Efectos de Allium sativum aceite esencial como agente antimicrobiano para la película de plástico de envasado de alimentos

Suet-Yen Sung a, Lee Tin Sin a,*, Tiam-Ting Tee a, Soo-Tueen Bee a,*, A.R. Rahmat b

a Departamento de Ingeniería Química de la Facultad de Ingeniería y Ciencias, Universidad de Tunku Abdul Rahman, Jalan Genting Kelang, 53300 Setapak, Kuala Lumpur, Malasia b Departamento de Ingeniería de Polímeros de la Facultad de Ingeniería Química, Universidad Tecnológica de Malasia, 81.310 UTM Skudai, Johor, Malasia

RESUMENEsta investigación se centra en el desarrollo de los antimicrobianos en envases de plástico mediante máquina de extrusión sopladora de películas. Las películas de plástico incorporadas con 0, 2, 4, 6 y 8% de aceite de esencia de Allium sativum  (% w / w) se pusieron a prueba para las actividades AM frente a bacterias de carne relacionados a saber Listeria monocytogenes , Escherichia coli y Brochothrix thermosphacta . Las propiedades mecánicas, propiedades térmicas y la microestructura de las películas fueron investigados para justificar los efectos de la OEA sobre la funcionalidad física de la película. La zona de retroceso en el resultado de difusión en disco de agar muestra que low-density-polyethylene/ethylene-vinyl-acetate (LDPE / EVA) película de copolímero con 8% de OEA reducir significativamente la concentración de bacterias con resistencia a la inhibición de L. monocytogenes > B. thermosphacta > E. coli. Para la prueba de desafío, las películas veo reducido suficientemente la velocidad de crecimiento de L. monocytogenes en carne cocida a 4 ° C. Alta cantidad de AEO debilita ligeramente las propiedades mecánicas mediante el cual se incrementa significativamente cuando cristalinidad película pequeña cantidad de AEO Incorporated.

Relevancia IndustrialLa actual innovación se aplica para la industria de la carne donde se requiere un almacenamiento prolongado de la carne.  El extracto de A. sativum  es un aceite esencial natural que no causa riesgo para la salud cuando está en contacto con la comida cuando se aplica en el envase.

Palabras clave: Antimicrobianos; Allium sativum; Envases activos; Listeria monocytogenes

1. IntroducciónSe sabe comúnmente que el deterioro de los alimentos es causado principalmente por la contaminación microbiana. La mayoría de los métodos de conservación de alimentos tales como la fermentación, el secado, el tratamiento térmico, la congelación, refrigeración y atmósfera modificada son eficaces pero que tienen su propia limitación especialmente cuando se aplica a la carne fresca que requiere cambios mínimos de textura ( Quintavalla y Vicini, 2002 ). Dado que la contaminación microbiana siempre se produce principalmente en la superficie de los alimentos, muchos estudios sugirieron la adición de (AM) agentes antimicrobianos en las superficies de los alimentos para suprimir el crecimiento de microorganismos y prolongar su vida útil.  Sin embargo, la aplicación directa de agentes de AM en los alimentos no es eficaz para inhibir microorganismos debido a la rápida difusión del agente de AM en el alimento y la desnaturalización de las sustancias activas constituyentes del alimento. Con el fin de mantener la calidad de la carne, se ha desarrollado una variedad de sistemas alternativos de envasado para conservar los alimentos, así como garantizar su

seguridad. De hecho, el último desarrollo de envases de alimentos se trata de la utilización de películas especiales que contienen ingredientes bioactivos para suprimir la reactividad de los agentes degradantes ( Gutiérrez, Sánchez, Batlle, y Nerín, 2009 ). En este contexto, los agentes AM suelen añadirse como agente activo en el envase ( Rodríguez, Sepúlveda, Bruna, Guarda, y Galotto, 2012 ).  La película antimicrobiana se define como el embalaje que contiene el agente AM donde este agente se podría incrustar dentro de las cadenas de polímeros, ofreciendo una migración lenta y continua para formar la capa antimicrobiana en la superficie del alimento. En otras palabras, el agente de AM podría mantener en alta concentración durante un largo tiempo de aplicación ( Quintavalla y Vicini, 2002 ).

En general, existen varios componentes químicos de origen vegetal que poseen efectos antimicrobianos incluyendo a saponina y flavonoides, tiosulfinatos, glucosinolatos y saponinas. Las especias como el comino, la canela y el clavo mostraron los mayores efectos en contra de bacterias tales como Escherichia coli,  Enterococcus faecalis ,  Mycobacterium smegmatis ,  Staphylococcus aureus ,Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa , Micrococcus luteus , y Candida albicans mediante el método de disco-difusión ( Agaoglu, Dostbil, y Alemdar, 2007 ). Además, Pattaratanawadee, Thongson, Mahakarnchanakul y Wanchaitanawong (2006) concluyeron que extractos de Zingiber officinale , Alpinia galanga ,Curcuma longa , y Pandurata Boesenbergia  puede luchar contra las bacterias patógenas Gram-positivas y Gram-negativas, especialmente en el rango de 0,2-0,4% v / v y 8-10% v / v, respectivamente ( Pattaratanawadee et al., 2006 ). En general los aceites esenciales que se componen principalmente de terpenos y sesquiterpenos con diferentes grupos de hidrocarburos alifáticos, ácidos, alcoholes, aldehídos, ésteres acíclicos o cetonas también poseen los efectos AM ( Fisher & Phillips, 2006 ). Por ejemplo, Sudjana et al. (2009) encontraron que las hojas de olivo (Olea europaea) mostraron efectos AM contra Campylobacter jejuni , Helicobacter pylori y S. aureus .Rahman y Kang (2009) han demostrado que el extracto de hoja de etanol de Lonicera japonica Thunb tiene efectos en contra de algunos agentes patógenos transmitidos por los alimentos. 

En este estudio se utilizó aceite esencial de, Allium sativum  como el agente AM que se añade en la película de envasado. A. sativum o comúnmente conocido como el ajo es bien reconocido por su funcionalidad antibacteriana, para complementar los nutrientes de la humanidad. Se trata de compuestos naturales y complejos formados normalmente por las plantas aromáticas como metabolitos secundarios. Benefician a los seres humanos debido a las propiedades de anti-bacteriano, antifungico y antioxidante aumentando la inmunidad del cuerpo ( Bakkali, Averbeck, Averbeck, y Idaomar, 2008 ). Las propiedades AM de ajo fueron estudiados por primera vez en el año 1844. Un tiempo después, Cavallito, Bailey, y Buck (1944) encontraron que los sulfuros de alilo son el principal constituyente del ajo machacado y la alicina es responsable de las actividades antibacterianas. Se ha informado de otros beneficios de AM de ajo como reducir los lípidos en sangre, modulación cardiovascular, mejora de las funciones inmunes, y que tiene propiedades antioxidantes y anticancerígenas. Hasta la fecha, hay pocos trabajos publicados sobre la utilización de aceite esencial de ajo como agente AM en el sistema de envasado de alimentos.  La mayoría de los estudios se centraron en la película comestible, y hasta donde sabemos, investigaciones realizadas sobre aceite esencial de ajo incorporado a las películas de plástico producido mediante la técnica de extrusión de película soplada faltan. 

La razón puede ser debido a la alicina que es muy inestable y se descompone fácilmente a alta temperatura de procesamiento y la presión. Sin embargo, las actividades de AM no puede pérdida desde la alicina tiende a transformar a sulfuro de dialilo (DAS), disulfuro de dialilo (DAD), trisulfuro de dialilo (DAT) y ajoeno, que es relativamente más estable a alta temperatura. Estos compuestos también poseen efecto AM comparables con alicina ( Corzo-Martínez et al., 2007  y  Tansey y Appleton, 1975 ). En general, este estudio se centra en la eficacia del aceite esencial de ajo incorporado a las películas plásticas para inhibir bacterias patógenas relacionadas a la descomposición de carne de res y su descomposición in vitro. Se evaluaron las propiedades mecánicas y térmicas de películas para determinar la compatibilidad entre la OEA y el compuesto de polietileno.

2. Experimental

2.1. MaterialesMateria prima para la producción de películas, de baja densidad de polietileno (LDPE), fue adquirido de Titan petroquímicos (M) Sdn. Bhd, Malasia. De etileno-vinil-acetato (EVA) copolímero con el grado de UE629 (10% de contenido de acetato de vinilo) fue suministrado por USI Corporation, Taiwán. EVA se añadió con LDPE como compatibilizante de desodorizado A. sativum aceite de esencia (OEA) y la matriz de LDPE. Por otro lado, el medio de cultivo, a saber, Triptona Soja (agar, CM0131B y el caldo, CM0129B) y solución salina de peptona en polvo (CM0733B), se adquirió de Microbiología Oxoid, Reino Unido. El agente de AM, es decir, desodorizado A. sativum aceite esencial se obtuvo de Xiamen Forever Green Tech Fuente Biochem.Co., Ltd., China.

2.2. Preparación de la película a los antimicrobianosLas películas de plástico AM se prepararon a partir de pre-mezclado 90% de baja densidad de polietileno (LDPE) de pellets y 10% de etileno-acetato de vinilo (EVA) polvo de copolímero. EVA copolímero de pellets se basaba en polvo mediante el uso de la amoladora molino de bolas, a continuación, mezclado con AEO (0, 2, 4, 6, 8% w / w, respectivamente) a fondo en la secadora de tambor y continuó con la adición de sedimento de LDPE. La mezcla madre fue fabricado en películas por soplado máquina de extrusión de película (Tai King Machinery, Taiwan). La temperatura en la extrusora se fijó a 170 ° C en todas las zonas de calentamiento.

2.3. Los cultivos bacterianosLos cultivos bacterianos utilizados en este estudio fueron los contaminantes de carne típicos incluyendo bacterias Gram-negativas, E. coli (ATCC 10536) y Gram-positivas bacterias, Listeria monocytogenes (ATCC 13932) y Brochothrix thermosphacta (ATCC 11509). L. monocytogenes y E. coli son bacterias patógenas y B. thermosphacta es bacterias de descomposición de carne. Ellos fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC), EE.UU. Los cultivos de bacterias se mantuvieron de acuerdo con los pasos que se describen en el manual obtenido del proveedor. Para cesar las actividades de bacterias, las cepas de bacterias se almacenaron a - 80 ° C en caldo de soja triptona (TSB) que contenía 20% de glicerol. Para propósito experimento, las bacterias se subcultivaron regularmente en triptona de soja agar (TSA) y se almacenaron a 4 ° C. En la preparación para la prueba antibacteriana, una colonia de

bacterias se transfirió de TSA en 50 ml de caldo de soja triptona (TSB) y se incubó en agitador incubadora 37 ° C, 200 rpm durante 18 h. La dilución en serie se realizó para obtener la concentración requerida de bacterias.

2.4. Difusión en disco AgarLas actividades de AM se realizaron mediante la prueba de difusión en agar.  Las películas de plástico se cortaron en discos de diámetro 26 mm y se colocan en placas de TSA con aproximadamente 10 6  ufc / ml de bacterias probadas. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 ° C durante L. monocytogenes y E. coli , y 25 ° C para B. thermosphacta . Después de 24 h, se observó el crecimiento de las bacterias circundantes y por debajo de la película y se midió el área de la zona de inhibidor / retracción. La prueba se realizó por triplicado.

2.5. Prueba de provocación a la carne cocidaCon el fin de comprobar la veracidad de la actividad AM de las películas en una situación más real, las películas se han probado en carne cocida. La carne cocida se corta en un tamaño más pequeño que pesa 5 g por pieza y se expone a la luz UV durante 15 minutos antes de la prueba en. Las carnes se inocularon a continuación con 0,1 ml de E. coli , L. monocytogenes y B. thermosphacta respectivamente con concentración de 10 6 -10 7  UFC / ml. Los inóculos distribuidos uniformemente para obtener la concentración de bacterias en alrededor de 10 5  ufc / g. A continuación, la carne estaba bien envuelta con películas de plástico que contenían 0, 2, 4, 6 y 8% w / w de AEO, respectivamente y se almacena inmediatamente a 4 ° C durante 15 días como temperatura normal de venta al consumidor ( Torstveit y Magnussen, 1998 ). Los números de recuentos de bacterias se examinaron inmediatamente después de la inoculación y periódicamente después de 3, 6, 9 y 15 días de la inoculación mediante el método de dilución en serie. En los días de muestreo, dos paquetes para cada formulación se abrieron y las bacterias se extraen por 50 ml de solución salina de agua de peptona con homogeneizador (BagMixer).  0,1 ml de homogeneizado fue pipeta en el tubo de centrífuga y se diluyó en serie con 0,9 ml de solución salina de agua de peptona. 0,1 ml de cada homogenado diluido se transfirió a continuación sobre la placa de TSA y se incubaron a 37 ° C ( de E. coli y L. monocytogenes ) o 25 ° C ( B. thermosphacta ) en la cámara de la incubadora. Después de 24 h, se calculó el número de colonias formadas y se expresó como ufc / g.

2.6. Ensayo de tracciónLas propiedades de tracción de las películas de plástico se determinaron según la norma ASTM D882-10mediante el uso de ensayos universales máquina Instron 5567. Antes de la prueba, la película se acondicionó a temperatura ambiente durante 48 h. Cada película con diferentes formulaciones se redujo a la dirección de la máquina (MD) durante cinco hojas con dimensión de 100 mm de longitud y 12,7 mm de ancho. El espécimen se colocó en garras de la máquina con distancia de agarre inicial de 50 mm y la velocidad de separación de agarre utilizado fue de 500 mm / min.

2.7. Calorimetría de barrido diferencial (DSC)El comportamiento de fusión de películas de plástico se determinó mediante el uso de Mettler Toledo DSC823 DSC de acuerdo con ASTM D3418-08 . Las muestras se cortaron en aproximadamente 5 mg y sellados por bandeja de aluminio. Otro recipiente vacío se utilizó como

referencia. La máquina de DSC se establece en un calentamiento constante y velocidad de enfriamiento de 10 ° C / min bajo atmósfera de nitrógeno para evitar la degradación térmica durante la prueba. El rango de temperatura utilizado fue de 50 a 250 ° C. El grado de cristalinidad del endodermo de fusión se calculó de acuerdo a la ecuación.  (1) .

x % = 100 x ( ΔHm/WΔHmo) (1)

Donde Δ H m (J / g) es el calor latente de fusión, W es la fracción en peso de polímero en la muestra, y ΔH m O es el calor latente de fusión teórico de 100% de polietileno cristalino, 293 J / g ( Suppakul , Miltz, Sonneveld, y más grande, 2006 ).

2.8. Fuerza de la propagación del desgarroFuerza de la propagación del desgarro de las películas de plástico se determinó según  la norma ASTM D1938-08 mediante el uso de máquina de prueba universal (UTM) Instron 5567. Antes de la prueba, las películas se acondicionaron a temperatura ambiente durante 48 h.  Cada una de las muestras de película se cortó a cinco hojas de pantalones en la dirección de la máquina (MD) de acuerdo a la dimensión especificada en la norma ASTM. El espesor de las muestras se midió en tres puntos y promedió. A continuación, la muestra se coloca en garras de la máquina con distancia de agarre inicial de 50 mm y la velocidad de separación de agarre utilizado fue de 250 mm / min. La fuerza media propagación del desgarro se calcula promediando la carga en el intervalo de 25,4 mm.

2.9. Microestructura de CineLa superficie y la sección transversal de las películas se ensayaron en Hitachi VP-SEM S-3400N para obtener los gráficos de la microestructura. Las películas se cortan en trozos pequeños con el fin de ser montado en muestras talones con cinta adhesiva de doble cara. SC7620 Mini Sputter Coater se utilizó para recubrir las muestras con una capa de oro (Au) y el paladio (Pd).  Entonces, la imagen se observó bajo microscopio de barrido de electrones (SEM) usando un voltaje de aceleración de 15 kV con una distancia de trabajo de 5,7 mm. Para sección transversal de observación, las muestras se alargaron previamente y se fracturó durante la prueba de resistencia a la tracción.

3. Resultados y discusión

3.1. Difusión en disco AgarPara la aplicación en los alimentos, las propiedades organolépticas de los envases son importantes con el fin de que sea aceptable entre el público. Desde AEO utilizado en este estudio es inodoro, no tiene ningún olor penetrante desagradable significativa en todos los niveles de la OEA agregó. Las películas comenzaron a se convirtió ligeramente aceitoso cuando se incorpora 6% w / w de OEA.

Según Ross, O'gara, Colina, Sleightholme y Maslin (2001) , la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la OEA variar ampliamente entre las diferentes especies y sobre todo dentro de un rango de 10 veces la concentración de OEA para diferentes cepas de la misma especie.  CIMs requeridos para evitar el crecimiento de E. coli y L. monocytogenes especies fueron

aproximadamente 0,68 mg / ml y 0,02 mg / ml, respectivamente. La concentración de OEA utilizado en este estudio es que van de 16,91 mg / ml a 67,64 mg / ml.  Una concentración tan elevada se utilizó debido a la evaporación de los componentes activos puede ser muy alta según lo informado por Marino, Alfonso, Mercedes, y María (2012) que, sólo 25-44% de peso de timol y carvacrol se mantuvo en la película de polipropileno cuando se someten a la temperatura 190 ° C durante 18 min durante el proceso de prensado en caliente.

El efecto AM de películas de LDPE / EVA incorporadas-OEA se estudió mediante la prueba de difusión en disco de agar Tabla 1 muestra las actividades antibacterianas de películas contra bacterias Gram-positivas:L. monocytogenes , B. thermosphacta ; y bacterias Gram-negativos: E. coli. Las bacterias seleccionadas para la prueba fueron las bacterias patógenas y de descomposición relacionadas con los productos de carne. Para todas las bacterias probadas, no tiene ni la inhibición ni zona de retracción formado por película de control, es decir, película sin AEO. Cuando se probó con 2-6% w / w de OEA-films, las zonas de inhibición no fueron evidentes. En lugar de ello, se observó una zona de retirada clara formada debajo de las películas. Para B. thermosphacta y E. coli , concentraciones crecientes de OEA del 2 al 6% w / w de no ampliar el área de la zona de retracción. Sin embargo, una zona de retracción mucho más grande formado cuando se prueba con 8% w / w de AEO-películas ( Tabla 2 ). Esto indica que 8% w / w de OEA es la dosis eficaz para reducir el crecimiento de las bacterias mencionadas. Para L. monocytogenes, 6% w / w de OEA era eficaz para producir una zona de retracción grande.

Tabla 1.Superficie de zonas de retracción ⁎ producido por diferentes porcentajes de AEO-que contienen LDPE / películas de EVA observados por el método de difusión en agar.

OEA (% w / w)

Zona de retirada (cm 2 )

L. monocytogenesB.

thermosphactaE. coli

0 0.00 0.00 0.00

2 5,31 ± 0,00 7,08 ± 0,92 5,31 ± 0,00

4 5,31 ± 0,00 7,56 ± 0,07 5,31 ± 0,00

6 10,22 ± 0,87 8,07 ± 0,58 7,55 ± 1,31

8 12.51 ± 0.60 9,63 ± 0,18 9,02 ± 1,76

Zona de retroceso: una disminución visible de la densidad microbiana en la placa de Petri.

Tabla 2. Efecto antimicrobiano de LDPE / EVA con 0 y 8% w / w de OEA contra (a) L. monocytogenes , (b) B. thermosphacta , y (c) E. coli .

Aunque la dosificación eficaz en este estudio es mucho mayor en comparación con otras investigaciones, se espera ya que las películas se producen por la máquina de extrusión de película soplada convencional a alta temperatura (170 ° C). La mayoría de los agentes extractos-AM de plantas son muy sensibles a la película condiciones de proceso de producción. Bajo la presión de procesamiento de alta y la temperatura, la deformación o la evaporación de AM se puede pasar ( Jari, Skytta, Enqvist, y Ahvenainen-Rantala, 2003 ).Según Kamel y Saleh (2000) , el componente activo de AM OEA, alicina, es altamente inestable y tiende a degradarse para producir principalmente ajoenes y trisulfuro de dialilo (DAT) cuando se somete a elevar la temperatura. Sin embargo, se cree que la mayoría de la DAT se evapora durante el período de procesamiento. Por lo tanto, ajoeno es el compuesto principal responsable de las propiedades antimicrobianas de la película de plástico. La cantidad de alicina retenido depende de la temperatura. La vida media de alicina se reduce a la de un orden de magnitud por cada 10 ° C de aumento de temperatura. Cuando se somete a 42 ° C, la vida media es de aproximadamente 17 h ( Fujisawa, Suma, Origuchi, Seki, y Ariga, 2008 ). Por lo tanto, no se espera alicina disponible después transformada en película de plástico a 170 ° C. Una vez expuesto a alta temperatura, alicina tiende a degradarse y hacer participar en la unión entre las moléculas de alicina para formar macromolécula, conocido como ajoeno, que es 3 veces más grande que la alicina.  Sin embargo, se cree que el ajoeno componente restante, que es una más estables sulfuros de alilo

liposolubles para devastar una amplia gama de microbios ( Banerjee et al., 2003  y  Corzo-Martínez et al., 2007 ). La mayoría del tiempo, ajoeno es bacteriostática en vez de bactericida ( Fujisawa et al., 2008 ).Previene el crecimiento de bacterias, mientras que no necesariamente matarlos. Tras la eliminación de los sulfuros, las bacterias suelen comenzar a crecer de nuevo. En la alicina, la estructura tiosulfinato (RS (O)SR ') se piensa que es responsable de la actividad antibacteriana mediante la inhibición de grupo sulfhidrilo ( SH)-que contiene enzimas en microorganismos. Ajoene también contiene S Grupo O que creía casi tan activa como la alicina. Sin embargo, debido a la evaporación y la degradación de la alicina, se necesita una concentración mucho mayor de OEA para prevenir el crecimiento de bacterias. Antes de la fabricación de película de plástico, las cantidades mínimas de OEA obligados a evitar el crecimiento de E. coli y L.monocytogenes son alrededor de 0,68 mg / ml y 0,02 mg / ml, respectivamente (Ross, O'gara, Colina, Sleightholme y Maslin, 2000). Después de proceso de fabricación de la película, la cantidad es mucho mayor que es 67,65 mg /ml (8% w/w) y 50,73 mg/ml (6% w/w) para E. coli y L. monocytogenes, respectivamente. Considerando que, cuando la temperatura de procesamiento de la película es insignificante como el enfoque de fundición solución en la preparación de la película AM, menor cantidad de agente de AM podría exhibir una zona de inhibición claras. Por ejemplo, la proteína de suero de leche comestible aislado (WPI) película AM producido bajo temperatura máxima de 90 ± 2 ° C inhibe significativamente el crecimiento de bacterias, incluyendo L. monocytogenes y E. coli O157: H7, cuando se incorpora 3-4% de OEA en peso / volumen ( Seydim y Sarikus, 2006 ).

Entre las bacterias ensayadas, L. monocytogenes es la bacteria más susceptibles con zona de retracción obvia de 10,22 ± 0,87 y 12,51 ± 0,60 cm 2 cuando se prueba por la película con 6% y 8% w / w de OEA respectivamente ( Tabla 1 ). Mientras tanto, B. thermosphacta y E. coli mostró zonas de retracción de 9,63 ± 0,18 y 9,02 ± 1,76 cm 2 , respectivamente, cuando se prueba con 8% w / w de AEO-película. Este resultado muestra que las bacterias Gram-negativas ( E. coli ) son más resistentes a la OEA comparar las bacterias a Gram-positivas ( L. monocytogenes y B. thermosphacta ). La capa adicional de membrana externa construida por lipopolisacárido y la proteína que presenta en bacterias Gram-negativas puede afectar la permeabilidad de compuestos inhibidores de OEA ( Perry et al., 2009  y  Ramos et al., 2012 ). Por lo tanto, la cantidad de AEO necesaria para inhibir las bacterias Gram-negativas es más alta que las bacterias Gram-positivas ( Gamage et al., 2009 , Pranoto et al., 2005  y  Seydim y Sarikus, 2006 ).

3.2. Prueba de provocación a la carne cocida

Figura. 1 , .Fig. 2  y  la fig. 3 muestran el comportamiento de crecimiento de  L. Monocytogenes, B.thermosphacta y E. coli , respectivamente, sobre contaminadas artificialmente la carne de vacuno cocinada que empaqueta en las películas con diferentes cantidades de OEA. Para las muestras con L.monocytogenes y B. thermosphacta, los patrones de curva de crecimiento de las bacterias son similares para todas cantidad de OEA, donde el número de bacterias aumentó rápidamente dentro de los días del experimento. Para muestras con E. coli , los recuentos de bacterias sólo aumentó ligeramente durante todo el período de almacenamiento. Esto es debido a que la temperatura óptima para el crecimiento de E. coliestá en el rango de 35-40 °

C. Sin embargo, E. coli generalmente sobrevive bien en la gama de 3-7 ° C dentro de 5 semanas de período de almacenamiento ( ICMSF, 1996 ).

Figura. 1. Los recuentos de L. monocytogenes en la carne cocinada envasado en película con diferentes cantidades de OEA y se almacenó a 4 ° C.

Figura. 2.  Los condes de B. thermosphacta en el sector de la carne cocinada envasado en película con diferentes cantidades de OEA y se almacenó a 4 ° C.

Figura. 3.  Los recuentos de E. coli en la carne cocinada envasado en película con diferentes cantidades de OEA y se almacenó a 4 ° C.

Para L. monocytogenes, entre las películas con diferentes cantidades de OEA, las bacterias crecen más rápidamente en las muestras de carne envasados en película de control. Básicamente, el crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases conocidas como fase de retardo, fase, fase estacionaria y fase de muerte log. Durante la fase de latencia, el número de bacterias se mantiene con el fin de adaptarse al entorno. En este experimento, ya que sólo hay un punto de datos tomado por cada tres días de almacenamiento, la fase de retardo no es observable. En lugar de ello, el número de bacterias aumenta exponencialmente desde el día 0 al día 6. Esta fase se conoce como la fase de registro. La pendiente de esta fase representa la tasa de crecimiento específico de las bacterias. Las bacterias crecen más rápidamente en la película de control con la tasa de crecimiento específico de 0,78 log ufc / g / día, siga por la película con 2, 4, 6 y 8% de OEA con tasas de crecimiento específico de 0,51, 0,49, 0,48 y 0,45 log ufc / g / día, respectivamente. Después de la fase de registro, el recuento de bacterias comenzaron a ser constante, donde la tasa de crecimiento es igual a la tasa de mortalidad.  Esta etapa se conoce como fase estacionaria, donde la curva de crecimiento se convierte en horizontal. Para película de control, las bacterias comenzaron a llegar a la fase estacionaria en el día 6 de almacenamiento. Sin embargo, para la película con OEA, bacterias comenzaron a llegar a esta fase después de 8 días de almacenamiento. El día 6 de almacenamiento, los condes de L. monocytogenes fueron 8,81 log ufc / g para la película de control y de 7,20, 7,09, 7,01, y

6,84 log ufc / g para películas con 2, 4, 6, y 8% w / w de AEO, respectivamente. Esto demuestra que los paquetes con AEO reprimir eficazmente el crecimiento de L. monocytogenes y el resultado es más prominente en la película con el 8% w / w de OEA. Los números de L. monocytogenes son 1,98 log ufc / g y 0,18 log ufc / g inferiores a los de película de control en el día 6 de almacenamiento y en el final del almacenamiento, respectivamente. La eficacia de los envases AM se atribuyó a el atrapamiento de agentes SOY dentro de cadenas de polímero que ofrecen la migración lenta y continua de los agentes de material de embalaje a las superficies de los alimentos ( Quintavalla y Vicini, 2002 ).

En el caso de B. thermosphacta , los condes de B. thermosphacta aumentar rápidamente hasta el día 6 de almacenamiento. Las tasas de crecimiento específicas en la fase de registro fueron 0,60, 0,58, 0,58, 0,56 y 0,57 log ufc / g / día, respectivamente, para las películas con 0, 2, 4, 6 y 8% w / w de OEA. Después de 6 días de almacenamiento, la tasa de crecimiento comenzó a cesar y entrar en fase estacionaria. Al final del almacenamiento, aunque el número de bacterias es menor para las muestras con los OEA, sin embargo se no considera eficaz ya que las diferencias en los recuentos entre película de control y AM películas eran bajos a <0,3 log ufc / g para todos los puntos de datos. Similar con L. monocytogenes, B. thermosphacta es bacterias Gram-positivas. B. thermosphacta es más resistencia al agente AM en comparación con L.monocytogenes.

Para las muestras con E. coli, no tiene ninguna fase de crecimiento evidente. Esto se debe a E. coli no está activo en estas condiciones de almacenamiento. Sólo puede sobrevivir sin un crecimiento activo. Sin embargo, el número de bacterias en la carne de vacuno envasada en películas que contienen OEA fueron sistemáticamente inferiores a los de la muestra de película de control. Sin embargo, la diferencia en el recuento entre el cine de control y AM películas fue baja a ≤ 0,2 log ufc / g para todos los puntos de datos. Por lo tanto, se concluye que la OEA-que contienen películas en este caso tienen efectos mínimos de la mañana del E. coli . Du et al. (2009) que desarrolló películas me halló también que las películas de tomate elaborado con aceite de ajo en el 0,5-3% w / w no fueron efectivos contra  E. coli  (bacterias Gram - negativas). Fueron sin embargo eficaz contra  L. monocytogenes (Bacterias Gram-positivas) en todas las concentraciones de ensayo de difusión en agar. Esto es debido a la alta resistencia de la capa de lipopolisacáridos en bacterias Gram-negativas hacia los compuestos de OEA ( Sivarooban, Hettiarachchy, y Johnson, 2008 ).

3.3. Ensayo de tracciónAditivos AM podrían cambiar las propiedades de la película y afectar negativamente el rendimiento de envasado. Fig. 4  y  fig. 5 muestran el efecto de diferentes concentraciones de OEA en la resistencia a la tracción (TS) y el alargamiento a la rotura (ε) de película de LDPE / EVA, respectivamente. En comparación con la película de control, TS de películas disminuyó gradualmente con la mayor cantidad de AEO incorporado. Cuando se incorpora con OEA en 2, 4, 6 y 8%, TS reduce gradualmente a 15,40, 14,88, 13,73 y 13,52 MPa, respectivamente, en comparación con el control de película de 16,96 MPa y sin la adición de OEA. Esto es razonable, porque los aditivos distintos de los agentes de reticulación pueden interrumpir la integridad de la película y la resultante de TS inferiores ( Cagri, Ustunol, y Ryser, 2001 ). Sin embargo, la matriz

de polietileno puede tolerar con pequeña cantidad de AEO existía. Esto indica que una pequeña cantidad de OEA tiene buena compatibilidad con la matriz polimérica. Los agentes de AM se pueden impregnar primero en la zona menos densa de la estructura polimérica - la región amorfa, sin interferencia significativa con la interacción polímero-polímero. En contraste, cuando se incorpora alto nivel de agente de AM, el espacio dentro de la región amorfa se llena y el agente AM comenzará a llenar la región cristalina e interferir con las interacciones polímero-polímero ( Han, 2005 ). Por lo tanto, la estructura cristalina se hizo más débil en mayor cantidad de OEA. Además, el nivel alto aditivos daría lugar a la aglomeración dentro de las cadenas de polímeros y ha contribuido a subrayar área de concentración que reduce aún más el TS.Bastarrachea, Dhawan y Sablani (2001) , que examinó las propiedades de ingeniería de las películas de AM, informó que incluso pequeñas cantidades de AM puede cambiar las propiedades de tracción cuando interactúan con la matriz del material de embalaje.  Se obtuvieron resultados similares por Pranoto et al.(2005) , Gamage et al. (2009) , Nostro et al. (2012) , y Solano y de Rojas Gante (2011) , que probó el polímero natural incorporado-AM y el polímero sintético.

Figura. 4. Resistencia a la tracción de LDPE / película de EVA incorporado con diferentes cantidades de OEA.

Figura. 5. Alargamiento a la rotura de la película de LDPE / EVA incorporado con diferentes cantidades de AEO.En las otras manos, la adición de OEA en 2% y 4% w / w de aumento de ε de 598,23% de película de control a 672,5% y 658,95% respectivamente. OEA con partículas de bajo peso molecular puede estar colocado por primera vez en el espacio proporcionado por la fase amorfa de la estructura del polímero ( Han, 2005 ) y actuando además como agente plastificante. Estas partículas tienden a reducir las fuerzas intermoleculares de las cadenas de polímero. Cuando se aplica con fuerza de tracción, cadenas de polímeros se deslizaron y pasan a través de unos a otros, lo que mejora la flexibilidad y la capacidad de estiramiento de la película (Nostro et al., 2012 ). Sin embargo, ε cae ligeramente en 6% w / w de AEO-película por el que se observó una caída significativa en 8% de OEA-película con valor ε de 407,21%. Este espectáculo que la alta cantidad de AEO debilitó enormemente la estructura de la película mediante la ocupación de los espacios entre las cadenas de polímeros. Esto reduce aún más las fuerzas intermoleculares de las cadenas de polímero y causó las cadenas no pueden celebrar entre sí cuando se produce el deslizamiento durante el dibujo externo. Por lo tanto, las películas se volvieron menos extensibles. Una tendencia similar se obtuvo Pranoto et al.(2005) . Aunque el aumento de cantidad de OEA ha reducido tanto TS y el valor ε de película de plástico, que todavía caen dentro de valor común de material de envasado de alimentos que se utiliza en comercial.  En este estudio, que se incorpora-AEO film LDPE / EVA tiene valor TS de 13,52 a 15,40 MPa y un valor ε de 407,21 a 672,50%, que está dentro del valor del material de embalaje utilizado más común - LDPE con valor TS de 7-25 MPa y valor ε de 300-900% ( Bastarrachea et al., 2001 ). Esto indica que las propiedades mecánicas de las películas AM todavía son aceptables para su aplicación.

3.4. Calorimetría de barrido diferencial (DSC)El efecto de la adición de diferentes concentraciones de OEA en las propiedades térmicas de películas de LDPE / EVA se estudió mediante el uso de la calorimetría diferencial de barrido (DSC). figura 6 muestra el termograma de DSC de las cinco formulaciones obtenidas durante el segundo proceso de calentamiento. El resultado de la primera de calentamiento que refleja la

historia térmica ha sido eliminado con el fin de resultado obtenido con mejor precisión. Independientemente de la cantidad de OEA añadió, sólo hay un pico endotérmico obtenido durante el proceso de calentamiento con temperatura de fusión se mantiene prácticamente sin cambios en alrededor de 92,7 a 93,7 ° C ( Tabla 3 ). Del mismo modo, Herath (2010) , que estudió en timol y carcacrol añadió películas LDPE / EVA también concluyeron que la adición de agente AM en películas de polímero no cambió las películas temperatura de fusión.

Figura. 6. Termogramas DSC de películas LDPE / EVA con diferentes porcentajes de AEO incorporados.

Tabla 3. La entalpía de fusión y la temperatura de fusión de las películas de LDPE / EVA con AEO incorporadas.

OEA (w / w%)

La entalpía de fusión (Δ H m )

Temperatura de fusión (° C)

0 39.0 92.7

2 63.3 93.3

4 55.8 93.7

6 54.3 93.7

8 49.4 92.8

Además, todas las películas de haber fusión transición endotérmica en la región de 86-96 ° C con diferentes áreas ( . Fig. 6 ). Entalpía de fusión representa la magnitud de la unión intermolecular entre las cadenas de polímero y con otros aditivos ( Tiam-Ting et al., 2013 ). Cuanto mayor es la entalpía, mayor será la cantidad de energía térmica necesaria para transformar en energía cinética con el fin de debilitar la unión y por lo tanto libre de las moléculas de polímero de estructura cristalina ordenada. Termograma de DSC mostró que la adición de OEA en 2% y 4% aumenta en gran medida la entalpía de fusión de 39,0 J / g de película de control de 63,3 J / g y 55,8 J / g, respectivamente ( Tabla 3 ). Entalpía de fusión reduce aún más a 49,4 J / g cuando la cantidad de

AEO añadió aumento de 8%. Esto demuestra que la OEA había inducido efecto pronunciado sobre la formación de la unión secundaria especialmente cuando se añade una pequeña cantidad de AEO.Por otra parte, la cristalinidad de las películas se estudia más y se resume en la figura 7 . La cristalinidad se calculó basada en la fusión de relación de la entalpía de las películas de mezcla de 100% de LDPE cristalina. Se encontró que la adición de OEA ha aumentado en gran medida la cristalinidad película a partir de 13,3% de película de control a 21,6%, 19%, 18,5% y 16,9%, respectivamente, para las películas con 2%, 4%, 6% y 8% de OEA. Esto se atribuyó a la buena afinidad de OEA hacia polímero de LDPE / EVA. En otras palabras, la adición del componente de EVA ha actuado con éxito como el compatibilizador entre OEA y de la matriz de LDPE porque este último es un polímero no polar que se espera que sea incompatible con los OEA.  Esto es razonable ya que, según Giannakas, Xidas, Triantafyllidis, Katsoulidis, y Ladavos (2009) , una buena compatibilizador con alta afinidad a una matriz de polímero podría actuar para promover la interacción entre los componentes aditivos, posteriormente, aumentar la tendencia de los núcleos para formar la estructura cristalina. Por otra parte, los efectos lubricantes de OEA también facilitan el movimiento de las cadenas poliméricas y acelerar el crecimiento de cristales. Como resultado, la cristalinidad de la OEA incorporado-LDPE / EVA mezcla mejoró gradualmente.

Figura. 7. La cristalinidad de las películas de LDPE / EVA con diferentes cantidades de AEO agregó.

3.5. Fuerza de la propagación del desgarroSe requiere que los envases de plástico para tener una buena resistencia al desgarre progresivo con el fin de prevenir daño del paquete durante el procesamiento, el transporte y la aplicación. D1938 ASTM (ensayo de desgarro del pantalón) es una prueba ampliamente utilizada para materiales muy dúctiles, tales como películas de plástico ( Chang, Inge, Tau, Hiltner, y Baer, 2002 ). Se cubre la fuerza requerida para propagar un desgarro en una región sola lágrima especialmente creada. Cuando las tensiones llegaron a un cierto nivel, arrancar propagarse desde la región sola lágrima. Propiedades de desgarro de las películas de plástico se ven afectadas principalmente por la estructura y la alineación de las fases cristalina y amorfa según lo informado por Seyed, Pierre, y Abdellah (2009) . Cuanto mayor sea la orientación de fases cristalinas y amorfas, menor es la resistencia a la rotura a lo largo de dirección de la

máquina. Además, las películas con mayor cristalinidad tienden a tener mayor resistencia a la rotura debido a que las regiones cristalinas actúan como zona de refuerzo ( Nikolaos, 1977 ). figura 8 resume la fuerza requerida para propagar el desgarro inicial de películas de LDPE / EVA (a lo largo de dirección de la máquina) con diferentes niveles de OEA. Se muestra que la fuerza de desgarro no se ve afectada significativamente por la OEA. En el cine con un 2% de OEA, Fuerza de rotura aumenta ligeramente de 1.537 N de película de control a 1.594 N. Esto se debe a la mayor cristalinidad de la película. Cuando más aumenta el nivel de OEA, fuerza de desgarro disminuye a 1,51 N, 1,458 N y 1,347 N, respectivamente, para la película con 4, 6 y 8% de OEA. Aceite con efecto lubricante facilita el movimiento de las cadenas poliméricas y hace que sea más fácil para alinear durante el proceso de película soplada. Aunque estas películas que tienen una cristalinidad más elevada que la película de control ( . Fig. 7 ), la fuerza de la región cristalina fue probablemente sobrescrita por la fase de polímero altamente orientado.

Figura. 8. Fuerza de la propagación del desgarro de las películas de LDPE / EVA con diferentes cantidades de AEO agregó.

3.6. MicroestructuraAdemás, es importante examinar los cambios de microestructura sucedieron en la película de plástico después de la adición de agente de AM por los medios de microscopio electrónico de barrido (SEM). Las micrografías SEM de la película de LDPE / EVA añaden con OEA que van desde 0% w / w para 8% w / w de antes y después de la prueba de tracción se obtiene mediante el escaneo de la superficie de las películas y la parte de la fractura de la película después de ensayo de tracción. Inicialmente mediante la observación de las imágenes como se muestra en la figura. 9 , no hubo una diferencia obvia de la apariencia tanto para película de control y la película agregado con 2% w / w de OEA. Las películas eran lisas y tiene una superficie homogénea, sin estructura porosa, lo que indica que la matriz ordenada se formó en ambas películas. Considerando que, las películas incorporadas con 4-8% w / w de OEA tienen superficies relativamente rugosas. Se observaron las superficies de contracción a lo largo de las películas y más pronuncia en película con 8% w / w de OEA. La existencia de la irregularidad de

la superficie fue posiblemente debido a la volatilidad del aceite esencial, por lo que causa la formación de estructura amorfa resultado de rastros extraídos de AEO. La evaporación de los componentes volátiles en AEO durante el proceso de película soplada creó los micro-agujeros vacíos ( Sánchez-González, Pastor, Vargas, CHIRALT, y González-Martínez, 2011 ), y estos podrían estar asociados con la reducción de la resistencia a la tracción. Un examen más detallado de la parte de la fractura de las películas como se muestra en la figura. 10 encontraron que las secciones transversales de película de control mostraron una mayor rotura regular y superficie lisa como se destaca en la figura. 10 (a). Considerando que, cuando el contenido de OEA aumentó, la sección transversal de la película fracturada mostró superficies más ásperas. Esto fue claramente resaltado en la figura. 10 (b), (c), (d) y (e). Esto puede ser causado por la adición de aceite inducida por una mayor flexibilidad de las cadenas de polímero lo que aumentó la mayor ductilidad de las películas.

Figura. 9. Las micrografías (1,000 ×) de películas antimicrobiano incorporado con OEA al (a) 0% w / w, (b) 2% w / w, (c) 4% w / w, (d) 6% w / w y (e) 8% w / w.

4. ConclusiónLa zona de retroceso en el resultado de difusión en disco de agar muestra que el LDPE / película de EVA con 8% w / w de OEA podría reducir significativamente la concentración de bacterias probadas con fuerza inhibición de L. monocytogenes > B. thermosphacta >  E. coli. La película de

plástico incorporado con OEA había reducido suficientemente la tasa de crecimiento de L. monocytogenes en carne de res cocida después de 3, 6, 9 y 15 días de almacenamiento a 4 ° C. Sin embargo, no se observaron efectos tanto en E.coli y B. thermosphacta. La incorporación de la OEA en más alta concentración (es decir, el 6 y el 8% w / w) redujo sólo ligeramente la integridad de la película en términos de resistencia a la tracción, el alargamiento a la rotura, la fuerza de la propagación del desgarro (resistencia al desgarro), así como la microestructura de la película. Por lo cual, la cristalinidad de la película aumentó significativamente especialmente cuando pequeña cantidad de OEA incorporado tal como se calcula sobre la base del análisis de DSC. Cuando la cristalinidad de la película es superior puede conducir a mejores propiedades de barrera de vapor y oxígeno, pero puede reducir la transparencia de la película. Como conclusión, esta película AM es capaz de inhibir el crecimiento de L.monocytogenes cuando se incorpora el 8% de OEA, sin disminuir las propiedades físicas de la película. Sin embargo, el alto costo material es siempre la limitante para la sostenibilidad de esta tecnología. El precio actual de mercado para la OEA es de alrededor de EE.UU. $ 75/kg, según el cual el precio de los envases de alimentos LDPE es de alrededor de EE.UU. $ 2.10/kg. Por lo tanto, el costo de AM películas con 8% de OEA aumentará cerca de tres veces. Por lo tanto, este envase se podría aplicar a los alimentos con mayor riesgo de contaminación bacteriana como la carne y los alimentos listos para el consumo.

Figura. 10. Las micrografías (2,000 ×) de superficie de fractura a la tracción de las películas antimicrobiano incorporado con OEA al (a) 0% w / w, (b) 2% w / w, (c) 4% w / w, (d) 6% w / W y (e) 8% w / w.

Reconocimiento

Esta investigación fue preparada como parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación, Malasia (MOSTI) del Gobierno Federal de Malasia-Putrajaya bajo Fondo de Ciencias.

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