misidentified as atypical pneumococci in a

recent study from the USA. [45] This observation may indicate

that some representatives of these serotypes may be hard to

visualize by the Quellung reaction, leading to misidentification, or

that these serotypes may contain unknown different subtypes.

Multiresistance (non-susceptibility to three or more classes of

antimicrobials) was found among 11 isolates (3 were from invasive

disease) and was associated to NT (n = 4), and serotypes 6B (n = 3),

19F (n = 2), 19A (n = 1), and 33F (n = 1) (Table 3). Three of the

eleven NT isolates were multiresistant. A high frequency of

multiresistance among non-typeable strains has been observed in

other studies. [7,9].

Regarding the classical presumptive identification of pneumo-

cocci based on optochin susceptibility in CO2 atmosphere and bile

solubility, many exceptions were found among this group of

isolates: 20 were optochin resistant and one was bile insoluble.

Although rare, these exceptional phenotypes were previously

reported in other studies. [46].

Table 1. Phenotypic and genotypic characterization of MLSA typeable isolates.

MLSA classification (%)

S. pseudopneumoniae (n =61) S. mitis (n = 13)S. pneumonia

typeable (n =23) nontypeable (n=11)

Phenotypic characterization

optochin susceptibility ($14 mm)

5% CO2 10 (16.4) 8 (34.8) 6 (54.6) 4 (30.8)

ambient atmosphere 39a (63.9) 21 (91.3) 6b (54.6) 8c (61.5)

bile solubility 22 (36.1) 22 (95.7) 11 (100) 2 (15.4)

Genotypic characterization

PCR-based

pneumococcal lytA 0 (0) 23 (100) 11 (100) 0 (0)

pneumococcal specific 16S-rRNA 49 (80.3) 23 (100) 11 (100) 2 (15.4)

Spn9802 59 (96.7) 23 (100) 8 (72.7) 8 (61.5)

pspA 1 (1.6) 21 (91.3) 10 (90.9) 7 (53.8)

cpsA 0 (0.0) 17 (73.9) 2 (18.2) 0 (0)

aliB-like ORF2 61 (100.0) 7 (30.4) 9 (81.8) 12 (92.3)

RFLP signatures

pneumococcal lytA/atypical lytA 0 (0)/61 (100) 23 (100) 9 (81.8)/2 (18.2) 0/11(84.6)d

ply/mly 7 (11.5)/54 (88.5) 23 (100)/0 (0) 11 (100)/0 2 (15.4)/7 (53.8)e

a11 strains did not grow in an ambient atmosphere, among the 39 isolates susceptible to optochin in ambient atmosphere, 31 were resistant in CO2.b3 strains did not grow in ambient atmosphere.c2 strains did not grow in ambient atmosphere.d2 strains were not screened.e2 strains did not amplify, 2 yielded a mixed pattern.doi:10.1371/journal.pone.0057047.t001

Table 2. Antimicrobial susceptibility of 61 S. pseudopneumoniae clinical isolates.

Antibiotic MIC (mg/L) No. non-susceptible isolates (%)

Range MIC50 MIC90

Penicillin #0.03–2 #0.03 0.5 37 (60.7%)

Cefotaxime #0.03–1 #0.12 0.25 2 (3.3%)

Erythromycin #0.12–$128 #0.12 $32 26 (42.6%)

Clindamycin #0.12–$128 #0.12 $0.5 13 (21.3%)

Cotrimoxazole #0.5/9.5–$2/38 #0.5/9.5 $2/38 24 (39.3%)

Tetracycline #0.12–64 #0.25 4 18 (29.5%)

Ciprofloxacin #0.12–32 #1 #1 6 (9.8%)

Levofloxacin #0.12–$16 #1 #1 3 (4.9%)

Chloramphenicol #2–4 #2 #2 0 (0%)

doi:10.1371/journal.pone.0057047.t002

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 5 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 191: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0<?�

Genotypic analysis showed the ubiquitous presence of pneu-

mococcal lytA, specific16S-rRNA, and ply. Spn9802 was present in

all but three non-typeable isolates contrasting with previous

publications that suggested that this ORF was ubiquitous in

pneumococcus. [22,23].

The lytA-typical pneumococcal RFLP signature was identified in

all but two isolates. The two exceptions were associated with a

novel signature also distinct from the characteristic atypical

pattern associated with non-pneumococcal isolates. The molecular

basis of this novel signature is currently being investigated.

The capsular gene cpsA was present in most capsulated isolates

with the exception of those of serotypes 25A and 38 in agreement

with published literature. [9,47] Instead, isolates of serotype 25A

and 38 had aliB-likeORF2 as described, [9] which was also

detected in single isolates of serotype 35A. Among non-typeable

isolates, nine had aliB-like ORF2 and two had cpsA. A possible

explanation for this latter observation is that the isolates may have

lost the capacity to produce a capsule in vitro [14] due to alterations

in the capsular genes. [48].

MLST analysis of the S. pneumoniae isolates showed that close to

one-third (32.4%) had novel allelic profiles. Of interest, six of the

nine allelic profiles identified among the non-typeable pneumo-

coccal isolates were previously identified in other countries and

were also associated to non-serotypeability. The international

PMEN lineages USANT-ST448 and NorwayNT-ST344 accounted

for five isolates, three having been recovered from invasive disease.

Non-typeable pneumococci were previously found not only among

colonization, but also as causative agents of acute otitis media and

conjunctivitis. [7,9,11,12,14] The association of MLST lineages

exclusive of non-capsulated isolates to invasive disease has only

been described recently. [14] These observations suggest that, in

spite of their sporadic occurrence, non-typeable pneumococci

have a higher clinical impact than previously thought as they have

been associated with a varied spectrum of infections including

invasive disease.

S. mitisAlthough the 13 S. mitis isolates were phenotypically and

genotypically heterogeneous, lytA analyses (in addition to MLSA)

consistently suggested they were not pneumococci. Of interest, and

as observed for some S. pseudopneumoniae isolates, a few of the S. mitis

harboured genetic markers – Spn9802, pspA and ply - previously

associated to pneumococci. The occurrence of S. mitis isolates

harbouring genes encoding S. pneumoniae virulence factors has been

described, [15,26] and led to the suggestion that identification of

this group of bacteria by a single identification marker may not be

possible as horizontal gene transfer between them can occur.

[24,27].

Regarding antimicrobial susceptibility, 84.6% were non-suscep-

tible to penicilin and 69.2% were multidrug resistant. Most of the

isolates (12/13) were recovered from non-invasive disease;

however, one isolate was recovered from bronchoalveolar lavage.

S. mitis isolates have been previously associated with disease,

[36,49,50] and high levels of antimicrobial resistance. [15,51].

Non-classified IsolatesClose to one-fifth of the isolates (18.2%) remained non-

classified. Although MLSA associated to the MLST S. pneumoniae

scheme works well to identify atypical isolates, we were unable to

apply it to 24 isolates due to lack of amplification of some DNA

fragments with the combinations of primers that are routinely used

for S. pneumoniae. For these isolates, alternative primers, MLSA

schemes or assays would have been needed. [52] Of note, only one

isolate was recovered from invasive disease.

Figure 2. Representation of the S. pseudopneumoniae population by eBURST analysis. Each point represents a different allele combination.Solid lines, single-locus variants; dashed circles, invasive disease isolates; larger circles indicate two isolates with the same allele combination.doi:10.1371/journal.pone.0057047.g002

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 6 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 192: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

0<@�

ConclusionsIn summary, among disease isolates classified as atypical

pneumococci, close to half (46.2%) were S. pseudopneumoniae, and

only a quarter were pneumococci (17.4% were capsulated and

8.3% were non-typeable). In addition, 9.8% were S. mitis and the

rest were non-pneumococci that remained unidentified. In

agreement with other studies, we found that many of the currently

proposed methodologies to distinguish pneumococci from closely-

related species are not species-specific. Furthermore, S. pseudopneu-

moniae that failed to have the optochin phenotypes described by

Arbique et al. were also identified.

We found that S. pseudopneumoniae have low clonality and that

antimicrobial resistance is well-disseminated is this species. Our

study stresses the clinical role of S. pseudopneumoniae and non-

typeable pneumococci since they have the capacity to cause

invasive disease and the high antimicrobial resistance rates are of

concern.

Supporting Information

Table S1 MLST allelic profiles of non-pneumococcalisolates. Invasive strains are indicated in bold. Most alleles are

divergent from all the alleles described at the S. pneumoniae MLST

database as of July 26, 2012. The allele number of the closest

match is indicated; similarity (in %) is indicated in parenthesis.

ND, not determined.

(DOCX)

Table 3. Properties of S. pneumoniae clinical isolates.

SerotypesSequence typea

(no. of isolates) MLST allelic profile Antimicrobial non-susceptibility patternb Observationsc

6B 90 (1) 5-6-1-2-6-3-4 PEN, TET, ERY, CLI, CTX Spain6B-ST90

94 (1) 5-6-1-2-6-3-54 PEN, TET, CHL, ERY, CLI, SXT, CIP Spain6B-ST90 SLV

8270 (1) 32-28-1-1-15-52-15 TET, ERY, CLI

38 393 (2) 10-43-41-18-13-49-6 Susceptible

8278 (1) 10-61-41-18-13-49-6 Susceptible

13 70 (1) 2-13-1-4-6-12-1 Susceptible

8271 (1) 7-13-368-4-6-1-20 Susceptible

19F 89 (1) 5-5-7-7-8-5-1 PEN, TET, CHL, SXT

8275 (1) 5-5-7-7-8-5-538 PEN, TET, CHL, ERY, CLI, CTX, SXT

25A 393 (1) 10-43-41-18-13-49-6 Susceptible

8274 (1) 10-43-41-18-13-37-6 PEN, SXT

3 180 (1) 7-15-2-10-6-1-22 Susceptible Netherlands3-ST180

4 247 (1) 16-13-4-5-6-10-14 Susceptible

7F 2178 (1) 10-20-14-1-6-20-29 TET Denmark12F-ST218 SLV

10A 8272 (1) 5-13-4-4-6-1-20 Susceptible

17A 8277 (1) 5-365-2-16-6-3-245 Susceptible

18C 191 (1) 8-9-2-1-6-1-17 Susceptible Netherlands7F-ST191

19A 81 (1) 4-4-2-4-4-1-1 PEN, TET, CHL, ERY, CLI, CTX, SXT, CIP, LEV Spain23F-ST81

20 8269 (1) 15-364-8-18-15-1-31 Susceptible

22F 2104 (1) 2-16-1-4-6-1-1 Susceptible

33F 1012 (1) 2-5-29-18-42-3-18 TET, ERY, CLI

35A 1273 (1) 10-12-4-12-9-28-18 Susceptible

NT 448 (2) 8-5-2-27-2-11-71 Susceptible USANT-ST448

508 (2) 13-8-65-1-60-16-6 Susceptible

66 (1) 2-8-2-4-6-1-1 PEN, TET, SXT, CIP, LEV

72 (1) 2-13-2-4-9-4-1 Susceptible

344 (1) 8-37-9-29-2-12-53 PEN, TET, ERY, SXT NorwayNT-ST344

942 (1) 8-10-15-27-2-28-4 PEN, SXT

8268 (1) 8-10-84-1-2-14-4 Susceptible

8273 (1) 8-37-2-27-2-11-53 Susceptible USANT-ST448 DLV

8276 (1) 8-178-9-29-2-12-15 PEN, TET, ERY, CLI, SXT NorwayNT-ST344 DLV

aNovel STs and alleles found in this study are represented in bold.bPEN, penicillin; CTX, cefotaxime; ERY, erythromycin; CLI, clindamycin; TET, tetracycline; CHL, chloramphenicol, SXT, trimethoprim-sulfamethoxazole non-susceptible;CIP, ciprofloxacin; LEV, levofloxacin.cInternational clones of PMEN; SLV, Single Locus Variant; DLV, Double Locus Variant.doi:10.1371/journal.pone.0057047.t003

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 7 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 193: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0<Q�

Acknowledgments

We would like to acknowledge the use of the pneumococcal MLST

database, which is located at Imperial College London and is funded by the

Wellcome Trust.

Author Contributions

Revised the manuscript and approved the final version: RSL DR ASS AD

AF JL HL CA. Conceived and designed the experiments: DR ASS JL CA

RSL. Performed the experiments: DR ASS AD. Analyzed the data: DR

ASS AD CA RSL. Contributed reagents/materials/analysis tools: AF JL

HL CA RSL. Wrote the paper: DR ASS RSL.

References

1. Blasi F, Mantero M, Santus P, Tarsia P (2012) Understanding the burden of

pneumococcal disease in adults. Clin Microbiol Infect 18 Suppl 5: 7–14.

2. O’Brien KL, Wolfson LJ, Watt JP, Henkle E, Deloria-Knoll M, et al. (2009)

Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5years: global estimates. Lancet 374: 893–902.

3. Ruoff KL, Whiley RA, Beighton D (2003) Streptococcus. In: Murray PR, Baron

EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH, editors. Manual of clinical

microbiology. 8th edition ed. Washington D.C.: ASM Press.

4. Munoz R, Fenoll A, Vicioso D, Casal J (1990) Optochin-resistant variants of

Streptococcus pneumoniae. Diagn Microbiol Infect Dis 13: 63–66.

5. Nunes S, Sa-Leao R, de Lencastre H (2008) Optochin resistance among

Streptococcus pneumoniae strains colonizing healthy children in Portugal. J Clin

Microbiol 46: 321–324.

6. Obregon V, Garcıa P, Garcıa E, Fenoll A, Lopez R, et al. (2002) Molecular

peculiarities of the lytA gene isolated from clinical pneumococcal strains that are

bile insoluble. J Clin Microbiol 40: 2545–2554.

7. Sa-Leao R, Simoes AS, Nunes S, Sousa NG, Frazao N, et al. (2006)

Identification, prevalence and population structure of non-typable Streptococcuspneumoniae in carriage samples isolated from preschoolers attending day-care

centres. Microbiology 152: 367–376.

8. Hathaway LJ, Stutzmann Meier P, Battig P, Aebi S, Muhlemann K (2004) A

homologue of aliB is found in the capsule region of nonencapsulated Streptococcuspneumoniae. J Bacteriol 186: 3721–3729.

9. Simoes AS, Valente C, de Lencastre H, Sa-Leao R (2011) Rapid identification of

noncapsulated Streptococcus pneumoniae in nasopharyngeal samples allowing

detection of co-colonization and reevaluation of prevalence. Diagn Microbiol

Infect Dis 71: 208–216.

10. Berron S, Fenoll A, Ortega M, Arellano N, Casal J (2005) Analysis of the genetic

structure of nontypeable pneumococcal strains isolated from conjunctiva. J Clin

Microbiol 43: 1694–1698.

11. Martin M, Turco JH, Zegans ME, Facklam RR, Sodha S, et al. (2003) An

outbreak of conjunctivitis due to atypical Streptococcus pneumoniae. N Engl J Med

348: 1112–1121.

12. Xu Q, Kaur R, Casey JR, Sabharwal V, Pelton S, et al. (2011) Nontypeable

Streptococcus pneumoniae as an otopathogen. Diagn Microbiol Infect Dis 69: 200–204.

13. Domenech A, Ardanuy C, Calatayud L, Santos S, Tubau F, et al. (2011)

Serotypes and genotypes of Streptococcus pneumoniae causing pneumonia and acute

exacerbations in patients with chronic obstructive pulmonary disease.

J Antimicrob Chemother 66: 487–493.

14. Scott JR, Hinds J, Gould KA, Millar EV, Reid R, et al. (2012) Nontypeable

pneumococcal isolates among navajo and white mountain apache communities:

are these really a cause of invasive disease? J Infect Dis 206: 73–80.

15. Simoes AS, Sa-Leao R, Eleveld MJ, Tavares DA, Carrico JA, et al. (2010)Highly penicillin-resistant multidrug-resistant pneumococcus-like strains colo-

nizing children in Oeiras, Portugal: genomic characteristics and implications for

surveillance. J Clin Microbiol 48: 238–246.

16. Llull D, Lopez R, Garcia E (2006) Characteristic signatures of the lytA gene

provide a basis for rapid and reliable diagnosis of Streptococcus pneumoniaeinfections. J Clin Microbiol 44: 1250–1256.

17. Arbique JC, Poyart C, Trieu-Cuot P, Quesne G, Carvalho Mda G, et al. (2004)

Accuracy of phenotypic and genotypic testing for identification of Streptococcuspneumoniae and description of Streptococcus pseudopneumoniae sp. nov. J Clin

Microbiol 42: 4686–4696.

18. Laurens C, Michon AL, Marchandin H, Bayette J, Didelot MN, et al. (2012)

Clinical and antimicrobial susceptibility data of 140 Streptococcus pseudopneumoniaeisolates in France. Antimicrob Agents Chemother 56: 4504–4507.

19. Keith ER, Murdoch DR (2008) Antimicrobial susceptibility profile of Streptococcuspseudopneumoniae isolated from sputum. Antimicrob Agents Chemother 52: 2998.

20. Harf-Monteil C, Granello C, Le Brun C, Monteil H, Riegel P (2006) Incidence

and pathogenic effect of Streptococcus pseudopneumoniae. J Clin Microbiol 44: 2240–

2241.

21. Hanage WP, Kaijalainen T, Herva E, Saukkoriipi A, Syrjanen R, et al. (2005)

Using multilocus sequence data to define the pneumococcus. J Bacteriol 187:

6223–6230.

22. El Aila NA, Emler S, Kaijalainen T, De Baere T, Saerens B, et al. (2010) Thedevelopment of a 16S rRNA gene based PCR for the identification of

Streptococcus pneumoniae and comparison with four other species specific PCR

assays. BMC Infect Dis 10: 104.

23. Suzuki N, Seki M, Nakano Y, Kiyoura Y, Maeno M, et al. (2005) Discrimination

of Streptococcus pneumoniae from viridans group streptococci by genomic subtractivehybridization. J Clin Microbiol 43: 4528–4534.

24. Kilian M, Poulsen K, Blomqvist T, Havarstein LS, Bek-Thomsen M, et al.

(2008) Evolution of Streptococcus pneumoniae and its close commensal relatives.

PLoS One 3: e2683.

25. Denapaite D, Bruckner R, Nuhn M, Reichmann P, Henrich B, et al. (2010) The

genome of Streptococcus mitis B6–what is a commensal? PLoS One 5: e9426.

26. Johnston C, Hinds J, Smith A, van der Linden M, Van Eldere J, et al. (2010)Detection of large numbers of pneumococcal virulence genes in streptococci of

the mitis group. J Clin Microbiol 48: 2762–2769.

27. Whatmore AM, Efstratiou A, Pickerill AP, Broughton K, Woodard G, et al.(2000) Genetic relationships between clinical isolates of Streptococcus pneumoniae,Streptococcus oralis, and Streptococcus mitis: characterization of ‘‘Atypical’’ pneumo-

cocci and organisms allied to S. mitis harboring S. pneumoniae virulence factor-encoding genes. Infect Immun 68: 1374–1382.

28. Clinical and Laboratory Standards Institute (2008) Performance standards for

antimicrobial susceptibility testing; 18th informational supplement. CLSIdocument M100-S18. Wayne, PA.

29. Pai R, Gertz RE, Beall B (2006) Sequential multiplex PCR approach for

determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J ClinMicrobiol 44: 124–131.

30. Available: http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm.Accessed 2012

November 5.

31. Rolo D, Ardanuy C, Fleites A, Martın R, Linares J (2009) Diversity of

pneumococcal surface protein A (PspA) among prevalent clones in Spain. BMC

Microbiol 9: 80.

32. Jefferies JM, Johnston CH, Kirkham LA, Cowan GJ, Ross KS, et al. (2007)

Presence of nonhemolytic pneumolysin in serotypes of Streptococcus pneumoniaeassociated with disease outbreaks. J Infect Dis 196: 936–944.

33. Available: http://spneumoniae.mlst.net/.Accessed 2012 November 5.

34. Available: http://eburst.mlst.net/.Accessed 2012 November 5.

35. Chi F, Nolte O, Bergmann C, Ip M, Hakenbeck R (2007) Crossing the barrier:

evolution and spread of a major class of mosaic pbp2x in Streptococcus pneumoniae,S. mitis and S. oralis. Int J Med Microbiol 297: 503–512.

36. Balsalobre L, Hernandez-Madrid A, Llull D, Martin-Galiano AJ, Garcia E, et al.

(2006) Molecular characterization of disease-associated streptococci of the mitisgroup that are optochin susceptible. J Clin Microbiol 44: 4163–4171.

37. Shahinas D, Tamber GS, Arya G, Wong A, Lau R, et al. (2011) Whole-genome

sequence of Streptococcus pseudopneumoniae isolate IS7493. J Bacteriol 193: 6102–6103.

38. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24: 1596–1599.

39. Scholz CF, Poulsen K, Kilian M (2012) Novel molecular method foridentification of Streptococcus pneumoniae applicable to clinical microbiology and

16S rRNA sequence-based microbiome studies. J Clin Microbiol 50: 1968–1973.

40. Keith ER, Podmore RG, Anderson TP, Murdoch DR (2006) Characteristics of

Streptococcus pseudopneumoniae isolated from purulent sputum samples. J ClinMicrobiol 44: 923–927.

41. Balsalobre L, Ortega M, de la Campa AG (2012) Characterization of

recombinant fluoroquinolone-resistant pneumococcus-like isolates. AntimicrobAgents Chemother.

42. Wessels E, Schelfaut JJ, Bernards AT, Claas EC (2012) Evaluation of several

biochemical and molecular techniques for identification of Streptococcus pneumoniaeand Streptococcus pseudopneumoniae and their detection in respiratory samples. J Clin

Microbiol 50: 1171–1177.

43. Abdeldaim G, Herrmann B, Molling P, Holmberg H, Blomberg J, et al. (2010)Usefulness of real-time PCR for lytA, ply, and Spn9802 on plasma samples for the

diagnosis of pneumococcal pneumonia. Clin Microbiol Infect 16: 1135–1141.

44. Park HK, Lee SJ, Yoon JW, Shin JW, Shin HS, et al. (2010) Identification of thecpsA gene as a specific marker for the discrimination of Streptococcus pneumoniaefrom viridans group streptococci. J Med Microbiol 59: 1146–1152.

45. Ing J, Mason EO, Kaplan SL, Lamberth LB, Revell PA, et al. (2012)Characterization of nontypeable and atypical Streptococcus pneumoniae pediatric

isolates from 1994 to 2010. J Clin Microbiol 50: 1326–1330.

46. Fenoll A, Munoz R, Garcia E, de la Campa AG (1994) Molecular basis of theoptochin-sensitive phenotype of pneumococcus: characterization of the genes

encoding the F0 complex of the Streptococcus pneumoniae and Streptococcus oralisH(+)-

ATPases. Mol Microbiol 12: 587–598.

47. Bentley SD, Aanensen DM, Mavroidi A, Saunders D, Rabbinowitsch E, et al.

(2006) Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90

pneumococcal serotypes. PLoS Genet 2: e31.

48. Melchiorre S, Camilli R, Pietrantoni A, Moschioni M, Berti F, et al. (2012) Point

mutations in wchA are responsible for the non-typability of two invasive

Streptococcus pneumoniae isolates. Microbiology 158: 338–344.

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 8 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 194: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

0<.�

49. Leegaard TM, Bootsma HJ, Caugant DA, Eleveld MJ, Mannsaker T, et al.(2010) Phenotypic and genomic characterization of pneumococcus-like strepto-cocci isolated from HIV-seropositive patients. Microbiology 156: 838–848.

50. Douglas CW, Heath J, Hampton KK, Preston FE (1993) Identity of viridansstreptococci isolated from cases of infective endocarditis. J Med Microbiol 39:179–182.

51. Ioannidou S, Tassios PT, Kotsovili-Tseleni A, Foustoukou M, Legakis NJ, et al.(2001) Antibiotic resistance rates and macrolide resistance phenotypes of viridansgroup streptococci from the oropharynx of healthy Greek children.Int J Antimicrob Agents 17: 195–201.

52. Bishop CJ, Aanensen DM, Jordan GE, Kilian M, Hanage WP, et al. (2009)Assigning strains to bacterial species via the internet. BMC Biol 7: 3.

S. pseudopneumoniae and Non-Typeable Pneumococci

PLOS ONE | www.plosone.org 9 February 2013 | Volume 8 | Issue 2 | e57047

Page 195: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��C

HA

PTER

V

0R-�

Page 196: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

CHAPTER V: S.� pseudopneumoniae�

�����������������������D����������

Objective 7: ��� ���7��� ���� ������ ���

����������� ������������� �#� 4H"�� ��������

�#������7�S. pseudopneumoniae�(,--0/,-0,1��

������� �&� "���� 4&� 3����� 3&� )����� 3&� �����7� 4&� ��6����� B��

4������ ������������� �#� �������� ���� ����� ��������%��

�������7� �������� (4H"�1� �#����� �7� Streptococcus

pseudopneumoniae.�R8���5��������4�#�������������������

������ ��� 4����������7� (54��41�� 3��������� ,-08&� ��%��&�

$�����3�������

Page 197: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

CH

APT

ER V

0R,�

Page 198: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

Clinical characteristics of patients with chronic obstructive 1 pulmonary disease (COPD) infected by Streptococcus 2 pseudopneumoniae.3

4

��� ������0&,\&� 4�� "���0&,&� 3�� 3����,&8&� 3�� )����0&,&� 4�� �����70&,&� B��5

��6����0&,6

7 0)���������7� ���������&� E�������� $�%��������� ��� >���%����/5�5>*��/8 >������� $�%�����7&� >������&� 3����� ,45>*=*3� (4����� ���9 *#���������� =������������1�� 534555�� )������� 3����� 8���������� �#�10 =���������7� )�����&� E�������� $�%��������� ��� >���%����/5�5>*��&�11 >������&�3����12

13

*Corresponding author:14

������������15 Address:�)���������7����������&�E��������$�%������������>���%�����16

!��D����������;&�-Q.-@���E����������������������&�>��������3����17 e-mail:������s����%����������������18

Phone: t8<.8,[email protected]�19

20

Running title:�S. pseudopneumoniae���4H"� �21

Key words: Streptococcus pseudopneumoniae, ����� ��������%��22

�������7��������&�������D���������23

24

25

26

0R8�

Page 199: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

Abstract.27

Background. !� � ����� ���� �%�������� ������ ���� ������ ����%��� �#� S. 28

pseudopneumoniae� ��4H"�����������`�������� ��� ���7��� ���� ������29

��������������#�4H"�����������#������7������������������������30

Methods. !���� ,--,� ��� ,-0,� �� �������� �#� 8?� S. pseudopneumoniae�31

�������������#���������������7����������������������������������32

�#� J���� ������%�� ��������� ���7� ���� ���%����� #���� 8?� ��������33

��##�����������D����������(u8R1������������ (u01�� 5����#������34

��� ��������� ���%�����7� (=���� et al.� "���H�� ,-081+� ������������35

������������7� ������#�������7��������������36

Results. �������������#� ������������ ���?.�@�7�����(3�tQ�?1����8,�37

(QQ�.S1� �#� ����� ���� ���� ������ JH��� ������� ��:� JH��� 55� (u� Q1&�38

JH���555�(u�081����JH���5A�(u�0R1��>�������4H"�&�,R�������������39

������ �/�����������&� ����7� �7������ ��������� �7��������� (u0R1&�40

�7���������(u0R1&������������������� (u.1���;��������%���������������41

(uR1�� 5� ,-� ��������� (0.� ����� �D���������� ��� ��� �������1� S. 42

pseudopneumoniae� ��������������������������������43

�������� �������� ���� ��� ��������� ��������������&� ��D� �������� ����44

������������� T8� ��7�&� ��%�� �������� ��� ��� <� ��� .� ��7�&� ��� ������45

����������##�������%������������� ����������������/��������������������46

(a0-���7�1+��%���������&�����8?��������������������#������������47

0R<�

Page 200: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

������������ ������������7� ������ ���:� ,R�-S� #��� �������&� RQ�8S� #���48

��7�����7�&�@R�-S���������7�&�@,�,S�#��� �����7�������.@�,S����49

��%�#��D����3�D���������� �������������������������������������������50

Conclusions. S. pseudopneumoniae, �������� ���� �� � #�����7� ���� ��51

�������������������������D�����������#��������� ������%����4H"���52

5���������������������� ����������#����������������������������������53

54

55

Introduction.56

Streptococcus pseudopneumoniae� ��� �� ������� ���� ������� ��� ����57

%�����������������������(AJ31&������������������������������ ����58

Streptococcus pneumoniae.0� >���� ������� ��%�� ..S� 0?3� �=G�� ����59

������7&� ���� S. pseudopneumoniae� �D������� �G�/�G�� �7�����������60

%�������#�@-S&������������7�����7��������0�61

� �� �����7��� ������������� ���� ��������7� ����� #��� ���� ���������%��62

�����#������ �#� S. pseudopneumoniae:� ���D7������� (�H41� ����������7�63

(�����7���#����������������� ����������71�����������(H"�1����������64

��� ������� �� �� ����������� ������� ��4H,&� ����H"�� �����������65

��� �������� �� ������� ������������ E� �%��&� �� �� ����� ����7�66

���#������ �� ���� ������������ ����&� ��7� �� ���#� �#� ���� S. 67

pseudopneumoniae� ��������� ������7��� ����� �7����� �����7��&� ������68

������������#�������%���������##�����,�69

0RR�

Page 201: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

5�� ���� ���� ��������� ����� S. pseudopneumoniae� �� ��� ��������� ������70

��������� �#� �%���%�� �������&� ���� ��� ����������� ��� �������+�71

�� �%��&� ��� ���� ������7� ���� ���������� ���� ������� �������&� ��7���72

���������� ���� 4����� H�������%�� "������7� �������� (4H"�1�,/<� 5�73

#��&�����������##����������������� �������S. pseudopneumoniae�������74

����������7������������ ������� ��� ��������7��� ����������7� ������������&�75

���������������������#�AJ3�<�76

5��������������������������/�7�������S. pneumoniae�������������������77

�����%���� #��� ����� �#������ ������������ ���������� S. 78

pseudopneumoniae ������������������������� �7&�����������������7�79

���� #��� ����� �� ����� ���7���� �#� ���� ����� ������ �#� <� S. 80

pseudopneumoniae� ��������� ��%������ ���� ������� �#� ��%�����81

��������� %������� #������ ��� ����������� �#� ������������82

���������R83

5� ����� ����7� �� ������ ��� ���7��� ���� ������ ������������� �#� 4H"��84

�������� �#������7����������������������&���� �������������������%�����#�85

�����������/���������������������86

Material and methods.87

Ethical statement88

����� ����7� ��� ���� ���������� �#� ���� �������� ���� �����%��� �7� ����89

4����F� w��� ��5%��������� 4�2��� ��� ��E�������� $�%��������� ��� >���%�����90

(E$>1'�� 3������ �������� ��� ��������� ������� ���� �������� �� ��91

��7����������������92

0R?�

Page 202: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

Study design and bacterial isolates93

����� ���������7/����������7� �����������%��7��������������� ���,--.�94

��� ,-0,� ��� ���� E�������� $�%��������� ��� >���%����� �� ���� ������ �#�95

>��������H�7�S. pseudopneumoniae����������#���������������7��������96

�������� ���� ��������� (T0-� ��������� ����� ��� a,R� ����7���� ����97

�� /�� ���#����1&� �����������������#�J���/������%�����������4������98

��� ����������� ������������� �#� ���� �������� ���� �������� �� ��99

����������100

3������ �������� ���� ���������%��7� �������� ��� ��� ���������101

���%�����7&� ����������������� ��������7�#�������������������#��������102

������� (#�;��1�(B� 5�#1�`��� ���� ������� �#� S. pseudopneumoniae ���103

��������&� � ��%�� ������� ���� �����&� ��� �����7��� �������� ����104

���#������ ��� ���� �#� �����,� !������� ��������� ���7���� (������ �����105

������� ���7���&� )�3�1� ��� ���#������ �� ������ ��� �#���� ����106

�����#������( ��������1��107

5� �������&� �� ����������%�� ���7���� ��� ���#�����&� ������� ������108

4H"�� �������� �#����� ���� S. pseudopneumoniae ������ ���� �������109

,--0/,--.&� ����������������7���� ������%�����7�����������,�!��� �����110

����� ����&� ������������ ������� ������� �#� 4H"�� �������� ����111

��%�� ������4H"��������� ��������������������������������������112

JH��� �������� ( ����� JH��� ������ #��� J������ 5������%�� #��� 4�����113

H�������%�������������1�?�114

Antimicrobial susceptibility115

0R@�

Page 203: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

����������������������������7�����������#����������������������#�������116

����������#�S. pneumoniae��#������ �����������7���������������;���117

�����������##�����������������S. pneumoniae�������������������������7�118

�������������#�����7�4���������������7�3�������5��������(4�351� ����119

����&Q������������������ #���3���������������������������#����120

7����121

Statistical analysis.122

3�������������7���� ��������������������3"33�%������0Q�-&������4��/123

����������!�����l���D�������������������������������� �/������"�%������124

���������-�-R� ������������������������7�����#�����125

126

127

Results.128

���������#�8?�S. pseudopneumoniae ������� ���� ���������#����8?�4H"��129

��������������������� ���?.�@�7�����(3���������%�������Q�?1&����8,�130

(QQ�.S1��#������ ������������JH�����������#������������������� ���131

������0��132

>������� 4H"�&� ,R� (?.�<S1� �������� ���� ������ �/�����������:� ���133

�����7�����������(u00��������1&� � �������7������������(u?1&� ������134

�����7������������(u?1���� #���������7������������(u,1����������135

�/�������������#��������������� ���������������������0��136

0RQ�

Page 204: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

�����7/#�%�� �#� 8?� ��������� ���� ��������� ��� ����� �D���������137

��������&� ����������������������������������������+�������������138

���� ����������������������������������� ��� ������������#�� �139

�#��������������������������7����140

5� ,-� ��������� (������ ����� �D���������� ��� ��� �������1&� S. 141

pseudopneumoniae� ��� ��������� ��� �� ������ ���������`������&� �� ����142

��������0?����������S. pseudopneumoniae� ��� ������������������ ����143

������� ���������7� ��������� ��������:� Pseudomonas� aeruginosa�144

(u.1&�Haemophilus� influenzae�(u81&�Haemophilus parainfluenzae (u,1&�145

Moraxella catarrhalis�(u01����Acinetobacter baumannii (u01��E� �%��&�146

���� ������� �������� ���� �������&� ���� �� ����� ������7� ��� ����147

�����������#�J���/������%���������&�����������������������������148

�#� S. pseudopneumoniae�� 5� �������&� �� @� �#� ���� 0?� �������������149

��������&����������� ���,-0-����,-0,&���������������������� ���150

�%��������#��������������%����������5����������S. pseudopneumoniae� ���151

����������a0-Q����7/#��������������������������(#�;��1��152

=�������� ���� �#����� ��%����7&� 08� �������� ��##����� ����� �����153

�D�������������������������������������������&� �������������������154

,,� �������� ���� ��%���� ����� �D���������� ��� ���� ������������:� ?�155

�������� ����� ���� T8� ��7�&� @� �������� ��� ��� <� ��� .� ��7�&� ��� Q�156

�������� a0-� ��7��� ���� ������� ��������� ���� �������� ��������157

�����������7���/��7�����������������G�%���������&�����8?���������������158

�����#�����������159

0R.�

Page 205: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

��������� ���� ������ �#� ����� �D���������� ������ �7� S. 160

pseudopneumoniae� ��� �� &� �� ��##������ ���� �����%��� ����� ����161

��%����7� �#� ���������������� ���� �������#������7�������������� ����162

!*A0� %����:�0-��#�08� �������� ��##��������������� �D�����������������163

�����������������7����������� ����4H"�����������!*A0u�8R�8S�164

�0,�8+� ����&�@��#�Q���������������������/��������������������(o0-���7�1�165

�������������,��/��������������������4H"�� ����������!*A0u�8?�@S�166

�0,�8�(Pu�0�---1��5������ �7&�����##�����������������%����7��#������167

�D���������� ��� ���� ������ �#� ���������7� ��������� ���������168

��������:� ?� �#� ,-� (8-S1� ����� �D���������� ������ �7� S. 169

pseudopneumoniae� ��� �� ������ �������� ��������� o0-� ��7�� �#�170

��������������&� ��� ,� �#� 0?� (0,�RS1� ��������� ���� � �� ��������� (Pu�171

-�,R@1��172

���� ����� #������� ������������ ���������� ���� ����������� (u0?1�173

q���D�����/��%����� ���� (u0<1&� �#���D���� (u01� ��� ����������/174

���������� (u01r&� #���� ��� �7� #�������������� (u0-1� q��%�#��D���175

(u<1&���D�#��D���(u<1��������#��D���(u01r&���������7��(u01��176

*����� �������� (����� �#� ����� ��##����� ����� ����� �D���������1� ����177

�������� ���� ������� �������������� ��� ���� ��� ����%��� ������������178

����������179

������ ,� ��� �� ���� ������������ ������������7� �#� ���� 8?� S. 180

pseudopneumoniae� ���������� ������� ��� S. pneumoniae 4�35�181

����������� #��� S.pneumoniae&� ��D� ��������� ���� ����������� ��� ���� ����182

0?-�

Page 206: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

������������� �������� 3�����������7� ������ ��� �������� ���� �� &� ,R�-S�183

����� ����� �������� A� ����������� #��� S. pneumoniae� ��� 8-�?S� �����184

Streptococcus� ���� A������� J����� ������������ ���� ��������� ����185

����������� ���������������������7� � �� ������������� ������������186

��� #���������������� 5� ������&� ����7� �� ���#� �#� ��������� ���� ��7�187

����������� �����7�����7�� (RQ�8S1�����/�����D������ (RR�?S1�������188

#�#���� S. pseudopneumoniae� ��������� ���� ��������� ��� ��7�����7�&�189

����������� ��� ��������� ��� �����7�� ()�3>������7��1&� �������190

��������������D���������� ���������7�/������������7�()������7��1��191

192

193

Discussion.194

��������������%����#�S. pseudopneumoniae������������������������195

7��&� �� ����� ���� ��� ���� �����7��� ��� ������ �����������7&� ���� ����196

����� ��� ��##����� ��� �����#7�� 3�%����� ���������� ���� ��������+� �� �%��&�197

��7� �����/����� ������� ���7���� ()�3�1� ������ ��� ��� ����� ���198

�����������S. pseudopneumoniae�#����S. pneumoniae����������3JA��199

(,1��!�������������&��������%������#�S. pseudopneumoniae�����������200

�������������������������������201

5� ���� ������� ����7&� �� ���7���� �� ��������%�� �������� �#� S. 202

pseudopneumoniae� ������������%�����#����4H"����������������,-0-/203

,-0,� ������&� ��� �� ����������%�� ���7���� #���� ,--0� ��� ,--.�� 5� ����204

������&������#� (u�0?;8?1��#�S. pseudopneumoniae� ��������� ���� ���������205

0?0�

Page 207: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

������ ����,-0-/,-0,��������� 5�����������D��������7� � �� #���:� ���� #�����206

��&� ��� �������� �#� �� �������� �#� ����� �������� ������ �����207

�D���������� �����������7��������������������������������������208

7������������������������%������������������#�����7��������#������209

5� �� ��������%�� ����7� ���#������ �7� ���� �����&� �� ��������� S. 210

pseudopneumoniae� �� �� RS� (u.;0Q<1� �#� ����� �D���������� ����211

������� �� ��%���� 4H"�� �������� ������ ��/7���� ������� (,-0-/,-001��212

���� ���� ���������� �#� ����� ����7� ��� ����� ��� ��� ���#������ �� �� ������213

��������� ��� �� ������ ����� ��� �%�������+� �����#���&� #������� ��������214

���� ������ �� ������ ��� ��������� ���� #�����7� ��� ���� ����%��� ��� ��215

����������216

���� ����� ��&� ����� ��� �D������� �7� ���� #��� ����� �� ���� ��������%��217

�����(#����,-0-����,-0,1&�������������������� �������������%��7���������218

��� ������ ����� ������� ���� �������� �� RS� 4H,� ��� ������� ����219

�����������+���������&����������������#����,--0����,--.�������� ����220

���������%�� �������� ��� ��7� �������� ���� �� 4H,� ����������+� �� �����221

������&� S. pseudopneumoniae� ������7� ��� �� �������/��������&� ���222

������3JA�������1��!��� ����� �����&� ��4H"���������&���������7� ������223

���� ��%���� ���#�� � ���������� ���� ���� ���� �� ��� ����������7� �����224

�������� �7� ��%����� ������������&� ���� ��������� �#� S. 225

pseudopneumoniae� ����� ��� �������������� ������� ���� �������#� ��226

��������������������� ������##��������������#�������227

5� ���� ������&� �� ���� ���� ��� ��������� (�� �������� �������1&� S. 228

pseudopneumoniae� �������������������������D�����������������������229

0?,�

Page 208: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

�������� ���� �� �����#��� ������+� �� �%��&� ��� ��� ����������� ����� � ��230

��������#�������������������������������������������#� ����&��� ���/� �����231

��������������� (����� ���� 0-� ��7�1�� 5� �������&� �������� ���� ������ �#�232

��������� ��� �� &� �� ��##������ ���� �����%��� ��� ��� ���� ������ �#�233

�����7��� �������� �#� ���� �������� ��� ���� ��%����7� �#� ���� ���������234

������ #���� �#���� ���� ����� �#� S. pseudopneumoniae� ��� �� �����������235

����� �#� ����� �D���������&� �#��� ��������� ���� ��������������� �#� ����236

������&��%������������������������������ �#�������������237

S. pseudopneumoniae������������������������A�������J����&��� �%���238

��� ��������7� �������� ���S. pneumoniae ��� #��� ����� �����&� �� ������� ����239

������������������������7����������4�35������������#���S. pneumoniae��240

J������7&��/������������7��#�S. pseudopneumoniae���������� �������&����241

��� ��������� ���%�����7� �� !���� ��� G� � K�����8&.� 5� #��&� ��7� ?�242

��������� ����#���7������������������� ����������������� ������&������������243

�#�����8?���������� ��������/��������������(��#��������/������������7����244

��� ������ ������ ������������ ������1�� =�������� �������� �/245

������������7&� �������� ������ �#� ������� ������������7� ���� #���� #��� S. 246

pseudopneumoniae&� ����� ���� ����� �������� A� ����������� #��� S. 247

pneumoniae� ��� ���� Streptococcal� ����� A������� J�����Q� ����� �����248

������������ ��������� ������ ��� �� ����� �#� ���&� �� �%��&� �� ����249

�����������7&�����0<��������� ��������%��������������� ��������� ����250

����������&� ���� �� �����#��� ������&� ��� �� ��������� #������� ���251

�����%�������252

0?8�

Page 209: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

����� ����7� ��� ���#������ �� �� ������ ������� ����&� ��� ����253

�������#����������#������7���������������������%���#�����#�����7��#�254

S. pseudopneumoniae� ������ ����� �D���������� �� 4H"�� ���������255

��������� ���� �������� ������� �� ����� ����7� ���� ��%����� �����7���256

��������&� � �� ��������#� ����������������������������� #��� ���� ����������#�257

�� ����� �D��������� �������� ������ �7� S. pseudopneumoniae�� ����258

������ �#� �� ������ ����� �������� �������� #��� ���� �����#������ �#� S. 259

pseudopneumoniae, ���������� �7� ���� #��� ����� �� ���#� �#� ���������260

�����������������,-0-/,-0,��������(��������%��������1&���������������261

���� #�����7� �#� S. pseudopneumoniae� ������ �������� �� 4H"��262

��������������������������263

264

0?<�

Page 210: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

References.265

0�� �������� B4&� "�7���� 4&� �����/4���� "&� W����� J&� 4��%����� )��� J&�266

3������ �����J&�)���7�=*&�B������&���%�����=B&�!������==�(,--<1�267

����7� �#� �����7��� ��� ����7��� ������� #��� �����#������ �#�268

Streptococcus pneumoniae� ��� ���������� �#� Streptococcus 269

pseudopneumoniae������%��B�4���)��������<,:�<?Q?/.?�270

,��=�����&�3�3��]����&���������&�!������&���6�����B&������������E&�271

�����7� 4&� 3O/��^�� =� (,-081� �������� ��������� �#� Streptococcus�272

pseudopneumoniae� ��� �/�7������� S.� pneumoniae� ���������%��7�273

�����#���������7�����3�������������3�����"��3�H��Q:��R@-<@�274

8�� ������� 4&� )���� ��&� )������� E&� >�7����� B&� �������� )G&� B��/275

"������ E� (,-0,1� 4������ ��� ������������ ������������7� ����� �#� 0<-�276

Streptococcus�pseudopneumoniae� ��������� ��!��������������������277

4���������R?:�<R-</@�278

<�� L����� *=&� "������� =J&� ������� �"&� )������ �=� (,--?1�279

4������������� �#� Streptococcus pseudopneumoniae� ��������� #����280

������������������������B�4���)��������<<:�.,8/@�281

R��3��������&��������43&��������J3&���7��J&�`����&�B�������!>&�282

)��BE&����D������4&� �� ��*&�"�������=� (,-081�4��������%��J�����283

���7���� �#� Streptococcus pseudopneumoniae� "��%���� 5������ ����284

A����������4������������7������"��3�Q:��?R?@-�285

0?R�

Page 211: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

?� "�� ����=�&�>������3&�4��%����7�")�et al� (,--01�J������ �������7� #���286

���� ��������&� ��������&� ��� ���%����� �#� ����� ��������%��287

�������7����������GE�>5;`EH�J������ 5������%��#���4�����H�������%��288

������������ (JH��1�`��������������7�����B�=������4����4����)���289

0?8:�0,R?_@?�290

@����������&� "����4&�)���2�3&� 3�����3&� !��O�����&�4�����7����&�291

����� B&� �����7� 4&� ��6����� B� (,-081� 5#������� ��������7� �#� �����292

*D���������� ��3�%����4H"��"�������� B������ �#� 5#����� (����������293

���I�����1��294

Q�� 4������ ���������7� 3�������� 5��������� "��#������ 3�������� #���295

������������3�����������7�������:�*���������5#����������3���������296

)0--/30Q��4�35&�`�7�&�"�&�$3�&�,-0,�297

.�� L����� *=&� )������ �=� (,--Q1� ������������ ������������7� ���#���� �#�298

Streptococcus� pseudopneumoniae� ��������� #���� �������� ���������299

������4���������R,:�,..Q�300

301

0??�

Page 212: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A�

S. pseudopneumoniae

CA

USIN

G A

ECO

PD

������ 0�� 4������ ��� ����������� ������������� �#� ���� 8?� ��������302

�#������7�S. pseudopneumoniae�����������303

304

)���������7�����(3�+�����1:� ?.�@�(��Q�?1�)���� 8,�(QQ�.S1�JH���������:�

5� -�55� Q�555� 08�5A� 0R�

4�������7�����:�������D��������� 8R�"������� 0�

H��������������7�����������:��7����������������7��������� 0R�(<0�@S1��7��������� 0R�(<0�@S1������������������� .�(,R�-S1�4�����%��������������� R�(08�.S1�H�����7� 8�(Q�8S1������������� 0�(,�QS1�4���� 0�(,�QS1�

0?@�

Page 213: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

S. pseudopneumoniae��������*4H"��

CH

APT

ER V

������ ,. In vitro� ���%��7� �#� ��� ������������� ������� S. 305

pseudopneumoniae��������������������������4H"����������306

307

308

4������ ���������7� 3������� 5�������� (4�351� ����������� #��� S. 309 pneumoniae:� �H���� �������� A� ����������� (3:� y-�-?� ��;�&� 5:� -�0,� /� 0�310 ��;�� ��� =:� o,� ��;�1�� �"������� ���������� �������� (�/��������1�311 ���������� (3:� y,� ��;�&� � 5:� <� ��;�� ��� =:� oQ� ��;�1�� "�������312 �����������#���Streptococcus������Az�������J�����(3:�y-�0,���;�&�5:�-�,R�313 /�,���;�����=:�o<���;�1�� �G�/������������7� �������#��D�������������314 )54�a<���;���315

Antimicrobial�MIC

50(μg/mL)�

MIC90

(μg/mL)�MIC range

(μg/mL) % S� % I� % R�

"������� -�R� ,� y-�-8�/�<�,R�-��.@�,��8-�?�

?0�0�,�Q�?.�<�

08�.�-�-�-�-�

4�#���D���� -�,R� -�R� y-�-8�/�,� .@�,� ,�Q� -�-�

4����#��D��� y-�R� ,� y-�R�/�a8,� .<�8�� /� R�@�

��%�#��D��� y-�R� ,� y-�R�/�a8,� .@�,� -�-� ,�Q�

�����7���� y,� a8,� y,�/�a8,� @,�,� ,�Q� ,R�-�

*�7�����7�� y-�,R� o8,� y-�,R�/�a8,� RQ�8� -�-� <0�@�

4�����7�� y-�,R� o8,� y-�,R�/�a8,� @R�-� -�-� ,R�-�

4������������� y,� y,� y,� 0--�-� /� -�-�

4�/�����D������ y-�R;.�R� o,;8Q� y-�R;.�R�/�a<;@?� RR�?� 08�Q� 8-�?�

0?Q�

Page 214: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

CHAPTER VI: synopsis of results

and discussion, and conclusions.

Page 215: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

CH

APT

ER V

I

0@-�

Page 216: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

Synopsis of results and discussion

Page 217: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

0@,�

Page 218: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

S. pneumoniae���������������������������� ��������

���� ����7� ������������ �%��� ���� ������)���� ������ ����������%��

#�������� �%���%���������&� ��� ������� �#�������� ��� �%����������

����������#�S. pneumoniae����������� ����4H"���E� �%��&�4H"��

��� ���� ���� �����7��� �������� �#� �������� ��������� ��������

������&� ��� ���� ������ ����� �#� �/��������� �������� �������

����������� ���� ����&� �#���� �����%������� ��������� ��� �����

(`����� E������ =�����&� ,-0,1+� �� #��&� ����`EH����������� ����� �7�

,-8-�4H"�� ������������������������������#������������ ���� ����

(`�����E������H���������&�,--R1��

��������������������������������������#�S. pneumoniae����

S. pseudopneumoniae� ����������� ������ �������� �� 4H"��

�������&� �D������ ��� ���� ����� ����� ���� �����7��� ��� ����7���

������������ �#� �������� ������ ����� �D���������� ���

�������&����7���� ���� ������#� �������� �7��� �� ��������������

�#� ��������� ������� �%��� ����&� ��� #����7� ���� ������ �#�

�����������������������������������������������

3�%����� �������� ��%�� ��������� ���� #�����7� �#� ���������

��������� ��������� ������ �#� ����� �D���������&� ���� �#� �����

������������JH�����������#�������������(*�����et al., 0..Q+ L��et

al., ,--@+�3�����et al�&�,--Q1��E� �%��&� ����� �JH�������������

������������� ��%�� �����&� ��� �� ������������ ������ ��

����JH���������&��������������������������������D���������

��������� ��� ���� �7�����������7� �#� ���� �������� ���� ����

0@8�

Page 219: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

���������� 5� ������ ��� ���������� ���� #�����7� �#� S. pneumoniae�

��� ������ ��������� ��� #����� ������ �#� ����� �D����������

#���� �������� ����������&� �����#��������������7������������

�������55��

H��� ������� ��� ��� ����� P. aeruginosa� ��� ���� �����

#������� �������� ��������� #���� �*4H"�� �� �������� ���� ��

��%����JH���������&��#��������������������#��������������

��� �� ����� �#� ����� �D���������� �� �������� ���� ��%����

�������+� ��#��&����������#������������7������##��������*4H"��

������ �7� P. aeruginosa ��� �7� ������ ���� #��������� �#� H.

influenzae&�S. pneumoniae&����M. catarrhalis���������������������

�#��*4H"�� �� ���� ����7� ���� �������� ��� ������ ������7� ���������

(�������� et al., ,-0,; L�� et al., ,--@+� 3����� et al�&� ,--Q1&� S.

pneumoniae����������������#�����D����#������%����������������

G�� ��##������ ���� �����%��� �� ���� ���������

������������ ��� ��� �������� ���� ��� ����� �*4H"�� ��������

��� �������� ���� a,� ���������� 5� ������&� H. influenzae ���������

��� ���������� ���� �������� ���� �� �� � #�����7� �#� �*4H"��

��������&� ��� Enterobacteriaceae ������� ���� ��7� �������� ��

�������� ���� #������� �D����������� ���� ����� #�����7� �#� P.

aeruginosa� ��������� ���� ��� ���� ��������� ���%�����7&� ��� ���

����������������������������������������#��������������&�

��������7� �������������������������������������������������

3�%����� ��������� �������� ��� ��� �� ����� ��������� S.

pneumoniae����4H"���������&�����#����7� ������#������������

0@<�

Page 220: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

������������ �#� ��������� ����������� (�����7���� ���

����7���1&� ���� ���������� �#� ��������� ������&� ��� ����

������ �#� ������������ ������7&� ���� ��%�� ���� ��� ���� ��������

������������������555�����������5A��

5�� ��� ���� �� � ����� �������� ���7��������� ��� ���� ����

%������� #����&� ��������� ��������� ����� �� ���� �%���%������#�

���������������&����������������7������������������ ����

���������� ��� ���� ��������� ���������� (>��������� et

al., ,--81��!�������� �����&�����##����������7��������������������

�������� ������ �������� ��� ����� �D���������� ��

4H"���������� ����D�����������������7��������������&� ���������

��������##�����������������������������7� ���������������������

555� ����&� �����7���� (��� ������ �������� ����7���1� 0� (3 ���0/

3�8-?1&� 8� (G���������8/3�0Q-� ��� 3�,?-81&� <� (3�,<@<1&� R�

(4�������R/3�,Q.1� ��� Q� (G���������Q/3�R81� ���� �����

#�������7����������� ������������(����7����������������

�������1����� �����*4H"��(PT-�-R1������������������#��������

����� ���������� �#� ���� ��I��� ����7���� ����� ��������

����������5���������������������������������&������7���8� ������������

#������� ����� �#� ��������� �������� �� 4H"�� �������&�

���������%���%������������#�����������7��� �������������������� �

(>���������et al., ,--<1�����������������������������������7���

�������� �#� ������ 4H"�� �������� ���7� �� ��7� ����� �� ����

��%�������� �#� ����������&� ��� ���� ���� ��������� ���%�����7�

(������et al, ,--@1��H� ���� ������ ���&� �����7���� 0?!���� 00��

��� �/�7������� �������� ���� ���������� ���� �*4H"�&�

��� ������� ��%���%������������!����������&������������ ������

0@R�

Page 221: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

���%����� ����7� (��6����� et al., 0..,1&� �������� ��������� #����

�*4H"�� ��������� ���� ����� ��������� ��� ������������� ����

�%���%�� ��������&� ��������7� ��� #�������������� (8�RS� ��

�����������?�,S����*4H"����������1��5���������������������

����������������� �#������������������ ����7���������������

����������7�������#�����&���������7����������� ����4H"���

4H"�� ��� ���������� �7� #������� ��� �������� �����

�D���������&� ���� ���� ��������� �#� ����� ��������� ����

����������������7��##����������7��#���#��(�������et al., ,--@1&����

��� ����� ���������� ���� ����� ���������� ������ !��� ������ ������&�

���� ���%����� �#� �#������� �*4H"�� ��� �� ��������� �������

=�������� S. pneumoniae&� ����� ���� ���������� �#� �I������

%����� �� ,---&� ���� ���%����� �#� ��������� ��������� ���

������ �� ���� ���� �#� ���� ""A,8� (��������� �� 0.Q81�� 5�� ���

���������� #��� ������� �%��� ���� ���� �#� ,� 7����� ��� ���� ��� ��

�����������7� �������� ������#���%���������������� �#����+�

�� �%��&� ���� �##���%����� �� ���%����� ��������7� ��� ��������7�

���������� ���� ��������� �#����� ��� �����&� ��������7� ��

4H"�� �������� (A���/4������� �� 2�0�,3���, ,-0,1�� 5�

������&� ��� �� �������� �#� "4A@� ����� ��������&� �� ��������

�����������%���%�����������������7�"4A@������7�������������

������������7�����������������%�����

5�����������#���� ����������������������#�"4A@�������

������(�7��������������1������������������*4H"�&� ��

���#�������������������7������������������������555&��� ����

���D������������������#�����7�(#����,--0����,-0,1�������7����

0@?�

Page 222: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

���� ������ �#� "4A@� �� �����7���� ������ �*4H"�� ��� ����

�%�������#�"4A08&������7�����������#�����������

��� �D�����&� �� �������� �������� ���*4H"�������� �7�

"4A@� �����7���� ��� ������ �������� ����7���� ��� �����%���

����������� ���� ����7� ������&� ��������7� 3���.A/440R?&� 3���,8!/

44Q0� ��� 44QQ0.!� ������ 5� ��������&� � �� �����/����� ���������

�����7���&����������������������&�3 ���0R�/3�?8����3�8Q??4�

����� ��� ��� ����#���� ��������� ��� �� �������&� ���������

��������� ������ �#� U/������� ��������� �%��� ����&� ���������

�����������������/�������������������������������

���������������#������7�����%������7�"4A08�����������,--./0,�

������� ��� �� � (,@�,S1+� �� �%��&� %������� �����%��� ���������

������7� �#� ��#�&� ���� 4H"�� ��� ���� ���� �����7��� ��������

���������� ��������������������� �#������� 5�#��&����������

��� ��� ��������7� ����%������� ������������������ ������ �#�"4A08� ��

�������� ������ ����� �D���������&� �� �/����#����

����������"4A08������7����������������"4A@�(0&�8&�R&�?�&�@!�

���0.�1� ��������%������ ���,--.����,-0,��

����� 4H"�� �������&� ���� ��������� �#� � � ������� �#� H.

influenzae����M. catarrhalis� ������������� �����*4H"��(3�����

et al., ,--,1�� E� �%��&� �����7� ����� ���� �%�������� #��� S.

pneumoniae�� H��� �������� �� ���� ������ �#� ���������

������������4H"���������&���������� �������������#��#��������

���%�����7� ���������� ���� ��� ��� ���#���� ���� �������� ��������� ��

�������5A��

0@@�

Page 223: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

H����������&���������������������#��������� ������������

��������&� �#���� ����� ���#����� �������� ���������� �#� �� � �

������ ��� ���� ����� #������� ����� �#� �*4H"�� ����������

E� �%��&� ����� ��� ����� ���������������#� �������������������

�����������������&����������������#�������������&����������

�������������������������������� ��������%������������

5� �������&� �����7���� .A� ��� 0.!� ���� ���������� ����

��������� (PT-�-R1�� ���� ��������� �D�������� ���� �����7��� .A�

�������� ��� ���� 3���.A/440R?+� ���&� ����� ���� ��� �����

���������� ��������������5�������&���%���������7�����D��������

���� �����7��� 0.!� ��� ��� �#� ����� ��� ����#����7� ����������

��������������������������������������������������7��&������������

��������������&���7����7���������������������������������

�#� �������� ����� 4H"�� ��������� >���� �����7���� ����

�%����� �7� ���� ������ �I������ %����&� "4A@&� "4A0-� ���

"4A08+� �� �%��&� ��� ��� ������� ����� ������ �������� �����7���� ���

�������������"4A08�(�����7����0R�&�00�����?41���������������

�#���������������

���� �#����� �#� ���%����� ������������ ������7� �� ����

�������� �*4H"�� ��������� ��� ����� �D�������� )���� �#� ����

�������� ������� �� ���� ����7� ���� ��%���� ��� %��7� ��%���� 4H"�&�

��� ����%��� ��������� ��������� �������� =�������� U/������&�

��������� ������ ���� �� ��##������ �� ���� U/������ ���������

��� ��� ������� (��������� ��� ���#�����1&� U/������ ���������

������ ���������������� �����������������7���%�������������

����������������� �����������7�#� ������/��������������(����7�

440R?� ��� 44QQ1&� ��������� ���� �� ������� ������ ��%�����7�

������� �������/����������� ��� /��������� ����� ��������� #����

0@Q�

Page 224: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

���#������� E� �%��&� �� #���� �� ���������� ��� ���

#������������� ��������� ��� ��%�������� �#� ��������&� ���

���� ���� #�������7� ��������� �� ���� ����������� (��%����� et al.,�

,--,+�������4�����et al.&�,--81��

5� ���� ����� ����7� �� ������� 5A� �� #������ �� ����

��������� ������� ����� ���� ����� ��� �������� �%��� �� ���� �����

������&� ������ ��������� ��������� �#� ����� �D��������� (a8�

��������1�� 5� ��������� ���� ���� ���%����� ����7&� �� ������ �#� 08�

�������� ���� ������7� ��������� ���������� ���� �������

�D�������� �����7���� .A� ��� 0.!&� ���%�����7� ���������� ����

��������+� ��&� �� ����� ���������� ��� ��� #�������������

��������� ��� ��%�������� �#� ��������� ��� ����� ��������

�����������������������������

S. pneumoniae� �� ����%�� U/������ ��������� �7�

���������D��������G���������pbp��#�����������U/�����/���������

�������� ��� �������� ���������&� ���� ��� Streptococcus

oralis ��� Streptococcus mitis (`������� et al., ,-001�� E� �%��&� ��

����������#�������������&�������������������#�U/������������

������� �#� ���� U/������� )54�� ��� �����%��&� �� ������ �#� ���� U/

������ ��������� �� ���� ���������� ��������� ����� ���

���������� ���� ������������7��#� ����pbps&� ��������������������

���������������%����������������������&���������� ��������#��������

���� ���������� ������� �#� ��##����� �������� ���� ���� ����� ����7���

����������������pbps,����������������������������������#�pbp

��������������7�#�������%�������7��#������������(���������et al.,

,-001��

0@.�

Page 225: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

3��� ���� ���������� �#�S. pseudopneumoniae� ������� �7�

��������et al. ��,--<, #� ������ �����%���������� ����������#��/

���������� ��������/����� ������� ������7� #���� �� �������

���������#�4H"��(��������et al., ,--<+�L�����et al., ,--?1�� 5������

�����7��������������� �����S. pseudopneumoniae� ������������

�������������%����#������������%�������#�������������#���

������#��������������������������&��������� �����������

�������� ���� ��%������ ���� ������� �#� ������ ����� �� ������

������� �#� S. pseudopneumoniae (B������ 4� et al.&� ,-0-+�

3������� et al., ,-001�� E� �%��&� ���� ������ ����%��� �#� S.

pseudopneumoniae ������������������������

5� 4������� A&� �� ������� �� ����� �#� �����7��� ���

��������� ����7�� �� ������ ��� ���� �������� ���� ���� ������ �#� S.

pseudopneumoniae�������������&���� ��������������������������

����������4H"������������

3���� S. pseudopneumoniae� ��������� ��������� ��7�����

�����7���� (������/����������� ��4H,����H,�����������&������

������%�&� ��� ��������� �7����� ��������� %������� ����1��

E��&� ���� ���������� ������ ���#������ ���� ��������7�

���##����� ��� ����������� S. pseudopneumoniae� #���� S.

pneumoniae� ��� ������ �����7/�������� ���������&� ������� ����

)�3�� ���7���� ��� ��������� �� ����� �������� ��� ��##���������

����Streptococcal���������)����%��&����������� ������������ �����

����� ������ %���������7&� ��� ��7� ��%�� ����� ������� ����

�������� ����� ���� R.� ������� �%�������� #��� ����� ���7����� �����

#����&� ��������� ���� ��������������������� ������������ ����7�

������ ������&� ��������� ���� ����� ����� ����� ������� ����� ���7� ��

��������� ����� �� ���� ���D�� �#� ��������� �����7�� 5� #��&� ��

0Q-�

Page 226: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

RESU

LTS AN

D D

ISCU

SSION

SYNO

PSIS

����� ��������� �#� ���� ������ ��������� �#� �� S.

pseudopneumoniae� �������� ���� ���� ������ �#� =?� �������&�

��� ����������7� ��������������� ��������������� (3�������et

al., ,-081��

�4������ ����� �#� 4H"�� �������� �#����� �7� S.

pseudopneumoniae ���� ����� ���7����� H��� �������� ��� ��� �����

���� 4H"�� �������� ���� �� �����#��� ������&� ���������� �� �� �

������ ����� �#� ����� �������+� �� �%��&� � �� ������� �#� ��������

�����������������������&� �����#����� ��������������� �����������

������D���������� ��4H"�����������!����7&������#��#����������

������������� ����,-0-/,-0,�������&� ��� �������������������

���� ���������%��7� �������� ��� ���������� �����7���� ����

���#��������������0,�������������������������#��&���������� ����

�����������#������������������������������#������������#������

�#� S. pseudopneumoniae&� ��������� ����� ���� #�����7� ������

����������4H"��������������������������������

H%�����&��������������������������������������%������������

������������������������#������7������#�S. pneumoniae����S.

pseudopneumoniae� ����������� ������ �������� �� 4H"��

��������� !������ ���%������� �������� ���� ������ ��� ������� ����

������ �#� "4A08� ��� #������ %����� �� ���%����� �#�

����������#��������������������&���������7���������##�����

#����4H"���

0Q0�

Page 227: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

37�������#���������������������

CH

APT

ER V

I

0Q,�

Page 228: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

CO

NC

LUSIO

NSCONCLUDING REMARKS

Page 229: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4���������������

CH

APT

ER V

I

0Q<�

Page 230: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4�������A5�

CO

NC

LUSIO

NS

0� �������%����4H"���������&�Streptococcus pneumoniae� ��

��������� ������D����#����������������D���������+� ��� ��� ���

������ ����� ����� ����� �#���� P. aeruginosa� ��� H.

influenzae�

,� 5� ���� �D������&� �����7��� 8� �������� (G���������8/

3�0Q-� ��� 3�,?-8� ����7���1� �����7� ������ �������

���������D������������4H"����������

8� "������� �#� �����7���� 0� (3 ���0/3�8-?1&� <� (3�,<@<1&� R

(4�������R/3�,Q.1����Q�(G���������Q/3�R81� ����������#��

���������� �����������&� ����������7����0?!����00�� ���

���������� ����������D����������

<� 3����7���� ������� �� "4A@� ��%�� ����������7� ��������

�����4H"�����������5���������&������7����0R�����?4&���

������������������7���&���%����� �������#�����������

R� )�������� ��� �����/����� ��������� �������� ������� ����

�������� ������ ����� �D���������� ������ ���� ����

�������5�������&�����������������#��������������������

�%��������

?� �0���4��"�&���� �����"&����"�&0����"&� ��4��&���"���

��&�� �5���*&��"�� 0���-���� � ������ �#� ��������� ����

�������7������������������&�����7��#������7����.A����0.!�

@� W=�=� ������ �%��%��� �� #������������� ��������� ���

#�������7� �����%��� �� ���������� ������� �#���� #������������

����������E� �%��&�����">"������������)�3������7���

�#�������������� ������������%��������

Page 231: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

4���������������

CH

APT

ER V

I

Q� Streptococcus� pseudopneumoniae� ��� ����7� ��������� #���

������D��������������%����4H"�����������5����������������

������ ����������#����������������������������������

.� �������������������%���������7������������������������&�S.

pseudopneumoniae ����� ��� ��� �� �����%���� �#� ������������

�����������������������%�������������

0Q?�

Page 232: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RE

FER

EN

CE

S

REFERENCES

Page 233: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

0QQ�

Page 234: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

�45"� ������ 5���������� `���� J����&� >������� 4>&� `����� �&�

4�7�/>�����7� �+� 4������ #��� �������� 4������ ��� "��%�����

q4�4r� (,-081� ��%����7� 4��������� �� 5���������� "�������

(�45"1������������������������������#���������������0.�

7�������������//$�����3�������))`=�3��%�����3����?,:�./0.�

�������35&�"����!=&�G����3&�3������5&�)���/4�������B&�3O/��^��

=&�=�������)&������������E� (,-0-1�������0</,8-��������

����������������#�����������#�������"�������� �����

������������#���%����������7���0.�� ���������B�4���)��������

<Q:�0-0/Q�

������3=&� )J��� �&� B������&�4�����44&� !������4&�)������

�B&� H���%���� �&� =����� B&� ���� 4)&� >������� �)&� 5�� )&� N�� A�&�

L������ L"+� 5���������� "�������� 3���7� J����� (,--@1�

���������� �#� �����7���� �#� Streptococcus pneumoniae� ����

�������� ��%����7� ��� ������� �� ������:� �� ����������� ����7��

4���5#�������<R:�<?_R0�

���������H�����J&�"����J*&�4������"=&�4���)>&�*�������B�

(,-001�� 4���������7� �%������� �#� ���� ��������� ��������� ����

#���������� ���������7�����/�����������������Streptococcus

pneumoniae��"��3�"�������@:��0--,---�

�������A������ *&� A������� �!&� A�����#� B&� 3����� E� (0..R1�

Streptococcus pneumoniae:�%�������#�����&������������&����

%������)��������=�%�R.:�.0/?-8�

�������B�������#�=���������7����4�������4����)������(0..R1�

3�������� #��� ���� ��������� ��� ���� �#� �������� ���� �����

0Q.�

Page 235: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

��������%���������7�����������������B�������#�=���������7�

���4�������4����)������0R,&�3@@/30,0�

�������� G=&� )�#����� B&�`����� 4"&� E����#����� *3&� E������

JL&�G�����(0.Q@1����������������7����D�����������#������

��������%���������7������������5����)���0-?:�0.?/,-<�

��������&�3�����3&�)�������!B� (,--@1�*D���������� �#� �����

��������%���������7����������"������������3��<:�RR</R?<�

���������� "4� (0..,1� ������������ ��������� �� 3����������

��������:����%��%�� ��4���5#�������0R:�@@_Q8�

�������� B4&� "�7���� 4&� �����/4���� "&� W����� J&� 4��%����� )J&�

3������ ���� �J&� )���7� =*&� B����� �&� ��%����� =B&� !������

==� (,--<1� ����7� �#� �����7��� ��� ����7��� ������� #���

�����#������ �#� Streptococcus pneumoniae� ��� ���������� �#�

Streptococcus pseudopneumoniae� ���� �%�� B�4��� )�������� <,:�

<?Q?/<?.?�

�����7�4&�=�����&� !����� �&� ���������&�4�����7����&� ��6����� B�

(,--.�1�*����������7��#� �%���%������������������������

������ �������� �� >������� ��#���� ��� �#���� ��������� @/%�����

��������� �I������ %���� ���������&� 0..@/,--@�� 4���

5#�������<Q:�R@/?<�

�����7�4&�=���� �&� !����� �&� ���������&�4�����7��� �&� ��6����� B�

(,--.�1� *������� �#� �� ���������/��������� ���� (3�8,-1�

����� �%���%�� �����7��� 0.�� �������� �� 3����� B�

���������4���������?<:�R-@/0-�

0.-�

Page 236: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

�����������4&�������=&�J�����*�(0..?1��7���8/����#���7������

�#� Streptococcus pneumoniae� (4��8>1� ������� �7��� 8�

���7��������� ����7������� �� Escherichia coli� ��� ��

�����������������#���##����������7�����B�*D��)���0Q<:�<<./

<RR�

��������=� (0.Q01�3���������%������ �� ���� ��������� ���

�� ���� ������ ������� �#� ��������� �������� ��� ����

���%������=�%�5#�������8�3����:�30/0@�

��������=�(0.Q?1�3������������#����������������������������

B����������4���������0Q�3������:�8R/<R�

��������=&�J����B�(0.?<1�"������������������ ������������

��#����� ��� ��������� ��������� ��������� �� 5����

)���?-:�@R./@@?�

�%��7� H�&� )������ 4)&� )4���7� )� (0.<<1� 3������� �� ����

������� ������ �#� ���� �������� ������ ����#�������� �#�

��������� �7���:� ������� �#� ����#�������� �7� ��

����D7�������������#���������������#��������������7���

555� B�*D��)���@.:�08@/0RQ

>������ !&� )������� )&� ������ 4&� �������%���� A&� !�������� 5&�

!�������4&�)������&�J������!&�*�����4&�3������&�E����������

)&�"��������`&�4�����3&�=��������=&�4�%����&�)�������

A&� >������ )�� (,--Q1� �� ����� ������ �7��� �� Streptococcus�

pneumoniae� ��� ���%����� �� �������� �����7���� ��� ���������

����������������������B�>��������0.-:�R<Q-/.,�

>�������!�(,--,1�>������������G�*���B�)���8<?:�08Q8/08.8�

0.0�

Page 237: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

>������ B"&� 3����� )`� (0..?1� ���� �����/�����7��� �#�

Streptococcus gordonii� ��� �7������ ����D����� 5#��� 5���� ?<:�

8QR8/8QR@�

>������ )�&� =���� B&� K���I� P&� E�����7� 4&� �������� >&� L���� �&�

���������3&�!�������B&�)�������)&�)�������A&�E�����7�L&�

��������=&�>������L&�`������!&�%��*������&�4�%����&�E�����

�`&� G������� 3&� =�������� =&� E�������/G������� >� (,--?1� ��

��������� ������ �#������ %������� ��� ����� �#��������7�

����������"���G��������3��$3��0-8:�,QR@/,Q?,�

>����� >&� )*��������� )4&� J����� =*&� B��&� `����� 3&� >�D���� �B&�

J��O���� ��&� )����� )B&� "��� =&� �������� ��&� E������� �E&�

)J��� �&� `����7� 4J� (,--?1� "��/� ��� ����%������� �����

����������� �#� �%���%�� ��������� �����7���� #��� ���������

�������� �� ���� $����� 3������ �� 0...&� ,--0&� ��� ,--,�� B� 4���

)��������<<:�.../0-0@�

>���7�4�&�J��7���� B�&�`���3"&�L���44&�=����43&�)������=�

(0..01�Chlamydia pneumoniae&��������`�=&��#���������������

�����������������%���������7�������������=�%�=����������

0<<:�0<-Q/0<0-�

>����7� 3�&� ������ �)&� )�%������ �&� 3������� �&�

=����� ����� *&� 4������ )&� ������� L&� E������ �&� )����7� �&�

W�����)�&�3������J&�3��%�����54&�L����#��)3&�>�������>&�=��%���

"=&�"��������B&�3������>J�(,--?1�J��������7�����#�������������

����7������ ����� #���� ���� .-� ��������� �����7����� "��3�

J����,:��80�

0.,�

Page 238: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

>����7� �E&� >����� =*&� ��� J������ G*� (0.@<1� >����7l��

)������#�����������%��>���������7��

>������ 3&� E������������ 3� (,--?1� A���������7� �#�

������������#������������)���������7�0R,:�,.R/8-8�

>����=*&�)������33&�>�7��B�(,--81�`�������� �7�����0-��������

��������7����%��7�7���{������8?0:�,,,?/,,8<�

>������� �&� E������ "`&� ������ "A&� =����� E4&� ��� J=HH�� =�

(,--<1�"��������%����:������������������������������

A����,,:�,,-./,,,-�

>�������� B&� G���7�� )&� ���/L������ G&� ����/)������ 5&� A������

�)� (,--81� )�������� �#� ����� ����������7� ��� ��������

��������� ����%����������������!���������/3�������#�����

������7�RQ:�,?R/,Q8�

>����������>&�J��##�������&�)�����*&�"�����&�4������`&�3������

>J� (,--8�1�4����� ������������� ��� ��� �%���%�� ��� ��������

Streptococcus pneumoniae� ��� �����7��/� ��� ���/����#��

��##������ �� �%���%��������������������B�5#�������0Q@:�0<,</

0<8,�

>����������>����3������ (,--8�1�J������������������������

�������%�����7��#�Streptococcus pneumoniae �����7���0�����������

B�4���)��������<0:�<.??_<.@-�

>��������� �>&� "��� =&� 4����� �`&� >����� >� (,--@1� A����

������������������������#�������������%������� ��

����$�����3�������"��3�"������8:�0?Q�

0.8�

Page 239: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

>�7�� B&� >����/"���� 4&� 3����7�� L&� >���� =*� (,--R1� `EH�

���������� �#� ���� ������ �#� ������ �� �������� ����� 8?R:00<@/

00R,�

>���� >� (0.?.1� =�%������ �#� �����/� ���� ����/�����7���� �#�

Diplococcus pneumoniae� �7� �� � ��������� �#� ��������

*D���������,R:�.QR/.Q?�

>����� �3&� )>����� )�&� A������� `)&� J��������� 3&� >���7� "&�

)���� �)&� )������ �)&� 3����%�� 3�&� ���� ��&� `����� L>&�

B���� =�&� )����� J>&� J���%��� �&� G����� ���/)�������� *�

(,--@1� 5���������� %�������� �� ���� ���%����� �#� 4H"�� (����

>H���3���71:������������/���������%���������7�������8@-:�

@<0/@R-�

4�����7����&������7�4&�4�������*&�!������&�>�����*&�"��������

=&� )���2� =&� ��6����� B� (,--@1� 3����7���&� 4����&� ���

)�������� �#� =�������� �#� *�7�����7�/=��������

Streptococcus� pneumoniae� 5�������� 4�������� �� 3�����

���������������4���������R0:�8,<-/?�

4�����*&�A���F��*&�H���� ���*���Y���&� !��������&�)������ �&�

P���%���)&�!���D���G&�=���2����/4�����������)&�J�����B�(,--.1�

>����������������������������4H"���������:��������

�������������D�������*���B�4���)��������5#�������,Q:�.@0/?�

4���D� BB&� "������� =B&� >���7� �)&� ������ �=&� N������ B&�

���7�� ������4&�G����)E�(,-0,1�>��������&������&����

����������� �������������� �#� � �� ������� ����7���� �����

Streptococcus pneumoniae� �����7��� ,-� ������:� ����%��7� �#� ��

� ���������������7����B�>����4����,Q@:�,@QQR/,@Q.<�

0.<�

Page 240: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

4������>�&�L� ���)&�L� ���4&���������&�J������J3�(0..,1�

=�����#� ����������������� ���� ������������� �#���������������

�7�Streptococcus pneumoniae��5#���5����?-:�,QR-/,QR<�

4��%�����)J&�3������ �����J&����������&� B������&�!������

==� (,--81� 4�#�������� �#� ��7������� Streptococcus

pneumoniae/�������������� ��������� #���������������#� ��������

�I���%��������Streptococcus pneumoniae.�B�4���)��������<0:�

<<0R/<<0@�

4���������� )&� J����� �4&� )����� =*&� B���� =G&� 3����� E3�

(,--<1������������� ������������7� �#�Streptococcus pneumoniae�

�� ����� ������:� �������� #���� #�%�� 7����� �#� ���� 3*G�=N�

������������3��%�������"��������4���)��������5#���0-:�?<R/

?R0�

4����6���� *&� "�6����� 5&� A���� )4&� ������� �� (0..Q1� "������/

��������� Streptococcus� pneumoniae� �� 4�������:� ������� �#�

�������������������������)����������=������<:�,88/.�

4������ #��� �������� 4������ ��� "��%����� (,--R1� ������ ���

������� �##���� �#� ������� %������� �#� ������� ���� @/%�����

��������� �I������ %���� �� ������ �#� �%���%��

�����������������/�$�����3�����&�0..Q/,--8��))`=�)����

)������`��7�=���R<:�Q.8/Q.@�

4����L&�)J�����&�������%����B4&��� ��*� (0...1����������

������������7�of Streptococcus pneumoniae����#����������������

4������4������>��������3��%�������G�� �����G�*���B�)���

8<0:�,88/,8.�

0.R�

Page 241: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

4���!&�G�����H&�>������4&�5��)&�E�������=�(,--@1�4�������

���� �������:� �%������� ��� ������� �#� �� ��I��� ����� �#� ������

pbp2x� ��Streptococcus pneumoniae&�S. mitis����S. oralis��5��B�

)���)���������,.@:�R-8/R0,�

4������ ���������7� 3�������� 5�������� (,--Q1� "��#������

3�������� #��� ������������ 3�����������7� ������:� *���������

5#����������3����������5:�4�35��������)0--/30Q��`�7�&�

"�&�$3���

4�##�7��B&��� ���4J&��������)&�K����B&�)�����4&�3������>J&�

)������B)�(0..01�E�������������#����#�����������������/������

������� ����&� ��� �������� ����7������ ����&� �� �������

����������� �#� Streptococcus pneumoniae�� )��� )�������� R:�

,,RR_,,?-�

4�##�7��B&��� ���4J&��������)&�3������>J�(0..R1�J���������

��������� ������7� �#� ����/�����/��������� ��������� )�����

�����=������0:�,./8<�

4�##�7� �B&� >�����3&�������� )&�J����/�����)*&�4�������*&�

>�����*&�!������&�3������>J� (0..?1�)������7���������/���������

Streptococcus� pneumoniae� ���%����� #���� 3������ ����������

(0.QQ/0..<1:� �%�����I��� ����� �#� �����7���� 0<&� 0.!� ��� 0R!��

)���������7�0<,:�,@<@/R@�

4�##�7� �B&� *������ )4&� ������� )&� )����� BL&� )����� =&�

E�7�� ��� `&� "���� B4&� 3������ >J� (0..Q�1� =������������

�D������������������������7�������������7����������������

��� #������� �����7��� ������ ����� ������� ��������� �#�

Streptococcus pneumoniae��)���)��������,@:�@8/Q8�

0.?�

Page 242: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

4�##�7��B&�*������)4&��������)&�`�������"&�>�����3&�!������&�

3������>J�(0..Q�1�3����7���0.��%��������#�����3�����������7���

,8!� �������������� ���� �#� Streptococcus pneumoniae. )�����

�����=������<:�R0/RR�

4�����J&�`��������=� (0.@,1���D���7��#�����������%�������

����������� 5:� Streptococci� ��� ����������� ����������

�������"����&�G� �N������������

4����� �&� 3�%����� *"&� "������ A!&� )������ N=&� ������� �� (0..Q1�

)�������� �������������� �#� �������/��������� Streptococcus�

pneumoniae� ��������� ������ ����������7� �������� �� ���� $�����

3�������)����������=������<:�8,R/8@�

4����)B&�`������`�&�,�&�������B3&�N������B&�����������!&�

)�������3&�J��7�>)&�>�������*�(0..-1�"�����������#���

���������("���1���������������7������7�%���������������D��������

�7� ���� ������7� ��������� �������� �����7���� �#� 3����������

����������5#���5����RQ:�8,.8/8,..�

�����=&�)�������=&�)�������)&�"������7��&�N������7�"�(0..?1�

G�������7����� ���������� �� �������� 5������ ���� ��������/

��������� �������� ������ ���� #����� ,� 7������#� ��#�:� �������� ���

�����7���� �����7� ��� ��� ������� �� ��������� �I������

%������B�5#�������0@<:�08R,/08RR�

�����=&�L������L"�(,--Q1� 5������#��I���������������

%�������������������������������5#�������Q:�@QR/@.R�

�����=&�J�%�/��%��G&������%����*&�J���������&�"�����G�(,--.1�

5�����������������#��������#����������/���������3����������

0.@�

Page 243: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

��������������7���0.�������������������������������������

���%������������������B�5#�������0..:�@@?_QR�

������ G&� )J���� �&� J���� L&� �� � �*� (,--?1� )��������

��������� ���������������������������:� �����������#���

�����������������4���5#�������<8:�<8,/<8Q�

��%�����=&�4�%������=&�>����� B�&�>�����B&� ������%���� B4&�

L����7�"&�!������4&��� ��*�(,--,1��=�������������%�#��D���

��� #������� �#� ��������� �#� ��������� ���������G�*��� B�

)���8<?:�@<@/@R-�

��� A�7��� �&� �������� >� (0...1� E��������7���������� #���� �����

�������������!*)3�)��������=�%�,8:�0R8/0@@�

��������)&�B������`&�)���%�������)�(,-0,1�4�������������%��

�������7���������������8@.:�08<0/08R0�

������4������J&�!��������)B&�������!&�"�����F��=&�)������!&�

��6����� B� (,--81� J����� �������������� �#� #������������/

��������� Streptococcus� pneumoniae ������� ��������� ������

����#��D��� ������7� #���� �� ������� ���� �������������

���������������4���������<@:�0<0./,,�

��� ��� 4����� �J&� >���������� �&� �����7� 4&� !����� �&� "F���/

��������� *&� ��6����� B+� 3������ "�������� 5#����� 3���7�

G�� ����J-8;0-8�(,--<1�!�������������������������������/

���������Streptococcus�pneumoniae�����&�3�����*�����5#���

����0-:�0@R0/.�

��� ��� 4����� �J&� �����7� 4&� >���������� �&� "F���/��������� *&�

)������ B)&� !����� �&� ��6����� B� (,--.1� 4������ ��

0.Q�

Page 244: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

#������������/��������� Streptococcus� pneumoniae� �#���� @/

%������I������%������&�3�����*�����5#�������0R:�.-R/00�

���� J������ )&� 5������ !&� )������ 4&� 3�������� )&� "���������� G&�

3��#��� 3&� "����� J&� "������� �� (,--,1� )�������� �##��D� �����

mef(�1� ��� ��#(*1� ���� ������� �7� ��##����� ������ �������� ��

Streptococcus pneumoniae��B�4���)��������<-:�@@</@@Q�

���� J������ )&� G���� ���� BJ&� !������� �B&� "������� �� (,--@1� ����

��������� ��������� ����� erm(>1� ��� mef(*1� ���� ������� �7�

�,-0-� �� ����/���� Streptococcus pneumoniae� ���������

�������� ��� ����� �����D� 44,@0�� ��������� ������

4���������R0:�<0Q</?�

��� �������� E&� ������� �� (,--,1� !���� ��������� �����%���� ���

�������:� ���� �������7D&� ��7/���� ������ ��� ����/���������

������#�Streptococcus�pneumoniae��B����������4���������R-�

3�����3,:�@R/Q0�

��������� �&� >������ =&� E������� =&� A������� `� (,-0,1�

>���7��������#� ������������ ��Streptococcus pneumoniae����

�����7� �������� ������:� ������� #���� �������� )����� �����

=������0Q:�8<</8RQ�

��� �&� B����7� L�&� )����� )4&� J������� 34&� 4����� �&� `���� `J&�

>��������� (,--.1� "��������� ��������� �#� Streptococcus oralis��

)���������7�0RR:�,R.8/,?-,�

�� ���4J&�E��������&�`���#����G&�B������"&�J������=4&�

3������ >J� (0..-1� "������/��������� %������� ���������� ��%��

�������� �������� �������/������ ������� ����� #���� �������/

0..�

Page 245: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

��������� ������� �#� Streptococcus pneumoniae�� "��� G���� ����

3��$3��Q@:�RQRQ/?,�

*����� B&� *��� �&� 3������� �&� G�������� )3&� )���� E&� ����� E�

(0..Q1� 5#���%�� �D���������� �#� ����� ��������:� ��������

��� ��� ������������ �������7� ��� ���� #������ 4����� 008:�

0R<,/Q�

*������ )4&� 3������ >J� (0..Q1� �� ���������� ������� �7����

������ #��� Streptococcus pneumoniae:� �����#������ �#� �����

���������� ���� �������� �%���%�� ��������� )���������7� 0<<:�

8-<./?-�

*������ B&� ������� )� (0...1� "�������� �I������ %������

"�������5#�������B�0Q:�R<8/RR0�

!�����&�=�(,--,1�`����������������������������:��%��%�� ��#�

��D����� ��� ���������� ������� 4��� )�������� =�%� 0R:�

?08/?8-�

!����������&�`������=&�B�����)=&�����������"4&�"�������B&�

)������ ��&� J�������� =G� (,--R1� ���� ���D����� "��I��:� ����

���#���� #�������������#����%��������B����������4���������

R?�3�����,:���8/��,0�

!�������&�L��##���J&�"�������>&�H�������>�(0.RR1�3���������

�������������#����������������������7�����������������7�

������������7�����������B�5������@<:�0@/,?�

!������&�B���� 5&�A�������&�"F�����&�4�����B� (0..Q1�*%��������#�

Streptococcus�pneumoniae������7���������������������������

3���:��������(0..-����0..?1��B�4���)��������8?:�8<<@/R<�

,--�

Page 246: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

!������&�)���2�>������4&�)�6���=&�A�������&�4�����B� (0..01�

3����7��� ������������ ��� ������������ ��������� �#�

Streptococcus�pneumoniae�����������������7�������#��������

3���&�0.@._0.Q.��=�%�5#�������08:�R?/?-�

!������&�J������BB&����������&�J��F���)B&����������/!������&�

E������ J&� 4����� B&� �������� �� (,--.1� ��������� ������ �#�

�%���%��Streptococcus�pneumoniae �����7�������������������

����������������� ��3���� #����0.@.����,--@��B�4���)��������

<@:�0-0,/,-�

!������&����������&�J��F���)B&�A������)�&�=�������H&�J������

BB&�4������"�(,-0,1�A����������������7�������������������7��#�

������ �/�%���%�� Streptococcus� pneumoniae� ��������� ��� ���

��������������#����()�7�,---/)�7�,--01����0-�7������#����()�7�

,-0-/)�7� ,-001� ���������� �#� �I������ %����� #��� �����

�������������3�����5��B����������������<-:�0Q/,8�

!�������� )B&� !����� �&� ������� B&� ��� ��� 4����� �J� (,---1�

E��������� ����#����#�parC����gyrA� �� #������������/���������

����������������#�Streptococcus�pneumoniae�����������������

4���������<<:�Q<-/Q<@�

!����(,--<1�>�����������7��������/��������I������%������

>��)���>����@-:�0/0<�

!������*&�4�� �����>�(0.Q01�*%�����#����I����� ����#����#���

Streptococcus faecalis� ��������� (�9161� #�����������������

����� �� ���� ������ �#� �������� �G��� 4���� 3����� E���� 37���

W����>����0:�@@/Q-�

,-0�

Page 247: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

!�������� 5=&� L������ L"� (0..,1� ��������/���������

�������������������3������#���������������B�����4�����

0<?:�.,-_.,8�

!������B�&��� ��*�(,--R1��� ��%�� ��#�Streptococcus pneumoniae�

�#����� ��������� #�������� ���������� ���� #�������������

����������4���5#�������<0:�00Q/0,0�

J�����*&�������=�(0..@1�)��������������7��#������������������

�#�Streptococcus pneumoniae��!*)3�)�������������0<.:�0/0-�

J����/A����� 4&� 4��������� B&� !��O���/3��F� G&� ����� B&�

A���������=&�)������!&�J������!�(,--.1���������7��#&���������

#������ #��&� �������� ������7/�������� ��������� 4���

)��������5#���0R:�0-88/Q�

J�7� L&� 3������� �3� (,--01� 3�������� ��� ������������ �#� ��

����������� �������� ������� ������ ��������� �##��D� ��

Streptococcus pneumoniae��B�5#�������0Q<:�R?/?R�

J����� =*� B�&� ��� K&� "������ !4&� B����� �&� B��� >�&� �7#����� =&�

B�������BE&�4��%�����)���J&�>�����>`+����%��>��������4����

3��%������������(,-001�5����������������������������7��#�

�%���/�����7��� �%���%���������������� ���������7����

0.�����?�� ������/@/%����� �I������ %��������� B� 5#�������

,-0:�@@-/R�

J��������J&��l���������!&�A���������&��������J&�����J������)&�

"������� �� (,-0,1� 3����7��� ��� ����� �%������� �#� �������/

������������ �%���%�� Streptococcus pneumoniae� �� ���� @/

%����� ��������� �I������ %���� ���� �� 5���7�� ���������

������4���������R?:�<.?R/Q�

,-,�

Page 248: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

J���� )B&� >�� ���� G"&� `���� =� (0...1� 5����#������ �#� �� �##��D�

��������&�pmrA&����������� ���� #���������������������� ��

Streptococcus pneumoniae�� ��������� ������ 4��������� <8:�

0Q@/0Q.�

J�������� =�&� B�##������ B)&� !����� 3G&� 4������ 34� (,-001�

4������� ������ �#� ��������� �������� �� ���� $L� /� ����

�������#�%��������B�)���)��������?-:�0/Q�

J������ 5������%�� #��� 4����� H�������%�� ���� �������� (,-001�

J�������������7�#���������������&���������&�������%������#�

�������������%���������7��������� (��������!������7�,-081�

������������;�������;�����;#����;JH��v=�����v,-08v!��,

-���#

J������ "&� ������ �� (,-0-1� G�/7���� #�������� �����������:�

�����������������������,0�������7��"��������)���B�Q?:�

<.8/R-0�

J���� 4� (0QQ<1� $����� ���� ��������� #p����� ���� ������7����� ��

�����/�����������p��������!�������)���,:�0QR/0Q.�

J������ �&� >���7/�������� J&� ������� "&� `����� L&� =����� )�

(,--?1� )�������� ������������� �#� pbp1a� ��� pbp2b� �� ������

Streptococcus pneumoniae� ��������� �� W����&� 4������ B�

���������4���������R@:�?0/@-�

J����5&������7�4&�4�����7����&�=�����&���������&���6�����B&�

"�������� =� (,-0,1� 5%���%�� ��������� �������� �� ������7�

������:� ������� �#� ���7���� ���������� ���� ���� ����/�7���

3 ���(01/3�8-?��"��3�H��@:��<,R.R�

,-8�

Page 249: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

J��7� >)&� 4�%����� J)� 8��&� ������ E4� B�� (0.Q-1� *������������

�������� �#� Streptococcus� pneumoniae� �� �#���:� ���������&�

�������&���� �#����������� ���� #�����,<��������#� ��#���B� 5#���

����0<,:�.,8/88�

J��##���&�!�(0.,Q1�����3���#�����#�"���������7�����B�E7��

(���1�,@:�008/0R.�

J��%��� 5G&� ��������� �J&� )������� �G&� 37������������� J��

(,-001��7������#�Streptococcus�pneumoniae��������7�����

�������� ��������������%���������������I������%����

�%��������4������J������A����,.:�QQQ,_@�

J����� ��� �����I�� ��� ��� "����� ��� =�������� 7� "�������� ���

A����� (,--?1� *#�������� 5%���%�� ���� 3����������

���������� 5�������� ��� ��� %������ �� ��� %����

�I�����������%�������4������)�37�(��1&�)������

E���*&�J��������*&�3������*�&�A�����I��B&�>���������)&�E��I���

3)&�J������`4&�����7�3&�)��������&�������>&�"��������

3&� %�� ������ �B&� >���� )B� (,--Q1� =�������� ��� ������ �#�

4�"5��:���=4���#� 08/%����� �I���������������� %����

�##��7��������������������G����B�)��??:�8@Q/Q8�

E�������=&�J������&�K������&�3����B>� (0...�1�>���/������

��������� �� Streptococcus� pneumoniae:� �������/������

�������� ��� �/�������/������ ��������� )��� )�������� 88:�

?@8/?@Q�

E������� =&� L������� L&� L���� �&� %�� ���� ����� )&� "���� B&�

=������ "&� K����� �� (0...�1� "������/������ �������� ��

,-<�

Page 250: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

����/�����/��������� Streptococcus� pneumoniae�� )����������

=������R:�.0/..�

E������� =&� )������� �&� ��������� �&� >������ =� (,--.1�

A���������7� �#� �������������������������/�������������� ��

Streptococcus pneumoniae� ��� �������� �����������!*)3�

)��������=�%�88:�R@,/RQ?�

E���� �)&� `����7� =�&� ����� >&� J������ =4&� *#��������� �� (0..?1�

J����� ����������� ����� ��� ��� ��� �����7���� �#�

3�������������������#��������$�����L�����:����7�����#�

���������� ��7��� ��������������&� ������/#����� ����

��������������&� ��� ������������ ��������� ��������� B� 4���

)��������8<:�QR8/.�

E������������3&�����7�3=&�>���������"&�4���� ���J3�(0..@1�

3���&����%���������������#���������� ��������#��������

��� �������7� ������������� �� ��� �������7� �������� )���

)������� ,R:�0008_00,<�

E������������ 3&� >����� J&� =����� "E&� 4���� ��� J3� (0...1�

5����#�������#�������������#���������������������#����/

������ ������� �#���������� �� �� �������� 5#��� 5����?@:�

0?Q8/0?Q@�

E�����`"&�!���������B�&�E����33&�"�����35&�3��%�����*&�

L������ L&� E������� A�&� !������ 4� (,-0-1� *%����� �����

��������������7������������� ��)������������ #���� ���

�I������%����������� ����������*��������,:�Q-/<�

E����� �� ��� >����� ))� (0.?@1� �� ��������� ����������

�����,:�,?<�

,-R�

Page 251: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

E������##� `"&� !����� �=&� L������ L"� (,--R1� *��������������

��##�������������������������7����������5#�������R:�

Q8_.8�

E������&�E��������E&�!����7�>&�E������B�&�3��##���`&�4�����

�3&� B����� �&� ������� �&� >����� >&� �7#����� =&� =������� �&�

!����7� ))&� `����7� 4J� (,--@1� 5����� �#� ���������

�������� ���� ��� �/��������� �I������ %���� ("4A@1�

�����7���� �� ���� $����� 3������ ������ ���� ���� �#� ����������

"4A@�%������&�0..Q/,--<��B�5#�������0.?:�08<?/R<�

E��"�&�4����33&����5&�����N��(,-001�3����7�������������������

�����������������#��%���%��Streptococcus�pneumoniae���#�������

�#���� ���������� �#� @/%����� ��������� �I������ %���&�

E���L��&�0..R/,--.��A����,.:�8,@-/R�

E����������� 3L&� >����� =&� >������ �*� (,---1� ��%�����7� �#� "���:�

������ ����� ��� �%����� #��� ����� ����������� ��

Streptococcus�pneumoniae��5#���5����?Q:�RQQ./R.--�

E������ L&� `������� E&� 3������ =&� ����� G&� G��������� 3�&�

`������� L&� H����� L&� G�������� �� (,--,1� E���� ����� �#�

����������� �#� �������/�������� Streptococcus pneumoniae�

��� ���������������������B�4���)��������<-:�<8R@/<8R.�

E������ B&� ������ `*� B�&� ������ B&� >�������� �4&� >������� 3&�

��E�##� >3&� *������ 3�&� !����� �&� !�� �B&� !������ `&� J������� 4&�

J�������=&�J�����B3&�L��I��E&�L��#���=&�������=*&���>����B&�

���� �G&� ��#�� ���� *B&� ��� B&� )���������� "&� )����� 3)&�

)E��7� )&� )�������� L&� )��7� 4`&� G���� �5&� G������ !E&�

HlJ����)&�"���7�=>&�=��������J�&�=���7�"&�3��")&�`������

,-?�

Page 252: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

)*&� N��� N&� N���/>������� )&� K���� J&� K���� 4�&� >����� =E&�

B������� 3=&� =������ "=� B�&� 3������� "�&� J����� B5� (,--01�

J������#��������������Streptococcus�pneumoniae�������=?��B�

>��������0Q8:�R@-./R@0@�

5������!&�H������)=&�"�����J�(,--,1��������%�������������������7�

���7������� ����� ���4� �#� Streptococcus pneumoniae�� Gene�

,Q<:�?8/@0�

5��7����%�� �G&� !������%�� �A&� )������%�� )A&� 3�%��%�� �&�

!������%��H&�5����*G&�����%���7��A�&�3��������3A&�J�%����

A)� (,-0,1� ������������ ��� ��� Streptococcus pneumoniae�

��� Streptococcus mitis� ������ �� ������� �#� ������ )���5������

��������4���)��������5#���,@����:�0-�0000;0<?./-?.0�0,008�

B����� )=&� L�����#� EB&� =����/>�� �� =)&� 3��%���� 4)&�

A������� K�&� !������ 5&� )������ J>&� `������ )�&� 5������ )&�

`���� B5&� �������� =� (0.@Q1� *������� �#� �������7� ���������

���������G�*���B�)���,..:�@8R/@<-�

B�����)=&�>�I���������3&�>�����=�&�J����4*&�`������=&�

E�I����)&�)�������4&�)�����=&�>�7��>&�*�����B&�3�������=�

(,--.1� H�����&� �����������&� ��� ������� �#� Streptococcus

pneumoniae������7���?4&��������7� ��������������7����B�4���

)��������<@:�?</@,�

B����5&�!������&�4�����B&�"�������(,--01�5����#�������#�����psaA�

���&� ����� #��� ��������� ���#��� ������� �&� �� %�������

������ ���������� ������ ���� Streptococcus� pneumoniae�� 4���

���������5������Q:�Q.R/Q.Q�

,-@�

Page 253: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

B�����I���)B�(,--01�"��������%�������#�����:�������������

#������)��������)���>����=�%�?R:�0Q@_,-@�

B����� 3J&� >�� � 3�&� !������� �B� (,--Q1� ������ �� ������������

��������� ����� Streptococcus� pneumoniae� ��������� �� ����

$3�:�������� #����"=H�*L��$3�N�����0/<����4���)��������

���������@:0�

B����"`�(,--.1�E����������������������������#��������4H"��?:�

R./?8�

B������ 4&� E���� B&� 3����� �&� %�� ���� ����� )&� A�� *������ B&�

)��������B� (,-0-1����������#� ��������������#����������

%�������������������������#�����mitis �������B�4���)��������

<Q:�,@?,_,@?.�

B�%���&�)��������B&�`�����)&�������)&�)������H&�=��%����

)&� *������ B&� 3������ "&� =������� H� (,---1� *������7� �#�

������7/�������� �������� �� ,R<� ������������� ��������

"�������5#�������B�0.:�,.8/,.Q�

L�������� �&� 4� ���� `&� 4������ )&� E� ���� 4&� ���� � "� (,--<1�

4�</�� �7����7��� ���������� ���� ������7��� ���

�������� �������� �� ������ �������%�� ����� �� ���� �����

�������� ��� ��������� �#������ 5#��� 5���� @,:� ,?Q._

,?.@�

L���������&�`������BG&�"����B4&����� �"`�(,--Q1�����������#�

Streptococcus� pneumoniae� %������� #������ �� ����� ����������7�

����������������������G���=�%�)��������?:�,QQ/8-0�

,-Q�

Page 254: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

L���� )&� �������� ��� (0.Q81� ��������� �#� ���������

�������:� �� ��������� ��� ��� ��������� �D�������� �#�

�D��������&�������������������������������������3���B�

5#�������0R:�,<@/,RR�

L� ������ N&� E��� PJ&� 3������ !&� )����� E&� *����� �� (0..R1�

������������ �#� 0?3� �=G�� �������� �#� Streptococcus mitis�

��� Streptococcus gordonii� ��� ��7�������� �������������

��������������#����������Streptococcus��5��B�37���>��������

<R:�<-?/<-Q�

L����� *=&� "������� =J&� ������� �"&� )������ �=� (,--?1�

4������������� �#� Streptococcus pseudopneumoniae ���������

#����������������������������B�4���)��������<<:�.,8/.,@�

L����� �&� E��%�� *&� L��I������ �&� 37�I��� =&� ������� �L� (,--01�

>���������7��#������������������� �����������#�!������������

#���� ���#�������#������ ��7������#���#���"�������5#�������B�,-:�?R</

??,�

L��� BH&� =�����/3������ 3&� 3|����� $>&� >���� B&� 4��%����� )&�

>������3&�4������J&�`������ BG� (0...1�=����������� ��� ���

���� ���#��� �����7������� ��� ���������� %�������� ��

����������7�������#�Streptococcus pneumoniae��5#���5����

?@:�,8,@/88�

L���� *� (0QQ<1� )������������ ��� ��������� "���������� PPP55:�

8,0/8R,�

L������ L"� (0..-1� "�������� ��������� ��� ����������� 4���

)��������=�%�8:�0@0/0.?�

,-.�

Page 255: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

L��!`&�5��)&�4���"L&�!���B"&�4���)4&�G����B4&�4����"&�E���

�3�(,--@1���0/7������������%������7��#������#��������������7���

�������� ������������� ���� ����� �D���������� �#� 4H"��� 4�����

080:�<</R,�

L���5J&�3�����&�N����N&�G�����&�����������E&�3� ����3&�)�I����

)&�L����� ��3&�H�����L&�3����3&�>�������*&�L���� ��B&�5����

N&� N�������� )&� ���7����� L&� L�7��� E�� (,-081� G�����/>�����

"���� 5�������� A���� "��%���� 5%���%�� �������� ��� G�����

4���������� �7� Streptococcus pneumoniae�� 5#��� 5���� Q0:�

0?,R/8<�

L�������7���>&�JO����J&�)��������5&�J�����B4&�E������������3&�

E������ �&� "���������� �� (,-001� J����� ����������&� ��������&�

���������� ��� ��������� ����� �#� ������ ���������� �� ��I���

��������� Streptococci� ��� Enterococci�� 5�� B� )��� )��������

8-0:�,<-/R0�

L��������� LJ� (0..R1� *����������7� �#� �������� ���������

����������5������)����������=������0:�0,0/R�

L7� �)E&��7#�����=&�3��##���`&�4������3&�E������B&�=�������

�&���������=&�E��������E&�>�����G)&�!����7�))&�!������

==&�B�������BE&�>������B&�K����*=&�3�������&�`����7�4J+�

���%�� >�������� 4���� 3��%������� �#� ���� *������� 5#������

"������� G�� ���� (,--?1� *##��� �#� ���������� �#� ����

��������� �I������ %���� �� ����/���������

3��������������������G�*���B�)���8R<:�0<RR/?8�

���#����� =4� (0.881� �� ����������� ��##���������� �#� ����� ���

��������������#�������7���3����������B�*D��)���R@:�R@0/R.R�

,0-�

Page 256: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

����� �&� A������� GB&� ������� B�&� ��� A����� 4"&� E���I����� E&�

A��������E�&�%��`�����`B&�B������A`&�E�#����&�E������

"`&� )�� B&� )������� �B&� )���� E�&� %�� >������ �� (,-001� G�������

���������� ������� ��%����� ��������� %������� �������� ��

������� ������ ���� ���/��������/%���� ���:� ����

���������=�����7��5#���5����@.:�0?Q-/0?Q@�

������� =&� 4���%���� "� (,--,1� =�������� ��� ���������� ���

�������� ���������� �� Streptococcus� pneumoniae�� ���������

������4���������<?:�,@,@/,@8<�

��#C%���B4&�>�������)�&�!����J�(0..R1�)�����������7�����7�

������/#����� ���� ��������������� �#� �������/���������

Streptococcus� pneumoniae� #���� ��������&� !����� *��� B� 4���

)��������5#�������0<:��<.0/@�

������&�������L&� B����� B&� ������)&����%���"&��������

�L�(,--01�"�������������������������������������#������ ��

7����:� ���������������#�#����7��D��������"������� 5#�������B�,-:�

0-,,/0-,@�

����������&�����������&�>�/N����%�)&�3������%�H&�J��#���N&�

A�����%��7� =&� H���� >&� ������%��� K&� >������ 5� (,--,1�

3���������� �%����� �#� Mycoplasma� pneumoniae� �#����� ��

������D����������#�4H"��������)��������5#�������<<:�0/?�

������������3&�4��������*&�4�����������&�J�������J&�E�������

�&�B�����)�&�B�##��)�&�)��������&�=���#����=)&�3�%�����P�&�

3� �����=E&��������"�&��������*�(,-081�����������������

����������#��������������������"���������080:��.?</..�

,00�

Page 257: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

��6����� B&� "�������� =&� ������ �&� "����� B�&� �7���� B&� J������ !&�

A��������"!&�)�����=� (0..,1������� �������������� ���������

�#� ������ ��������� �#� Streptococcus� pneumoniae� �� >���%�����

E�������&� >������&� 3���� (0.@./0..-1�� 4��� 5#��� ���� 0R:� ../

0-R�

��6����� B&� ��� ��� 4����� �J&� "�������� =� (0...1� !�������������

��������� �� Streptococcus� pneumoniae�� G� *��� B� )��� 8<0:�

0R<?/@�

��6����� B&� �����7� 4&� "�������� =&� !����� �� (,-0-1� 4������ ��

������������ ��������&� �����7���� ��� ����7���� ��

Streptococcus�pneumoniae��%�����8-/7������������4���)��������

5#���0?:�<-,/<0-�

���7�/*%���G&�Hl������7��B&�>������5&�3����H&�������*&������

B*&� )������ �!&� >�7�� `3&� J��� ���� >)� (0..?1�

G�������7����� �������� �#� �������� �� J������ �������

�����������#���������"�������5#�������B�0R:�Q??/Q@0�

������ �&� ������ =&� J����� *� (,--01� J����� ������ ��� �������

����%����#������������7�������������7������� �����������

�����������4����)���)���0:�<@R/<.0�

�������&�������=&�J��2��*� (,--?1�4�����������������������#� ����

�7��� ���� ���%���� �� ������ #��� ������ ��� ��������� ��������� �#�

Streptococcus pneumoniae��#�������B�4���)��������<<:�0,R-/?�

����=�&�E�������k�"����B4�(0..,1�4��������%���##��7��#�

�����7��� ��� ������7��� ��� ��������� ��������� ����

������� �#����� �7� Streptococcus pneumoniae�� )�����

"�����������0,:�08@_0<8�

,0,�

Page 258: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

�h#���� B&� A������� A&� >������ "&� E�������/G������� >� (,-001�

4�������������������7��"D�J/������������������������

��������������������������������4����)��������08:�0Q?/0.@�

������=&�J��2��*�(,--<1�=�������������������������������7�

�#� ��������� �������&� �7��� ��7���&� ��� ��������������

!*)3�)��������=�%�,Q:�RR8/Q-�

�� � �*� (,--R1� 4������ ������ �� �����������/���������

�������:� ����� ��� ���� ����� ���4��� 5#�������<0� (������ <1:�

3,,Q_3,88�

����*� (0.@-1��7���� �#� �������� #���� �������&� ������ #�����

��� �������� �D������ ������ �� ������� �#� 0R� 7����� (0.R</0.?.1��

����"������)��������3���>�)��������5������@Q:�888/88?�

)��I���/)������!&������4&�L����B�&�>��������&�*%�����>&�>�����"&�

E����� 4&� =�7���� B&� ��%7� 4&� 4���� =&� >���� *� (,--.1�

"������������������#�Streptococcus�pneumoniae������7���0.��

��������� ��#���� ��� �#���� ���� ���������� �#� @/%�����

���������%���������!������������B�4���)��������<@:�

Q8@_<-�

)���3&�E����!&�N������7��E&�"����B4&����� �"`&�L��������

�� (,--?1� "�������� ������������� �� ��� >� ����� ��%��

����������������������#������#���������������7�����������������

5#���5����@<:�<-0</<-,-�

)��������&�=�������)&�3�����J4&���������� (0..Q1�)��������

�����������7� �#� �������/��������� Streptococcus� pneumoniae�

������������%�������5���7�#����0..8����0..?��B�4���)��������8?:�

,.<</.�

,08�

Page 259: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

)���2��/J��2�� )�&� ��� ��� =���� 4�������� �&� 3����/4�����6�� BB&�

����/3��� N&� 3����� "4&� ������ )�&� >������2� B&� 3O���� 5A&�

3����� !������ )B&� ���#�� �=&� A���������� )>� (,-081� "��������

%����� �#� ������������ �� �������� ���� ��������/��/��%����

����� ��������%�� �������7� ��������� ��� B� =������ 4���� 4����

)����0Q@:�Q,8/80�

)4������� B�&� ������� *5� (,--01� )�������� ������������ �#�

������������������!����>�����?:��Q@@/�QQ.�

)������ �3&� N������ B&� A�I�7������� )&� )J���7� �&� J����� `=&�

>������ �*� (0.Q@1� $��� �#� ���������� ����%����� ��� #���������

���������#�����������������������#�������������#����������

��("���1��B�*D��)���0?R:�8Q0/8.<�

)*��������� )4&� ������ B)&� 3����� L&� 3���� ��&� !������ ==&�

`����7� 4J&� B������� BE&� E������� �� (,--R1�� *�7�����7�/

������������ Streptococcus� pneumoniae� �� ������&� 0..._

,--0��*�����5#�������00:�.?._.@,�

)J����&�)��������&�K����B&�3������>J&����%���!4&�J������=&�

E������� =&� E�7�� ��� `&� ��#F%��� B4&� ������� �&� L������

L"� (,--01� G���������� �#� ��I��� �����������/��������� �����

�#� Streptococcus� pneumoniae� ��#���� �7� ���� ���������

��������������������7��� �����B�4���)��������8.:�,R?R/@0�

)����� B&��������&�J��������K&�>�����/=���� ����3� (0.Q81�

3����7����������������#��������/��������������������������

���������������� ��� ��%�� ������������ ����������������������

4���������,8:�8.@_<-0�

,0<�

Page 260: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

)���%�������)&�3������B>&�J����/=���!&�)�����&�����/���������

*&� 3����� J&� 3���������� A&� ������ B� (,--.1� "��%����� �#�

4H"�� ��3���:� �������#�����������4H"����������7��#� ��#��

�������7���#�����%������������D�?<:�Q?8/Q?Q�

)���� )&� 4������� =&� ����������� !&� ���� J������ )&� "������� ��

(,--R1� *%������� �#� ��7�����7�� ��������� �� Streptococcus

pneumoniae���5���7��B����������4���������RR:�,R?_,R.�

)����*&�=����B&�=�������&�)��������B&�!���B&�)������B&�������A�

(0..R1� >�������� �#����� �� ����� ��������%�� �������7�

���������������7��#������������D�����������������������������

��������������������������B�=������4����4����)���0R,:�080?/

08,-�

)����� )=&� J����� =*� B�&� `������7� =�&� >����7/J��������� J�&�

3��##��� `&� ��D��� 4&� J������� L&� =������� �&� !����7� )&�

E������� �E&� E������ B�&� >����� G)&� ������� �=&� )J��� �&�

"�����%�����&�>����������>&�`����7�4J&�B�������BE&�>�����

>� (,--Q1� "��������� �������� �#� �������� Streptococcus�

pneumoniae������7���0.��������$�����3�����&�,--R��B�5#�������

0.@:�0-0?/,@�

)������� )&� J��2�� "&� ��� ��� 4����� �J&� ��6����� B&� �����7� 4&�

J��2�� *� (,-0-1� *%����� �#� ��������� ��������/�����

����������� �� ���� �7��� ���&� ������ ���� ��I���

��������������7����B�>��������0.,:�,?,</8,�

)�������7� >)� (,--@1� "����������� �#� ������������� 4��� 4�����

)���,Q:�,Q./,.?�

,0R�

Page 261: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

)�6��/��������4&�3��%���&�3�����4B&�*���%��4&����3�%�����)!&�

"��������=&�H��������4B�(,-0-1�"��"&����������%�����������

�����&� ��� �����7� ���%����� �� ������� ���� �������� ��� ���

������7� ���������� ���� ����� �7���� 4��� A���� 5������ 0@:�

0?@,/Q�

)�6���=&�4�##�7��B&��������)&��� ���4J&� �������J&�4����� B&�

E������� =&� B����� )&� )������ B)&� 3������ >J� (0..01�

5����������� ��������#� ���������������� �����#� �����7���,8!�

Streptococcus�pneumoniae��B�5#�������0?<:�8-,/?�

)����7� �!� (,--?1� ���� ����� �#� �������� �� ��� �7� �#��������� ��

�D���������� �#� ����� ��������%�� �������7� ��������� 4����

H���5#�������0.:�,,R/,8-�

G�������&�=���� B&�>������ !&����������3&� !p�����3&�=����I��3&�

���h��B&�)��#�����*&�!�������� 5&�E����������)&�E������`&�

=�������� =&� G������� 3&� >������ )�&� E�������/G������� >�

(,--@1� =���� ��� �� �����/���������� ������� �� Streptococcus�

pneumoniae��)���)��������??:�8,./<-�

G����3&�A������4&�3O/��^��=&������������E�(,--.1����������

�����������������������������7��#������7���������������7���

?4��#�Streptococcus�pneumoniae��B�4���)��������<@:�<@,/<�

Hl>����L�&�)������*A&�K����*=&�>������)&�`������������=&�=����

=&� >����� B&� L%����� 3&� `����7� 4J&� 3�������� )� (,--@1�

*##��� �#� ��������� �I������ %���� �� �������7�����

���������� ����� ��������� ��� ���������� ������� �� ��

������7/�����������������B�5#�������0.?:�0,00/0,,-�

,0?�

Page 262: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

H������� 3&� =����I�� 3&� 3����#��� �&� J�������� )&� G����� )&�

E������ L&� !p����� 3&� N�����/*������� 3&� E�������� )&�

B�������>&�$�������)&�J��������4J&�>������)&�J�����)&�

G������� 3&� E�������/G������� >� (,-0,1� "����� ������� =����

�������� ���� ��������� �������� 8&� ������7� �##�����

����������#���������7������������������������)>���

<:��--R8R/0,�

"��������=&���6�����B&�A�������)&�4��������4&�)������!&�A��������

"!&� )����� =&� J������ !� (0..R1� =�������� ��� �������� ���

������������ ��� ��������7� #���� ��%���� ���������

����������>������&�3�����G�*���B�)���888:�<@</<Q-�

"��������=&�J������!&���6�����B&�������B&�=�#��J&�)�������&������B&�

A�������� "!� (0..@1� =���� #������ ��� �������� ��� ���������

������7���������� ����������������������������7��������/

������������������G�*���B�)���80@:�0Q/,,�

"���� LE&� ������ ``� (,--81� ����� �D���������� �#� �����

��������%�� �������7� ��������� *����� )��� 4��� G����� ��� ,0:�

880/R,�

"��������J3&������������*&�H�����������(,--.1�Chlamydophila�

pneumoniae� �#����� ��� 4H"�:� ����� �%����� #��� ���� �#�

�%����{��*���B�5����)���,-:�R@./RQR�

"���� �&� >���������� 4)&� >������ !&� =�������� )&� 4�������� "&�

4�������� J&� !������ �)&� B������ 3�� (,--?1� 5#������ ���

��� �7� �#��������� �� ����� ��������%�� �������7� ��������

��%���� �D����������� ��� B� =������ 4���� 4���� )��� 0@8:� 000</

00,0�

,0@�

Page 263: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

"������ EL&� �������� �E� (,--,1� ���� ������ �#� �%���%��

��������� �������� ��� ���� ��������� #��� �������� �7�

������������5��B����������������0.:�QR/.8�

"������� �� (0QQ01� G���� ���� ��� �������� ��%����� ���%���F�� ���� ���

����%���l���#��������������������>��������)���("����1�0-:�.</

0-8�

"�����53&�3����������&�`�����)&����7�/H ��3B&���������J4&�

`�������B��(,--,1�=�������������� ����������������������

��� ���� #�����7&� �������&� ��� ��%����7� �#� 4H"��

�D����������������D�R@:�@R./@?<�

"����� 53&�A������ 5&�`��������)&����7�/H ��3B&���������J4&�

`����� )&� =����� =E&� `������� B�� (,--<1� >����������&�

�D��������� �����&� ��� �#��������� �� ����� ��������%��

�������7�������������B�=������4����4����)���0@-:�<--/<-@�

"����B4&����� �"`&�>�������JB&�)��������B�(0..81�)��������

���7���� �#� ���� ����������7� �#�Streptococcus pneumoniae:� ����

������#����������������������=�%�)��������<@:�Q./00R�

"�� ����=�&�>������3&�4��%����7�")&�B�����4=&�E����33�(,--01�

J�������������7�#���������������&���������&�������%������#�

����� ��������%�� �������7� ��������� GE�>5;`EH� J������

5������%�� #��� 4����� H�������%�� ���� �������� (JH��1�

`��������������7�����B�=������4����4����)���0?8:�0,R?/0,@?�

"������� �))&� !���� L"&� N����)"&�������� B&�J��##��� !� (,--?1�

A�������� �� ���� ������� �#� ������������ ����� �����

Streptococcus pneumoniae� ��������� ���� �������� �������

�7�����5#���5����@<:�88?-/88?R�

,0Q�

Page 264: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

"��������)*�(,-081�H�������������"�������4���G��������?-:�8.0/

<-@�

"�����%���� �&� ��D��� 4&� !����7� ))&� E������ B&� E������� �E&� >�����

G)&�=��������&� ��������&�3��##���`&�4������3&�3�����"B&�

>����� >`&� `����7� 4J&� )����� )=+� ���%�� >�������� 4����

3��%������;*������� 5#������ "������� G�� ���� (,-0-1�

3�������� ��������� �� �%���%�� ��������� �������� �� ����

�����#��I������%�����B�5#�������,-0:�8,/<0�

=����L!&�E����3&���������&�>�����"B&�>�����3�&�4��%����7�"&�

!������N&�B�����4&�=��������/=�����=&�%��`����4&�K��������

B+�J������ 5������%�� #���4�����H�������%�������������� (,--@1�

J�������������7�#���������������&���������&�������%������#�

����� ��������%�� �������7� �������:� JH��� �D����%��

������7�����B�=������4����4����)���0@?:�R8,/RR�

=������EL&������L&�)�������)&�`�� ������4*&�L��������(,-001�

N���/�/��%�� � ,-0-:� ������&� 4H"�&� 7���� #�������� ��� ��� �7�

������7��=���������7�0?:�R<-/RR,�

=������ "&� G��� )&� ��������� �&� >�Y���� =&� E����� >&�

)������"&�=������)&�L������3&�=�������=&�E�������=�(,-001�

J����� �#� Streptococcus oralis ������ $�R�� B� >�������� 0.8:�

,QQQ/.�

=���� �)� (0.Q?1� ���� ��������7� �#� ��������%�� ��� �#��������7�

��� �7�����������*���B�=����������3�����0<@:,?/8@�

=������==&�=����������&�%�����������)&�4���)N&���/��������&�

3������!B�(,--R1�)�������������������7��#���������/���������

,0.�

Page 265: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

Streptococcus� pneumoniae� ��������� �� *������� B� 4��� )��������

<8:�0,.</8--�

=������ 3&� >������ 3*&� E������ L"&� =������ 33&� J����/��/

������B&�!�����)&�J������E&������JA�(,--@1�������������

���� �� *������ ��� ������������ ��������� �� 3����������

����������*���B�4���)��������5#�������,?:�<QR_<.-�

=������ B>&� 3������� =� (0.Q81� "����� #��� �� ����� (,8�

%����1�������������������%�����`�������������#�����

��� � ���%��������� �� ���� ����������� �#� ���� ��������� ���

������7��#����7�����������>����*���"�7����������=������0.:�,0R/

,,?�

=��������� !&� G���� 3&� 3O/��^�� =&� J�9��%��� J&� ������ �&� ���

��������E� (,--.1�Streptococcus pneumoniae� �������7�����

�������� �� ������� �������� ��7/���� ������ �� ���� ������

�������#�"�������&������������#�@/%���������������I������

%�����)����������=������0R:�,?./,@@�

=��������� !&� !������ �&� 4�������� !&� 3������� "&� J�9��%��� J&�

B��O�����&�!����(,-0,1�"��������%�������������������

���������������������������7������"���������#����?�7������#�

���������I������%����������������� �#���������������������

%���������7������������� ������������� ������ ����%�����7��

A����8-:�8.R0/?�

=�����&������7�4&�!��������&�)���2�=&���6�����B�(,--.1���%�����7�

�#� ��������� ���#��� ������� �� ("���1� ����� ���%�����

�������3�����>)4�)��������.:�Q-�

,,-�

Page 266: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

=�����&�!������&������7�4&�4�����7����&�4������)&�������4�����

�J&� ��6����� B� (,-001� ������ �#� �%���%�� �����7��� ?4�

����������3���:����������#���� ���������B����������

4���������??:�0@0,/Q�

=���� �&� 3��%������� "&� E��I���� *&� =��������� �&� 3����� 4B&�

H�������� 4B� (,--Q1� ���������� ������� "��"&� �� �%���

Streptococcus�pneumoniae�������&������������������������

�����������������������������B�5#�������0.Q:�8@R_8Q8�

=���� �4&�=7��"&�`������BG&�B�����3&�!����"&�H���%�����&�

)������E=�(0..@1�4�����������#��%��������/��������������

����������&������������������������7��#�Streptococcus

pneumoniae��)���)��������,R:�Q0./Q,.�

3��������&��������J3&���7��J&�`����&�����=&�B�������!&�)��

BE&� ���D����� �4&� �� � �*&� "������ �=� (,-001� `����/������

��������#�Streptococcus pseudopneumoniae ��������53@<.8��B��

>��������0.8:�?0-,/?0-8�

3��������&��������43&��������J3&���7��J&�`����&�B�������

!>&� )�� BE&� -���D����� �4&� �� � �*&� "������ �=� (,-081�

4��������%�� J����� ���7���� �#� Streptococcus

pseudopneumoniae� "��%���� 5������ ���� A������� ���

4������������7������"��3�H��Q:��?R?@-�

3O/��^�� =&� "���� !&� ������� 3&� G���� 3&� 4����9�� B�&� !���^�� G&�

J�9��%��/3�����G&�)���/4�������B&������������E&�=�������)�

(,-001����7�����#� �%���%������#���������������7�������

����������������"����������#���� ���������������#��I������

,,0�

Page 267: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

%����� ��%����� ������������� ����%���� �#� ����� �D��������

��������������7����B�4���)��������<.:�08?./@R�

3��7������&�3���������G>&�3��%����)&�����N�(0..R1�4�I�����%��

���������:� �� ������� ��� ��%����� ���� �#� ���������� ����

����#������������)��������=�%�R.:�R@./R.-�

3�����4B&�3��%�������"&�3����L&��������������3&�3������")&�

3����&� E������ "`)&� H�������� 4B� (,-0-1� ���� "��������

3����/=���=������"������5����5���/3������>���������������

����� "�������� >�������� ����������� 5� A�%�� ��� �� >��#������

"��3�"������?:��0--0-<<�

3������ BJ&� G���� )E&� ����#����� )�� (,--Q1� "��������

%������� #��� �������� ���� 4H"�:� ������ ������� ��� #������

����������4�����088:�@?@/@@<�

3������ �&� =������ L&� `����� B�&� E������� �E&� !����7� )&�

=���������&���#�� �����&�"������>��(0..@1�>�����������������

������$�����3��������0..R�����%��3��%�������������G�*���B�

)���88@:�.@-/.@?�

3���p�p�E&�3������)&�3����E&�=�������)4&�E��%���"�(0..Q1���

�%��� ��7�����7�� ��������� ����7����� ���� (����=1� ��

Streptococcus pyogenes�����������������4���������<,:�,R@/

,?,�

3����� 3&� *%��� G&� J���� >B&� )����7� �!� (,--,1� G� � ������� �#�

�������� ��� �D���������� �#� ����� ��������%�� �������7�

���������G�*���B�)���8<@:�<?R/<@0�

,,,�

Page 268: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

3����� 3&� )����7� �!� (,--Q1� 5#����� �� ���� ������������ ���

�������#��������������%���������7����������G�*���B�)���

8R.:�,8RR/,8?R�

3������� *�&� >���� ��&� �������� =&� 3�������� �&� "������� A&�

)���������&�������=L&�4������B��(0..01������������%���##��7�

�#� ���7%����� ��������� ���7��������� %����� G� *��� B�

)���8,R:�0<R8/0<?-�

3������B)�(0.8@1����������������>��������=�%�0:�8/.@�

3��%������� "&� 3����� 4&� =���� �!&� H�������� 4B� (,--.1� ����

Streptococcus�pneumoniae��������"��"���������L������0-���

����������)���)��������@8:�??8/@.�

3��]����3&�"��������&�G����3&�>����/�%}��&������������E&�3O/

��^�� =� (,-001� 4����� �%������� ������� ��� �������� �#�

��������� ����������������������������"������� �� ����

"4A@�������"���������B�4���)��������<.:�,Q0-/@�

3������A>�&�3�����"E�&�)J� ��A�(0.Q-1������%����������#�

���������������5��B�37���>��������8-:�,,R/<,-�

3�������`J&�`����� JE&�`����� EB� (0.8Q1� �� 3���7� �#� �� �7��� 5�

"�������� *������� ��� ���� 3����� E�������� ��� `�������&�

)��������B�"�����E������G������E������,Q:�,.8/8-,�

3������)&�L������L"�(0..Q1��������������">"�0����������/#���

����/��%��� �������� ��������� �� Streptococcus� pneumoniae��

���������������4���������<,:�08,./0888�

3�����4>&�J�����4�&�L����=*&�=����������(0.Q-1�����������

�#� %����� ��� Mycoplasma� pneumoniae� �#������ ���� �����

,,8�

Page 269: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

����������7� ������� ���������� �����������������%���������7�

�������������=�%�=����������0,0:�,,R/,8,�

3�����5&������=&�J�%�/��%��G&�"�����G&�=����3&�����������&�

"������� )&� "����� G&� J�������� �&� �����%���� *� (,-001�

�����������&� �7����� ��� ��������� ��������� �������� �#�

Streptococcus pneumoniae������7����������������������������

�������������������5����������������0-�7���/���������#��������

���������� �#� ���� @/%����� ��������� �I������ %�����

A����?:�<,-,/.�

3���BE&�B���35&�L��L3&�L���GN&�3��B3&�4����EE&�L��EL&�H��

`3&�3���BN&�"���L=&�����GN&�N���N&����W&�4������������&�

4����4E&���������)L&�"������B&�N�����&�L�����������J&�B�����

!&� L����������� �&� "���������� G&� A�� "E&� 4������ 4&� 3�� �&�

G��L&�3�������(,--<1�E�������%������#����������������������

����� ������ Streptococcus pneumoniae� ��������� �� ����� (��

�G3H="�����71�����������������4���������<Q:�,0-0/,0-@�

3������ $>&� E������� B&� 4��� E4&� 3��� 34� (0..-1� 4�%�����

������� ��� ��� ���� �������� ���7��������� ��� ���� ���� ����

���������7�� �#� Streptococcus pneumoniae� ��%������ �7�

���������������������)�����"������Q:�8,R/88<�

3������� )B&� `����� 3�&� >����� B�&� 5������ )B&� 5������� L�&�

J 7�)G&�)�������&�"�������B�&�)��������&�>�� �B=&������/

)����� E� (,--R1� )�������� �%������� ��������%��� ��

��������#�� �������� �G�� ����#��� �#� �������������� ��� �7�����

���� �� Streptococcus pneumoniae&� ���� ����������� #���

#������������� ��������� ��%�������� ��� �������� ���������

������4���������<.:�<80R/<8,?�

,,<�

Page 270: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

3���������&�A��������B&� �������L� (,-001�)����D/��������� ������

���������� ��������/����� �#� #������ ����� ����������7� #��� ����

�����#������ �#� �������� ��� 7������ �� �� ������ ��������������

���������7:�����%�� ������4���>����??:�,?@/,@8�

3������� �=&� !������� =�&� =���� B�&� )J���7� �B&� ������� ")&�

L������ L"&� "����� 35&� J������� L*&� `������� )4� (,-0,1�

)������� ���� ������ �#� ���� 08/%����� ��������� �I������

%���� �����7��� ���/��� �������� ����� $����� 3������ ������

������>)4�5#�������0,:�0@R�

3 �����)G�(,--<1�>����������������:���%�� ��#����������.-�7������

G�*���B�)���8R0:�0Q,?/0Q,Q�

3 ������*&�4�������!=&�E�����34&�`�����``&�`����B)�(,--,1�

4�����������#�4�����/>�����"�����������������#��������������

�#� Streptococcus pneumoniae. 5#����� ��� 5�����7� @-:� <0,/

<0R�

���������&����������&�J��2��=&�J������)B&�J������BB&�!�������

(,-001�*%������� �#� ����� ��� ������������7� ���#����� �#� �����7���

0.�� Streptococcus pneumoniae� ����� �%���%�� ��������� #����

������� �� 3���&� 0..-� ��� ,--Q�� ��������� ������ 4���������

RR:�,,.@/8-,��

�������`&�L����BH&�=�����>�(0.Q.1�*����������7��#��������������

����������#�������%��7������#���#���������������������>����:���

��������%�&�����������7��B�5#�������0?-:�Q8/.<�

��������E&�G�����L*&�"������5�&�*����B�&�=������&�"�������3&�

E����������B&���>�7�=�&�E�#���E&�������=B&��������3&�J ��

)&�L����7�B!&�G�����`4&�"�������B�&�$��7�����&�`�����H&�

,,R�

Page 271: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

3��������3�&��� ���)=&�=������&�E����������*&�L������E&�`��#�

�)&� $�������� �=&� E���� 4�&� )������ ��&� !�����7��� �A&�

��������3&���������&�E���7�*L&�E���� 5*&���#����>B&�N���!&�

3�����EH&�A�����B4&���������7�>�&�)���������&�E�����������

3L&�!������4)�(,--01�4����������������������#���%�������

���������#�Streptococcus�pneumoniae��3����,.8:�<.Q/R-?�

��������=4&�!�����)�(0.8@1�4����������#�����#������������

������������������������5����)���R.:�?-,/?0.�

�����7�3&�H���%��*&�J�������=&����� �"&�3������E�(,--R1�3���������

������ �#� ����� #���������7� ���� ��������� ��D�� ������7����4����

0,0:�,<@_,R?�

����%�� �3&� B�##������ B)&� =����7� E&� >����� B&� �#������ J&�

J������ B&� 4��������������� )&� !����� 3G&� 4������ 34� (,-001�

������� �����7��� �%������ �#� � � ��������� �I������

%�����������������������������#�Streptococcus�pneumoniae���

7������������A����,.:�<<--_<�

���������� 4&� L�������� �&� 4������ )&� E�7��� B&� 5������ !&� "����� J&�

���� �"`&�H������)=�(,--.1�3��������:������%�������������

#���������������#����#�������&����������&�����%������#�

����������B�5#�������0..:�0<.@/0R-R�

��� �&� !������� =&� )4���7� )&� >������ �&� 3������ �� (0...1�

"�������� ���#��� ������� �� �������� ��������� ���%�����

�7�Streptococcus�pneumoniae��5#���5����?@:�<@,-_<@,<�

�������*&�����E&�E��������>&�K���H&���������� (0.QR�1�����

������� �#� �������� �#��������� �7� �������� �#� ����

������������� �����B�5#�������0R0:�QR./Q?Q�

,,?�

Page 272: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

�������*&���������&�E��������>&�K���H�(0.QR�1�����������%��

����� �#� ��������� ���� ���� ��� ������� �� ���� ������� �#�

�#��������� ���������������������B� 5#�������0R0:�R8R/

R<-�

%�� ��� >����� )=&� 3��I������ B&� 3 ��� L)&� !��9���� G�&�

"������J&�>��7���&�3��������&� 5I������*"&�>����B"&�%��

���� *����&� A����%��=E&� 3������ *�� (,-081� *##���� �#� ����

0-/%����� ��������� ��7������� Haemophilus� influenzae�

������� �/�I������ %���� �� �������7����� ���������

������������7����������:�����������������������������4���

5#�������R?:��8-/.�

%�� ���� ����� )&� ��/������� �&� E������ 3&� =������ ==� (,--@1�

4����� ������� �#� mef/������%�� ��������/��������� Streptococcus�

pneumoniae� ��������� ������ �%���%�� �������� �� ������� ��

J����7�����������������4���������R0:�0Q8-_0Q8<�

%�� ���� ����� )&� =������ ==&� L��� `A&� 5�h��� )� (,-081�

*����������7� �#� �����7��� 0.�� ��������� #���� �%���%��

��������� �������� �� J����� �������� >)4� 5#��� ���� R:�

08:@-�

A�������"*&�)�������)"&�J��%������*�(,--.1�J�������������

����������� #��� ��7�����7�� ��������� �� �����������

���������������4���������R8:�8<8/8R8�

A������%��B&�L�����A&�)����*H�B�&�3����$&�L�������&��������B=&�

)������B)�(0..81�"������/���������Streptococcus pneumoniae�

������� ���%����� �� E�����:� �����#������ ��� ���������

���������������#����������������B�5#�������0?@:�QR-/?�

,,@�

Page 273: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

A����������!&�E|��7�*�&��������� 53&�4���������(,-0-1� 5�����

�#� �� ��������� �I������ %������� �������� �� ��������

��������������G�� �7��4���A����5������0@:�8,R_8<�

A���/4������� �&� H���/J����� H� (,-0,1� "��������

%�������������������� ���� ����� ����������7� ��������:� ��

�����������%��%�� ��*D������=�%�A�����00:�,,0/8?�

`�������B�&�3�����3&�"�����"&�J������=E&�`���/>�����=�(,-0-1�

5I������� %����� #��� ���%����� ��������� �#����� ��

�������� ���� ����� ��������%�� �������7� ��������� 4������

���������37���=�%�00:4�--08.-�

`�������&�)�������)&� B������B`&�A�����#� B� (0..81�������#�

������7��#���������������������������������:��������7��#�

�����#������%��7��4���5#�������0@:�.08/.,<�

`�D����B&�3��������� B�� (0.Q81�"������/�����������������

���� �������� �#� ����� �#� ����/������ ����������� ��� =�%�

>������R,:�Q,R/Q?.�

`����������� �� (0QQ?1� $����� ���� ����������� ���� ����� ����/�

��������#������Y������)���B�����Q,:�<Q8/RR<�

`�������� >� (0..R1� *�7�����7�� ��������� �7� ���������

����#����������������������4���������8.:�R@@/RQR�

`���� �)&� 4�������� )&� ������� �"&� )������ �=� (,-0,1�

��##���������� �#� Streptococcus pneumoniae� #����

�������������������� �#� ����Streptococcus�mitis� ������

�7������D/��������� ���������������� ��������/������#� #�����������

����������7��B�4���)��������R-:�,Q?8/@�

,,Q�

Page 274: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

`���������)&�*#����������&�"���������"&�>��������L&�`�������J&�

3��������&�J������=&��� ���4J�(,---1�J������������������

��� ��� ������ ��������� �#� Streptococcus pneumoniae&�

Streptococcus oralis&����Streptococcus mitis:����������������#�

~��7����~�������������������������������S. mitis����������

S. pneumoniae� %������� #����/������ ������ 5#��� 5����

?Q:�08@</08Q,�

`�����>�(0.8Q1�����������7��#�����������E��%����$�%�����7�

"�����

`����7�4J&�!����7�))&�E������B&�E��������E&���D���4&�=�������

�&� ��#�� ���� �&� 4������� "=&� 4����� )&� K���� *=&� B������� BE&�

3������ �� (,---1� 5������� ���%����� �#� ���������/���������

Streptococcus� pneumoniae� �� ���� $����� 3������� G� *��� B� )���

8<8:�0.0@/0.,<�

`����7� 4J&� !����7� ))&� E������ B&� E������� �E&� >����� G)&�

�7#����� =&� =������� �&� 4������� "=&� "�����%���� �&� B����� �&�

!������ ==&� B������� BE&� 3������ �� (,--81� ������ ��

�%���%��������������������#���� ���� �����������#�������/

���7����������I������%�����G�*���B�)���8<Q:�0@8@/0@<?�

`������� =B&� E�����`"&� >����� �*&� !���� *B� (,-001� "���������

������7� �#� J���/������%�� ��������:� ����/����� ����� #���

������������ �#� ��������� ���������� !*)3� )�������� =�%� 8R:�

Q@,_.--�

`��������� B�&� ������� �� (0.@Q1� ���%����� �#� ���� ��������%��

������������� �7��7�������������� ���� ������������B�

5������0,-:�0@</0@Q�

,,.�

Page 275: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

`��#��� B3&� E������ �4� (0.Q.1� !������������� ������������

�������4���)��������=�%�,:�8@Q/<,<�

`�����E������H����������(,--R1�J�������������7�#���������������&�

��������&� ��� ���%����� �#� ����� ��������%�� �������7�

���������GE�>5;`EH�`��������=������

`�����E������=�������J��%�:�`�����E������H���������������

����%��������#����$=�:�����:;; � �����;���;����������;��

��� ����v������v���������;�;���5�0&��������

`������ �*&� )����� `"&� 4��������� �&� ������� =`� (0.0<1�

H����%�������������7����� �������������������������

�#�����&� ��� �� ���� �������� ���� ��%�� ���� ����%��� �7� ����

������:��/0-�

`7����L�&������������)&�4�������GB&�)J����&�%��J��������

�&���6�����B&�B�����)=&�L���������LJ&�>�����>`&�L������L"&�

"�������� B&� E�������=&� >����7� 3�&� >����������>� (,-081�

"�������� �������� � �����:� �� ���������� ��������%��� B�

5#�������,-@:�<8./<.�

K����B=&�)����%�L*&������)*&�G���)&�3�������3&�H� ����)&�

������� *� (,---1� ���� ���7����� ������������� ��������

,8-�

`����"4&�����J)&�!���������B�&�"�����35&�E�����`"&���������

)&�3��%�����*&�=�#��/3�����3�&�L������L&������/���))&�

E������� A�&� ������� )&� E���� 33� (,-0,1� "��������

�������� ��� ��������� ��������� �� 7���� ������� ��#���� 08/

%������I������%�����"�������5#�������B�80:�,<./R<�

Page 276: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

=�#������

RE

FER

EN

CE

S

����������� �������� ������ ����� �������7�����

�����������������4����0-,:�Q,@_Q8@�

K���� B&� *������ )4&� 3������ >J� (,---1� 5����#������ �#� ���� ��I���

3������������#��������/�����������������%�������5������

�����������������������7�����B�4���)��������8Q:�.@@_.Q?�

,80�

Page 277: Dynamics of Streptococcus pneumoniae in patients with Chronic

RE

FER

EN

CE

S

,8,�