Diagnostika pertussis v NRCDiagnostika pertussis v NRC pre pertussis a parapertussis

(Prínos zavedenia real-time PCR do diagnostickej praxe tohto agens)

Regionálny úrad verejného zdravotníctva ídl B k j B i iso sídlom v Banskej Bystrici

NRC pre pertussis a parapertussis

Maďarová L., Janičinová L., Klement C., Kohútová D.,

Bordetella pertussis• pôvodca čierneho kašľa• ochorenie preventabilné očkovaním

Z údajov WHO:•20 - 30 miliónov chorých/rok (90% v rozvojových krajinách)• Slovensko - vakcinácia od roku

1959• rok 2006 - zmena celulárnej

rozvojových krajinách)•200 - 300 tisíc úmrtí/rok (85% deti do 2 rokov)•pred zavedením očkovania - pertussis

vakcíny na acelulárnu• rok 2009 - booster v 13. roku života

(poliomyelitída, tetanus, záškrt)

pred zavedením očkovania - pertussis jednou z hlavných príčin úmrtí detí na celom svete•pred zavedením ATB - smrtnosť na(p y )

• NRC – zriadené 15. októbra 1994

pred zavedením ATB smrtnosť na pertussis u kojencov do pol roka života: 85 %

http://9999buddha.commedpedia.framar.bg

Laboratórna diagnostika B pertussisLaboratórna diagnostika B. pertussisPriame diagnostické metódy Nepriame diagnostické metódyKultivácia

Bordet-Gengou agar (resp.Charcoal agar)

Sérologické metódy4- násobný vzostup (pokles) titraprotilátok resp. sérokonverziaCharcoal agar)

na konci inkubačnej doby, počaskatarálneho štádia a na začiatku

p paglutinácia (neodporúča sa vprípade očkovania acelulárnouvakcínou)

paroxyzmálneho štádiapred začatím ATB terapie

PCR a real-time PCR

vakcínou)ELISA (dôkaz protilátok tried IgG,IgA, IgM )

PCR a real-time PCRrýchla, vysoko citlivá a špecifickámetódarelevantné výsledkymožnosť dokázať prítomnosť B.pertussis aj po zahájení ATBpertussis aj po zahájení ATBterapie

Obr. 9. Bordetella pertussis,elektrónová mikroskopia, foto:

http://historique.net/microbes/pertussis.html

L b tó di tik B t iLaboratórna diagnostika B. pertussis

Materiál a metódyMateriál vhodný na vyšetreniepomocou real-time PCR.

Izolácia nukleových kyselín•High Pure PCR Template Isolation Kit(Roche)

Agens Vyšetrovaný materiálBordetella pertussis

Bordetella parapertussis

nazofaryngeálny výter (výplach, aspirát)bronchoalveolárna laváž (BAL)

( )•Qiamp DNA mini Kit (QIAGEN)Real-time PCR•PCR v reálnom časekombinácia klasickej PCR s metódouparapertussis (BAL)

spútumbunková kultúra

•kombinácia klasickej PCR s metódouidentifikácie pomocou fluorescenčneoznačených sond (detekčný formát -duálne sondy)y)

•možnosť sledovať každý cyklus PCRpriamo na monitore počítača

•odlíšenie B. pertussis od B. parapertussisdôkaz IS481 a IS1001•dôkaz IS481 a IS1001

www.cdc.gov

Výsledky - Bordetella pertussis

rok 2004 - zavedená real-time PCR (B. pertussis, B. parapertussis)

cieľové sekvencie IS481 B. pertussis, IS 1001 B. parapertussis

pomocou real-time PCR metódy sa v období od decembra 2004 domarca roku 2011 vyšetrilo spolu 784 klinických materiálov naprítomnosť B pertussis resp B parapertussis

Vyšetrovaný materiál

Počet

prítomnosť B. pertussis resp. B. parapertussis

Prehľad materiálov vyšetrených na prítomnosť materiál

Výter z nosohltana

758

B kt iál 10

y ý pBordetella pertussis pomocou real-time PCR

0,53%0,66%Výter znosohltana Bakteriálna

kultúra10

Nekroptický materiál

10

0,26 %1,33%

nosohltana

Bakteriálnakultúra

Nekroptický materiál

Bronchoalveolárna laváž

4

S út 297 22%

p ýmateriál

Bronchoalveolárna laváž

Spútum Spútum 2

Spolu 784

97,22% Spútum

Výsledky - Bordetella pertussis

11 prípadov zaznamenaných od 01.januára do 31. marca 2010

Rok Počet vyšetrených vzoriek

Počet pozitívnych vzoriek

2004 5 3B. pertussis je popri RSV, adenovíruse,Streptococus pneumoniae, Chlamydiapneumoniae a Mycoplasma

2004 (december)

5 3

2005 40 6

2006 54 3

pneumoniae: diferenciálna diagnostikachrípky

chrípková sezóna 2009/ 2010-

2007 65 2

2008 174 7

2009 169 3 p /celosvetové kolovanie pandemickéhotypu vírusu chrípky typu A/ H1N1v populácii počas celého roka

2010 (január-marec)

67 11

2010 (marec-december)

165 7p p p

skutočnosť zvýšeného záchytu B.pertussis od januára do marca 2010súvisí s približne 12 násobným

december)

2011 (január-marec)

45 1

Spolu 784 43 súvisí s približne 12 násobnýmvzostupom počtu vzoriek zaslaných navyšetrenie, na RÚVZ BBprítomnosť B. pertussis bola dokázaná

v 43 krát, čo predstavuje 41 pacientov;š k l b ó d é í d b livšetky laboratórne potvrdené prípady boli

potvrdením klinicky stanovenej diagnózy

Výhody zavedenia real-time PCR do diagnostiky B. pertussisresp. B. parapertussis v NRC na RÚVZ BB .

AgensAgens Bežná diagnostikaBežná diagnostika RealReal time PCRtime PCRAgensAgens Bežná diagnostikaBežná diagnostika RealReal--time PCRtime PCR

Bordetella pertussis kultivácia 7 dní, sérológia 1,5 – 3 hod.

Bordetella parapertussis kultivácia 2 dni, sérológia 1,5 – 3 hod.

Bordetella pertussis, farbenie podľa Grama, foto: Maďarová

Vyhodnotenie real-time PCR, ilustračný obrázok

Prečo je na Slovensku stále viac diagnostikovaných pozitívnych prípadov na prítomnosť B. pertussis aj u zaočkovanej populácie?

Ako sa dá tento problém riešiť?Ako sa dá tento problém riešiť?

celosvetový problém, epidémie- Holandsko, Taliansko, Francúzsko, Fínsko, Poľsko,Anglicko, Kanada, Argentína, USA, Tajwan, Austrália, Švédskopo ornosť sa sústreď je na akcináci mena akcín an tie im nit (booster) shiftpozornosť sa sústreďuje na vakcináciu- zmena vakcíny, vyvanutie imunity (booster), shift vgenóme divého kmeňa (PFGE- príbuznosť resp. odlišnosť kmeňov)Slovensko- projekt EUVAC.NET, zosúladenie diagnostiky (sérologickej, MB+PFGE)nevyhnutnosť surveillance výskytu pertussis nielen pomocou real-time PCR ale aj pomocouk lti á i á l d lý j d tli ý h i lát PFGEkultivácie s následnou analýzou jednotlivých izolátov pomocou PFGEpríprava odborného usmernenia, diagnostika pertussis, klinický aspekt

Výsledok pulznej elektroforézy (PFGE)

ZÁVERY• rozšírenie a skvalitnenie diagnostiky Bordetella pertussis• rýchlejšie odhalenie pôvodcu ochorenia• presná a spoľahlivá diagnostika: rozhodujúci predpoklad prepresná a spoľahlivá diagnostika: rozhodujúci predpoklad pre

zodpovedné rozhodovanie lekára o začatí adekvátnej terapie• nadstavbové vyšetrenia aj pre ostatné pracoviská resp. laboratóriá

a lekárov•• nevyhnutnosťnevyhnutnosť surveillancesurveillance pertussis,pertussis, identifikáciaidentifikácia jednotlivýchjednotlivých

kmeňov,kmeňov, zisťovaniezisťovanie genetickejgenetickej príbuznostipríbuznosti respresp.. odlišnostiodlišnosti

http://www.whoopingcough.nethttp://www.whoopingcough.net

It is hard to exaggerate the impact of the polymerase chain reaction. PCR, the

quick, easy method for generating unlimited copies of any fragment of unlimited copies of any fragment of

DNA, is one of those scientific developments that actually deserves developments that actually deserves

timeworn superlatives like "revolutionary" and "breakthrough."

Tabitha M. Powledge

Je veľmi dôležité správne posúdiť, kedy majú molekulárno-biologické metódy význam v diagnostike a kedy je ich použitie zbytočné y ý g y j p y

resp. nedostatočné.

Kultivačné a sérologické metódy nemôžu byť úplne nahradené molekulárno-biologickými metódami dôkazu.

ĎAKUJEM ZA POZORNOSŤ