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DETECCIÓN DE FITOPLASMAS Y DESCRIPCIÓN DE SÍNTOMAS EN REPOLLO (Brassica oleracea L. var. capitata)

EN AGUASCALIENTES Y ZACATECASPhytoplasmas detection and description of symptoms in cabbage (Brassica oleracea L. var.

capitata) in Aguascalientes and Zacatecas

Yukari Guillén-Peralta, Luis Roberto Reveles-Torres y Rodolfo Velásquez-Valle

Campo Experimental Zacatecas – INIFAP, Km. 24.5 Carr. Zacatecas – Fresnillo, Calera de V. R., Zacatecas, México. CP 98500. e-mail:lreveles@zacatecas.inifap.gob.mx

RESUMENEl repollo, es una de las más importantes especies en la

familia Cruciferae. En los estados de Aguascalientes y Zacate-cas, México es un cultivo ampliamente distribuido, sin embargo, a la fecha no existen reportes actuales sobre las enfermedades de este cultivo en esta región. Últimamente, algunas plantas de repollo han mostrado síntomas relacionados con la infec-ción por fitoplasmas; por lo que el objetivo de este trabajo fue describir su sintomatología y detectar la presencia de fitoplas-mas por PCR. Los síntomas más comunes asociados con la infección por fitoplasmas fueron enanismo, deformación de in-florescencia, presencia de hojas pequeñas y de color amarillo o cloróticas; la raíz principal mostraba excesiva o baja producción de raíces secundarias. De un total de 26 muestras analizadas por PCR, el 38.5% resultaron positivas a la presencia de fito-plasmas; estos resultados hacen posible la asociación entre los síntomas mencionados y la infección por fitoplasmas.

SUMMARYThe cabbage is one of the most important species in the

Cruciferae family. In the states of Aguascalientes and Zacate-cas, Mexico, cabbage is a wide spread crop, however, to date there are no current reports on the diseases affecting of this crop in this region. Lately, some cabbage plants have shown symptoms related to the infection by phytoplasmas, so the aim of this work was to describe the symptoms as well as to de-tect the presence of phtoplasmas by PCR. The most common symptoms associated to phytoplasma infection were dwarfing, inflorescence deformation, presence of small, yellow or chloro-tic leaf; the main root showed excessive or too low secondary root production. A total of 26 samples were analyzed by PCR, 38.5 % were positive; these results make possible the asso-

ciation between the mentioned symptoms and the phytoplasma infection.

INTRODUCCIONEl género Brassica está integrado por 37 especies en el

mundo, cuya capacidad de adaptación a un amplio rango de condiciones climáticas, las convierte en hortalizas de gran inte-rés. Los tres cultivos más importantes de este género en Méxi-co son brócoli, coliflor y repollo, destinados a consumo interno y a exportación, principalmente como producto congelado a EUA (Casseres, 1980). Aunque el principal estado productor de bra-sicáceas en México es Guanajuato, también son importantes los estados de Nuevo León, Coahuila, Durango, Zacatecas, Michoacán y Jalisco. En el noroeste de la República existe un gran potencial de producción y se cultiva para consumos re-gionales y en ocasiones para exportación en fresco. El cultivo del repollo está clasificado como hortaliza de hoja y ocupa los primeros lugares en importancia en esta clasificación. La super-ficie sembrada a nivel nacional se estima entre 7,000 a 8,000 hectáreas según datos de la Dirección General de Economía Agrícola de la Secretaria de Agricultura y Recursos Hidráulicos, utilizándose exclusivamente para el consumo nacional (Nava y Cárdenas, 1995). La col o repollo se desarrollan en climas relativamente frescos y húmedos, pero se produce en una va-riedad de climas; la coliflor exige temperaturas frescas y am-bientes húmedos. Los principales problemas identificados por los productores al menos para repollo son: insectos plaga, falta de fertilidad en el suelo y enfermedades de la planta.

Con respecto a estos problemas, en los últimos años, se han incrementando las patologías producidas por fitoplasmas en diversos cultivos como jitomate, chile, frijol, nopal entre otros (Velásquez et al., 2011). Debido a que los fitoplasmas no se han podido aislar o cultivar en medios artificiales y a su restrictiva

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presencia en concentraciones muy bajas en el tejido del floe-ma de las plantas, hasta ahora la técnica de PCR es el único método eficiente y confiable para su detección e identificación (Bertaccini, 2007). Atribuyendo a que ciertas patologías como la presencia de viriscencia, filodia, proliferación de yemas o brotes grandes y amarillamientos como típicas sintomatologías causa-das por fitoplasmas, se han observado en parcelas de repollo, se creó la inquietud de determinar su sintomatología y detec-ción por PCR, el cual fue el objetivo de este trabajo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Toma de muestras en campoLas muestras de crucíferas se tomaron de parcelas comer-

ciales ubicadas en los municipios de Loreto, Zacatecas (una parcela); y Villa Juárez, Aguascalientes (dos parcelas), en las que se presentaban plantas con síntomas de la enfermedad. La recolección de muestras se llevó a cabo en los primeros meses de 2013. Para colectar plantas con síntomas de infección por fitoplasmas se realizó un recorrido por la parcela para detec-tar plantas con enanismo, amarillamientos u otros cambios de color, proliferación y malformación de hojas, malformación de inflorescencia (fruto). A las plantas sintomáticas se les tomaron fotografías para evidenciar las infecciones; también se tomaron muestras de plantas aparentemente sanas de la misma varie-dad, con la finalidad de corroborar los resultados sintomatolo-gía. Ambos grupos de muestras colectadas se identificaron y etiquetaron y fueron trasladadas al Campo Experimental Zaca-tecas del INIFAP.

Registro de síntomasEn las muestras colectadas se registraron síntomas asocia-

dos con enfermedades provocadas por fitoplasmas como cre-cimiento reducido, hojas anormalmente pequeñas y modifica-das, con pérdida de color verde o con coloraciones diferentes, proliferación de hojas y raíces, una vez concluido su proceso de caracterización fitopatológica, se tomaron fotografías de las partes dañadas de cada planta, se separaron por órganos (raí-ces, tallo y hojas).

Extracción de DNAA cada muestra se le extrajo DNA total por el protocolo de

Dellaporta et al., (1983), en la cual las muestras de los teji-dos son molidos en nitrógeno líquido y traspasados a un tubo Eppendorf de 1.5 ml; a este se le añadió 600 ml de Buffer de extracción (1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl ph 8.0, 2 % CTAB w/v, 1 % de b-mercaptoetanol) agitando la mezcla hasta homogeneizar. Las muestras fueron incubadas por 20 minutos a 65ºC. (homogenizando cada 3 minutos). Después de la incubación se le agregaron 600 ml de cloroformo-isoamil alcohol (24:1) (frío), y fueron mezclados con agitación por 15 minutos. Los tubos se centrifugan a 13,000 rpm por 15 minutos y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo conteniendo

600 ml de isopropanol frío. Las muestras se mezclaron y se dejaron a temperatura ambiente por 5 minutos. Enseguida se centrifugaron a 13,000 rpm por 15 minutos, el sobrenadante fue descartado y los tubos se invertidos por 5 minutos para secar la pastilla de ADN. Posteriormente la pastilla se resuspendío en 100 ml de buffer TE (Tris- EDTA 0.01 mM pH 8.0) y 100 ml de etanol al 100 %.

PCR- AnidadaLa primera amplificación, y la PCR anidada fueron hechas

utilizando los pares de primers universales, para amplificar se-cuencias de rRNA 16S de los fitoplasmas, P1/Tint y R16F2n/R16R2, respectivamente (Gundersen y Lee, 1996; Smart et al., 1996; Lee et al., 1998). Las PCR se realizaron en un ter-mociclador de Applied Biosystems con el programa: 1 ciclo de desnaturalización a 95°C durante 2 min y 30 ciclos adicionales con el siguiente programa: 1 min de desnaturalización a 94°C: 1 min de hibridación a 55°C, 2 min de polimerización a 72°C, y una extensión final de 72°C durante 5 min. Las muestras de extracción de DNA y los productos de PCR, se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y visualizados mediante luz ultravioleta (Smart et al., 1996).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSe analizaron un total de 26 muestras de repollo en tres

localidades, con sintomatología aparente. En la parcela de Loreto, Zac., las plantas muestreadas expresaban enanismo generalizado, deformación de inflorescencia (fruto) sin centro y reducida principalmente, presencia de manchas amarillas en general, hojas pequeñas mayoritariamente amarillas y con clo-rosis, la venación normal con bordes aserrados y el desarrollo de la raíz desde poca, pasando por normal y en algunos casos llegando a ser abundante. En la parcela 1 de Villa Juárez se observó también el enanismo en la mayoría de las muestras, la deformación de la inflorescencia fue rosetada, manchas amarillas en las hojas, gran variación en el tamaño de las hojas que podían mostrar un color verde o clorosis hasta amarillo, la venación desde poca a numerosa, bordes foliares aserrados y con poco desarrollo radicular. En la parcela 2 de Villa Juárez se observaron plantas con enanismo pero expresando otras sintomatologías características de la presencia de fitoplasmas como inflorescencias sin centro, hojas pequeñas y de color ver-de pero con venación numerosa y los bordes ondulados. Con respecto al desarrollo radicular este fue calificado visualmente como pobre o abundante (Cuadro1).

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Cuadro 1. Características sintomatológicas asociadas con la presencia de fitoplasmas en plantas de repollo en tres parcelas comerciales de Zacatecas y Aguascalientes, México.

Dentro del diagnóstico de la presencia de fitoplasmas por PCR anidado, para el municipio de Loreto, Zac, el 41.7% de las muestras resulto positiva. En el estado de Aguascalientes se encontró que para los sitios de muestreo (parcelas) uno y dos

en el municipio de Villa Juárez, los resultados positivos fueron del 80 y 22.2% respectivamente (Cuadro 2). De tal forma que de las 26 muestras de repollo, el 38.5% resultó positiva (Figura 1).

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Cuadro 2. Presencia de fitoplasmas en 26 muestras de repollo analizadas por PCR-Anidada y obtenidas en par-celas comerciales de Aguascalientes y Zacatecas, México.

Con respecto a la detección de fitoplasmas en diversos ór-ganos de la planta, se analizaron por medio de PCR muestras de hojas, tallos y raíces, encontrando presencia de esos pa-tógenos tanto en muestras de hojas y tallos procedentes de dos plantas, sin embargo se obtuvieron resultados negativos

para las muestras obtenidas de raíz de todas las plantas ana-lizadas. Es importante señalar que las muestras provenientes de la planta testigo (planta aparentemente sana, es decir sin ninguno de los síntomas mencionados), resultaron negativas (Cuadro 3).

Cuadro 3. Identificación de fitoplasmas en órganos de las plantas de repollo analizadas por medio de PCR.

.* Planta de repollo aparentemente sana

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Estudios recientes han demostrado que la distribución de estos patógenos dentro de las plantas hospederas es irregular (Sugio et al., 2011), y que diversos vectores pueden ser trans-misores de diferentes fitoplasmas causando distintas sintoma-tologías (Firrao et al., 2006; Gao et al., 2011; Hernández, 2005;

Kakizawa et al., 2006; Sugio et al., 2011); lo anterior explicaría, al menos parcialmente, la falta de consistencia en los resulta-dos de distribución de esos patógenos en los distintos órganos de repollo obtenidos en el presente trabajo.

Figura 1. Electroforesis en Gel de Agarosa de los productos amplificados por PCR-anidada de extractos de 18 individuos de Brassica oleraceae var. capitata. Amplificación de una banda de 1600 pb en las muestras de las

líneas 1,3, 6,7, 11, 12, 13, 14, 15, 17. Linea 18 individuo Sano. Control positivo línea (+). 1 kb marcador molecular Invitrogen (M).

El rango de infección de los fitoplasmas es amplio, afec-tando a una gran variedad de plantas con interés económico alrededor de todo el mundo (Hogenhout et al., 2008) por lo que es necesario continuar con los estudios que permitan la identi-ficación completa del o los fitoplasmas involucrados en la pro-ducción de los síntomas anteriores.

CONCLUSIONESEn plantas de repollo (Brassica oleraceae var. capitata),

colectadas en Aguascalientes y Zacatecas los síntomas de enanismo, malformación de hojas y de inflorescencia (fruto) y producción anormal de raíces secundarias se encontraron aso-ciados con la presencia de fitoplasmas.

Hasta donde sabemos este es el primer reporte de fitoplas-mas asociados con plantas de repollo en México.

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