INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Lic. TM. Nancy Susy Merino Sarmiento

Laboratorio Metaxénicas Virales INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Diagnóstico del dengue.

Rol del Laboratorio de

Salud Pública en el Perú

Flavivirus: Virus del Dengue

Barros BE & Figueiredo. LTM, 2004

Virionextracelular

(maduro)

Virionintracelular(inmaduro)

Nucleocápside

M

Dímero E

E

prM

Barros VE & Figueiredo LTM, 2004

70nm

DENV 1, 2, 3 y 4

FlaviviridaeFlavivirus

ARN +

40-50 nm

El genoma codifica los genes estructurales y no estructurales.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dengue: Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1

Pruebas para muestras < = 5 días Virológicas: Aislamiento viral en línea C6-36.

Moleculares: RT-PCR convencional y en tiempo real.

ELISA Antígeno NS1

Secuenciación genética (genotipos).

Pruebas para muestras >= 6 días Serológicas: in house

ELISA IgM Tariki para dengue (Prod. por el INS)

ELISA IgG de captura para dengue (Infección secundaria).

ELISA IgG Indirecta (Infección pasada).

PRUEBAS DISPONIBLES EN EL PAIS

Ficha Clínica Tipo de muestra y Obtención de

muestras Transporte y conservación de M. Tipo de prueba

En vigilancia centinela: En pacientes ambulatorios: Dos centros En pacientes hospitalizados: Todo paciente hospitalizado, debe tener diagnóstico

- En brotes y/o epidemias: 30 a 50 sueros.

Método de

Diagnóstico Obtención de muestras

Muestra

Biológica Cantidad

Conservación

y Transporte

Tiempo de

resultado en el

Sistema NETLAB

Anticuerpos: IgM,

IgG

Sangre.- A pacientes con

tiempo de enfermedad

igual o mayor a 6 días. Suero 2 ml

Estéril. Enviar

en cadena de

frío 2 – 8 C 3 días.

Detección del

antígeno Ag NS1,

detección de ARN,

aislamiento viral y

tipificación de los

serotipos.

Sangre.- A pacientes con

un tiempo de enfermedad

igual o menor a 5 días.

(período virémico)

Suero 2 ml.

Estéril. Enviar

en cadena de

frío 2 – 8 C

3 días para PCR y

hasta 30 días para

aislamiento viral.

Tejido.- Realizar la

necropsia dentro las 24

horas de fallecimiento

(Tejido bazo, hígado y/o

riñón).

Tejido 2 cm3

Estéril. Enviar

sin

preservante y

en cadena de

frío 2 – 8 C

3 días para PCR y

hasta 30 días para

aislamiento viral.

Histopatología e

inmunohistoquímic

a.

Tejido.- Realizar la

necropsia dentro de las 24

horas de fallecimiento

(Tejido bazo, hígado y/o

riñón). Tejido 2cm3

Enviar en

formol al 10%

tamponado, en

un volumen 10

veces del

volumen de la

muestra, a

temperatura

ambiente.

3 días.

ELISA CAPTURA IgM

ELISA CAPTURA IgM: Infección reciente

PERSONAL DEL CNSP Y CNPB

CONTROL DE REACTIVIDAD: LAB. DE MET. VIRALES-CNSP

DESCRIPCION Valor IC (95%)

Sensibilidad (%) 98.67 96.50 100.00

Especificidad (%) 94.62 90.35 98.88

Índice de validez (%) 96.79 94.54 99.03

Valor predictivo + (%) 95.48 91.89 99.08

Valor predictivo - (%) 98.40 95.80 100.00

Resultados de Sen, Esp, IV, VPP, VPN eI Kappa

obtenidos mediante el programa Epidat.

GRUPOS NÚMERO

DIAS NÚMERO

MUESTRAS POSITIVOS %

A 1-2 44 6 13.64%

B 3-4 38 12 30.77%

C 5-6 23 12 47.83%

D 7-8 13 13 100%

E 9-10 7 7 100%

F 11- a más 12 12 100%

TOTAL 137 62

44% positividad en sueros de pacientes con < 5 días, porcentaje significativo como para considerar la necesidad de buscar anticuerpos IgM aun en este periodo de la enfermedad, dentro de la vigilancia del dengue.

ELISA CAPTURA IgG DENGUE

ELISA CAPTURA IgG: Infección

secundaria

ELISA INDIRECTA IgG: Infección

pasada

- ELISA de captura de IgG: INFECCIONES SECUNDARIAS.

- ELISA IgG Indirecta: DETECTA ANTICUERPOS DE MEMORIA.

Sensitivity and specificity of three ELISA-based assays for discriminating primary

from secondary acute dengue virus infection

Vanda Akico Ueda Fick de Souzaa, Adriana Fumie Tatenoa, Renato Reis Oliveiraa, Renan B.

Dominguesb, Evaldo Stanislau Araújoac, Gustavo W. Kusterb, Cláudio Sérgio Pannutia

OBJETIVO:

Evalúa tres métodos para discriminar infeccion primaria de secundaria basada en ELISA

(ELISA IgG captura, IgM/IgG ratio e IgG titer)

PRUEBA ELISA ANTIGENO NS1

• Detecta antígeno NS1

• Diagnostico temprano de dengue.

• Suero de 1-5 días

V. Kumarasamya, A.H. Abdul Wahaba, S.K. Chuab, Z. Hassana, Y.K. Chema, M. Mohamada and K.B. Chua. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue

virus infection. Journal of Virological Methods Volume 140, Issues 1-2, March 2007, Pages 75-79

Sensibilidad 93%

Especificidad 98% ??????

Sensibilidad (97.3%) en inf. aguda primaria

Sensibilidad (70.0%) en inf. aguda segundaria

VPP 100%

VPN 97.3%.

100.00%

55.00%

84.00%

56.00%

37.04%

58.59%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

1er día 2do día 3er día 4to día 5to día TE ≤ 5días

Sensibilidad ELISA NS1

50.00%

100.00%

91.30% 88.89% 90.00% 91.55%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

1er día 2do día 3er día 4to día 5to día TE ≤ 5días

Especificidad ELISA NS1 Tiempo de enfermedad

Especificidad ELISA NS1

n

1er día 50.00% 4

2do día 100.00% 38

3er día 91.30% 48

4to día 88.89% 43

5to día 90.00% 37 TE ≤ 5días 91.55% 169

* Comparado con la seroconversión de ELISA IgG

Tiempo de enfermedad

Sensibilidad ELISA NS1

n

1er día 100.00% 4

2do día 55.00% 38

3er día 84.00% 48

4to día 56.00% 43

5to día 37.04% 37

TE ≤ 5días 58.59% 169 * Comparado con la seroconversión de ELISA IgG

Evaluación de pruebas rápidas de detección NS1Ag, IgM e IgG

PRUEBA DIAGNÓSTICA

AgNS1 AgNS1 + IgM/IgG

Estándar Diagnostic, INC®

Sensibilidad 40.6% (31.7-49.5) 73.4% (65.4-81.5)

Especificidad 95.1% (89.8-100) 91.5% (84.8-98.1)

Pan Bio®

Sensibilidad 42.1% (31.7-49.5) 74.2% (66.1-82.3)

Especificidad 95.1% (89.8-100) 79.2% (69.9-88.6)

Detección IgA Anti-dengue

•ASSURE® Dengue IgA Rapid

99.4 sensibilidad en I. primaria

99.2 sensibilidad en I. secundaria.

99.2 Especificidad.

. INS: Evalua la utilidad de ELISA

como alternativa del Dx. Fase crítica.

Cultivo celular

C6-36 (glándulas salivales

Aedes albopictus.

LINEA C6-36 NORMAL

LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO

Aislamiento del virus Dengue

•Inmunofluorescencia Indirecta

Acs. Monoclonales específicos tipo

RT- PCR

•Diagnóstico

•Vigilancia

•Epidemiología Molecular

•Estudios etiopatogenia

•Vacunas

RT PCR Dengue Multiplex

RT-PCR EN DENGUE

Sensibilidad: 98%

Especificidad: 98%

Detecta

Cuantifica carga viral

PCR EN TIEMPO REAL

Diagnóstico Inmunohistoquímico en

muestras fallecidos FHD/SCD

Células Kupffer Necrosis Focal

CASO CONFIRMADO

•Resultado Positivo por RT-PCR.

•Resultado Positivo de aislamiento viral.

•Resultado Positivo a antígeno NS1.

•Resultado Positivo de IgM en una sola muestra

•Evidencia de seroconversión en IgG en muestras

pareadas.

INTERPRETACION DE RESULTADOS DE

LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO

DE DENGUE

PRUEBA RESULTADO INTERPRETACION OBSERVACION

ELISA NS1 1 -5 DIAS

POSITIVO CASO DE DENGUE (CON

CLINICA) inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune.

NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA

RT- PCR 1 - 5 DIAS

POSITIVO CASO DE DENGUE (CON

CLINICA) Contaminación

NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA

ELISA IGM 6 -10 DIAS

POSITIVO CASO DE DENGUE (CON

CLINICA) inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune,

lept. Malaria

NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA

ELISA IGG 1 -5 DIAS

POSITIVO INFECCION SECUNDARIA CON LA CLINICA Y PCR Y NS1

NEGATIVO INFECCION PRIMARIA

CUADRO DE RESULTADOS

Lab. Arbovirus-INS

Ingresar el

nombre de

usuario y

contraseña.

y hacer click en

“login”

REPORTE DE RESULTADOS POR INTERNET

(NET LAB)

RED DE LABORATORIOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE

Puerto Maldonado

Tumbes

Cajamarca

Piura

Chiclayo

La Libertad

Huaraz

Huancayo

Lima**

Huancavelica

Ayacucho

Arequipa

Bagua

Tarapoto

Pucallpa

Iquitos

Cusco

Abancay

Puno

Tacna

1 LAB. DE REFERENCIA NACIONAL

24 LAB. DE REFERENCIA REGIONAL

ELISA (IgM y Ag.NS1)

RT-PCR

4 DISAS - LIMA

LABORATORIOS

REGIONALES

CONCORDANCIA

(%) 2010

CONCORDANCIA

(%) 2011

TUMBES 85 100

PIURA 100 70

LAMBAYEQUE 90 100

LA LIBERTAD 100 95

LIMA ESTE 95 95

LIMA CIUDAD 100 95

AMAZONAS-BAGUA 100 100

LORETO 100 100

UCAYALI 100 100

MADRE DE DIOS 90 100

JUNIN 90 100

SAN MARTIN 100 90

LABORATORIOS

EVALUADOR PRUEBA

% DE

CONCORDANCIA

INSTITUTO DE MEDICINA

TROPICAL -PEDRO KOURI -

CUBA

ELISA IgM DENGUE

100

ELISA IgG DENGUE 100

RT-PCR DENGUE EN IMPLEMENTACION

INSTITUTO DE

ENFERMEDADES VIRALES

HUMANAS - ARGENTINA ELISA IGM HANTA 100

INSTTUTO ROBERT KOSH-

ALEMANIS

ELISA IgM

F.AMARILLA 100

RT-PCR F.AMARILLA

100

CDC-COLORADO

ELISA IGM -CHIK 100

RT-PCR - CHIK 100

Diversidad

Genética

Mutación

Recombinación

Flujo genético

Hospederos susceptibles

Población reservorio de

monos?

Virus con amplio rango de

propiedades patogénicas?

Selección de cepas para

incrementar

transmisibilidad (alta

viremia) y virulencia?

Factores que contribuyen a la diversidad genética del virus dengue

y dos consecuencias evolutivas posibles (Holmes y Burch, 2000)

DENV-1, 5 genotipos (I, II, III, IV y V).

DENV-2, 5 genotipos (América, América/Asia, Asiático I, Asiático II y Selvático, el cual es exclusivo de primates no humanos).

DENV-3, 4 genotipos (I, II, III, IV); algunas clasificaciones incluyen el genotipo V.

DENV- 4, 4 genotipos (I, II, III y Selvático, también exclusivo de primates no humanos)

Genotipos del DENV-2

Leroy EM, Nkoghe D, Ollomo B, Nze-Nkogue C, Becquart P, Grard G, Pourrut X, et al. Concurrent

chikungunya and dengue virus infections during simultaneous outbreaks, Gabon, 2007. Emerg Infect Dis

Vol. 15, No. 4, April 2009. Disponible en: http://www.cdc.gov/EID/content/15/4/591.htm

GENOTIPO

SELVÁTICO

GENOTIPO

ASIA I

GENOTIPO

ASIA II

GENOTIPO

AMÉRICA/ASIA

GENOTIPO

AMÉRICA

GENOTIPO

COSMOPÓLITA

Cepa Asia P4-1407

Cepas Africanas

0,02

Cepas Asiáticas

Cepa Australiana Cepa Asiática

Cepa Libreville 2007

100

100

100

96

100

100 100

Las secuencias que obtuvimos se agrupan con el

genotipo América-África, siendo el primer serotipo

que reingreso al Perú en 1,990

Se mantiene la circulación del mismo genotipo

desde su ingreso en el año 1,990.

Aunque se han establecidos clados distintos que

tienen correlación con el tiempo y espacio, se

puede observar la circulación de tres linajes.

Las secuencias que obtuvimos hasta el presente corresponden a los genotipos América que ingresó a Perú en 1,995 y al genotipo América-Asia que ingreso en el 2,001. Se evidencia la relación del genotipo América Asia con la presencia de dengue grave.

Árbol filogenético obtenido para la cepa DENV-2 Perú/ 121776510/ 2010

mediante el método de Maximum Likelihood

Se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-3 genotipo III o INDIA. Se observa que desde su ingreso a Perú, este genotipo presenta alta dispersión, formando linajes que se agrupan según los años y área geográfica, respectivamente. La presencia de este genotipo ha sido permanente a la fecha y esta relacionado con casos de DH.

Para el análisis también se consideraron secuencias reportadas al GENBANK por diferentes países a fin de establecer la distribución filogenética descritos por Rico-Hesse et. al. También se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-4 genotipo II o INDONESIA.

Genotipos circulantes en Perú SEROTIPO GENOTIPO AÑO DE INGRESO PERÚ

DENV-1 AMERICA-AFRICA 1990

DENV-2 AMERICA 1995

AMERICA-ASIA 2001

DENV-3 INDIA 2001

DENV-4 INDONESIA 2001

Den 4

Den 3

Den 2

Den 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100 110

90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11

Tasa de incidencia acumulada de dengue y serotipos. Perú 1990-2011*

Año

TIA

x 1

00

00

0

LINEAS DE INVESTIGACION EN DENGUE

• Prevalencia de serotipos en la población

• Identificación de genotipos

• Diseño y estandarización de nuevas herramientas

diagnosticas

• Implementación del diagnóstico diferencial

• Dinámica de transmisión del dengue en las diferentes

regiones.

• Evaluar e incorporar la IgA anti-dengue en suero saliva y

orina y comparar con la IgM.

• Aplicar la relación entre IgM/IgG específica para la proteína

E/M del virus del dengue para distinguir las infecciones

primarias de las secundarias.

• Vigilancia de virus en vectores.

Laboratorio de Microbiología y Biomedicina

Chorrillos, Lima

Investigar para proteger la salud

PREMIO A LA CREATIVIDAD EMPRESARIAL

Marco

Miguel Dina

Tomas Enrique

Susy Paquita Dana Noelia

MIEMBROS DEL LABORATORIO DE

METAXENICAS VIRALES