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Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp)Vol. 101, Nº. 2, pp 399-417, 2007VIII Programa de Promoción de la Cultura Científica y Tecnológica

ENZIMAS: QUÉ SON Y PARA QUE SIRVEN

LUIS FRANCO VERA *

* Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Universidad de Valencia. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. 46100 Burjassot, Valencia. [email protected]

INTRODUCCIÓN

A veces, tendemos a contemplar las realidades na-turales con una visión excesivamente antropocéntrica,de modo que cuando nos planteamos preguntas comola que sugiere el encabezamiento de este artículo,“¿para qué sirven las enzimas?”, podemos pensarinmediatamente en dar una respuesta del tipo: “lasenzimas sirven para que el hombre pueda desarrollartal o cual operación”. Además, no es infrecuente queuno seleccione la respuesta entre aquellas operacionesque reportan un beneficio inmediato, de modo que a laperspectiva antropocéntrica se añada otra de corte uti-litarista. Es evidente que el hombre tiene plenoderecho a obtener provecho de la naturaleza, siempre,huelga decirlo, que esa actividad no perjudique a losdemás ni a la propia naturaleza, lo que sería un modoindirecto de perjudicar al resto de la humanidad pre-sente o futura. Pero también es cierto que una men-talidad pragmática a ultranza puede entorpecer lacontemplación de las realidades naturales en símismas; puede impedir descubrir múltiples facetas

que, tal vez, podrían redundar en un mayor beneficiopara la humanidad. En este sentido, puede ser conve-niente aproximarse a la comprensión del mundobiológico con una actitud abierta, contemplativa si sequiere, sin intentar aprovechar inmediatamente lasposibilidades que nos ofrece. Y muchas veces resultaráde esa visión, asombrada y desinteresada, un profundoconocimiento de las realidades más íntimas de la natu-raleza que hará posible su aplicación.

Desde este punto de vista, nos acercaremos alconocimiento de las enzimas. En primer lugar, paratratar de comprender su funcionamiento y, ¿por quéno?, para llenarnos de asombro ante su eficaciacatalítica y ante el resto de sus propiedades; después,para con esa comprensión, tratar de entender las basessobre las que se asienta el aprovechamiento de esaspropiedades.

¿POR QUÉ LAS ENZIMAS SONCATALIZADORES TAN EFICACES

Una reacción química en la que, a partir de unasmoléculas se obtienen unos productos diferentes,siempre implica una redistribución de enlaces. Laorganización de los átomos que componen los reac-tivos es distinta de la de los productos y en lasmoléculas, los átomos se unen entre sí medianteenlaces. Cuando, por ejemplo, representamos unareacción como A B C D, estamos indicandoimplícitamente un balance de materia, es decir, que losátomos presentes en A y B se encuentran también en Cy D, aunque, evidentemente, están distribuidos deforma diferente. La figura 1 representa esquemática-mente esa idea.

+→+

Figura 1. Representación esquemática de una reacción quími-ca que pone de manifiesto que en cualquiera de ellas debeproducirse una reorganización de enlaces covalentes.

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Una reacción química puede considerarse tantodesde una perspectiva termodinámica como desde unpunto de vista cinético. En el primer caso, lo másinmediato es indicar el cambio de energía libre que seproduce al transcurrir la reacción. Por ejemplo, si lareacción A B C D transcurre en condicionesestándar, la variación de energía libre es ∆Gº.Evidentemente, el valor de esta magnitud no repre-senta la variación real de energía libre, ya que rarasveces se dará la reacción en condiciones estándar, esdecir, con todos los reactivos y productos a concen-tración 1 M. Pero sí aporta un dato valioso: un valor de∆Gº negativo, por ejemplo, indica que la reaccióntiende a producirse de izquierda a derecha, aunque lascondiciones actuales puedan obligar a lo contrario1.

Para introducir un nuevo concepto, vale la penacitar ahora un ejemplo, del que luego se hará más uso.En las reacciones de hidrólisis ∆Gº es siempre nega-tivo: el aumento de entropía que implica la escisiónhidrolítica de un compuesto químico es responsable deello. Los aceites comestibles, por concretar, sontriésteres de glicerol con ácidos grasos, luego para suhidrólisis ∆Gº<0. Si se mezcla el aceite (A) con agua(B), necesariamente se tendrá ∆G<0. La reacción dehidrólisis, en principio, debe producirse con una granliberación de energía, pero todos tenemos experienciade que al mezclar aceite con agua, el aceite permaneceinalterado durante mucho tiempo. La razón de estaaparente paradoja estriba en que en una reacciónquímica, para que los reactivos se conviertan en pro-ductos es preciso pasar por un estado intermedio, elestado de transición. Como se esquematiza en la figura2, en el estado de transición ni se han terminado deromper los enlaces que hay en A y B, ni se hanacabado de formar los que han de aparecer en C y D.El estado de transición representa, pues, una situacióninestable, de modo que, para pasar de A B a C D,es necesario comunicar a los reactivos la energía nece-saria para que alcancen el estado de transición. Estaenergía se denomina energía de activación, y se repre-

++

+→+

senta con el símbolo ∆G‡ (Fig. 2). Es evidente que laexistencia de un estado de transición implica una difi-cultad al progreso de la reacción y que cuanto mayorsea el valor de ∆G‡, tanto más difícil será que lareacción se produzca.

La consideración de una reacción desde un puntode vista cinético es fácil si se trata de una reacción ele-mental2. Por ejemplo, para una reacción A B, lavelocidad,

,

será proporcional a la concentración de A, es decir,. La constante de proporcionalidad, k, recibe

el nombre de constante cinética y, en primera aproxi-mación, mide la facilidad intrínseca con que los reac-tivos se convierten en productos. Si la reacciónelemental, como la de la figura 1, implica dosmoléculas, es evidente que la velocidad dependerá dela concentración de ambas de modo que .

→

1 Hay que recordar que

,

con lo que, aunque ∆Gº sea negativo, si C y D están mucho más concentrados que A y B, el segundo sumando de la ecuación puede hacerque ∆G resulte positivo y la reacción transcurra de derecha a izquierda.2 De una forma sencilla, se puede decir que una reacción es elemental cuando transcurre tal como se escribe, sin incorporación ni salida deotras especies químicas.

Figura 2. Perfil energético simplificado de una reacción quími-ca. Se supone que la reacción esquematizada en la fig. 1 secaracteriza por una variación de energía libre negativa encondiciones estándar. Para que se conviertan los reactivos enproductos, es necesario pasar por un estado de transición enel que los nuevos enlaces aún no se han formado totalmente.Este estado, representado en el centro del esquema, esinestable, por lo que para llegar a él es preciso comunicar a losreactivos una energía de activación, ∆G‡.

Las consideraciones elementales anteriores3, sobrecinética y termodinámica de reacciones no son inde-pendientes. Intuitivamente se ve, por ejemplo, quedebe existir una relación entre ∆G‡ y k, de modo queuna energía de activación grande, al implicar un mayorobstáculo al avance de la reacción, se correlaciona conuna constante cinética pequeña. Por otro lado, estambién evidente —y se puede comprobar con unrápido examen de la figura 2— que el valor de laenergía de activación no tiene ningún efecto sobre elbalance energético de la reacción. Independientementede cuál sea la magnitud de ∆G‡, ∆Gº permaneceinvariable. En el transcurso de la reacción, la energíade activación que hay que comunicar a los reactivospara que alcancen el estado de transición, es devueltaal pasar desde éste a los productos.

Un ejemplo concreto puede ayudar a fijar mejor lasideas que se acaban de exponer y, al propio tiempo, aintroducir el concepto de catálisis. Por seguir con lalínea arriba apuntada, el ejemplo será la hidrólisis deun éster. En este caso, A y B son el éster y el agua,mientras que C y D representan al ácido y al alcoholresultantes. En la figura 3b, el átomo de oxígeno delagua se ha coloreado, para expresar gráficamentecómo este átomo acaba incorporado al ácido. En elestado de transición, que aparece en la parte central dela figura, el desplazamiento parcial de los electrones πdel enlace C=O hacia el oxígeno hace posible que unpar de electrones libres del agua realice un ataquenucleofílico al carbono del éster. Como consecuencia,aparece un enlace parcial entre el átomo de carbono,que pasa a ser tetraédrico, y el oxígeno del agua. Peroéste queda con una carga parcial positiva y esta es lacausa principal de la inestabilidad del estado de tran-sición, ya que el oxígeno es un elemento electronega-tivo. De hecho, esta inestabilidad puede implicar unaenergía de activación tan elevada que en muchos casos—como el del aceite antes mencionado— la reacciónde hidrólisis de ésteres, pese a ser exergónica, no seproduce al mezclarlos con agua.

No obstante, la Química Orgánica enseña que enpresencia de sosa concentrada sí se produce lahidrólisis de los ésteres. Desde tiempo inmemorial seha empleado este procedimiento para fabricar jabones

sólidos —sales sódicas de los ácidos grasos— a partirde grasas y aceites. Este proceso precisamente ha dadoel nombre, saponificación, a la reacción de hidrólisisde ésteres en presencia de una base fuerte como lasosa. ¿Cuál es el motivo por el que una base facilita lareacción de hidrólisis? En la figura 3c la base se harepresentado como :X-; hay que advertir que loesencial de una base es que posea un par de electroneslibres capaces de captar un protón. Que posea —comoen el caso del ion hidroxilo, OH-— carga negativa ono la posea es irrelevante. Pues bien, la base puedeceder parcialmente sus electrones libres a la moléculade agua reactiva, de modo que compense la carga ne-gativa que poseería de otro modo el oxígeno en elestado de transición. En consecuencia, la inestabilidaddel estado de transición —y, con ella, la energía deactivación— disminuye. Por lo que se ha comentadoantes, la reacción se acelera en presencia de la base.Pero el examen de la figura 3c permite añadir otrodetalle: al término de la reacción, los productos for-mados son los mismos que si la base no hubiera estadopresente y, lo que es más importante, la base se

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3 Un tratamiento cinético más completo quedaría fuera del alcance de estas líneas. El lector interesado puede acudir a cualquier texto de cinéti-ca química.

Figura 3. Esquema de una reacción química (a), que se pre-senta en el panel (b) para el caso concreto de la hidrólisis deun éster. Se indica el mecanismo químico y una estructuraposible para el estado de transición. En el panel (c) se da elmecanismo de esa misma reacción en presencia de una base,:X-, que actúa como catalizador.

recupera en el mismo estado inicial. De este modo, labase acelera la reacción sin consumirse en ella. Este esel rasgo fundamental de un catalizador químico:facilitar cinéticamente las reacciones sin gastarse. Unaúnica molécula de catalizador puede participar así enla transformación de un número muy elevado —enteoría, indefinido— de moléculas de reactivos. En lafigura 4 se puede observar cómo un catalizador,aunque estabiliza el estado de transición y rebaja, portanto, la energía de activación, no altera el balance ter-modinámico de la reacción. El valor de ∆Gº no seafecta y, como , el estado final de lareacción, el estado de equilibrio termodinámico, no seafecta por la presencia de un catalizador; simplemente,se alcanza más rápidamente.

Una consideración más a propósito del mecanismodescrito en la figura 3c. No hay que olvidar que lareacción transcurre en disolución, y que las moléculas,por tanto, poseen libertad de movimiento. Teniendopresente esta circunstancia, es razonable pensar que laestabilización del estado estacionario es un sucesosumamente improbable. En efecto, exige la concu-rrencia de tres moléculas, la del éster, la de agua y labase con una disposición espacial concreta. No bastaque la molécula de agua se acerque a la del éster; espreciso que lo haga de modo que uno de los pares deelectrones libres del oxígeno quede orientado hacia elcarbono para poder realizar el ataque nucleofílico. Y labase debe acercarse a la molécula de agua de formaque sus electrones libres queden en proximidad de uno

de los átomos de hidrógeno del agua. Por este motivo,en las reacciones de saponificación se emplea sosamuy concentrada: la abundancia de iones OH-aumenta la probabilidad de la formación de este com-plejo.

El ejemplo que se ha mencionado corresponde a untipo particular de catálisis, la catálisis ácido-base. Perolos rasgos fundamentales de la catálisis, es decir,rebajar la energía de activación por estabilizar elestado de transición —y, por ende, facilitar cinética-mente la reacción—, no consumirse en ella y no alterarsu balance termodinámico, son comunes a todos losmecanismos catalíticos.

Tras las consideraciones anteriores es ya hora deiniciar el estudio de las enzimas, los catalizadores queemplean los organismos vivos. En primer lugar, llamala atención que las enzimas son catalizadores muchomás eficaces que cualquier catalizador químico. Unaexperiencia común permite apoyar este aserto. Seacaba de hablar de la saponificación de los ésteres.Pues bien, para completar la reacción de hidrólisis deuna grasa en presencia de NaOH concentrada (p. ej., 1M) hacen falta unas 3 h a 100º aproximadamente. Sinembargo, la digestión de las grasas en el organismo,que implica su hidrólisis, se completa en mucho menostiempo y a 37º C, gracias a la actuación de unasenzimas, las lipasas. Y, como se ve en la tabla I, hayotras enzimas capaces de acelerar las reacciones por unfactor cercano a 1018. Esto es algo absolutamenteimpensable para un catalizador químico, cuya eficaciano pasa de 106 o 107 veces. Además, las enzimasposeen otra propiedad de la que carecen los catali-zadores químicos: la especificidad. La catálisis queejerce la sosa, puede emplearse para la hidrólisis decualquier éster, pero también para la hidrólisis deamidas, de anhídridos, etc. e incluso para otras reac-ciones no hidrolíticas. Sin embargo, una hidrolasa—una enzima que cataliza reacciones de hidrólisis—no es capaz de catalizar otro tipo de reacciones. Másaún, las enzimas no sólo poseen especificidad dereacción, sino también de sustrato. Una lipasa nohidroliza —al menos, no lo hace con eficacia— unéster distinto de un triacilglicerol, ni una amida, etc. Yla asparaginasa, enzima que hidroliza el enlace amidade la asparagina, no cataliza apenas la hidrólisis de laglutamina, que sólo difiere de la asparagina en poseerun átomo de carbono más.


Figura 4. Perfil energético, análogo al de la fig. 2, que mues-tra como en presencia de un catalizador se estabiliza el estadode transición con la consiguiente disminución de ∆G‡. En elcaso de que el catalizador sea una enzima, la disminución de∆G‡ puede ser muy importante (véanse los símbolos represen-tados en verde).

eqº lnG RT K∆ = −

¿Cuáles son las bases moleculares de una accióntan eficaz y específica? La clave para contestar estapregunta la dio el trabajo de Leonor Michaelis(1875-1949) y Maud Menten (1879-1960). El primeroera un joven profesor de la Universidad de Berlín; lasegunda, una, aún más joven, doctora de origen cana-diense. Sus nombres han pasado a la historia de laBioquímica, hasta el punto que se puede decir que laEnzimología comienza realmente con ellos. Noobstante, la mayoría de las veces se malinterpreta elverdadero significado de su trabajo. Todo el que hayaestudiado una Bioquímica, por elemental que hayasido, ha oído hablar de la constante de Michaelis, o dela ecuación de Michaelis-Menten. Pero asociar elnombre de estos investigadores a una ecuación es real-mente una injusticia. El verdadero alcance de sutrabajo es muy otro. Michaelis y Menten se interesaronpor la reacción catalizada por la invertasa, una enzimaque cataliza la hidrólisis de la sacarosa para producirglucosa y fructosa, reacción que se podría abreviarcomo:

donde E representa a la enzima y P a los productos dela reacción. Como ésta es irreversible, a simple vista,la velocidad de la reacción vendría dada por v k[S],en la que k sería la constante cinética. Esta ecuaciónimplicaría que, al representar v en función de [S], sedebería obtener una línea recta, que pasaría por elorigen y cuya pendiente sería k. No obstante, la repre-sentación era muy diferente. Como ya había observadoVictor Henri en 1903 (1), se obtenía una curva de pen-diente continuamente decreciente, que tendía asintóti-camente a un valor de velocidad que no se podíasuperar por mucho que se elevara la concentración delsustrato4. Pero Henri no acertó a comprender la razónde este resultado que, por el contrario, fue el punto departida del modelo de Michaelis y Menten. Supusieronestos autores que, para que el sustrato se convirtiera enproducto, un requisito esencial era que se uniera pre-viamente a la enzima, formando un complejo. La pro-puesta de de Michaelis y Menten se esquematiza pues:

Hoy en día estamos tan acostumbrados a ver elesquema [I] como prototipo de una reacción enz-imática, que puede costar trabajo comprender el ver-dadero mérito de Michaelis y Menten al proponerlo.Efectivamente, si el sustrato debe formar un complejocon la enzima —lo que, posteriormente, se ha llamadoel complejo de Michaelis—, la velocidad de lareacción, es decir, la velocidad de aparición del pro-ducto, vendrá dada por v k2[ES]. Y es evidente que laconcentración de complejo ES no puede superar elvalor de la concentración total de enzima, lo que jus-tifica que la velocidad tienda asintóticamente a unvalor máximo al aumentar la concentración de sus-trato.

El modelo de Michaelis-Menten implica algo queahora conviene detallar. La unión de la enzima con elsustrato no se efectúa por una simple adsorcióninespecífica, sino que tiene lugar a través de una loca-lización concreta de la enzima, llamada centro activo.El sustrato encaja en el centro activo, en primer lugarporque sus estructuras son más o menos complemen-tarias desde un punto de vista estérico. Pero además, yesto es más importante, se establecen múltiples inter-acciones entre los aminoácidos que forman el centroactivo y el sustrato. Se trata de interacciones no cova-lentes, débiles cada una de ellas, pero fuertes en suconjunto al ser muy numerosas. Tanto la complemen-tariedad estérica del centro activo y el sustrato como elestablecimiento de múltiples interacciones explican laespecificidad de la interacción enzima-sustrato. Parailustrar esta cuestión, se puede usar el ejemplo de laorotidina-5'-fosfato descarboxilasa, una de las enzimascuyas propiedades cinéticas se recogen en la tabla I. Laenzima cataliza la descarboxilación de la orotidina-5-fosfato, la última etapa de la biosíntesis de las pirimi-dinas. La reacción se recoge en la figura 5a. La enzimaestá formada por dos cadenas polipeptídicas de 239aminoácidos cada una y posee dos centros activossituados en la interfase entre ambas cadenas. En lafigura 5b se presenta un esquema del centro activo,elaborado a partir de los datos cristalográficos deAppleby et al. (3). Se puede ver que, de los aminoá-cidos que posee la enzima, sólo 11 intervienen directa-mente en la unión del sustrato en el centro activo.Nueve pertenecen a una de las cadenas y los 2restantes a la otra. Aunque estos aminoácidos están

=

1 2

1

E S ES E Pk k

k−

+ → +

=

ES P→


4 Desde hace mucho tiempo, se ha hecho costumbre denominar sustratos a los reaccionantes de una reacción enzimática.

[I]

alejados en la secuencia de la proteína, evidentementese encuentran próximos en la estructura terciaria de laenzima. Se aprecia también en la figura 5b que esos 11aminoácidos establecen un total de 16 interacciones —mayoritariamente enlaces de hidrógeno— con losátomos del sustrato.

Las propiedades del centro activo que se acaban demencionar y, especialmente, el ejemplo de la oro-tidina-5'-fosfato descarboxilasa, justifican la granespecificidad de sustrato de las enzimas. Es muy difícilencontrar una molécula que tenga una forma y tamañosemejantes a los del sustrato orotidina-5'-fosfato y queademás posea en la zona adecuada los átomos don-adores o aceptores para que se establezcan los enlacesde hidrógeno que retienen al sustrato unido al centroactivo. Pero esas propiedades aún son insuficientespara explicar el porqué de su eficacia catalítica. Paraello, hay que añadir un dato: en el centro activo,además de los aminoácidos que se encargan delreconocimiento específico del sustrato hay otros que

desempeñan el auténtico papel catalizador. En la oro-tidina-5'-fosfato descarboxilasa esa misión la realizanlas cadenas laterales de Lys62 y de Asp60. Como seaprecia en la figura 5b, esos aminoácidos seencuentran próximos al grupo carboxilo del sustrato,que ha de perderse en la reacción, y su función es pre-cisamente la de estabilizar el estado de transición. Trasla pérdida del grupo carboxilo, el carbono 6 queda enla forma inestable de carbanión (4), representada en lafigura 6, y la carga positiva de Lys62 estabiliza elestado de transición, a partir del cual, por protonacióndel carbanión, se obtiene el producto. Por su parte,muchas enzimas hidrolíticas poseen en su centroactivo aminoácidos capaces de actuar como bases,


Tabla I. Efecto de las enzimas sobre la velocidad de reacción.

Figura 5. Función del centro activo en la catálisis enzimática.Se emplea el ejemplo de la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa.(A) Descarboxilación de la de la orotidina-5-fosfato, reaccióncatalizada por la enzima. (B) Esquema del centro activo de laenzima, construido a partir de los datos de Appleby et al. (3).En verde se representan los aminoácidos implicados en la for-mación del complejo de Michaelis, que establecen los enlacesseñalados por las líneas de puntos azules. En rojo se señalanlos aminoácidos con función directamente catalítica. Véase eltexto para más detalles.

aportando un par de electrones libres, con lo quecumplen el papel de la base en un mecanismocatalítico como el esquematizado en la figura 3c.

La figura 5b pone de manifiesto, finalmente, otrade las propiedades que hacen de las enzimas catali-zadores tan eficaces. La gran cantidad de interaccionesentre el centro activo y el sustrato no sólo garantiza laespecificidad con la que éste se une, sino que aseguraque los aminoácidos implicados en la catálisis (en rojoen la figura 5b) queden próximos a la zona reactiva delsustrato. De esta manera, se soluciona el problemaapuntado al hablar antes sobre la catálisis homogénea,en disolución, en la que era necesario utilizar una granconcentración del catalizador. Evidentemente, lafijación del sustrato y su colocación con la proximidady orientación adecuadas a la acción de los residuoscatalíticos cumple con creces la misión de una elevadaconcentración de catalizador. Naturalmente, la fijacióndel sustrato implica una variación negativa deentropía. A la vista de la conocida relación termodi-námica entre entropía y energía libre, ,es obvio que un valor de ∆S<0 resulta desfavorabledesde un punto de vista energético, pero el elevadonúmero de interacciones favorables enzima-sustratohace que ∆H sea lo suficientemente negativo parahacer termodinámicamente favorable la formación delcomplejo de Michaelis.

Todas las consideraciones anteriores explican lainigualable eficacia de las enzimas como catali-zadores. Su papel estabilizador del estado de tran-sición, con la consiguiente disminución de la energía

de activación, es mucho más pronunciado que el queejercen los catalizadores químicos. Volviendo alesquema de la figura 4, se comprende que las enzimasaceleren las reacciones químicas mucho más que loscatalizadores ordinarios.

Si se admite la existencia del complejo deMichaelis como un intermediario en la conversión delsustrato en producto (esquema [I]), es posible desar-rollar la ecuación que relaciona la velocidad de lareacción con la concentración de sustrato. Se hacomentado antes que v k2[ES] y existen diversos pro-cedimientos para expresar [ES] en función de la con-centración de sustrato. Michaelis y Menten usaron unoaproximado; hoy en día se suele utilizar otro, pero elresultado matemático es similar. Se suele partir de laconsideración, apoyada por la integración numérica delas ecuaciones diferenciales cinéticas derivadas delesquema [I], de que la reacción enzimática transcurremayoritariamente en el estado estacionario. Seentiende como tal el periodo de tiempo durante el cualse puede suponer que la concentración de ES per-manece constante, ya que se forma a partir de laenzima y el sustrato libres a la misma velocidad quedesaparece para disociarse y para formar producto.Como quiera que el estado estacionario, en la inmensamayoría de los casos, comienza antes de 0,1 s tras lamezcla de la enzima y el sustrato y se prolonga variosminutos, la suposición de estado estacionario es habi-tualmente válida. En el estado estacionario

,

e imponiendo esta condición en las ecuacionescinéticas, se llega a:

La ecuación [1], ecuación de Michaelis-Menten, esla ecuación de una hipérbola. Su representacióngráfica, limitada al primer cuadrante, el único en quetiene sentido físico la ecuación, se puede observar enla figura 7. Como era de esperar, la representación sa-tisface la observación experimental de que lavelocidad no aumenta indefinidamente, sino quetiende asintóticamente a Vmax, el valor máximo quepuede alcanzar la velocidad en respuesta a un aumento

=


Figura 6. Estructura del estado de transición propuesto (4)para la reacción catalizada por la orotidina-5'-fosfato descar-boxilasa.

G H T S∆ = ∆ − ∆[1]

en la concentración de sustrato. Si la reacción enzi-mática se describiera adecuadamente por el esquema[I], la velocidad máxima sería el producto de k2 por[E]0, la concentración total de enzima en términos decentros activos5. Pero, en general, el esquema [I] essólo una aproximación, y el mecanismo de la reacciónenzimática implica un número superior de etapas entrela formación del complejo de Michaelis y la formacióndel producto. En general, se puede escribir:

donde kcat, constante catalítica o número de recambio,es una constante, combinación de todas las constantescinéticas de las etapas comprendidas entre el complejode Michaelis y la formación del producto. Sus dimen-siones son de (tiempo)-1. La ecuación [2] permiteelaborar una definición de constante catalítica como elnúmero máximo de moléculas de sustrato que cadacentro activo es capaz de transformar en producto enuna unidad de tiempo. A veces es útil otra manera deexpresar esta misma idea. El esquema de reacción [I]se puede representar de forma gráfica como aparece enla figura 8. Esta representación pone de manifiesto elcarácter cíclico de la actuación de una enzima, ya que,al no consumirse en la reacción —cosa que ocurre en

todos los catalizadores—, una molécula de enzima escapaz de catalizar la transformación de muchasmoléculas de sustrato, es decir, de realizar muchosciclos de catálisis. Pues bien, a la vista de estas consi-deraciones, la constante catalítica se podría definircomo el número máximo de ciclos de catálisis quecada centro activo puede realizar en la unidad detiempo.

En la ecuación [1] aparece un parámetro, Km, cons-tante de Michaelis, que algebraicamente resulta de unacombinación de las diferentes constantes cinéticas. Susentido físico, como concentración de sustrato para laque se alcanza una velocidad igual a Vmax/2, se puedeobtener fácilmente a partir de la ecuación [1] y serecoge en la figura 7. Es importante, pues, observarque la constante de Michaelis tiene dimensiones deconcentración. Aunque no sea tan evidente y tangeneral, la constante de Michaelis tiene también el sig-nificado de constante de disociación aparente de loscomplejos enzima-sustrato en el estado estacionario6.

Finalmente, hay que advertir que la validez de laecuación [1] no se restringe al caso del simplemecanismo representado por el esquema [I]. Ya se ha


5 Muchas enzimas tienen más de un centro activo. En ellas, [E]0 representa el producto de la concentración total de enzima, es decir, la con-centración de enzima libre a t 0 por el número de centros activos de la molécula de enzima.6 Este significado es exacto si la reacción enzimática puede describirse por el esquema [I]. En caso contrario, no pasa de ser una aproximación,válida para obtener muchas conclusiones. Cuando el mecanismo de reacción incluye otras formas del complejo enzima-sustrato posterioresal complejo de Michaelis, la expresión aparente de Km como constante de disociación incluiría Σ[ES] en vez de [ES] y por eso se habla deconstante de disociación de los complejos enzima-sustrato.

=

[2]

Figura 7. Representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten.

Figura 8. Representación esquemática de un ciclo de catálisis.

apuntado que puede aplicarse a otros mecanismos máscomplejos; lo que variará en cada caso es la forma delas expresiones algebraicas que relacionan Km y kcatcon las diferentes constantes cinéticas, pero en todoslos casos son válidos los significados físicos que sehan dado para esos parámetros. También es válida laecuación de Michaelis-Menten en el caso de que lareacción sea reversible, siempre que las velocidades sedeterminen en los momentos iniciales del estado esta-cionario. La notación v0 que aparece en la ecuación [1]significa precisamente velocidad inicial. Incluso esposible aplicar la ecuación [1] a reacciones queimpliquen más de un sustrato —que es lo habitual enlas reacciones de interés bioquímico—, si se expresa lavelocidad de la reacción en función de la concen-tración de un sustrato, manteniendo constante la con-centración de los demás. Naturalmente, en estos casoslos valores de Km y kcat son valores aparentes, depen-dientes de la concentración de aquellos sustratos queno se han variado durante la reacción.

ALGUNAS PROPIEDADESSORPRENDENTES DE LAS ENZIMAS

Un estudio detallado de las propiedades de lasenzimas quedaría totalmente fuera del alcance de estecapítulo7. Aún así, puede bastar la consideración de losvalores de Km y kcat de algunas enzimas para sorpren-derse ante las consecuencias de que posean esosvalores y no otros. Por ejemplo, la acetilcolinesterasaposee una constante catalítica de 25 000 s-1. Deacuerdo con la definición dada más arriba, eso sig-nifica que un centro activo es capaz de realizar 25 000ciclos de catálisis por segundo, o lo que es lo mismo,que un ciclo —que implica, no lo olvidemos, captar elsustrato para formar el complejo de Michaelis, pasarpor el estado de transición, formar el producto y libe-rarlo del centro activo— puede llegar a durar tan sólo0,04 ms. Pero esa extraordinaria rapidez está rela-cionada con la función que desempeña la enzima. Laacetilcolinesterasa cataliza la hidrólisis de la acetil-colina, un neurotransmisor que actúa, por ejemplo, enlas sinapsis neuromusculares. La acetilcolina sealmacena en las vesículas sinápticas, situadas en la ter-minal de un axón (figura 9).

Cuando el sistema nervioso central envía la ordende contracción a un músculo, el cambio de polari-zación de la membrana presináptica hace que lasvesículas sinápticas viertan su contenido a la hen-didura sináptica, que separa el axón de la célula mus-cular. La acetilcolina se difunde así por la hendidurasináptica y llega a interaccionar con un receptor que seencuentra en la membrana de las células musculares.Este receptor actúa como un canal de sodio, quepermite la entrada de este ion en las células muscu-lares, con la correspondiente despolarización de sumembrana. A su vez, ese cambio de potencial abre uncanal específico de calcio situado en la membrana delretículo sarcoplásmico, lo que permite que el ion alma-cenado en su interior difunda hacia el citosol. Y es pre-cisamente la interacción de calcio con loscomponentes de los miofilamentos lo que provoca lacontracción muscular. Así pues, la liberación de acetil-colina se traduce en contracción muscular. Pero si elmúsculo ha de relajarse de nuevo tiene que existir unaforma de revertir todo ese proceso. La acetilcoli-nesterasa actúa a este nivel. La enzima se encuentra enla hendidura sináptica, con lo que continuamente


7 El lector interesado puede encontrar excelentes descripciones en algunos libros clásicos, como los recogidos en las referencias 5 y 6.

Figura 9. Esquema de una sinapsis neuromuscular para ilus-trar la función del neurotransmisor acetilcolina y de la enzimaacetilcolinesterasa. Los detalles se dan en el texto.

hidroliza el neurotransmisor y hace descender su con-centración. Cuando ésta es suficientemente baja, selibera de su receptor, el canal de sodio se cierra, serestablece la polarización de la membrana de la célulamuscular, se cierra el canal de calcio y una bombaespecífica para este ion lo introduce de nuevo en elretículo sarcoplásmico, con lo que el músculo se relaja.Pero si los episodios de contracción y relajación debensucederse rápidamente, como ocurre en los dedos deun pianista que está ejecutando una obra de Chopin, oen los músculos de vuelo de un insecto, que puedealetear unas 400 veces por segundo, es menester quetodos los procesos implicados en la contracción-rela-jación ocurran a gran velocidad. La elevada constantecatalítica de la acetilcolinesterasa hace que la enzimapueda desempeñar perfectamente su función.

En el extremo contrario, se puede mencionar elejemplo de la lisozima, enzima cuya constantecatalítica es tan sólo de 0,5 s-1. A simple vista puedeparecer que la lisozima representa un fracasobiológico. Pero si se examina con detalle la función deesta enzima, se ve que no es ésa la realidad. Lalisozima es una enzima presente en la secreción nasal,en las lágrimas y en la saliva. Cataliza la escisión delos enlaces β-1,4 entre el ácido N-acetilmurámico y la2-acetamido 2-desoxiglucosa en mucopolisacáridos omucopéptidos. Como éstos polímeros son consti-tuyentes fundamentales de las paredes bacterianas, lalisozima ejerce una acción lítica sobre las bacterias. Supresencia en los fluidos corporales indicados tiene pre-cisamente una función de protección ante la invasióndel cuerpo por microorganismos. Pero no hace faltaque la lisis bacteriana se produzca a gran velocidad; entodo caso, lo que requiere la protección del organismoes que las bacterias se destruyan antes de que pro-liferen. Y como el tiempo de generación de una bac-teria es, en el caso más rápido, de varios minutos, unaconstante catalítica del orden de la indicada para lalisozima es más que suficiente para que la enzimapueda desempeñar su función a la perfección.

Ahora es tiempo de contemplar la adaptación de losvalores de la constante de Michaelis a las necesidadesfuncionales de las enzimas. Para ello, tomaremoscomo ejemplo la utilización de los aminoácidos. Sufunción primordial e insustituible es la de participarcomo monómeros en la síntesis de proteínas. Cuandohay exceso de algún aminoácido, el organismo escapaz de degradarlo, con lo que obtiene energía. Es

una forma adecuada de utilizar los aminoácidossobrantes, pero en esta función no son insustituibles;hay otros muchos componentes celulares capaces deproporcionar energía en su degradación y algunos que,como los triacilgliceroles, sólo juegan ese papel en elorganismo. Por tanto, no tendría sentido que una céluladegradara aminoácidos cuando hagan falta para sinte-tizar proteínas. ¿Cómo se asegura esa dedicación deaminoácidos a la síntesis de proteínas y se encaminasólo el sobrante a la degradación? La respuesta seencuentra si se contemplan las propiedades de lasenzimas que inician ambos procesos. La primerareacción que sufren los aminoácidos para intervenir enla biosíntesis de proteínas es la unión al tRNA. Lareacción está catalizada por las aminoacil-tRNA sinte-tasas. Existen sintetasas específicas para cadaaminoácido, pero todas tienen en común el poseer unaKm pequeña, que puede llegar a ser tan baja como 2,2µM (7).

La degradación de los aminoácidos suele empezarpor una reacción de transaminación, catalizada por unaaminotransferasa o transaminasa. Aunque estas enzi-mas son también específicas para los diferentesaminoácidos, su Km suele ser bastante alta y en algunoscasos, el valor absoluto encontrado es superior a 30mM (8). Teniendo en cuenta que una constante deMichaelis baja implica —con las reservas apuntadasantes— que el complejo de Michaelis se forma confacilidad, un aminoácido puede unirse muy bien a suaminoacil-tRNA sintetasa aunque se encuentre a bajaconcentración. Por el contrario, sólo cuando se en-cuentre en exceso se unirá apreciablemente a lasenzimas que van a conducir a su degradación.

La conclusión evidente de estos ejemplos es que lasenzimas presentan una exquisita adaptación de suspropiedades cinéticas a la función fisiológica quedesempeñan. Con la actitud que se mencionaba en laintroducción, el asombro que puede producir la cons-tatación de este hecho, debe animar al investigador aprofundizar más y más en el mecanismo de actuaciónde las enzimas.

EL CONTROL DE LA ACTIVIDADENZIMÁTICA

Los años que transcurrieron entre 1940 y 1955constituyeron, en opinión de algunos autores, una edad


de oro para la Enzimología. Se descubrieron en esosaños centenares de enzimas; muchas de ellas se ais-laron e incluso se cristalizaron; se caracterizaron suspropiedades cinéticas y se obtuvieron importantesdatos sobre sus mecanismos de actuación. A finales dela década de 1950, sin embargo, la Enzimologíacomenzó a experimentar un cambio notable. Se obtu-vieron los primeros datos sobre enzimas cuyaactividad dependía de algunos metabolitos diferentesde los sustratos o productos. Una de ellas era laaspartato transcarbamoilasa, que, pasando el tiempo,llegaría a constituir un caso paradigmático. Otra, en laque vamos a detenernos un momento, la treoninadesaminasa. Esta enzima cataliza la primera etapa dela biosíntesis de isoleucina y atrajo la atención deFrançois Jacob y Jacques Monod, que propusieron suestudio a Jean Pierre Changeux como tema de su tesisdoctoral. La isoleucina actuaba como inhibidor de latreonina desaminasa. Se trataba de un caso de retroin-hibición, inhibición de una enzima por el productofinal de la ruta metabólica, que también ocurría en laaspartato transcarbamoilasa. Changeux obtuvo prontounos interesantes datos. En primer lugar, la treoninadesaminasa, que poseía varias subunidades, no seguíauna cinética michaeliana: al representar su velocidadfrente a la concentración de sustrato, en vez de la típicacurva hiperbólica, se obtenía una sigmoide, lo quesugería que la unión del sustrato, treonina, era coope-rativa. Por otro lado, el calentamiento ligero de laenzima la hacía insensible a los efectos del inhibidor,isoleucina, pero no modificaba su capacidad catalítica.Este fenómeno, que el propio Changeux comenzó allamar desensibilización, parecía indicar que sustrato einhibidor se unían a sitios diferentes en la enzima. Fueentonces cuando Monod acuñó el término alosterismo,palabra de raíz griega que significa precisamente eso:otro lugar.

Monod y Jacob (9) por un lado y Changeux (10)por otro, presentaron sus resultados en la edición de1961 de los Cold Spring Harbor Symposia. Cuando elvolumen que recogía sus intervenciones se publicó, lacomunidad científica tuvo ocasión de leer por primeravez la palabra alosterismo, que Monod no habíallegado a pronunciar en público. En realidad, la posi-bilidad de que inhibidores y sustratos interaccionarancon las enzimas por localizaciones diferentes habíasido sugerida por otros investigadores. La primera vezque aparece escrita esa idea es en un artículo de Crane

y Sols (11) sobre la inhibición de la hexoquinasa decerebro por su producto, glucosa-6-fosfato, en el quese lee textualmente: «Los datos indican que la hexo-quinasa de cerebro posee, además de los sitios deunión para los sustratos y el adenosintrifosfato, untercer sitio de unión específico para la glucosa-6-fosfato». Y, por otro lado, otros autores habían for-mulado más tarde afirmaciones parecidas respecto alas enzimas que experimentan retroinhibición. Pero elmérito del grupo del Instituto Pasteur está en que lle-garon al fondo de la cuestión. Monod, Changeux yJacob (12) definen el mecanismo alostérico con unacondición negativa y con otra positiva. La primeraniega la existencia de interacciones directas decualquier género entre el sustrato o sustratos de unaproteína alostérica y los efectores, los metabolitos quecontrolan su actividad. La segunda establece que elefecto alostérico se debe totalmente a una alteraciónconformacional reversible inducida en la proteínacuando se une el efector específico.

Cuando Monod, Changeux y Jacob propusieronestos conceptos, se conocían aún pocas enzimas cuyocomportamiento se pudiera definir como alostérico. Ensu artículo (12) se detienen expresamente en 6, pero,además, añaden otra proteína, la hemoglobina, cuyocomportamiento encaja también dentro del conceptode alosterismo. Es especialmente importante el caso deesta proteína —enzima honoraria, la llamarían mástarde— que tanto contribuyó al desarrollo futuro de losmodelos alostéricos. Estos modelos intentabanexplicar los mecanismos moleculares por los que esoscambios de conformación de las proteínas —la tran-sición alostérica— podían modular la actividad enzi-mática.

El primer modelo alostérico fue también fruto de laintuición de Monod, que siguió contando con la parti-cipación de Changeux e inició una colaboración conJeffries Wyman. Este último era entonces uno de losmejores conocedores de la hemoglobina, la enzimaalostérica honoraria. Ya se ha comentado antes que enla treonina desaminasa el sustrato se une de modocooperativo y otro tanto ocurre en la mayoría de lasproteínas alostéricas. Este comportamiento incluye a lahemoglobina, precisamente la primera proteína para laque se demostró la unión cooperativa de un ligando, eneste caso el oxígeno. El resultado del esfuerzo coor-dinado de los tres investigadores, fue una publicación


en la que se proponía “un modelo plausible” paraexplicar la naturaleza de las transiciones alostéricas(13). El modelo postula que, en las proteínasalostéricas, existen dos estados conformacionales, T yR, que pueden interconvertirse libremente y que pre-sentan distinta afinidad por el ligando, pero no admitela existencia de estados intermedios con propiedadesestructurales híbridas entre T y R. Los sitios de uniónde ligando a las formas R son equivalentes e indepen-dientes entre sí, y otro tanto ocurre con los sitios de lasformas T. Es obvio que, si no fuera por la coexistenciade T y R, la unión de ligando transcurriría sin coopera-tividad. Pero cuando se tienen en cuenta los pre-supuestos anteriores, es evidente que, al añadirligando, éste se unirá preferentemente a las formas deafinidad mayor, las formas R. Una simple conside-ración de las leyes del equilibrio químico indica que lapresencia de ligando conlleva un desplazamiento delequilibrio T-R hacia estas últimas formas, lo que dalugar a un incremento global de la afinidad. Natural-mente, si se postula que los inhibidores alostéricostienen preferencia para unirse a las formas T y que losactivadores lo hacen predominantemente a las formasR, las mismas consideraciones sobre el equilibrioquímico explican el mecanismo de actuación de losefectores. Hay que señalar, no obstante, que estamisma sencillez ha pasado inadvertida a más de unautor, que se ha limitado a constatar que las ecuacionesderivadas de ese planteamiento conceptual se ajustancuantitativamente bien al comportamiento experi-mental de la hemoglobina. A título de ejemplo, seincluye la ecuación para la unión del sustrato:

en la que es la fracción de saturación8, L la con-stante alostérica, es decir la constante del equilibrio T-R en ausencia de ligandos, c es la relación entre lasconstantes de disociación del sustrato de las formas Ty R, y α es el cociente entre la concentración de sus-trato y su constante de disociación de las formas R.

Poco después de la aparición del artículo deMonod, Wyman y Changeux, se publicó otro con el

germen de lo que sería el segundo gran modeloalostérico, concretamente el de Koshland, Némethy yFilmer (14). Para explicar la cooperatividad, Koshlandy sus colaboradores proponían que la unión de ligandoa una proteína alteraba exclusivamente la confor-mación de la subunidad ocupada. Esto puede afectar ala estabilidad de la estructura cuaternaria, si cambia elmodo de interacción de esa subunidad con las con-tiguas. Y como la estabilidad puede aumentar o dis-minuir, puede resultar cooperatividad positiva onegativa. Algo más tarde, Koshland extendió elmodelo para explicar el alosterismo.

Los años siguientes fueron fecundos, ya que la pu-blicación del modelo de Koshland inició lo queChangeux llamó una “controversia creativa” entre lasdos concepciones de cooperatividad y alosterismo. Alser simples y generalizadores, como ha de ocurrir contodos los modelos, es ocioso decir que prácticamenteninguna proteína alostérica se puede definir al 100%por uno u otro de los modelos. Como consecuencia,han surgido modelos alternativos, modelos inte-gradores..., pero en definitiva, cuando han transcurridomás de 40 años desde la propuesta del alosterismocomo un modo de regulación, todos los modelos sereducen de una forma u otra a uno u otro de los origi-nales. El de Monod, Wyman y Changeux tiene elencanto especial de las ideas geniales, que en suaparente sencillez encierran un profundo significado.Por supuesto, es necesario introducir precisionesmatemáticas en las ecuaciones simples del tratamientoinicial, pero el rasgo fundamental del modelo, es decir,el que la transición entre dos estados conformacionalessea concertada, parece resistir los embates del tiempo.Al menos, eso ocurre en el caso de la hemoglobina. Enun reciente estudio exhaustivo, se han analizado datoscinéticos muy precisos sobre la disociación de com-plejos hemoglobina-monóxido de carbono para con-cluir que el modelo de dos estados sirve para explicarsatisfactoriamente la cooperatividad en la unión de li-gandos a la hemoglobina (15). Es necesario, eso sí, unsistema de 85 ecuaciones diferenciales acopladas paradescribir adecuadamente los resultados desde un puntode vista cuantitativo, pero el rasgo fundamental delmodelo ha persistido.


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8 La fracción de saturación es la fracción molar de sitios ocupados por ligando.

Hasta ahora, al hablar del alosterismo, realmentenos hemos limitado a uno de sus tipos, el alosterismoK, en el que la enzima alostérica presenta coopera-tividad en la unión de sustrato y los efectores alteran laafinidad de la enzima por el sustrato, pero no modi-fican la velocidad máxima (figura 10). Existe otro tipode alosterismo, menos frecuente, en el que el sustratose une a la enzima sin cooperatividad y los efectoresmodifican la constante catalítica —y, por tanto, lavelocidad máxima—, pero no alteran la afinidad delsustrato. Se trata del denominado alosterismo V.

El alosterismo, a pesar de su importancia, no es elúnico proceso del que se valen las células paramodular su actividad enzimática. Hay tambiénenzimas cuyos cambios de actividad se regulan pormodificación covalente. En este mecanismo, la enzimapuede encontrarse en dos estados: uno activo y otroinactivo. Pero los dos difieren fundamentalmente enque uno de ellos posee un grupo unido covalente-mente, mientras que el otro estado carece de ese grupo.Son numerosos los grupos que modifican las enzimas,pero la modificación más corriente —y la única que seva a considerar en este artículo— es la fosforilación,por la que se añade a la enzima un grupo fosfato, queesterifica un hidroxilo de la cadena lateral de serina,treonina o tirosina. Como se aprecia en la figura 11, latransformación de la forma no fosforilada en la fosfo-

rilada implica una reacción química. En efecto, elgrupo hidroxilo (-OH) de la forma no modificada (E-OH) tiene que convertirse en un éster fosfórico (E-O-P), cuya estructura se aprecia en el recuadro de lafigura. Pero ello implica la formación de nuevosenlaces, es decir, una reacción química. Concreta-mente, el grupo fosfato procede de otra molécula, queactúa como donadora, el ATP, que se transforma enADP. Y la conversión de la enzima fosforilada en laforma desfosforilada también implica una reacciónquímica, es decir, la hidrólisis del éster fosfórico paraliberar el anión fosfato. Naturalmente, para que se pro-duzcan estas reacciones de transformación de E-OH enE-O-P y viceversa hacen falta otras enzimas auxiliares,de modo que se da la circunstancia de que cada enzimaque se regula por modificación covalente necesita almenos de dos enzimas auxiliares, para que se puedaninterconvertir las formas modificadas y las no modifi-cadas. En el caso concreto de la modificación por fos-forilación que se esquematiza en la figura 11, lasenzimas auxiliares que introducen el grupo fosfato aexpensas del ATP se denominan proteína quinasas,mientras que las que catalizan la hidrólisis del ésterfosfórico de la proteína reciben el nombre de proteínafosfatasas.

Por otro lado, la regulación por modificación cova-lente puede afectar tanto a la afinidad con la que se uneel sustrato a la enzima regulada, como a su capacidad


Figura 10. Cinética de una enzima alostérica tipo K. La figuramuestra la cinética de la reacción en ausencia de efectores(curva negra), en presencia de varias concentraciones de unefector alostérico positivo (curvas rojas) o negativo (curvasverdes).

Figura 11. Reacciones de fosforilación y desfosforilación deuna enzima. La enzima desfosforilada se representa como E-OH, para hacer énfasis en el grupo o grupos hidroxilo que semodifican por transferencia de fosfato desde el ATP. La enzimafosforilada se representa como E-O-P y la estructura del ésterfosfórico se da en el recuadro.

catalítica. Por tanto, la velocidad de la reacción puederesultar alterada tanto por variaciones en [ES] como enkcat (ver ecuación [2]).

No se puede generalizar cuál de las dos formas,modificada o sin modificar, es la activa, ya que en lanaturaleza existen ejemplos de ambas situaciones.Centrándonos en un caso en el que la forma fosforiladasea la activa en la catálisis de una reacción que con-vierta un sustrato X en un producto Y, para que sepueda catalizar la reacción X Y se requiere que laactuación de la quinasa supere a la de la fosfatasa. Esdecir, el estado de actividad o no de la enzima dependede la actividad de las enzimas auxiliares. Este procesode regulación por modificación covalente da lugar,pues, a lo que se llama regulación en cascada, puestoque la actividad de una enzima depende a su vez delestado de actividad de otras. Con frecuencia, se daademás una complicación adicional: las enzimas auxi-liares pueden regularse también por modificacióncovalente, por lo que cada una de ellas requiere, a suvez, otras enzimas auxiliares. Se habla así de cascadasde regulación de dos o más ciclos. Por supuesto, nopuede multiplicarse hasta el infinito el número deciclos de una cascada de regulación. De hecho,siempre existe una primera enzima auxiliar que seregula por alosterismo, de modo que el efector de esaenzima es el que dispara toda la cascada de regulación.

Llegados a este punto, cabe preguntarse: si la regu-lación por modificación covalente es tan complicadacomparada con la regulación alostérica, ¿qué razoneshay para que exista? O, dicho de otro modo, ¿por qué,a lo largo de la evolución, la selección natural no haeliminado un proceso tan complicado? Para encontraruna respuesta convincente, hay que profundizar en las

peculiaridades de la regulación por modificación cova-lente y compararlas con las de la regulación alostérica,como se hace en la tabla II. En ella se hace mención ala complejidad de ambos mecanismos, a la velocidadde respuesta, a la amplificación y a la sensibilidad.

La complejidad se refiere, por ejemplo, al númerode enzimas requeridas, una sólo en el caso delalosterismo, y, por lo menos tres en la regulación pormodificación covalente. La velocidad de respuestaindica el tiempo que tiene que transcurrir desde que elefector que dispara el proceso aparece o cambia deconcentración hasta que se advierta el cambio final enla reacción catalizada por la enzima objeto de regu-lación. La regulación alostérica es virtualmente instan-tánea, ya que las interacciones enzima-efector, comotodas las interacciones proteína-ligando, son muyrápidas. Por el contrario, en la regulación por modifi-cación covalente desde que se activa la primera enzimaauxiliar hasta que lo haga la enzima final puede pasarun tiempo de varios minutos, ya que es preciso que sevayan completando las reacciones de modificacióncatalizadas por las enzimas auxiliares.

La amplificación hace referencia a la concentraciónmínima de efector que puede actuar. Hay que tener encuenta que, de ordinario, las enzimas se encuentran aconcentración bastante más baja que la de sus sus-tratos. Pues bien, las enzimas auxiliares tienen comosustrato a otra enzima, por lo que su concentraciónpuede ser bajísima. Y si la cascada tiene varios ciclos,la primera enzima auxiliar puede tener una concen-tración, por ejemplo, del orden de 10-14-10-15 M. Enestas condiciones, no es raro encontrar efectorescapaces de actuar a concentración de 10-11-10-12 M.Se dice que hay entonces una gran amplificación,

→


Tabla II. Comparación de algunas propiedades del alosterismo y de la modificación covalente.

porque una concentración mínima de efector puedetener una consecuencia importante. Esto sería impen-sable en una regulación alostérica.

El concepto de sensibilidad, aunque parezca asimple vista semejante al de amplificación, es distinto.Se refiere al cambio en la concentración de efector quese requiere para lograr un determinado cambio en laactividad de la enzima final. Casi siempre, se mide lavariación de concentración de efector necesaria paraaumentar la actividad de la enzima final del 10 al 90%(si se trata de una activación) o del 90 al 10% (si setrata de una inhibición). En la regulación alostérica, enel mejor de los casos, para lograr ese cambio hay quemultiplicar por 5 o 6 la concentración de efector,mientras que en la regulación por modificación cova-lente puede bastar multiplicar la concentración deefector por un factor menor que 1,1.

Así pues, en los organismos vivos coexisten ambostipos de regulación. El alosterismo se prefiere cuandose necesita una respuesta rápida y no se requiera granamplificación ni sensibilidad. Pero en los casos con-trarios, se prefiere la regulación por modificacióncovalente, aunque eso implique una mayor comple-jidad del sistema. En muchas enzimas, además, sepueden dar simultáneamente ambos tipos de regu-lación, apareciendo lo que Sols denominó multimodu-lación enzimática (16). Un ejemplo bien documentadoen el que interviene la multimodulación es el delmetabolismo del glucógeno. La figura 12 muestra elcomplejo proceso de la regulación de la glucógeno fos-forilasa, la enzima que cataliza la degradación delglucógeno. Sin necesidad de entrar en detalles —quese han expuesto en otro lugar (17)—, se puede decirsimplemente que la actividad de esta enzima, sujeta amodificación por fosforilación, depende en últimotérmino de la actuación de una hormona, que actúacomo efector inicial. Se trata, pues, de un proceso en elque una señal hormonal se convierte, en últimotérmino, en una señal catalítica. Con toda propiedad,se puede, por tanto hablar de una transducciónmediante la cual un tipo de señal se convierte en otrodistinto. En esa cascada de transducción interviene elreceptor hormonal y proteínas G, la proteína quinasa A,la glucógeno fosforilasa quinasa, las correspondientesproteína fosfatasas y, además, inhibidores de las fosfa-tasas que, a su vez, pueden modificar su actividad porfosforilación. Es evidente que el entramado de la regu-lación posee una elevada complejidad que permiteafinar hasta lo indecible el control de la actividad enzi-mática.

¿CÓMO PODEMOS APROVECHAR LASPROPIEDADES DE LAS ENZIMAS?

Ahora estamos en condiciones de plantear el ¿paraqué sirven? del título. Una vez que hemos pasadorevista a las propiedades más sobresalientes de lasenzimas —aunque por razones de brevedad haya sidonecesario pasar como de puntillas por la mayoría deellas—, estamos en condiciones de comprender lasposibilidades de su aprovechamiento práctico.

En primer lugar, nuestra atención se concentrasobre la especificidad de sustrato. Ningún reactivoquímico posee una especificidad comparable a la de


Figura 12. Cascadas de regulación de la actividad de laglucógeno fosforilasa. Se recogen las etapas esenciales de laregulación de la actividad de la glucógeno fosforilasa muscu-lar en respuesta a la descarga de adrenalina. Para mayor sen-cillez, se han omitido algunos pasos, como la participación delas proteínas G. Las enzimas se representan en rojo, mientrasque aparecen en negro las proteínas reguladoras no enzimáti-cas. Se emplea la convención de representar como rectánguloslas formas activas de las enzimas o proteínas reguladoras ycomo elipses las inactivas. En el caso de enzimas, la forma acti-va se representa junto a la flecha que indica la reacción catali-zada.

las enzimas que, como se ha visto, se basa en unaexquisita organización del centro activo. Esta especifi-cidad es un atractivo desde el punto de vista analítico,ya que permite determinar cualitativa y cuantitativa-mente un analito en mezclas complejas, sin necesidadde separación previa. Hay que tener en cuenta que paraseguir fácilmente el curso de la reacción, es conve-niente que en la misma se produzca un cambio en laspropiedades físicas —ordinariamente absorbancia ofluorescencia—de los sustratos o productos quepermita la determinación cuantitativa del progreso dela reacción. Cuando esto no ocurre, de ordinario serecurre a una reacción enzimática acoplada. En estecontexto, una reacción acoplada es la que utiliza comosustrato uno de los productos de la primera y que, a suvez, conduce a un producto de fácil detección. Sonmuy numerosas las posibilidades de empleo de reac-ciones acopladas, por lo que actualmente es posible lautilización de ensayos enzimáticos para la determi-nación de una amplísima variedad de analitos deinterés químico, clínico o industrial.

Cuando se trata de llevar a cabo determinacionescuantitativas —la situación más frecuente—, sepueden utilizar dos tipos de métodos: el del punto finaly los cinéticos. El primero, posible si la reacción prin-cipal y, en su caso, las acopladas, pueden transcurrir demodo prácticamente irreversible, consiste en dejar pro-gresar las reacciones hasta su finalización. La determi-nación cuantitativa del producto valorable permite —através del conocimiento de la estequiometría de todaslas reacciones— evaluar la concentración del analitoproblema. El fundamento del los métodos cinéticosrequiere una explicación previa. En la ecuación deMichaelis-Menten [1], si se multiplica numerador ydenominador por [S]/Km, se llega a:

Cuando la concentración de sustrato es muy pequeñacomparada con la constante de Michaelis, el término[S]/Km es despreciable frente a la unidad en el denom-inador y la ecuación [4] queda entonces como:

que corresponde a una ecuación de primer orden. Lavelocidad en esas condiciones es directamente propor-

cional a la concentración de sustrato, lo que permite,tras la calibración correspondiente con concentra-ciones conocidas de sustrato, la determinación cuanti-tativa de ese sustrato en muestras problema. Hay queinsistir en que este método implica la validez de laecuación [5], que sólo ocurre cuando [S]/Km<<1. Espues, necesario, conocer previamente no sólo Km—cosa que no entraña ninguna dificultad— sinotambién tener una idea aproximada del intervalo deconcentración en que se va a encontrar el analito en elproblema. Pero aún en el caso en que esa concen-tración sea demasiado grande para suponer que[S]/Km<<1, el método puede seguirse empleando si setrabaja en presencia de un inhibidor competitivo de lareacción, ya que estos inhibidores tienen como efectola elevación de la constante de Michaelis.

La utilización práctica de las enzimas supera concreces su empleo analítico. Su especificidad y suenorme eficacia catalítica han atraído la atención desdehace mucho tiempo con el fin de emplearlas comocatalizadores en reacciones de interés industrial. Dehecho, se emplean profusamente en la industria farma-céutica, en la alimentaria, etc. Pero el factor econó-mico puede ser, evidentemente, decisivo a la hora deprogramar un proceso industrial y, desde esa pers-pectiva, las enzimas presentan varios inconvenientes.En primer lugar, su costo elevado frente al de los cata-lizadores convencionales. Por otra parte, las enzimasson inestables a altas temperaturas, a valores extremosde pH, etc., lo que eleva el costo al reducir la vida útilde la enzima. Finalmente, al realizarse la catálisis endisolución acuosa, se presenta la dificultad de recu-perar la enzima después de la reacción, lo que puedereducir su uso a una sola operación.

Por otro lado, dejando aparte los problemas econó-micos, existen muchas reacciones químicas de interésindustrial para las que no hay enzimas, ya que partende sustratos que no son naturales, y hay también reac-ciones de interés industrial cuyos sustratos son escasa-mente soluble en agua, el medio en que se llevan acabo las reacciones enzimáticas en los organismos. Latecnología de enzimas, una rama emergente de laEnzimología, intenta superar todas esas dificultades.

La inmovilización de enzimas es un método bienconocido, que en muchos casos da excelentes resul-


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[5]

tados9. Se trata que la enzima quede retenida por unamatriz sólida, lo que permite recuperarla al término dela operación. La enzima se puede así reutilizar. Hayvarios tipos de inmovilización: por adsorción sobresoportes adecuados (por ejemplo, perlas de vidrio), porunión covalente a polímeros naturales o artificiales opor encapsulación en una matriz que permita el accesoa sustratos y productos e impida la salida de la enzima.En cualquier caso, hay que evitar que la inmovi-lización impida la aproximación de los sustratos alcentro activo. Cuando se emplea la unión covalente,suelen usarse reactivos bifuncionales, que se unen porun extremo a la enzima y por otro al polímero, de lon-gitud de cadena suficientemente larga, para que laenzima quede a distancia del polímero. La inmovi-lización tiene la ventaja adicional de que aumenta laestabilidad de la enzima. El dispositivo esquematizadoen la figura 13 representa un caso particular de inmovi-lización por encapsulación, que permite una operacióncontinua. La enzima se sitúa en este caso, en el interiorde fibras, ordinariamente capilares para aumentar susuperficie total, formadas por membranas permeablesa los sustratos y productos pero no a la enzima. Si porel espacio exterior a esos tubos se hace fluir una diso-lución de los sustratos, éstos pueden penetrar al lugarocupado por la enzima y, allí, convertirse en los pro-ductos, que difundirán hacia el exterior de los tubos. Sila relación entre la velocidad del flujo y la longitud deldispositivo se ajusta convenientemente, se puede con-seguir que los que a la entrada era una disolución desustrato lo sea a la salida de producto. Este es el funda-mento de los reactores enzimáticos, que se empleantanto en procesos industriales como para las finali-dades analíticas a las que se ha aludido antes.

La inmovilización de enzimas constituye una meto-dología clásica para su utilización práctica y, como tal,viene utilizándose desde hace bastante tiempo. Otraposibilidad, si bien menos utilizada en general, es eluso de enzimas en disolventes no acuosos (19). Esposible preparar las enzimas para que al exponerlas aesos disolventes mantengan la estructura nativa y, portanto, su actividad. El empleo de disolventes orgá-nicos, además de la obvia ventaja de que puedenemplearse enzimas como catalizadores de reaccionesque transcurren en medios no acuosos, presenta otra

peculiaridad. Hay muchas reacciones, como porejemplo las de hidrólisis a las que se aludía al prin-cipio, que en medio acuoso son irreversibles. Real-mente, en estas reacciones el agua actúa como reactivonucleófilo y si la reacción transcurre en medio acuoso,la elevada concentración de agua (55,5 M), junto conel valor de ∆Gº<0 propio de toda reacción hidrolítica,hace que el valor actual de ∆G sea tan negativo que lareacción se dirige indefectiblemente en el sentido dehidrólisis. Pero en medios anhidros, sólo queda el aguaestructural de la enzima; la concentración de esereactivo es ahora muy pequeña y la reacción puedeproducirse en el sentido de síntesis más que en el dehidrólisis, si existe un nucleófilo adecuado. De estamanera, se han podido utilizar, por ejemplo, lipasaspara sintetizar triacilgliceroles. La reacción transcurre,pues, justo en el sentido contrario al habitual. Hay querecalcar que este comportamiento no constituye unatransgresión a los principios termodinámicos: simple-mente es una consecuencia de realizar la reacción enunas condiciones en las que la concentración de aguaes varios órdenes de magnitud inferior a la habitual.

Pero, la mayor potencialidad de modificar lasenzimas para emplearlas con eficacia en procesosindustriales y —al mismo tiempo— las grandes espe-ranzas cara al futuro vienen proporcionadas por laposibilidad de alterar la secuencia de las enzimasmediante técnicas proporcionadas por la BiologíaMolecular. La creciente facilidad para provocarmutagénesis dirigida, de modo que se altere a voluntadla secuencia de las enzimas, así como el perfec-cionamiento de todas las técnicas requeridas para laproducción de proteínas recombinantes a gran escala,ha dado lugar al nacimiento de la denominada inge-


9 El artículo de Cao (18) contiene una útil revisión sobre inmovilización de enzimas.

Figura 13. Esquema de un reactor enzimático. Las fibras semi-permeables que contienen la enzima se representan en rojo.Véase el texto para los detalles de funcionamiento.

niería de enzimas. La mutagénesis dirigida se puedeemplear, por ejemplo, para aumentar la estabilidadtérmica de las enzimas. Para realizar la mutagénesissobre una base racional, es útil el conocimiento de losmecanismos de desnaturalización térmica, la termodi-námica y cinética del plegamiento10. También ayuda eldisponer de datos comparativos con enzimas de orga-nismos termófilos. Pero también se puede emplearmutagénesis con el fin de aumentar la estabilidad delas enzimas frente al pH, o bien para modificar su pHóptimo de acción. Normalmente se lleva a cabo cam-biando aminoácidos por otros similares con pKdiferente.

En los dos casos que se acaban de mencionar se hanobtenido avances interesantes, y las aplicaciones sonya en muchos casos una realidad (ver, por ejemplo, ref.20). Pero también caben otras opciones, que permitensoñar a los investigadores en posibilidades que hastahace poco parecerían ciencia ficción y que la inge-niería de enzimas puede convertir en algo alcanzable.Por ejemplo, es posible cambiar la especificidad deuna enzima, de modo que pueda aceptar algunos sus-tratos diferentes del natural. Los resultados obtenidosen esta línea son tangibles a nivel académico desdehace tiempo. Por ejemplo, hace ya dos décadas que sedemostró que es posible con una simple mutación,concretamente cambiando la glutamina 102 por unaarginina, convertir la lactato deshidrogenasa en malatodeshidrogenasa (21). Pero aún no se han obtenido enesta línea resultados utilizables con finalidad aplicada.Lo mismo puede decirse de la posibilidad de mejorarlos parámetros cinéticos de una enzima.

Recoger todas las líneas de actuación en el campode la tecnología de enzimas habría sido una tareatediosa y de dudosa utilidad en el presente contexto.Sirvan los anteriores ejemplos como muestra de laenorme potencialidad que el conocimiento teóricosobre el funcionamiento de las enzimas tiene sobre susaplicaciones prácticas.

CONCLUSIONES

Las líneas precedentes han constituido, aunque deforma sucinta, un recorrido por el mundo de las

enzimas. Desde el primer contacto con ellas, hasurgido posiblemente el asombro ante la perfeccióncatalítica que poseen. Y, posiblemente, sea eseasombro el que ha permitido a tantos científicos aden-trarse en un conocimiento más y más profundo de laarquitectura y funcionamiento de esos catalizadores.Sólo desde la base de este profundo conocimiento estásiendo posible el inicio de una segunda edad de oro enla Enzimología: una edad en la que el hombre puedesoñar con aplicar las reacciones enzimáticas a tantosproblemas de la vida ordinaria sin que se le tache devisionario. Pero hay que reconocer honradamente queel haber iniciado un camino no significa que ya se hayarecorrido. Aún son necesarios muchos esfuerzos y,posiblemente tenga que pasar bastante tiempo, paraque todos esos sueños vayan cristalizando en reali-dades.

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10 Lo contrario también es cierto: hasta ahora, la mutagénesis ha servido más para esclarecer esos mecanismos.

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enzimas: quÉ son y para que sirven · introducir el concepto de catálisis. por seguir con la...

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