evaluaciÓn e identificaciÓn molecular del...
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EVALUACIÓN E IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DEL IRIS
YELLOW SPOT VIRUS (IYSV) EN CULTIVARES DE
CEBOLLA.
OPCION I
TESIS PROFESIONAL
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
INGENIERO BIOQUIMICO
PRESENTA
GABRIELA HERNÁNDEZ RAMÍREZ
TEHUACAN, PUE. SEPTIEMBRE 2013
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AGRADECIMIENTOS
Al proyecto FOMIX: Estudios Epidemiológicos de Enfermedades y Bioecología de
Plagas en Cultivos de Importancia Económica en el Estado de Morelos, con clave:
MOR-2010C01-148902, financiado por los Fondos Mixtos del gobierno del estado
de Morelos y el CONACYT por su apoyo en la realización de esta tesis.
Al Instituto Nacional de Investigaciones, forestales, agrícolas y Pecuarias por
darme la oportunidad de aprender nuevas cosas para mi desarrollo profesional.
Al Dr. Sergio Ramírez Rojas por su apoyo brindado en el desarrollo de este
trabajo.
A Katya Ornelas por su dirección y observaciones hechas en esta investigación.
El más sincero agradecimiento a mi asesora la M.C Margarita Rivera Martínez por
su interés, sugerencias y observaciones en mi tesis.
A mi consejo sinodal a la Ing. María Virginia Lucila López Gallardo, Ing. Lucina
Lilia Gómez Hernández, y a la Ing. Nidia Esther Gómez Flores que con su apoyo y
conocimientos me ayudaron a concluir este trabajo de investigación.
A mis profesores por los conocimientos que me transmitieron, por ser parte de mi
formación académica.
Agradezco al personal del laboratorio de fitopatología y a todas las personas que
con su apoyo moral y profesional me apoyaron para la realización de este trabajo.
ii
DEDICATORIA
En primer lugar a mi padre Dios, por todo el amor que me da y por demostrarme
todos los días lo que soy gracias a él, porque solo tú sabes los planes que tienes
para mí; planes de prosperidad y no de desgracia, pues tú me das un porvenir
lleno de esperanza.
A mis padres por su apoyo incondicional en todos estos años de educación, por su
amor incondicional, por los valores con los que me han formado y por la confianza
y la seguridad que me han dado, por guiar mi vida en este camino de esperanza,
los amo, sin ustedes nada de esto sería posible.
A mi hermano, por todo su apoyo, cariño y amor, por creer en mí y estar en los
momentos que más te he necesitado, sin duda alguna eres una parte importante
en mi vida, te amo con todo mi corazón.
A mi hermosa comunidad porque en ella encontré el verdadero valor de la
amistad, a estos amigos que son un gran tesoro para mí, por sus oraciones y
apoyo, sé que a pesar de la distancia y las circunstancias están siempre conmigo.
A mis mejores amigos por compartir conmigo esta gran felicidad, por su cariño y
regalarme su linda amistad incondicional, bendigo a cada uno de ustedes.
Dedico este trabajo a todas las personas que me han abierto la puerta de su
corazón y con sus palabras y ejemplo me han hecho ser una mejor persona.
No dejes que se retiren de ti el amor y la fidelidad; átalas a tu cuello, grábalas en
tu corazón; así tendrás aceptación y éxito ante Dios y ante los hombres. Cuenta
con él en todos tus caminos, y él enderezará tus sendas. (Prov 3,3-4,6)
iii
RESUMEN
En el estado de Morelos, la cebolla (Allium cepa) ocupa el cuarto lugar en
producción. El Iris yellow spot virus (IYSV) se trasmite a la cebolla por Thrips
tabaci, que es la principal plaga de este cultivo. En el 2013 hubo casi 100% de
incidencia en la superficie cultivada, lo que representa 4,100 hectáreas; en más de
la mitad de esta superficie hubo 90% de pérdidas por IYSV este fue identificado
por RT-PCR. Los síntomas consisten en manchas cloróticas, amarillentas o
blancas, secas y alargadas. El RNA fue extraído usando Invitrogen Trizol®
Reagent (Cat no. 15596-026). La identificación de IYSV por RT-PCR en tiempo
real se hizo con los primers IYSV-465c (5'-AGCAAAGTGAGAGGACCACC-3') e
IYSV-239f (5'-TGAGCCCCAATCAAGACG-3'). Para su secuenciación se utilizaron
los primers IYSV917L (5-'TAAAACTTAACTAACACAAA-3') e IYSV56U (5'-
TCCTAAGTATTCACCAT-3'). El virus fue detectado desde los 11 días posteriores
al trasplante. La secuencia de IYSV (GenBank Acc. No. JX946658) confirmó 99%
de identidad con el gen de la nucleoproteína de IYSV (GenBank Acc. No.
DQ233475.1), previamente reportada. Esta es la primera identificación de IYSV a
nivel molecular en México.
iv
ABSTRACT
In Morelos state, Mexico, the onion (Allium cepa) ranks fourth in production among
horticultural crops. In onion, Iris yellow spot virus (IYSV) is transmitted by Thrips
tabaci, which is the main pest of this crop in Morelos. In 2013 we detected IYSV
serologically on onion, as a rare disease, but in autumn 2012 there is almost
100% incidence in cultivated area, accounting for 4 100 ha; in half this area, the
severity disease is over 90%, so we is decided to identify in real time RT-PCR.
Symptoms consist in chlorotic and necrotic elongated spots, straw color. Total RNA
was extracted by using Invitrogen TRIzol® Reagent (Cat. no. 15596-026). The
identification of IYSV by real-time PCR was performed with primers IYSV-465c (5'-
AGCAAAGTGAGAGGACCACC-3') and IYSV-239F (5'-
TGAGCCCCAATCAAGACG-3'). Virus sequencing was performed with primers
IYSV917L (5-'TAAAACTTAACTAACACAAA-3') and IYSV56U (5'-
TCCTAAGTATTCACCAT-3'). The IYSV was detected from 11 days after
transplanting and thereafter. The IYSV obtained sequence (GenBank Acc No.
JX946658), confirmed the 99% identity with the nucleoprotein gene IYSV
(GenBank Acc. No. DQ233475.1) previously reported (Srinivasan et al., 2012).
This is the first report of molecular detection of IYSV in Mexico.
v
LISTA DE TABLAS
Tabla 3. 1 Variedades de cebolla (Allium cepa L.) sembrados en Atlacholoaya, Morelos, 2012. ..... 20
Tabla 4. 1 Análisis de varianza de la variable rendimiento en toneladas por hectárea del peso de
cebolla en fresco……………………………………………………………………………………………………………………… 26
Tabla 4. 2 Análisis de varianza de la variable incidencia del IYSV en cultivares de cebolla. ............. 26
Tabla 4. 3 Prueba de medias (Tukey) al 5% de probabilidad de error. ............................................. 27
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 3. 1 Zacatepec, Morelos. Sitio de estudio en el Estado de Morelos. ..................................... 18
Figura 3. 2 Mapa de localización del municipio Atlacholoaya, Morelos. .......................................... 19
Figura 3. 3 Lesiones típicas del virus IYSV ......................................................................................... 21
Figura 4. 1 Plantas con síntomas de virosis, lesiones alargadas con el centro marrón claro y
amarillamiento………………………………………………………………………………………………………………………… 24
Figura 4. 2 RNA de hojas de cebolla con infección de IYSV ............................................................... 25
Figura 4. 3 Detección por RT-PCR ...................................................................................................... 25
1
Contenido
DEDICATORIA ................................................................................................................................. ii
RESUMEN .........................................................................................................................................iii
ABSTRACT ....................................................................................................................................... iv
1.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 3
1.2 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................... 4
1.3.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 5
1.3.2 OBJETIVO ESPECIFICO .............................................................................................. 5
1.3.3 HIPÓTESIS...................................................................................................................... 5
CAPITULO 2.- ANTECEDENTES .................................................................................................. 6
2.1 IMPORTANCIA DEL CULTIVO ........................................................................................... 6
2.2 VIRUS DETECTADO EN CULTIVO DE CEBOLLA ........................................................ 7
2.2.1 IRIS YELLOW SPOT VIRUS (IYSV) ........................................................................... 8
2.3 VECTOR DEL IYSV .............................................................................................................. 9
2.4 MANEJO DE VIROSIS EN CEBOLLA ............................................................................. 13
2.5 TÉCNICAS MOLECULARES ............................................................................................. 16
2.5.1 RT PCR EN TIEMPO REAL ....................................................................................... 16
2.6 GEN BANK ........................................................................................................................... 17
CAPÍTULO 3.- METODOLOGÍA .................................................................................................. 18
3.1. LUGAR DE INVESTIGACIÓN .......................................................................................... 18
3.1.2 LOCALIZACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO ............................................................. 19
3.2 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO PARA MEDIR EL EFECTO (IYSV) ................ 19
3.2.1 PREPARACIÓN DE ALMÁCIGOS ............................................................................ 19
3.2.2 TRASPLANTE ............................................................................................................... 21
3.2.3 MANEJO DEL CULTIVO ............................................................................................. 21
3.3 MUESTREO ......................................................................................................................... 21
3.4 INCIDENCIA ......................................................................................................................... 22
3.5 ANÁLISIS Y DETECCIÓN DE VIRUS EN LAS MUESTRAS ....................................... 22
CAPÍTULO 4. RESULTADOS ...................................................................................................... 24
4.1 MUESTREO ......................................................................................................................... 24
2
4.2 ANÁLISIS Y DETECCIÓN DE VIRUS EN LAS MUESTRAS ....................................... 24
DISCUSIONES ............................................................................................................................... 28
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 29
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 30
GLOSARIO ...................................................................................................................................... 43
ANEXOS .......................................................................................................................................... 47
3
1.1 INTRODUCCIÓN
El género Allium incluye diversas especies cultivadas, como el cebollino (A.
schoenoprasum), ajo (A. sativum) y la cebolla (Allium cepa L.), ésta última es la
de mayor importancia económicamente (Gent et al., 2006).
El cultivo de cebolla ha sido una actividad que puede dejar buenas utilidades,
apoyando el bienestar económico y social de los agricultores dedicados a su
producción. La demanda de especies del género Allium es mucha, los precios de
la cebolla fluctúan de año a año, este es un problema global en el mercado por lo
que es poco lo que los productores de una región pueden hacer para controlar y
estabilizar los precios. Los frecuentes daños por plagas y enfermedades demeritan
la cantidad y calidad del producto; aunado a esto la situación se hace más difícil
cuando la comercialización del producto debe cumplir con estrictos estándares de
calidad (Brewster, 2008).
Sin embargo las plagas y enfermedades son problemas dinámicos. Algunas que
no lo eran se convierten en nuevos problemas fitosanitarios que influyen en la
producción de cebolla. Este cultivo es afectado por la presencia de enfermedades
fungosas, bacterianas y virales, estos últimos se han convertido en un verdadero
problema en la producción de cebolla del estado de Morelos y Puebla, el cual
afecta a aproximadamente 4,301 hectáreas de cebolla en 2011(SIAP, 2011).
Los virus se transmiten de una planta a otra de diversas formas siendo las más
importantes las realizadas por áfidos, ácaros o trips, por lo que la epidemiología de
las enfermedades virales se vincula con la biología de estas plagas (Brewster,
2008). La importancia de dichas enfermedades radica en el daño que ocasionan
en la producción.
El Iris yellow spot virus (IYSV) fue identificado de forma ocasional en Iris
hollandica Tub en Holanda (Derks y Lemmers, 1996). La sintomatología
observada en iris fue asociada a la presencia de un nuevo tospovirus, el IYSV
(Cortes et al., 1998).
4
La identificación del IYSV se puede realizar mediante varios métodos, uno ellos es
la técnica de alta sensibilidad y precisión denominada RT-PCR (Polimerase chain
reaction) en tiempo real, la cual amplifica en millones de veces una secuencia
nucleotídica específica que se desea detectar (Albouy y Devergne, 2000), esta
última es 100 % eficiente a los 20 ciclos obteniendo una amplificación de un millón
de veces de la cadena de ADN molde. El presente trabajo tiene como objetivo
identificar mediante RT-PCR, la presencia de IYSV y calcular el rendimiento en 21
cultivares de cebolla.
1.2 JUSTIFICACIÓN
Desde 1999, el IYSV, está incluido en la lista de alerta de la Organización Europea
y Mediterránea para la Protección de las Plantas (EPPO), por ser un peligro
potencial para los cultivos de iris y cebolla, dado que su vector, Thrips tabaci
(Kritzman et al., 2001a; Nagata et al., 1999) tiene una distribución mundial (EPPO,
2004) y la enfermedad está asociada con la presencia de elevadas poblaciones
del mismo (Gera et al., 1998; Kritzman et al, 2001b). Estudios llevados a cabo en
Israel señalan que se ha observado una alta incidencia de la enfermedad en los
campos de los alrededores y en otras zonas de los cultivos de cebolla asociada a
grandes poblaciones del Thrips de la cebolla (Thrips Tabaci) (Gera et al., 1998).
Se sabe que 45% de los Thrips de la cebolla son portadores del IYSV (Kritzman et
al., 2001a), presentando una eficiencia de entre el 33 y 50% en la transmisión del
virus (Kritzman et al., 2001b).
El virus de la mancha amarilla Iris Yellow Spot Virus (IYSV) es de reciente
aparición en México, en Morelos fue detectado en el 2008 (RamÍrez y Ochoa,
2008) es causante de los bajos rendimientos en la producción del cultivo de
cebolla del estado de Morelos. Sin embargo en el 2012 la intensidad de daño
causo pérdidas totales en 25% de la superficie sembrada (Ramírez et al., 2013).
5
1.3.1 OBJETIVO GENERAL
Identificar la presencia de IYSV (Iris Yellow Spot Virus) mediante la técnica de
RT-PCR en tiempo real (Polimerase chain reaction).
1.3.2 OBJETIVO ESPECIFICO
Análisis del efecto del IYSV (Iris Yellow Spot Virus) en el rendimiento de
21 cultivares de cebolla.
Análisis de varianza utilizando el paquete estadístico SAS (2012).
Análisis de comparación de medias de tratamientos con la prueba de
Tukey.
1.3.3 HIPÓTESIS
En la presente investigación se identificará molecularmente la presencia del “Iris
Yellow Spot Virus (IYSV) al causar destrucción del área foliar; que afecta
directamente el rendimiento del cultivo de cebolla”
6
CAPITULO 2.- ANTECEDENTES
2.1 IMPORTANCIA DEL CULTIVO
El género Allium es un cultivo importante en todo el mundo. En México se produce
cebolla de color blanco, rojo, amarillo y verde. Los principales estados productores
son Baja California Norte, Chihuahua, Guanajuato, Tamaulipas, Michoacán y
Morelos que en conjunto aportan el 73.4% de la producción nacional. Como en el
ciclo otoño-invierno es cuando más se siembra este cultivo, en marzo se obtiene la
máxima producción. Tamaulipas, Guanajuato y Morelos son los productores
sobresalientes en esta época. (Ramírez et al., 2010).
Con base en estadísticos de la FAO, la producción mundial de cebolla (Allium
cepa) en el 2011 es de 4,867,053.00 t, con un rendimiento de 204,732.87 t ha-1 y
el área cosechada fue de 237,727.00 hectáreas (FAO, 2011).
A nivel nacional en el 2011, la superficie sembrada de cebolla fue de 48,638.91
hectáreas, la superficie cosechada de 47,126.16 hectáreas con una producción
anual de 1,398,851.214 toneladas y un rendimiento medio de 29.68 t ha-1 (SIAP,
2011). En el 2011, en Morelos la superficie sembrada y cosechada fue de
2,421.00 ha-1 con una producción anual de 69,524.25 toneladas, con un
rendimiento promedio de 28.72 t ha-1, con un valor en la producción de $
285,347.21 (SIAP, 2011).
El cultivo de la cebolla ocupa un importante lugar a nivel mundial dentro del grupo
de las hortalizas debido a sus propiedades alimenticias, su cultivo continuo y su
facilidad de almacenamiento permiten que el producto se encuentre disponible a la
venta durante todo el año, lo que representa un gran beneficio para los
productores (Brewster, 2008).
El cultivo de cebolla ha sido una actividad que puede dejar buenas utilidades,
apoyando el bienestar económico y social de los agricultores dedicados a su
producción. La importancia del cultivo se debe a sus diversas propiedades y
características y a su distintivo sabor y olor que se produce cuando los tejidos de
las plantas son golpeadas o cortadas, la enzima allinasa hidroliza sulfóxidos que
son precursores para formar compuestos volátiles de azufre. Miembros del género
7
también poseen características antimicrobianas probablemente como resultado de
la producción de compuestos de azufre. Especies del género Allium, aunque se
cultivan principalmente para la alimentación, también se utilizan en la medicina
tradicional, incluyendo el tratamiento de la varicela, resfriado común, gripe,
sarampión y reumatismo. La investigación ha demostrado que los extractos de
cebolla contribuyen en el descenso de los niveles de azúcares, lípidos, y la
agregación plaquetaria, aumentando la fibrinólisis en la sangre, lo que indica que
estas plantas pueden ayudar a prevenir la arteriosclerosis y otras enfermedades
cardiovasculares (EPPO, 2004).
2.2 VIRUS DETECTADO EN CULTIVO DE CEBOLLA
Los síntomas de moteado amarillo (mosaico) o la aparición de bandas en las
hojas, distorsión de los brotes y las reducciones en rendimiento causadas por
infecciones virales son muy comunes en plantas del género Allium. Los virus son
partículas subcelulares que consisten en una cubierta proteica alrededor de una
línea central de RNA, que lleva la información genética (Agrios, 2005). La mayoría
de los virus que infectan especies del género Allium son en forma de varilla flexible
siendo el más grande de unos 800 nm de largo y 12 nm de ancho. Después de la
infección, los procesos de replicación de la célula huésped se desvían hacia la
proliferación del virus y por lo tanto en la mayoría de los casos la aparición
evidente de síntomas. Los virus se transmiten de una planta a otra de diversas
maneras siendo las más importantes las llevadas a cabo por áfidos, ácaros o trips,
por lo que la epidemiología de las enfermedades virales se vincula con la biología
de estas plagas (Brewster, 2008). La importancia de dichas enfermedades radica
en el daño que ocasionan en la producción. Messiaen et al., (1994) reporta en
Francia reducciones en el rendimiento del 25 al 50%.
En el cultivo de la cebolla la enfermedad está asociada a una reducción general
del tamaño del bulbo (Gent et al., 2004). Su incidencia a menudo alcanza
porcentajes de 50 ó 60%, produciendo elevadas pérdidas de producción de bulbos
(Kritzman et al., 2001a). Según Ockey y Thomson (1994), plantas de cebolla
infectadas son capaces de producir bulbos de buena calidad en algunos casos,
aspecto aparentemente contradictorio con lo expuesto anteriormente; estos
8
autores, sin embargo, indican que la infección hace tremendamente susceptibles a
las plantas a condiciones adversas como sequía, exceso de riego y temperaturas
muy altas; bajo esas situaciones desfavorables las porciones aéreas de las
plantas mueren y disminuye el crecimiento de los bulbos.
El movimiento y distribución de virus a través de las plantas puede llevarse a cabo
lentamente desde el sitio de inoculación, de célula a célula, a través de los
plasmodesmos modificados por las proteínas de movimiento del agente viral o de
manera más rápida (centímetros/hora) desde las células epidermales a las células
del mesófilo para posteriormente alcanzar los tejidos vasculares, generalmente el
floema: o en forma masiva hacia los tejidos de crecimiento rápido; sin embargo, la
distribución final del o los virus en los tejidos u órganos de una planta puede no
ser uniforme y es influenciada por el virus, el hospedero y la interacción entre
ambos (Velásquez et al, 2012).
2.2.1 IRIS YELLOW SPOT VIRUS (IYSV)
En 1991 se describió en Estados Unidos una nueva enfermedad en cebolla (Hall
et al., 1993) que más tarde se diagnosticó como un aislado del IYSV. Este virus
era el causante de una enfermedad potencialmente devastadora y de amplia
distribución en este cultivo (Gent et al., 2004) es una limitación importante para la
cebolla de bulbo y producción de semillas en varios crecientes de cebolla de las
regiones de los Estados Unidos (Bag et al., 2009). En América del Sur, el virus fue
reportado en Brasil durante 1999 y más recientemente en Chile durante 2005.
Durante el año 2003, una investigación de las lesiones necróticas y muerte
regresiva en las cebollas cultivadas cerca de las localidades de Supe e Ica, Perú
llevó al descubrimiento de IYSV en esta región (Mullis et al., 2006). En Holanda el
virus fue identificado de forma ocasional (Derks y Lemmers, 1996). La
sintomatología observada en iris fue asociada a la presencia de un nuevo
tospovirus, el Iris Yellow Spot Virus (Cortes et al., 1998). En Grecia se identificó el
virus causando lesiones de color pajizo y cloróticas de febrero a junio de 2008 las
9
muestras que fueron recolectadas de diferentes zonas de Grecia presentaron
variedad de lesiones. (Chatzivassiliou et al, 2009).
La sintomatología del IYSV se presenta con lesiones que pueden tener el centro
verde, con bordes amarillentos de color marrón claro; otras lesiones aparecen
como anillos concentricos o alterando coloraciones de tejidos verdes y amarillos o
marrón claro (Schwartz et al., 2003)., la aparición de bandas en las hojas,
distorsión de los brotes y los bajos rendimientos (Schwartz y col., 2007). Estas
lesiones contribuyen a una temprana senescencia foliar (PELTER,2001), pudiendo
también aparecer manchas en el escapo floral (SCHWARTZ et al.,2003). La
infección ha sido detectada en cultivos de cebollas tiernas, así como en cultivos de
cebollas para semilla y bulbos (Coutts, 2003). Las plantas infectadas pueden
aparecer diseminadas o presentarse de forma generalizada (Schwartz et al.,
2003).
Su incidencia a menudo alcanza porcentajes de 50 ó 60%, produciendo elevadas
pérdidas de producción de bulbos (Kritzman et al., 2001a).
El sistema de propagación vegetativa lleva a la acumulación de virus en las
plantas de cebolla, permitiendo su diseminación e induciendo pérdidas del
rendimiento (Davies, 1994).
El IYSV pertenece a la familia Bunyaviridae, género Tospovirus. Su genoma es
RNA monocatenario de sentido negativo y tripartita; cada segmento es de
diferente tamaño. La partícula viral es isométrica con membrana fosfolípida, de 80-
120 nm de diámetro (Cortez et al., 2002).
El IYSV es transmitido por el trips de la cebolla, Thrips tabaci. Estudios en Israel
han demostrado una correlación entre las poblaciones de T. tabaci en cultivos de
cebolla y la severidad de plantas infectadas con IYSV (Gent et al., 2006).
2.3 VECTOR DEL IYSV
Los principales insectos plaga del cultivo de cebolla son miembros del Orden
Thysanoptera, Suborden Terebrantia, Familia Tripidae y Subfamilia Tripinae.
Estos insectos se caracterizan por ser diminutos y en su mayoría de color marrón,
10
aunque se pueden encontrar en tonalidades desde amarillo claro hasta negro
(Carrillo, 1985; Delahaut, 2001; Medina, 1961). Dentro de esta familia, Thrips
tabaci Lindeman y especies del género Frankliniella son considerados los trípidos
de mayor importancia económica en el cultivo de cebolla, ocasionando daños que
pueden alcanzar hasta un 100% (Shelton et al., 2006). Además de los daños
directos que pueden causar al destruir las células epidermales, éstos son
considerados vectores de varios virus del género Tospovirus (Gent et al., 2004;
Mound, 2002). A nivel mundial, estos virus causan pérdidas económicas severas
en vegetales y plantas ornamentales producidas en campo e invernadero
(Daughtrey et al., 1997; German et al., 1992; Goldbach y Peters, 1994).
El trips afecta la producción en Estados unidos y el mundo. La presencia de IYSV
in Georgia fue confirmada en el 2003. El trips de tabaco, Frankliniella fusca
(hinds), y el trips de la cebolla, thrips tabaci (Lindeman), son plagas de numerosos
cultivos agrícolas y hortícolas en todo el mundo (Moritz et al., 2004, Montículo,
2005). Ambas especies de trips regularmente plantas de cebolla se han
encontrado en Georgia, más frecuentemente Thrips Tabaci (Sparks et al., 2011).
Estudios llevados a cabo en Israel señalan que un 45% de los trips de la cebolla
son portadores del virus (Kritzman et al., 2001a), presentando una eficiencia de
entre el 33 y 50% en la transmisión del virus (Kritzman et al., 2001b). En Grecia
las plantas de cebolla fueron infestadas por los Trips, los cuales fueron
identificados como el vector de este virus (Chatzivassiliou et al, 2009).
El trípido de la cebolla (Thrips tabaci Lindeman), es una plaga polífaga que causa
serios daños a hortalizas y ornamentales en aproximadamente 140 especies de
plantas, pertenecientes a 40 familias alrededor del mundo (MacIntyre et al., 2005;
Murai, 2000). Es una plaga de gran importancia económica en plantas de la familia
Alliaceae tales como cebolla (Allium cepa L.) y puerro (Allium porrum L.) (Lewis,
1997; McKenzie et al., 1993). Alrededor del mundo se considera la plaga principal
del cultivo de cebolla, principalmente en países orientales y regiones de los
Estados Unidos (Kannan and Mohamed, 2001; Kisha, 1977; MacIntyre et al., 2005;
Shelton et al., 2006). En el estado de Nueva York, puede llegar a infestar el 100%
de las 53,000 ha de cebolla sembradas anualmente (Shelton et al., 2006). En
11
regiones de Sudan, se reportan pérdidas hasta de 57% en la producción bajo
ataques severos del insecto (Kannan and Mohamed, 2001). Trips tabaci puede
colonizar cultivos a una altura de 200 metros sobre el nivel del mar y su ataque
puede ser más severo en climas secos y con altas temperaturas (Cornell, 2005).
El mayor daño de T. tabaci en la producción ocurre durante el desarrollo del bulbo
(Kendall and Capinera, 1987). Bajo condiciones de invernadero, un total de 10
trípidos por planta reducen la producción en 7%. Morfológicamente, T. tabaci se
caracteriza por poseer alas sin venas y flecadas con pelos muy largos, antenas de
siete segmentos y una línea de setas o pelos en el margen posterior del pronoto
(Delahaut, 2001; Medina, 1961). Los adultos son de color marrón oscuro y las
ninfas amarillo pálido (Medina, 1961). El tamaño y el color de T. tabaci puede ser
influenciado por la temperatura y la humedad, observándose especímenes que
varían de marrón claro a amarillo y entre 965 μm hasta 1043 μm de largo (Murai
and Toda, 2002). Se sabe que el vector más eficiente del IYSV es Thrips
tabaci, sin embargo, la especificidad del vector y la eficiencia de transmisión
varía entre otras especies de trips y tospovirus. De igual manera la competencia
y eficiencia de la transmisión de IYSV por otras especies de trips o biotipos de T.
tabaci no se conocen (Wijkamp et al., 1995).
Es importante mencionar que los individuos adultos no pueden adquirir el virus
aunque se alimenten en plantas infectadas porque las partículas virales no pasan
el epitelio del intestino medio y no pueden llegar a las glándulas salivales
(Sakimura, 1962). Solamente pueden adquirirlo cuando se alimenta sobre plantas
infectadas en su estado larvario segundo (larvario II) para posteriormente en la
etapa adulta transmitirlo a hospederos sanos (Black, 1954; Bald and Samuel,
1931). En trabajos realizados con Trips tabaci se ha comprobado que para
adquirir el virus, el insecto tiene que pasar como mínimo un cuarto de hora
alimentándose en una planta infectada y cuanto más tiempo pasan en ella, el
porcentaje de trips virulíferos aumenta. Después de la adquisición del virus hay un
periodo de latencia o incubación (4-18 días) y se puede transmitir desde la fase
larvaria II hasta 1-4 días después de la emergencia del adulto. Por tanto, la
infectividad perdura de manera continua y el periodo en que un trips puede
12
transmitir el virus puede llegar a 24-43 días según la especie (Harris and
Maramorosch, 1980). El periodo de retención de un virus varia, siendo como
máximo 22-24 días para F. schultei, 30 días para F. occidentalis y T. tabaci y 43
días para F. fusca (Sakimura, 1962). Los trips virulíferos pueden invernar como
ninfas y ser portadores en la primavera siguiente cuando aparecen en forma de
adultos. La relación del IYSV con Trips tabaci parece del tipo persistente
propagativo, esto quiere decir que la concentración del virus en el cuerpo del
vector aumenta con la edad del insecto, y por otro lado que la longevidad y
fecundidad resultan disminuidos en los insectos virulíferos (Conti, 2001).
Según Lewis (1997) las pérdidas resultantes de las infestaciones de trips
dependen de múltiples factores, incluyendo el tamaño de las poblaciones,
condiciones climáticas para el crecimiento de las poblaciones, etapa de
crecimiento de la planta, momento de la infestación, y la susceptibilidad de los
cultivares al daño de estos insectos por alimentación, ovoposición y la
infección por virus. Se han detectado diversos mecanismos de antixenosis y
antibiosis asociados con la resistencia a los trips en cebolla. Por ejemplo, una
mayor apertura entre las hojas aumenta la exposición a enemigos naturales de
los trips que buscan espacios reducidos, tales como vainas de las hojas e
inflorescencias, para vivir y reproducirse.
Brar et al. (1993) seleccionaron 61 cultivares de cebolla resistentes a T. tabaci
y concluyeron que su susceptibilidad al insecto no se correlaciona
necesariamente con el color del bulbo, sino más bien con el color de las hojas,
sugiriendo que los cultivares de cebolla con follaje verde azulado pueden sufrir
más daño de trips que los que tenían follaje verde, probablemente debido a
diferencias en la química de las ceras de la hoja ( McKenzie et al., 1993) lo que
provoca una disminución en la ovoposición de huevecillos así como en el
proceso de incubación y alimentación de larvas (Rösingh, 1980).
Es de vital importancia para evitar presencia de virus tener un programa de
manejo de vectores. En el cultivo de cebolla es común encontrar altas poblaciones
de trips lo que aumenta el potencial grado de transmisión de tospovirus. Muchos
agricultores hacen aplicaciones de insecticidas, sin embargo, utilizar solo este
13
método de control resulta ser ineficaz pues no se logra combatir totalmente las
poblaciones y en muchos de los casos se desarrolla resistencia a productos
químicos lo que incrementa la dificultad en el manejo. Estudios recientes sugieren
el control biológico mediante la aplicación de hongos entomopatógenos o usando
enemigos naturales como Orius spp. Es importante que el manejo incluya
prácticas culturales y métodos de sanitización, tales como la eliminación de
malezas y de restos de cultivo anteriores sobre todo antes de realizar una nueva
plantación y la colocación de trampas adhesivas azules antitrips desde el inicio del
cultivo para realizar un seguimiento de las poblaciones de adultos. Estas
medidas en conjunto con los métodos antes mencionados pueden reducir
potencialmente poblaciones de trips y por lo tanto epidemias de tospovirus (Cho et
al., 1989; Parrella, 1995 a,b,c).
Debido a lo anterior se hace evidente que el ataque de virus en el cultivo de
cebolla está íntimamente relacionado con la presencia de vectores y por ende los
graves efectos en la producción mundial y nacional.
2.4 MANEJO DE VIROSIS EN CEBOLLA
Puesto que el vector del IYSV es Trips tabaci, se han realizado estudios para
seleccionar materiales tolerantes al ataque de trips. Diversos mecanismos de
antixenosis (características morfológicas, físicas y estructurales de la planta que
impiden o inhiben a los herbívoros encontrarla, colonizarla o aceptarla como
hospedante) y antibiosis (características de la planta que impiden o inhiben el
desarrollo o reproducción de los herbívoros) se han asociados con la resistencia a
los trips en cebolla (Lewis, 1997). En Colorado, E.U en 2004 y 2005, la rotación
de aplicaciones de extracto de neem y espinosad, en combinación con paja,
redujeron en gran número infestaciones de trips en comparación con una rotación
de los productos convencionales Lamba-cyhalothrina y Methomyl, además de
lograr un aumento en el rendimiento de los bulbos (Fichtner et al., 2004).
También se han utilizado abonos para el manejo de insectos plaga en muchos
sistemas de cultivo (Diaz-Pérez et al., 2003; Momol et al., 2004). Mantillos
reflectantes pueden reducir poblaciones de trips al perturbar su capacidad para
14
reconocer a las plantas hospedantes (Diaz-Pérez et al., 2003; Momol et al., 2004;
Terry, 1997).
La relativamente limitada gama de hospedantes de IYSV hace muy eficiente la
rotación de cultivos, lo que puede ayudar a limitar la propagación del virus dentro
de una región. Por otro lado, la temporada de cosecha de semillas de cebolla
proporciona un "puente verde" para la supervivencia de IYSV y sus vectores
durante el invierno, por lo que la producción de cebolla para la obtención de
bulbos y para la obtención de semillas deben estar aislados geográficamente. Del
mismo modo, otros hospederos de IYSV (por ejemplo ajo y puerro), no deben ser
cultivados en las cercanías de cultivos de cebolla (du Toit et al., 2004).
La nutrición equilibrada tiene una función importante en los cultivos al afectar su
resistencia o susceptibilidad a las enfermedades, ya que los elementos minerales
están directamente involucrados en los mecanismos de defensa de la planta, al
formar parte de compuestos estructurales o funcionales de las células y de
procesos metabólicos. La incidencia de plagas y enfermedades puede ser un
indicador de un mal manejo nutrimental del cultivo (Pound, 1961; Huber and
Watson, 1974; Jarvis, 1997).
Muchas sustancias simples, como aminoácidos libres, azúcares y nitratos,
constituyen el alimento básico de diferentes microorganismos, y pueden estar
relacionadas con la menor formación de proteínas en la planta. El mayor daño de
patógenos puede ocurrir cuando hay inhibición de la síntesis de proteínas o
cuando hay un exceso en la producción de aminoácidos libres. La inhibición de la
síntesis de proteínas puede ser consecuencia del uso de agrotóxicos
(Chaboussou, 1967). Velasco (1999), menciona que el desbalance nutrimental
influye en el crecimiento y la supervivencia de los patógenos, así como en la
predisposición, tolerancia y resistencia de las plantas a éstos. La influencia de la
nutrición mineral en la actividad patogénica de los hongos y virus ha sido
documentada por Jarvis (1997) y Pacumbaba et al. (1997); se reconoce que las
enfermedades causadas por virus alteran la absorción, translocación y
concentración de nutrimentos en las plantas (Velasco, 1999). Además de la
adición de los nutrimentos clásicos, se ha propuesto el uso alternativo de
15
compuestos naturales como la miel de abeja como una manera de disminuir la
severidad ocasionada por virus en las plantas (Ramírez et al., 2006).
Un manejo propuesto para las enfermedades de las plantas causados por
tospovirus en se ha logrado mediante la inducción de resistencia sistémica
adquirida (RSA), la mayoría de las veces a través de la aplicación exógena de
productos químicos como ácido acetil salicílico o sus análogos estructurales
(Cole, 1999; Gorlach et al., 1996; Kessman et al., 1994). Villegas et al. (2001),
señalan que la aplicación de miel de abeja al follaje favorece el depósito de
aproximadamente 33 % de glucosa, misma que al difundir y penetrar en la hoja
aumenta el nivel de energía para la absorción activa favoreciendo la incorporación
de nutrimentos, mismos que incrementan el vigor de las plantas (Sosa et al.,
1973; Rodríguez et al., 1980; Germani and Reversat, 1982; Vawdery and Stirling,
1997; CDA, 2000; El -Nagdi and Youssef, 2004). Por otro lado, las plantas
producen muchos compuestos o sustancias químicas con acción antimicrobiana,
dentro de las cuales, los compuestos de naturaleza proteica, polisacáridos o
taninos interfieren con las infecciones virales (Sadasivam et al., 1991).
La potencialidad existe para introducir resistencia a muchas enfermedades
mediante transformación genética. Se han logrado identificar las secuencias de
DNA que codifican varios potyvirus y la incorporación de genes de proteínas
virales en el genoma de las plantas ha conferido resistencia en varios cultivos
(Eady, 2002).
Existen por lo tanto diversas técnicas en el manejo de enfermedades virales sin
embargo, aun así la mejor manera de evitar infecciones es mediante la
propagación de material “certificado” disponible comercialmente y libre de
patógenos (van Dijk, 1993).
16
2.5 TÉCNICAS MOLECULARES
2.5.1 RT PCR EN TIEMPO REAL
Esta técnica permite pasar, en sentido inverso al dogma central de la biología
molecular, de ARN a ADN. El primer paso es convertir el mARN en ADN
complementario (cADN) a partir de la actividad de la reverso transcriptasa.
Esta enzima existe en la naturaleza como parte del mecanismo de replicación en
virus y utiliza un tARN como oligonucleótido o primer. La PCR en tiempo real con
transcriptasa inversa se ha convertido en el método de elección para realizar un
examen rápido y preciso cuantitativo de la expresión de genes específicos
(Walker, 2002).
La sensibilidad de la PCR, combinada con su capacidad para amplificar
secuencias específicas diseñadas específicamente para desoxioligonucleotidos se
utilizan cebadores o primers, esto hace que sea una técnica atractiva con lo cual
es detectado RNA viral.
La síntesis de cDNA de RNA viral puede lograrse con el uso de RT-PCR y oligos
específicos o subconjuntos de RNA viral que pueden ser selectivamente
convertidos a cDNA. Una vez realizado el cDNA, la combinación de primers
puede ser utilizada para la amplificación de la PCR. La sensibilidad de PCR puede
permitir la detección de variantes de RNA que podrían estar presentes en un nivel
demasiado bajo para su detección, ya sea por su baja concentración o debido a
los antecedentes de moléculas de RNA de origen. Los cebadores pueden ser
designados de modo que los ARN o ADN que difieren por tan poco como un solo
nucleótido que puede copiarse selectivamente por la reverso transcriptasa y PCR
(Kwok et al.,1990).
Cuando la RT-PCR es 100 % eficiente a los 20 ciclos se obtiene una amplificación
de un millón de veces de la cadena de ADN molde (McPherson y Moller, 2006). La
reacción de RT-PCR puede ser inhibida por compuestos orgánicos e inorgánicos,
principalmente cuando los tejidos vegetales contienen altas cantidades de
proteínas o carbohidratos, los cuales pueden unirse a los iones magnesio
17
ocasionando que no estén disponibles para la Taq polimerasa (Moreira, 1998;
Queiroz et al., 2001).
La RT-PCR consta de cuatro etapas: (1) Retrotranscripción, que consiste en
sintetizar ADN a partir de una cadena de ARN, posteriormente genera una
segunda formando una doble hélice de ADN, denominada ADN complementario
(cADN). La enzima que cataliza la primera parte de este proceso recibe el nombre
de ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa) (Ausina y Moreno,
2006). (2) Desnaturalización, en donde se separan las dos hebras de DNA a una
temperatura de 94-95 °C (Zavala, 2005). (3) Alineamiento, el oligonucleótido se
une a su secuencia complementaria en el ADN complementario a una temperatura
de 40-68 °C, durante 20-40 segundos (Rodríguez y Barrera, 2004). (4) Elongación
de la cadena, actúa la ADN polimerasa tomando el ADN molde para generar la
cadena complementaria y a partir del oligonucleótido se inicia la síntesis del nuevo
ADN. La temperatura para este reacción depende de la ADN polimerasa que se
use. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está entre 75-
80 °C, utilizando comúnmente 72 °C (Zavala, 2005).
La técnica de PCR en tiempo real, a partir de la temperatura de
fusión (denominado valor Tm, del inglés melting temperature), permite identificar
fragmentos concretos amplificados. Esta temperatura es específica para el
fragmento amplificado que se está buscando. Los resultados son obtenidos a
partir de la observación de la curva de disociación o curva de melting de las
muestras de DNA analizadas.
2.6 GEN BANK
GenBank ® Es la base de datos de secuencia genética, una colección comentada
de todas las secuencias de ADN disponible en internet (Nucleic Acids Research,
Enero 2013). El Gen Bank es parte de la base de datos de secuencias de
nucleótidos Colaboración Internacional, que cuenta con el banco de datos de ADN
de Japón (DDBJ), el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) y
GenBank en NCBI. Estas tres organizaciones intercambian bases de datos en
forma permanente.
18
CAPÍTULO 3.- METODOLOGÍA
3.1. LUGAR DE INVESTIGACIÓN
El trabajo se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), entre los meses de
Noviembre de 2012 a Marzo de 2013 (Figura 3.1).
Figura 3. 1 Zacatepec, Morelos. Sitio de estudio en el Estado de Morelos.
19
3.1.2 LOCALIZACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
La parcela de estudio se ubica en la localidad de Atlacholoaya municipio de
Xochitepec Morelos, con latitud norte 18° 45´y longitud oeste 99° 12´, y una
altitud de 1133msnm.
Figura 3. 2 Mapa de localización del municipio Atlacholoaya, Morelos.
3.2 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO PARA MEDIR EL EFECTO (IYSV)
3.2.1 PREPARACIÓN DE ALMÁCIGOS
Se sembraron dos semillas por cavidad de 21 variedades de cebolla para
conocer su resistencia a virosis (Tabla 3.1). Se utilizaron charolas de unicel de 200
cavidades lavadas con cloro al 2 % durante 5 min. Se empleó peat moss como
sustrato y las charolas se mantuvieron en cámaras bioclimáticas con temperatura
controlada de 25/23ºC día/noche. Una vez que emergieron las plántulas (8 días
después de la siembra) se realizaron riegos diarios durante 25 días con solución
Steiner al 50%.
20
Tabla 3. 1 Variedades de cebolla (Allium cepa L.) sembrados en Atlacholoaya, Morelos, 2012.
VARIEDADES
1. Crown Blanca F1
2. Sor Blanca F1
3. Magia Blanca F1
4. Rosalí F1
5. HA3007 F1
6. Doña Blanca F1
7. 881 F1
8. Red Coach F1
9.Nube
10. Cal 214
11. Santa María Experimental
12. Copándaro
13. Línea INIFAP 19
14. Chona
15. Blanca Morelos
16. Mataharí
17. Hija de Suprema
18. Waster
19. Koral
20. Cirrus
21. Sakata
21
3.2.2 TRASPLANTE
A los 30 días después de la emergencia, se realizó el trasplante directamente al
suelo. La distancia entre plantas fue de 10cm y entre surcos de 45cm. El
experimento se estableció en un diseño en bloques completos al azar con 4
repeticiones, siendo la parcela útil de 1m2 con un total de 20 plantas por material.
3.2.3 MANEJO DEL CULTIVO
En la parcela experimental se realizaron las prácticas culturales que hace el
productor de manera regular.
3.3 MUESTREO
Se realizó un único muestreo, al momento de la cosecha en febrero de 2013. En
la parcela sembrada se tomaron muestras al azar de hojas con síntomas referidos
al virus (Figura 3.3). Las hojas fueron colocadas en bolsas de plástico de manera
individual y transportada en una hielera al laboratorio de fitopatología del campo
experimental Zacatepec.
Figura 3. 3 Lesiones típicas del virus IYSV
22
3.4 INCIDENCIA
La incidencia de la enfermedad fue calculada considerando el número de plantas
con los síntomas atribuibles a virosis antes descritos con respecto del número
total de plantas para cada bloque experimental, para luego derivar la proporción
de plantas enfermas por bloque.
3.5 ANÁLISIS Y DETECCIÓN DE VIRUS EN LAS MUESTRAS
El diagnostico consiste en la extracción de RNA y posteriormente la síntesis de
cDNA con oligos específicos para determinar la presencia del virus en la planta. La
detección del virus se realiza utilizando RT-PCR en tiempo real. Esta técnica
permite una mejor identificación al ser más precisa y sensible en la detección de
transcritos.
El procedimiento llevado a cabo para la detección del virus con RT- PCR en
tiempo real, comienza con la extracción de RNA total de las plantas con síntomas
de infección por IYSV.
Se utilizó el método de extracción con TRIzol® Reagent de Invitrogen (Cat. no.
15596-026). Para la extracción de RNA, se tomaron muestras de hojas que
mostraban síntomas de infección (manchas cloróticas, color amarillo claro y
alargadas). De cada planta se pesaron 100mg de tejido, se maceraron con
mortero agregándole 1ml de trizol. Todo el proceso de extracción se realizó
siguiendo el protocolo dispuesto por el proveedor. Posteriormente, el RNA total
extraído es cuantificado en un espectrofotómetro. La integridad del RNA puede ser
verificada, tomando 5µl de cada muestra, en un gel de agarosa a una
concentración de 1.8%, a 80V durante 40 minutos.
La reacción de transcripción reversa se realizó utilizando QuantiTect Reverse
Transcription kit (QIAGEN, Cat. 205314). La reacción de síntesis de cDNA se llevó
a cabo con 1µg de RNA (calculado a partir de la cuantificación de la concentración
del RNA total extraído), 4µl de Quantiscript RT Buffer, 5x, el cual ya incluye Mg2+ y
dNTPs; 0.7µM de cada primer específico del virus IYSV-465c: 5′
AGCAAAGTGAGAGGACCACC 3′ e IYSV-239f: 5′ TGAGCCCCAATCAAGACG 3′
(Pappu et al., 2008); 0.7µM de cada primer de un gen endógeno de la planta para
23
utilizarse como control Allium-F: (TCCGACTACAGGAACAACCAG) y Allium-R
(AAACTCCTCTGCCTTCTCAGC) (Cools et al., 2011); 1 µl de Quantiscript
Reverse Transcriptase. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 20µl,
siguiendo el protocolo dispuesto por el proveedor.
La reacción de PCR en tiempo real se realizó con QuantiFast® SYBR® Green
PCR Kit (QIAGEN, Cat. no. 204054). Se utilizaron 10ng de cDNA para cada
muestra a analizar, 12.5µl de 2x QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix, 0.3µM
de cada par de primers, agua libre de RNAsa para un volumen final de reacción de
25µl. Cada muestra se analizó por triplicado. El programa de PCR en tiempo real
consiste en un paso inicial de 95°C 10 min, para la activación de HotStarTaq®
Plus DNA Polymerase; un programa de 40 ciclos con tres pasos:
95°C 10 s, 61°C 15 s, 72°C 10s. Se registró la ganancia de optimización entre los
72 y 95°C para la curva de melting.
Se realizó un análisis de varianza a los resultados de las variables evaluadas,
utilizando el paquete estadístico SAS (2012), versión 9.2. En función de los
resultados del análisis de varianza, se realizaron comparaciones de medias de
tratamientos, de acuerdo con la prueba de Tukey, con el mismo paquete
estadístico.
24
CAPÍTULO 4. RESULTADOS
4.1 MUESTREO
En Febrero de 2013 se colectaron hojas de plantas de cebolla de 21 variedades
que presentaban síntomas asociados a virosis como amarillamiento y lesiones
cloróticas irregulares o en forma de huso con el centro marrón (Figura 4.1)
Figura 4. 1 Plantas con síntomas de virosis, lesiones alargadas con el centro marrón claro y amarillamiento.
4.2 ANÁLISIS Y DETECCIÓN DE VIRUS EN LAS MUESTRAS
Plantas de cebolla en las cuales se detectaron síntomas de infección por IYSV se
analizaron con PCR en tiempo real para confirmar a nivel molecular la presencia
del virus.
Se verificó la integridad del RNA en gel de agarosa (Figura 4.2). Se observa una
buena integridad del RNA al mostrarse bandas definidas.
25
Figura 4. 2 RNA de hojas de cebolla con infección de IYSV
Se obtuvo una buena concentración de RNA de cada extracción. La concentración
obtenida fue suficiente para la reacción de síntesis de cDNA.
Se llevó a cabo el análisis con las curvas de disociación (análisis de melting) de
las reacciones efectuadas para identificar la presencia de IYSV en cebolla. El
IYSV se identificó molecularmente por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en el
estado de Morelos (Figura 4.3). Es importante señalar que la qRT-PCR permite
una mejor identificación al ser más precisa y sensible en la detección de
transcritos virales.
Figura 4. 3 Detección por RT-PCR
Figura 5. Detección de IYSV por qRT-PCR.
26
Tabla 4. 1 Análisis de varianza de la variable rendimiento en toneladas por hectárea del peso de cebolla en fresco.
Fuente de
variación Gl
Suma de
cuadrados
Cuadrados de
la media Valor de F
Probabilidad
de F
Bloque 3 0.2342557 0.0780852 0.15 ns 0.9318
Tratamiento 20 2.540.165.321 127.008.266 23.77 ** <.0001
*= significativa ns= no significativa **=altamente significativa
En los bloques no hay diferencia significativa lo que significa que estos están
correctamente distribuidos.
Tabla 4. 2 Análisis de varianza de la variable incidencia del IYSV en cultivares de cebolla.
Fuente de
variación Gl
Suma de
cuadrados
Cuadrados de
la media Valor de F
Probabilidad
de F
Bloque 3 700.000.000 233.333.333 2.02 ns 0.1200
Tratamiento 20 5.065.000.000 25 3250000 2.20 * 0.0100
GL= Grados de libertad
*= significativa ns= no significativa **=altamente significativa
En esta tabla se observa que en los tratamientos hay una diferencia significativa lo
que indica que al menos un cultivar tiene un alto rendimiento y una baja incidencia
del IYSV.
27
Tabla 4. 3 Prueba de medias (Tukey) al 5% de probabilidad de error.
VARIEDADES INCIDENCIA RENDIMIENTO
1. Crown Blanca F1 18.000 ba 6.5375 fdec
2. Sor Blanca F1 14.000 ba 4.7313 gfjih
3. Magia Blanca F1 13.000 ba 3.0038 kj
4. Rosalí F1 15.000 ba 1.5875 k
5. HA3007 F1 13.250 ba 6.0538 gfdech
6. Doña Blanca F1 13.000 ba 6.9888 bdec
7. 881 F1 14.000 ba 5.2250 gfeih
8. Red Coach F1 12.000 ba 4.5413 gjih
9.Nube 14.000 ba 5.8063 gfdeh
10. Cal 214 11.000 ba 5.3875gfdeih
11. Santa María Experimental 11.750 ba 3.6750 ji
12. Copándaro 16.000 ba 6.3913 gfdec
13. Línea INIFAP 19 10.000 b 6.0913 gfdech
14. Chona 19.000 a 6.8275 bdec
15. Blanca Morelos 16.000 ba 8.5875 ba
16. Mataharí 18.000 ba 8.9750 a
17. Hija de Suprema 13.000 ba 7.2063 bdac
18. Waster 17.000 ba 4.3938 jih
19. Koral 13.000 ba 7.9288 bac
20. Cirrus 12.000 ba 5.1813 gfeih
21. Sakata 11.000 ba 5.6938 gfdeh
Valores del rendimiento total con letra diferente en la columna de rendimiento total
significa que estadísticamente, Tukey (P< 0.05), hay diferencias significativas
entre tratamientos y que la mejor variedad fue Mataharí seguida de Blanca
Morelos y Koral.
Si la variedad Koral tuvo una baja incidencia esto significa que esta es la mejor
variedad por tener una baja incidencia y un alto rendimiento.
28
DISCUSIONES
Los resultados obtenidos indican que en el sitio de estudio se tiene la infección del
IYSV perteneciente al género tospovirus, lo cual coincide con lo reportado por
otros autores en Israel (Gera et al, 1998.), Brasil (Nagata et al, 1999;.. Pozzer et
al, 1999) y los EE. UU. (Schwartz et al, 2001;. Mohan y Moyer, 2002; Schwartz et
al, 2002). En la India, IYSV causa potencialmente la pérdida completa de la
cosecha (Kumar y Rawal, 1999).
Las lesiones más observadas en el cultivo fueron en forma de huso con el centro
marrón claro corresponden a los causados por infecciones de IYSV, aunque a
veces el centro es de color verde, con bordes amarillentos o de color marrón
claro; otras lesiones aparecen como anillos concéntricos o alternando coloraciones
de tejidos verdes y amarillos o marrón claro (Schwartz et al., 2003).
Los porcentajes altos de incidencia observados en este estudio, sugieren que la
presencia del complejo viral incrementa la sintomatología de las plantas enfermas,
dando lugar a un incremento en la enfermedad (Pérez et al., 2010). Los
resultados obtenidos también muestran que la presencia del complejo viral afectó
negativamente las características de calidad, lo que fue evidente en el peso de los
bulbos obtenidos al final del experimento. Resultados similares han sido
reportados en Francia (Messiaen et al., 1981), Argentina (Lunello et al., 1999;
Cafrune et al., 2005; Perotto et al., 2005a; Perotto et al., 2005b) y México (Pérez
et al., 2008).
La mayoría de las variedades donde se detectó al IYSV se tuvo una incidencia
del 50-70%, intervalo semejante (50-60%) al reportado en Israel por Gera et al
(1998).
El IYSV está incluido en la lista de alerta de la EPPO, su presencia en México es
reciente y se conoce muy poco sobre su epidemiología en cebolla. Tiene una
gama limitada de hospedantes circunscrita a plantas de la familia Liliaceae,
principalmente a especies del género Allium como cebolla (A. cepa), puerro (A.
porrum), cebolla 60 francesa (A. schoenoprasum), cebollino inglés (A.
fistulosum), ajo (A. sativum L.) y algunas especies ornamentales como el iris
29
(Iris hollandica) y lisiantus (Eustoma russellianum) (Kritzman et al., 2000),
estas dos últimas cultivadas en el país. También ha sido encontrado en plantas
silvestres como Datura stramonium y Nicotiana benthamiana (Ockey and
Thomson, 1994).
El IYSV tiene como vector al trips de la cebolla, Thrips tabaci, insecto que por
sí mismo constituye una de las plagas más abundantes y frecuentes en el cultivo
de la cebolla. Este vector puede permanecer en plantas espontáneas de cebolla
que aparecen en los cultivos que se plantan a continuación muchas de las cuales
también están infectadas por el virus (Gent et al., 2004), de ahí la importancia
de la limpieza y destrucción de todos los restos del cultivo anterior. En el
programa MIP del estado de Colorado también se incluyen como medidas de
control, la rotación de cultivos y la selección de variedades de cebollas menos
susceptibles, llevar a cabo plantaciones con plántulas sanas, la eliminación de
especies silvestres hospederas de trips que se encuentran dentro de la parcela y
sus alrededores (Schwartz et al., 2003).
Durante la evaluación de las 21 variedades fueron visibles los síntomas de la
presencia del virus IYSV.
CONCLUSIONES
Al realizar la identificación molecular mediante la técnica de RT-PCR en tiempo
real se comprobó que el Iris Yellow Spot Virus (IYSV) es el virus que causa la
mancha blanca en la producción de cebolla en Morelos.
Se realizó la comparación de medias en 21 variedades de cebolla, identificando la
variedad Koral como la que tiene mayor rendimiento con una producción total de
7.9288 tha-1 y tuvo una menor incidencia del IYSV.
30
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GLOSARIO
Ácido desoxirribonucleico, es un ácido nucleico que contiene instrucciones
genéticas, y es responsable de su transmisión hereditaria.
Áfido. Estos insectos en forma de pera, se mueven despacio y varían en tamaño
desde 1/16 a 1/8 de pulgada de largo. Tienen antenas delgadas visibles y cerca
del extremo del abdomen tienen dos tubos llamados corniles (forma de tubos).
Ácido ribonucleico, es un ácido nucleico formado por una cadena
de ribonucleótidos. Está presente tanto en las células procariotas como en
las eucariotas, y es el único material genético de ciertos virus (virus ARN).
Arteriosclerosis. Se refiere a un endurecimiento de arterias de mediano y gran
calibre, por lo general causa estrechamiento de las arterias que puede progresar
hasta la oclusión del vaso impidiendo el flujo de la sangre por la arteria así
afectada.
Antimicrobiano. Es una sustancia que mata o inhibe el crecimiento de microbios,
tales como bacterias, hongos, parásitos o virus.
Diseminar. Extender los elementos de un conjunto sin orden y en diferentes
direcciones.
Entomopatógenos. (Entomon: insecto, pathos: enfermedad, gennân: engendrar),
se trata de enfermedades de los insectos causadas por bacterias, hongos, virus,
protozoos y nematodos.
Epitelio. Es el tejido formado por una o varias capas de células unidas entre sí,
que puestas recubren todas las superficies libres del organismo, y constituyen el
revestimiento interno de las cavidades, órganos huecos, conductos del cuerpo, así
como forman las mucosas y las glándulas.
Espécimen. Es aquel individuo o parte de un individuo que se toma como
muestra, especialmente el que se considera representativo de los caracteres de
la población a la que pertenece.
44
Exógeno. Que se forma o nace en el exterior.
Extracto de Neem. Es un árbol, que contiene un aceite bioinsectisida natural que
no es toxico.
Fibrinólisis. Consiste en la degradación de las redes de fibrina formadas en el
proceso de coagulación sanguínea, evitando la formación de trombos.
Fosfolípido. Tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol,
a la que se unen dos ácidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo fosfato.
Glándula. Es un conjunto de células cuya función es sintetizar sustancias
químicas.
Gen. Es un segmento de ADN que lleva información genética.
Genética (del griego antiguo γενετικός, genetikos genetivo y este de γένεσις
génesis, "origen") es el campo de la biología que busca comprender la herencia
biológica que se transmite de generación en generación.
Incidencia. Es el número de casos nuevos de una enfermedad en una población
determinada y en un periodo determinado.
Incubar. Desarrollar el organismo una enfermedad desde el momento del contagio
hasta cuando aparecen los primeros síntomas.
Inoculación. Introducir en el organismo por medios artificiales el virus o la
bacteria de una enfermedad contagiosa.
Latencia. Estado de lo que permanece oculto, sin manifestarse.
Membrana plasmática. Es una estructura laminada formada
por fosfolípidos, glicolípidos y proteínas que rodea, limita, da forma y contribuye a
mantener el equilibrio entre el interior (medio intracelular) y el exterior (medio
extracelular) de las células, regula la entrada y salida de muchas sustancias.
45
Necrosis. Es la muerte patológica de un conjunto de células o de cualquier tejido,
provocada por un agente nocivo que causa una lesión tan grave que no se puede
reparar o curar.
Oligonucleótido. Es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares
de bases o menos
Plaga. Peste conjunto grande de organismos animales o vegetales que ataca una
plantación.
Plasmodesmo. Es cada una de las unidades continuas de citoplasma que pueden
atravesar las paredes celulares, manteniendo interconectadas las células
continuas en organismos pluricelulares en los que existe pared celular, como las
plantas o los hongos. Permiten la circulación directa de las sustancias del
citoplasma entre célula y célula comunicándolas.
Polífago. Son un suborden de insectos del orden de los coleópteros, cuyas larvas
no poseen más de cuatro artejos y de una uña en las patas y algunas son ápodas.
Polisacáridos. Son polímeros cuyos constituyentes (sus monómeros)
son monosacáridos, los cuales se unen repetitivamente mediante enlaces
glucosídicos. Estos compuestos llegan a tener un peso molecular muy elevado,
que depende del número de residuos o unidades de monosacáridos que participen
en su estructura.
Protórax. Es el primero de los tres segmentos del tórax de un insecto. Su
principales escleritos (placas exoesqueléticas) son el pronoto (dorsal),
el prosterno (ventral), y las propleuras (lateral) de cada lado.
RT-PCR. Es una variante de PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada
en biología molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso
llamado "amplificación". En la RT-PCR, sin embargo, una hebra de ARN es
retrotranscripta en ADN complementario (ADNc) usando
una enzima llamada transcriptasa inversa, y el resultado, se amplifica en
una PCR tradicional.
46
Senescencia celular. Proceso iniciado como respuesta al estrés y daño ocurrido
en una célula, y constituye una ruta alternativa de respuesta a la muerte celular
programada.
Severidad. Porcentaje de daño presente en una planta.
Sulfóxido. Compuesto que contiene un grupo sulfinilo enlazado a dos átomos
de carbono; también puede ser considerado como tioéteresoxidados.
Tanino. Químicamente son metabolitos secundarios de las plantas, fenólicos, no
nitrogenados, solubles en agua y no en alcohol ni solventes orgánicos.
Vaina. Cáscara flexible y alargada en la que están encerradas en hilera las
semillas de ciertas plantas.
47
ANEXOS
Datos obtenidos de rendimiento y porcentaje de incidencia de los cuatro
repeticiones en los 21 cultivares de cebolla.
REPETICIÓN 1
REP TMT Rendimiento Incidencia (%)
1 1 2 15
1 2 3 18
1 3 4 20
1 4 5 15
1 5 6 18
1 6 7 15
1 7 8 16
1 8 9 12
1 9 10 9
1 10 11 12
1 11 12 14
1 12 13 20
1 13 14 8
1 14 15 21
1 15 16 16
1 16 17 20
1 17 18 16
1 18 19 18
1 19 20 15
1 20 21 8
1 21 22 12
48
REPETICIÓN 2
REP TMT Rendimiento Incidencia (%)
2 1 3 16
2 2 4 12
2 3 5 11
2 4 6 18
2 5 7 13
2 6 8 16
2 7 9 14
2 8 10 10
2 9 11 21
2 10 12 11
2 11 13 10
2 12 14 18
2 13 15 14
2 14 16 12
2 15 17 19
2 16 18 15
2 17 19 13
2 18 20 19
2 19 21 14
2 20 22 12
2 21 23 13
49
REPETICIÓN 3
REP TMT Rendimiento Incidencia (%)
3 1 4 21
3 2 5 11
3 3 6 12
3 4 7 17
3 5 8 11
3 6 9 7
3 7 10 14
3 8 11 16
3 9 12 14
3 10 13 13
3 11 14 10
3 12 15 13
3 13 16 13
3 14 17 26
3 15 18 17
3 16 19 13
3 17 20 12
3 18 21 17
3 19 22 10
3 20 23 14
3 21 24 11
50
REPETICIÓN 4
REP TMT Rendimiento Incidencia (%)
4 1 5 20
4 2 6 15
4 3 7 9
4 4 8 10
4 5 9 11
4 6 10 14
4 7 11 12
4 8 12 10
4 9 13 12
4 10 14 8
4 11 15 13
4 12 16 13
4 13 17 5
4 14 18 17
4 15 19 12
4 16 20 24
4 17 21 11
4 18 22 14
4 19 23 13
4 20 24 14
4 21 25 8
51
Pruebas de medias (Rendimiento e incidencia) de Tukey en Atlacholoaya
Morelos.
IYSV en cebolla de Atlacholoaya´
Procedimiento ANOVA
Variable dependiente: ProTOTAL
Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 23 254.2507878 11.0543821 20.69 <.0001
Error 60 32.0613631 0.5343561
Total corregido 83 286.3121509
R-cuadrado Coef Var Raíz MSE ProTOTAL Media
0.888020 12.70628 0.730997 5.753036
Cuadrado de
Fuente DF Anova SS la media F-Valor Pr > F
BLOQUE 3 0.2342557 0.0780852 0.15 0.9318
TRAT 20 254.0165321 12.7008266 23.77 <.0001
52
IYSV en cebolla de Atlacholoaya´ 13
Procedimiento ANOVA
Prueba del rango estudentizado de Tukey (HSD) para ProTOTAL
NOTE: Este test controla el índice de error experimentwise de tipo I, pero
normalmente tiene un índice de error de tipo II más elevado que REGWQ.
Alpha 0.05
Grados de libertad de error 60
Error de cuadrado medio 0.534356
Valor crítico del rango estudentizado 5.28110
Diferencia significativa mínima 1.9302
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tukey Agrupamiento Media N TRAT
A 8.9750 4 16
A
B A 8.5875 4 15
B A
B A C 7.9288 4 19
B A C
B D A C 7.2063 4 17
B D C
53
B D E C 6.9888 4 6
B D E C
B D E C 6.8275 4 14
D E C
F D E C 6.5375 4 1
F D E C
G F D E C 6.3913 4 12
G F D E C
G F D E C H 6.0913 4 13
G F D E C H
G F D E C H 6.0538 4 5
G F D E H
G F D E H 5.8063 4 9
G F D E H
G F D E H 5.6938 4 21
G F D E H
G F D E I H 5.3875 4 10
G F E I H
G F E I H 5.2250 4 7
G F E I H
G F E I H 5.1813 4 20
G F I H
G F J I H 4.7313 4 2
G J I H
G J I H 4.5413 4 8
J I H
J I H 4.3938 4 18
J I
J I 3.6750 4 11
J
K J 3.0038 4 3
54
K
K 1.5875 4 4
`IYSV en cebolla de Atlacholoaya´ 15
Procedimiento ANOVA
Prueba del rango estudentizado de Tukey (HSD) para Inciden
NOTE: Este test controla el índice de error experimentwise de tipo I, pero
normalmente tiene un índice de error de tipo II más elevado que REGWQ.
Alpha 0.05
Grados de libertad de error 60
Error de cuadrado medio 11.525
Valor crítico del rango estudentizado 5.28110
Diferencia significativa mínima 8.9643
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tukey Agrupamiento Media N TRAT
A 19.000 4 14
A
B A 18.000 4 1
B A
B A 18.000 4 16
B A
55
B A 17.000 4 18
B A
B A 16.000 4 15
B A
B A 16.000 4 12
B A
B A 15.000 4 4
B A
B A 14.000 4 9
B A
B A 14.000 4 7
B A
B A 14.000 4 2
B A
B A 13.250 4 5
B A
B A 13.000 4 3
B A
B A 13.000 4 17
B A
B A 13.000 4 6
B A
B A 13.000 4 19
B A
B A 12.000 4 8
B A
B A 12.000 4 20
B A 11.750 4 11
B A
B A 11.000 4 21
B A
56
B A 11.000 4 10
B
B 10.000 4 13