EPIFLUORESCENCIAEPIFLUORESCENCIA

                                                                                                            

EL EQUIPOEL EQUIPO

EL EQUIPO LED EPIEL EQUIPO LED EPI

MONTAJE DE LA LAMPARAMONTAJE DE LA LAMPARA

DESCRIPCION DEL DESCRIPCION DEL MICROSCOPIOMICROSCOPIO

EL MICROSCOPIOEL MICROSCOPIO

El microscopio Primo Star iLED ya está disponible con tres accesorios de fluorescencia adicionales que permiten el uso de distintos fluorocromos, tales como los FITC, Dapi y Rhodamine/Cy 3. De este modo puede emplearse un microscopio de LED para aplicaciones de fluorescencia simple en la formación, en procedimientos habituales y en investigación básica. Este dispositivo es especialmente robusto y fácil de usar, y ofrece una sobresaliente relación precio/rendimiento, gracias en gran medida a la fuente lumínica económica, duradera y de gran ahorro energético que ofrecen los LED.

Especialmente en el caso de la formación, la excitación de fluorescencia mediante la iluminación por LED resulta muy útil al no ser necesario contar con períodos de calentamiento o refrigeración, a diferencia de lo que ocurre con la excitación producida mediante lámparas de vapor de mercurio. Además, ya no es necesario reajustar las lámparas de excitación, por lo que el usuario puede comenzar a trabajar en el mismo momento en que se enciende la fuente de iluminación. El accesorio de fluorescencia del iLED cuenta con unos prácticos adaptadores oculares que permiten efectuar labores de microscopia de fluorescencia aunque no se esté en un cuarto oscuro (por ejemplo, en un auditorio). El microscopio dispone de una palanca que permite pasar de un uso de campo claro a uno de fluorescencia.

FILTROSFILTROS

CIRCUITO DE LA LUZCIRCUITO DE LA LUZ

La fluorescencia es La fluorescencia es

La fluorescencia es el fenómeno óptico que ocurre cuando la luz es absorbida por una sustancia -cuando se encuentra expuesta a radiaciones ultravioletas, rayos catódicos o rayos x-, creando así una excitación molecular que hace que dicho material re-emita la luz en una longitud de onda mayor a la longitud incidente.   Así, las moléculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada. La tinción molecular se basa en la utilización de colorantes fluorescentes, los cuales son detectados gracias al microscopio de fluorescencia. Este tipo de microscopía se fundamenta en el uso de filtros. El primer filtro selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. El microscopio fluorescente para epifluorescencia. La técnica de fluorescencia para microscopia con epiiluminadores (iluminador episcópico) está basada en la adaptación del iluminador vertical. La luz incide sobre la muestra a través de las lentes del objetivo, que permiten el paso de la luz ultravioleta exentos de tensión molecular.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

Estudios sobre naranjaEstudios sobre naranja

Fazii y col. (9) idearon un método de coloración de Fazii y col. (9) idearon un método de coloración de fluorescencia para la diferenciación entre bacterias Gram fluorescencia para la diferenciación entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, basada en el uso de naranja de positivas y Gram negativas, basada en el uso de naranja de acridina que interactúa con componentes de la pared acridina que interactúa con componentes de la pared celular, alcohol etílico-acetona para decolorar y fluoresceína celular, alcohol etílico-acetona para decolorar y fluoresceína de sodio que origina el sistema rojo/verde. Según los de sodio que origina el sistema rojo/verde. Según los autores, el decolorante, tal vez, desestabiliza la membrana autores, el decolorante, tal vez, desestabiliza la membrana externa de las bacterias Gram negativas, removiendo externa de las bacterias Gram negativas, removiendo parcialmente el naranja de acridina; de tal forma que al parcialmente el naranja de acridina; de tal forma que al incorporar la fluoresceína, se produce un efecto de incorporar la fluoresceína, se produce un efecto de coloración diferencial, donde las bacterias Gram positivas coloración diferencial, donde las bacterias Gram positivas se tiñen de amarillo fluorescente y las Gram negativas de se tiñen de amarillo fluorescente y las Gram negativas de verde fluorescente. Fazii y col. (9) y Ciancaglini y col. (10) verde fluorescente. Fazii y col. (9) y Ciancaglini y col. (10) emplearon la coloración diferencial de fluorescencia en emplearon la coloración diferencial de fluorescencia en hemocultivos y muestras de orina, obteniendo elevada hemocultivos y muestras de orina, obteniendo elevada sensibilidad en la detección de bacterias Gram positivas y sensibilidad en la detección de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Gram negativas.

NARANJA DE ACRIDINANARANJA DE ACRIDINA

Naranja de acridina (o N,N,N',N'-tetrametilacridina según Naranja de acridina (o N,N,N',N'-tetrametilacridina según IUPAC) es un colorante catiónico selectivo para los ácidos IUPAC) es un colorante catiónico selectivo para los ácidos nucléicos y útil para realizar determinaciones sobre el ciclo nucléicos y útil para realizar determinaciones sobre el ciclo celular. Interacciona con el ADN y el ARN por intercalación celular. Interacciona con el ADN y el ARN por intercalación dentro de la molécula o por atracción electrostática, dentro de la molécula o por atracción electrostática, respectivamente. Cuando asociado al ADN, el naranja de respectivamente. Cuando asociado al ADN, el naranja de acridina es espectralmente similar a la fluoresceína, acridina es espectralmente similar a la fluoresceína, presentado un máximo de excitación a 502 nm y una presentado un máximo de excitación a 502 nm y una emisión a 525 nm (en el verde). Cuando está asociado al emisión a 525 nm (en el verde). Cuando está asociado al ARN, la excitación máxima deriva a 460 nm (en el azul) y la ARN, la excitación máxima deriva a 460 nm (en el azul) y la emisión máxima a 650 nm (en el rojo). Por lo tanto, este emisión máxima a 650 nm (en el rojo). Por lo tanto, este colorante tiñe de verde a las células en fase de división colorante tiñe de verde a las células en fase de división activa (mucho ADN), y de naranja a las que están en reposo activa (mucho ADN), y de naranja a las que están en reposo multiplicativo (mucho ARN y proteínas).multiplicativo (mucho ARN y proteínas).

NARANJA DE ACRIDINANARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.de la tinción.

FOTOGRAFIAS CON FOTOGRAFIAS CON NARANJANARANJA

FOTOS DE LEVADURAS Y FOTOS DE LEVADURAS Y HONGOSHONGOS

Método para vinos con naranja de Método para vinos con naranja de acridinaacridina

Preparación del reactivo:Preparación del reactivo: Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en Pesar 0,05 g de naranja de acridina y llevar a 50 ml., con agua destilada que estuvo en

ebullición 10 minutos, y se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estéril.ebullición 10 minutos, y se filtra por 0,45 micrones y se mantiene estéril. Técnica:Técnica: Tomar 40 ml de vino si es de línea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo Tomar 40 ml de vino si es de línea y 10 ml de vino si es de vasija e instalar en el extremo

de la jeringa un portafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de de la jeringa un portafiltro de 13 mm con una membrana de poro de 0,6 micrones de poliamida, filtra la muestrapoliamida, filtra la muestra

Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm Con otra jeringa de 5 ml tomar 3 ml del naranja de acridina e instalar un filtro de 13 mm con una membrana de 0,22 micrones de poro estéril.con una membrana de 0,22 micrones de poro estéril.

En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presión en En la salida de este filtro instalamos el filtro donde filtramos el vino y ejercemos presión en la jeringa para que pase el colorante a través de los dos filtros con sumo cuidado.la jeringa para que pase el colorante a través de los dos filtros con sumo cuidado.

Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante.Luego hacemos pasar 1-2 ml de isopropanol para arrastrar el exceso de colorante. Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rápido y una vez Retirar la membrana del vino con una pinza, secarla con sumo cuidado y rápido y una vez

ocurrido esto colocar sobre un portaobjetos.ocurrido esto colocar sobre un portaobjetos. Agregar sobre la membrana aceite de inmersión de alta calidad, veremos que la Agregar sobre la membrana aceite de inmersión de alta calidad, veremos que la

membrana se transparenta, colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra membrana se transparenta, colocar un portaobjetos sobre la misma y volver a colocar otra gota de aceite de inmersión.gota de aceite de inmersión.

Asegurar una correcta inmersión de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la Asegurar una correcta inmersión de la lente del objetivo. La lectura se realiza en zigzag tomando la lectura de 10 campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro.lectura de 10 campos, comenzando por el extremo inferior y luego observar el centro.

RESULTADOS RESULTADOS INTERPRETACIONINTERPRETACION

Resultados:Resultados: En vasija < 400 levaduras y < 600 En vasija < 400 levaduras y < 600

bacterias por litros y en botella es de < bacterias por litros y en botella es de < 100 levaduras y < 200 bacterias100 levaduras y < 200 bacterias

Las levaduras verdes y bacterias se Las levaduras verdes y bacterias se tiñen de color naranja brillante sobre tiñen de color naranja brillante sobre un fondo negro un fondo negro

MUCHAS GRACIAS POR SU MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIONATENCION

ALEJANDRO CANGIALEJANDRO CANGI

MAG SRLMAG SRL