UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA VICERRECTORÍA ACADÉMICA

ESCUELA DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES MAESTRÍA EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES CON ENFÁSIS EN

BIODIVERSIDAD

Infección natural de Catharanthus roseus con algunos fitoplasmas en

Costa Rica

Tesis presentada al Tribunal Examinador del Programa de Maestría de Manejo de Recursos Naturales de la Escuela de Ciencias Exactas y Naturales para

optar por el grado de Magister Scientiae con énfasis en gestión de la biodiversidad

William Alberto Villalobos Muller

Director de tesis: Lisela Moreira Carmona lisela.moreira@gmail.com Lector de tesis: Federico Albertazzi Castro falbertazzi@gmail.com

Lector de tesis: Carolina Godoy Cabrera cgodoy@uned.ac.cr

San José, Costa Rica

Julio, 2018

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ÍNDICE

Abstract 04

Introducción 04

Materiales y métodos 06

Resultados 08

Discusión 19

Agradecimientos 22

Resumen 22

Referencias 23

Conclusiones 32

Recomendaciones 33

Anexos

Anexo 1 34

Anexo 2 36

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Infección natural de Catharanthus roseus con algunos fitoplasmas en

Costa Rica

William Villalobos Muller Maestría en Manejo de Recursos Naturales, UNED. williamvillalobosm@gmail.com (Este trabajo fue sometido a la revista Biología Tropical para su publicación formal. Debe buscarse como: William Villalobos, Kristi Bottner-Parker, Ing-Ming Lee, Mauricio Montero-Astúa, Federico J. Albertazzi-Castro, Teresita Coto-Morales, Izayana Sandoval-Carvajal, Laura Garita, Lisela Moreira. Infección natural de Catharanthus roseus con algunos fitoplasmas en Costa Rica) Abstract: Catharanthus roseus (Apocynaceae) naturally infected with diverse phytoplasmas in Costa Rica. A survey on diseased Catharanthus roseus plants that exhibited symptoms reminiscent of phytoplasma infection throughout Costa Rica was conducted from 2012 to 2016. A total of 72 plants were collected showing virescence, phyllody, axillary proliferation, little leaf, leaf malformation, chlorosis and yellowing. All samples were tested by nested PCR using phytoplasma universal and specific primer pairs. Phytoplasma infection was detected in 59 of the plants collected. Phytoplasmas of six subgroups belonging to 16Sr- I, -III, -IX, -XIII and -XV groups were identified based on sequencing and in silico RFLP analyses. This work reports the first evidence of phytoplasmas infecting this host in six of the seven provinces in Costa Rica. Group 16SrXIII phytoplasma was detected for the first time in this country. To the best of our knowledge, this is the first report of natural infection of C. roseus with phytoplasma subgroups 16SrI-B, 16SrI-P, 16SrIII-F, 16SrIX-A, 16SrXIII-A, and 16SrXV-B in Costa Rica and Central America.

Key words: periwinkle, nested PCR, 16SrI, 16SrIII, 16SrIX, 16SrXIII, 16SrXV

Los fitoplasmas, anteriormente denominados organismos semejantes a micoplasmas, son procariontes diminutos y sin pared celular que se han relacionado con enfermedades en más de 1000 especies de plantas en todo el mundo (Lee et al. 2000, Bertaccini. 2007, Hogenhout et al. 2008, Zhao et al. 2009). Fueron descubiertos a través de estudios de microscopía electrónica, por un grupo de científicos japoneses en 1967 (Doi et al. 1967). Con base en los análisis filogenéticos que utilizan el gen 16S del ARNr y/o secuencias de genes de proteínas ribosómicas, los fitoplasmas se han colocado en la clase Mollicutes (Lim & Sears 1991, 1992, Gundersen et al. 1994). La infección por fitoplasmas interfieren en el desarrollo de la planta e induce cambios

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morfológicos y fisiológicos, como: escoba de bruja, filodia, enverdecimiento floral, proliferación de tallos, enrojecimiento de hojas y tallos, amarillamiento generalizado, atrofia y decaimiento (Hogenhout et al. 2008). Estos mollicutes son responsables del daño devastador a muchos cultivos, árboles frutales, árboles leñosos y plantas ornamentales de importancia económica en todo el mundo (Oshima et al. 2013, Maejima et al. 2014, Pagliari et al. 2016). A nivel mundial, en las últimas décadas, ha habido una alta frecuencia de enfermedades emergentes causadas por fitoplasmas tanto en cultivos como en plantas silvestres (Anderson et al. 2004). Algunas de estas enfermedades pueden causar la muerte del huésped, lo que resulta en un daño económico grave y pueden afectar la biodiversidad local.

En la naturaleza, los fitoplasmas viven y se reproducen en el floema de las plantas, así como en las glándulas salivales y otros tejidos de algunas especies de insectos que se alimentan del floema pertenecientes a las familias Cicadellidae, Cixidae, Psyllidae, Delphacidae y Derbidae, del orden Hemiptera. Las enfermedades producidas por fitoplasmas, se transmiten de una planta a otra a través de insectos vectores. Una combinación adecuada de varios hospederos vegetales e insectos vectores es responsable de la transmisión horizontal de fitoplasmas entre plantas (Weintraub & Beanland 2006, Bertaccini 2007, Marcone 2014). Algunos estudios sugieren la posibilidad de transmisión transovarial de fitoplasmas (Alma et al. 1997; Hanboonsong et al. 2002, Mittelberger et al. 2017).

Los fitoplasmas son difíciles de cultivar in vitro y por lo tanto, son bacterias mal caracterizadas (Bertaccini et al. 2010, Contaldo et al. 2012, 2016). Se han utilizado métodos moleculares que utilizan el gen 16S ARNr, altamente conservado, así como otros biomarcadores conservados, que incluyen proteínas ribosomales, genes tuf, secA y secY para la detección, diferenciación y clasificación de los fitoplasmas (Lee y col., 1993, 1998, 2000, 2010, Schneider et al. 1995, Seemüller et al. 1994, 1998, Marcone et al. 2000, Hodgetts et al. 2008, Quaglino et al. 2015). Según la clasificación molecular y las directrices establecidas por el Grupo de trabajo en taxonomía de fitoplasmas / espiroplasmas (IRPCM, 2004), los fitoplasmas se han clasificado actualmente en 43 especies de ‘Candidatus Phytoplasma’ (IRPCM 2004, Davis et al. 2016, Zhao & Davis 2016, Zhao & Davis 2016, Fernández et al., 2016, Miyazaki et al. 2017, Naderali et al. 2017).

Se han reportado infecciones por cuatro grupos de fitoplasmas (16SrI, 16SrIII, 16SrIX y 16Sr XV) en varios cultivos en Costa Rica (Gámez & León 1985, Kenyon et al. 1999, Pardo et al. 2014, Villalobos et al. 2002, 2011), pero no en Catharanthus roseus. Aunque la infección por fitoplasma natural de C. roseus ha sido reportada en varios países (Pérez-López et al. 2016b), hasta donde sabemos, no ha sido reportada en Costa Rica. C. roseus G. Don

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(Apocinaceae), comúnmente conocida como vinca, vinca de Madagascar, o mariposa en Costa Rica, es una planta herbácea perenne originaria de Madagascar. Se cultiva ampliamente como una planta ornamental y se puede encontrar en jardines y casas en las partes más cálidas de los países tropicales y subtropicales (Nejat et al. 2015). Las plantas de C. roseus infectadas con fitoplasmas se utilizan como huésped experimental para el mantenimiento de las cepas de fitoplasmas, así como para estudiar las interacciones entre el fitoplasma y el huésped (Nejat et al. 2013).

Con este trabajo reportamos los resultados de un muestreo realizado del 2012 al 2016, en el cual se buscaron repetidamente plantas enfermas de C. roseus que mostraron síntomas similares a los producidos por infecciones por fitoplasmas (Bertaccini 2007) en toda Costa Rica. Los síntomas asociados con enfermedades causadas por estos patógenos se observaron principalmente en jardines, parques, cercas y aceras. Este trabajo informa los hallazgos de infecciones naturales con diferentes fitoplasmas del subgrupo 16Sr en el país, los cuales fueron detectados mediante PCR anidada, secuenciación, RFLP in silico y análisis filogenéticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron muestras de un total de 73 plantas de C. roseus que presentaban diferentes síntomas relacionados con la infección por fitoplasmas (escoba de bruja, filodia, virescencia, amarillamiento foliar en grados variables, enanismo, etc.). Fueron recolectadas en jardínes, zonas verdes de aceras y parques en las siete provincias de Costa Rica [provincia de Alajuela: Alajuela, provincia de Cartago: Dulce Nombre, Paraíso, Turrialba; provincia de Guanacaste: Hojancha, Filadelfia, Cañas, Sámara; provincia de Heredia: Santo Domingo; Provincia de Limón: Cahuita; provincia de Puntarenas: Chomes, Esparza, Paso Canoas, Potrero Grande, Quebrada Grande, Tárcoles; y la provincia de San José: Coronado, Moravia, Pérez Zeledón, San Pedro, Sabanilla].

De cada muestra de C. roseus recolectada, se realizó una extracción de ADN a partir de las nervaduras y el pecíolo de la hoja (100 mg) utilizando el Mini Kit DNeasy Plant (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Además, se extrajo el ADN de plantas sanas de C. roseus cultivadas en un invernadero a prueba de insectos el cual se utilizó como control negativo. El ADN extraído de Sechium edule infectado con 16SrI-B fitoplasma (Villalobos et al. 2002) se utilizó como control positivo. Se extrajo el ADN de dos plantas de Gliricidia sepium, con síntomas de hoja pequeña de la gliricidia (“Gliricidia little leaf disease”, GLLD), colectadas en la Guácima de

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Alajuela, éstas se compararon con las secuencias de las vincas infectadas con el fitoplasma del grupo 16SrIX.

La detección de fitoplasmas se realizó mediante la amplificación del gen 16S del ARNr, utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada con el par de cebadores universales P1 / P7 (Deng & Hiruki 1991, Smart et al. 1996) en la primera reacción, seguido en la segunda reacción con el par R16F2n / R16R2 (Gundersen & Lee 1996a; Lee et al. 1994). Las amplificaciones se realizaron con un PCR Gradient Palm Cycler (Corbett Research Modelo CG1-96, Australia), en un volumen de 25 µL conteniendo 200 µM de cada uno de los cuatro dNTPs, 0.4µM de cada cebador, 1.5 mM MgCl2, 0.625 unidades de DreamTaq DNA polimerasa, (Thermo Fisher Scientific Inc., EE.UU.) y 1µL de ADN. El producto de PCR diluido (1: 20) de la primera amplificación se utilizó como plantilla en la PCR anidada. El programa de PCR consistió en 38 ciclos: desnaturalización a 94°C durante 1 minuto (2 minutos para el primer ciclo), hibridación a 55°C durante 1 minuto y extensión a 72 °C durante 2 minutos (10 minutos para el último ciclo). Los productos amplificados (5 µL) se evaluaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, se tiñeron con GelRedTM (Biotium, California, EE.UU) y se visualizaron en un transiluminador ultravioleta.

Secuenciación y análisis filogenéticos: Todas las muestras donde se obtuvieron amplicones (aprox. 1,2 Kb), se utilizaron para preparar nuevas reacciones y usando cebadores internos para la PCR anidada (Gundersen & Lee 1996a) se secuenciaron en ambas direcciones por el método de Sanger utilizando el servicio de Macrogen Inc. (Corea del Sur). Para cada muestra se obtuvo la secuencia final a partir de las secuencias en ambos sentidos usando el programa BioEdit (Hall 1999). Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias depositadas en GenBank usando la herramienta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Se seleccionó un representante de cada subgrupo encontrado en muestras de C. roseus y de dos muestras de Gliricidia sepium para la clonación y la secuenciación. Para ello, se realizaron amplificaciones de PCR semi anidado usando el par de cebadores P1 / 16S-SR en la primera reacción seguido de P1A / 16S-SR (Lee et al. 2004) en la segunda reacción para amplificar el gen 16S ARNr casi completo (aproximadamente 1,5 kb). Los productos de PCR anidados se purificaron usando PCR Kleen Spin Columns (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU) y se clonaron en Escherichia coli (TOP10) utilizando el TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron dos clones por muestra con un secuenciador de ADN automatizado (Macrogen Inc., Rockville, MD, EE.UU.). Se ensamblaron las secuencias usando el programa SeqMan del paquete bioinformático DNAStar LaserGene (DNAStar, Madison, WI, EE.UU) y se obtuvo una secuencia

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consenso para cada clon. La herramienta iPhyClassifier (Zhao et al. 2009) se utilizó para generar in silico los perfiles de RFLP para determinar la clasificación del grupo y subgrupo de fitoplasmas (Wei et al. 2007). Además, se realizó una búsqueda de secuencias similares depositadas en GenBank utilizando la herramienta BLAST (Blastn).

Las secuencias de los clones obtenidos de C. roseus se depositaron en el GenBank y se encuentras disponibles con los números de acceso MH428957 a MH428964. Además, las secuencias de GLLD costarricense fueron depositadas y están disponibles como MH428965 y MH428966.

Las secuencias de representantes de subgrupos obtenidas en este estudio, así como 29 cepas de fitoplasmas disponibles en GenBank y Acholeplasma palmae J233 (como grupo externo) se alinearon usando ClustalW (Thompson et al. 1994) en MEGA v6.0 (Tamura et al. 2013). El análisis filogenético se realizó a través del Método de Máxima Similitud. La estimación de la estabilidad y el soporte para los clados inferidos se realizaron utilizando 1000 iteraciones (“bootstrap”).

RESULTADOS

Se recolectó un total de 73 muestras de C. roseus en diferentes regiones del país. Se detectó infección por fitoplasmas en el 82.2% (60/73) de las muestras analizadas por PCR anidada (Cuadro 1). Los síntomas predominantes encontrados en las muestras positivas fueron proliferación, virescencia y filodia. Además, se detectó infección por fitoplasma en una planta que presentaba tallos elongados (Fig. 1).

De acuerdo con los resultados de búsqueda con BLAST, se detectaron fitoplasmas pertenecientes a grupos: 16SrI, 16SrIII, 16SrIX, 16SrXIII y 16SrXV en muestras de vinca positivas. No se encontraron infecciones mixtas, a pesar de la presencia de dos o tres fitoplasmas diferentes en algunos lugares (Cuadro 1).

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CUADRO 1 Número de muestras según síntoma observado en Catharanthus roseus infectados con fitoplasmas, recolectadas en Costa Rica, 2012-2016.

Síntomas Grupo de fitoplasma Total

16SrI 16SrIII 16SrIX 16SrXIII 16SrXV Elongación de tallos 1 --- --- --- --- 1 Filodia + hoja pequeña + proliferación de tallos

2 --- --- --- --- 2

Enverdecimiento 14 2 1 1 1 19 Enverdecimiento + engrosamiento de bases florales (big bud)

--- --- --- --- 1 1

Enverdecimiento + filodia 1 --- --- --- 1 2 Enverdecimiento + proliferación 1 --- --- --- --- 1 Enverdecimiento + proliferación + hoja pequeña

2 --- --- 1 --- 3

Enverdecimiento + hoja pequeña + achaparramiento + entrenudos cortos

--- 3 --- --- --- 3

Enverdecimiento + amarillamiento 1 --- --- --- --- 1 Amarillamiento 8 9 2 --- --- 19

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Fig. 1 Síntomas presentados por plantas de vinca infectadas con fitoplasmas incluyeron A) amarillamiento, enanismo, hoja pequeña y brotación múltiple axilar, B) enverdecimiento floral, C) aborto y deformación floral, D) tallos elongados, E) base floral engrosada, F) filodia

La mayoría de las secuencias nucleotídicas obtenidas de plantas positivas (30 de 53 secuencias) indicaron infección con 'Ca. Phytoplasma asteris', con porcentajes de similitud entre 98-99% con representantes del subgrupo 16SrI-B. Las plantas infectadas con este subgrupo se encontraron en seis de las siete provincias del país (Cuadro 2). Sólo una vinca infectada con síntomas de

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elongación de tallos, detectada en la ciudad de Turrialba (provincia de Cartago), mostró un 97% de similitud con el subgrupo 16SrI-P (GenBank AF503568).

CUADRO 2

Número de muestras de Catharanthus roseus según grupo de fitoplasmas detectado por provincia de recolección en Costa Rica.

Provincia Grupo de fitoplasma s Total

16SrI 16SrIII 16SrIX 16SrXIII 16SrXV Cartago 7 1 --- 1 --- 9 Guanacaste 6 --- --- 1 3 10 Heredia 1 1 --- --- --- 2 Limón 1 --- --- --- --- 1 Puntarenas 4 --- 1 --- --- 5 San José 11 12 2 --- --- 25 Total 30 14 3 2 3 52

La distribución altitudinal de los fitoplasmas encontrados, sugiere que el grupo 16SrI tiene una amplia distribución, mientras que los grupos 16SrIII y 16SrXV mostraron una presencia superior a 1200 m.s.n.m. o por debajo de 500 m.s.n.m., respectivamente (Fig. 2).

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Fig. 2 Distribución altitudinal (metros sobre el nivel del mar, m.s.n.m.) de muestras de Catharantus roseus según grupo de fitoplasmas detectado en este estudio realizado en Costa Rica.

El cuadro 3 muestra el resumen de los datos obtenidos utilizando la herramienta iPhyClassifier para analizar las secuencias del gen rRNA del fitoplasma 16S clonado en este estudio. Los patrones de RFLP virtuales de las secuencias representativas de 16SrI-B (GenBank MH428957, MH428960 y MH428964) fueron idénticos a la raza de referencia de este subgrupo. Sin embargo, la secuencia de la muestra identificada como subgrupo 16SrI-P (GenBank MH428961) mostró patrones RFLP idénticos a 16SrI-P con 16 de las 17 enzimas utilizadas, pero el patrón con la enzima HhaI no corresponde al de 16Sr I-P, pero es idéntico al de otras razas en el grupo 16SrI, sugiriendo un posible nuevo subgrupo dentro del 'Ca. Phytoplasma asteris’ en Costa Rica (Fig. 3A).

Grupo 16Sr de fitoplasmas

Alti

tud

(m.s

.n.m

.)

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CUADRO 3

Resumen del análisis de datos para las secuencias de fitoplasmas obtenidos en este estudio usando la herramienta iPhyClassifier.

Muestra ID

GenBank Número de accesión

'Candidatus Phytoplasma’ sp. asignada usando las razas de referencia El número de accesión del GenBank se indica en paréntesis.

Similitud de secuencia respecto al 'Ca. Phytoplasma’ sp. de referencia asignado

Coeficiente de similitud respecto al patrón de referencia de fitoplasma 16Sr grupo/subgrupo (GenBank número de registro)

Relación al grupo / subgrupo 16Sr asignado

Enzima de restricción clave

CR078 MH428957

'Ca. Phytoplasma asteris' (M30790)

99.5% 1.00; 16Sr I-B (AP006628) 16SrI-B, miembro Patrones RFLPs virtuales son

idénticos al de 16SrI-B CR41 MH428960 CR47 MH428964

99.6% 0.97; 16SrI-P (AF503568) CR02 MH428961 16SrI, tentativo nuevo

subgrupo HhaI, patrón corresponde al de 16SrI-B y no al de 16SrI-P

CR33 MH428959 'Ca. Phytoplasma pruni' rrnA’ (JQ044393) 99.1% 0.98, 16SrIII-F

(AF510724) 16SrIII-F, variante

BstUI, patrón corresponde al de 16SrIII-D y no al de 16SrIII-F

CR06 MH428962 'Ca. Phytoplasma phoenicium' (AF515636)

98.4% 0.97; 16SrIX-A (AF248957)

16SrIX, tentativo nuevo subgrupo RsaI, nuevo patrón

GLLDCR1 MH428965 98.3% 1.00, 16SrIX-F

(AF361017) 16SrIX-F, miembro Patrones RFLPs virtuales son idénticos al de 16SrIX-F GLLDCR2 MH428966

CR25 MH428958 'Ca. Phytoplasma hispanicum '(AF248960) 99.5% 0.98, 16SrXIII-H

(JX626329) 16SrXIII-H, variante MseI, patrón corresponde al de 16SrXIII-A y no al de 16SrXIII-H

CR14 MH428963 'Ca. Phytoplasma brasiliense' (AF147708) 99.2% 0.96; 16SrXV-A

(AF147708). 16SrXV, tentativo nuevo subgrupo HaeIII, nuevo patrón

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El segundo grupo en importancia, de acuerdo con el número de detecciones, fue el grupo 16SrIII (X-disease o 'Ca. Phytoplasma pruni'). Se detectó infección en once muestras obtenidas de jardines de tres provincias diferentes (Heredia, Cartago y San José) con fitoplasmas del grupo 16SrIII. La búsqueda de secuencias similares en las bases de datos públicas mostró un 99% de identidad con el fitoplasma de “Mexican Xalapa periwinkle virescence phytoplasma” (GenBank KY778009). El patrón RFLP virtual derivado del fragmento 16S rDNA R16F2n / R16R2 de la secuencia MH428959, registrada en el GenBank) fue muy similar al patrón de referencia del subgrupo 16SrIII-F (GenBank AF510724), con un coeficiente de similitud de patrón de 0,98, indicando que ésta es una variante de 16SrIII-F. La variación se observó en RFLP virtual con la enzima BstUI, el patrón mostrado corresponde a 16SrIII-D en lugar de a 16SrIII-F (Fig. 3B).

La presencia de otros tres grupos: 16Sr-IX ('Ca. Phytoplasma phoenicium'), -XIII ('Ca. Phytoplasma hispanicum') y -XV ('Ca. Phytoplasma brasiliense') se detectaron mediante el muestreo de ocho plantas en tres provincias (Cartago, Guanacaste y San José).

Cuatro muestras de vincas presentaron infección por fitoplasmas del grupo 16SrIX. Una muestra recolectada en Potrero Grande (Puntarenas) mostró similitudes de 99% con “Pigeon pea witches’-broom” (PPWB, GenBank KJ817866), “Crotalaria juncea witches’-broom” (GenBank KF941131), y otros. Se comparó con la enfermedad de “Honduran Gliricidia little leaf” (GLLD, GenBank AF361017), un fitoplasma del 16SrIX detectado previamente en Costa Rica, pero la identidad de la secuencia fue inferior al 98%. Sin embargo, las secuencias obtenidas en este estudio de Gliricidia sepium con síntomas de GLLD mostraron una identidad del 100% con el GLLD hondureño (GenBank AF361017).

Los RFLP virtuales obtenidos de la muestra de Potrero Grande (GenBank MH428962) mostraron un patrón de RFLP único de tres bandas cuando se usó la enzima RsaI (Figura 2a). Sin embargo, los RFLP virtuales con las 16 enzimas restantes en el iPhyClassifier mostraron patrones virtuales correspondientes con el subgrupo 16SrIX-A (PPWB, GenBank AF248957). Sin embargo, las secuencias de GLLD costarricense (GenBank MH428965 y MH428966) coincidían 100% con los patrones de RFLP virtuales con Hond- GLLD (IX-F, GenBank AF361017) con 16 de 17 enzimas, pero la enzima TaqI mostró un patrón como el de 16SrIX-C o 16SrIX-E. Los fitoplasmas del grupo 16SrIX encontrados en la vinca y Gliricidia en este estudio son diferentes entre sí, y ambos pueden representar variantes o tentativos nuevos subgrupos para el grupo 16SrIX (Fig. 3C).

La presencia del grupo 16SrXIII, 'Ca. Phytoplasma hispanicum 'en Costa Rica se detectó por primera vez en este estudio. En Dulce Nombre (Cartago) y

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Hojancha (Guanacaste) se recolectaron dos plantas que presentaron enverdecimiento y albergan este grupo de fitoplasmas. Las secuencias del gen de 16S ribosomal obtenidas y comparadas por BLAST con la base de datos del GenBank, mostraron una identidad del 99% con el “Mexican periwinkle virescence phytoplasma” (MPVP, GenBank AF248960). Según el análisis virtual RFLP, presentaron mayor similitud con el patrón de referencia del subgrupo 16Sr XIII-A (GenBank AF248960), con un coeficiente de similitud de 0,96, esto sugiere un posible nuevo subgrupo dentro del grupo 16Sr-XIII. Los RFLP virtuales mostraron patrones idénticos al subgrupo XIII-A, excepto un patrón único al emplear la enzima AluI (Fig.3D).

La infección de C. roseus por 'Ca. Phytoplasma brasiliense' estuvo limitada a la provincia de Guanacaste. Tres plantas que albergaban este subgrupo mostraron virescencia, pero una planta (CR03) recolectada en Samara (Guanacaste) presentaba filodia y base floral engrosada (Fig. 1e). Las secuencias del gen 16S rRNA obtenidas mostraron un 99% de similitud con las secuencias correspondientes a este fitoplasma que infectan a Vitis vinifera, Carica papaya, Crotalaria juncea, Hibiscus sp. y Guazuma ulmifolia, de Perú (GenBank KX670807-9, KX810334-6), Brasil (GenBank KF878382 y AF147708), y Costa Rica (GenBank HQ258882-3), respectivamente. Sin embargo, una comparación de RFLP in silico usando el iPhyClassifier mostró que el fitoplasma encontrado en la vinca en este estudio no es el mismo que se informó previamente en Costa Rica infectando a G. ulmifolia. De acuerdo con el patrón de RFLP virtual de GenBank accesión no. MH428963, el más similar fue el patrón de referencia del subgrupo 16SrXV-A (GenBank AF147708), con un coeficiente de similitud de 0,96, lo que sugiere que esta raza puede representar un nuevo subgrupo tentativo de 16SrXV. El análisis de los RFLP virtuales mostró un patrón de RFLP único y diferente con HaeIII a las cepas informadas previamente. Los 16 RFLP virtuales restantes mostraron exactamente los mismos patrones que los de 16SrXV-A (Figura 3E). El patrón virtual usando HpaII mostró diferencias entre este nuevo subgrupo provisional y 'Ca. Phytoplasma brasiliense' encontrado previamente en Costa Rica (subgrupo 16SrXV-B) (Fig. 3F).

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Fig. 3. Patrones RFLPs virtuales para los fitoplasmas detectados en el estudio respecto a los patrones mostrados en el grupo asignado: (A) 16SrI usando HhaI (MH428961: 16SrI-P*); (B) 16SrIII con BstUI (MH428959: 16SrIII-F*); (C) 16SrIX usando RsaI (MH428962:16SrIX-A∞); (D) 16SrXIII usando MseI (MH428958: 16SrXIII-H*); (E, F) 16SrXV con HaeIII y HpaII (MH428963: 16SrXV-A∞), obtenidos con el programa iPhyClassifier. Los números de registro del GenBank para cada subgrupo se muestran en paréntesis. Los variantes de subgrupos se indican con un asterisco, mientras que los potenciales nuevos subgrupos con el símbolo ∞. Los números de registro GenBank: KX810335 y HQ230579 en E y F corresponden a otras variantes en 16SrXV reportadas. Los carriles del marcador de peso molecular (MW) corresponden a fragmentos de ADN del bacteriófago ΦX174 RFI digerido con HaeIII, el tamaño de los fragmentos de arriba hacia abajo es: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72 pares de bases. Figura editada con Paint.net.

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La comparación del análisis filogenético basado en las secuencias del gen 16S ARNr de los subgrupos de fitoplasmas encontrados en este estudio mostró un agrupamiento en grupos 16Sr consistente con los datos obtenidos en el BLAST. El mismo agrupamiento filogenético consistente se encontró con representantes de los grupos 16SrIII, 16SrIX y 16SrXIII. Sin embargo, los representantes del subgrupo 16SrI-B y 16SrI-P, obtenidos en este estudio, se agruparon en conjunto en lugar de con secuencias relacionadas obtenidas de GenBank, lo que sugiere una posible relación debido al origen geográfico. La cepa representativa del grupo 16SrXV de C. roseus obtenida, está más estrechamente relacionada con las cepas del subgrupo 16SrXV-B cepas que el subgrupo 16SrXV-A (Fig. 4).

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Fig. 4 Árbol filogenético inferido del análisis de las secuencias del gen 16S rRNA por el método de Máxima Probabilidad empleando el modelo “General Time Reversible”, empleando 2500 iteraciones para respaldar la confiabilidad del análisis. El análisis incluyó 41 secuencias nucleotídicas, entre ellas 30 de Ca. Phytoplasma spp. y de los subgrupos de referencia previamente descritas, disponibles en el GenBank, además del aislamiento J233 de Acholeplasma palmae (NR_029152), como grupo externo, empleado para enraizar el árbol filogenético. Los números de registro en el GenBank para las secuencias empleadas se muestran en paréntesis y las obtenidas en este estudio se resaltan en negrita. Bar = 0.02 sustituciones nucleotídicas por sitio.

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DISCUSIÓN

En este estudio, se detectaron fitoplasmas en C. roseus naturalmente infectados, en seis de las siete provincias de Costa Rica (Kenyon et al. 1999, Pardo et al. 2014, Villalobos et al. 2002, 2011). Las secuencias del gen 16S ARNr indicaron que pertenecían a cinco grupos: 16SrI, 16SrIII, 16SrIX 16SrXV y 16SrXIII. Los primeros cuatro son los mismos que se identificaron previamente en otros cultivos en Costa Rica. El 16Sr XIII es un nuevo grupo identificado en C. roseus y también se detectaron tres nuevos subgrupos tentativos. Estos hallazgos muestran que las cepas de fitoplasma presentes en Costa Rica son más diversas y complejas de lo que se indicó previamente. Catharanthus roseus representa un nuevo huésped de fitoplasmas en seis provincias de Costa Rica. Esta especie ha sido reportada como huésped natural de los grupos de fitoplasmas 16SrI, 16SrIII, 16SrIX, 16SrXV, 16SrXIII, en otras regiones geográficas de América, excluyendo Centroamérica, se han realizado informes en América del Norte y del Sur, así como en la Cuenca del Caribe, por Lee et al. (1998, 2000), Montano et al. (2001b), Torres et al. (2004), Duduk et al. (2008), Galdeano et al. (2013), Dumonceaux et al. (2014), Barbosa et al. (2012), Caicedo et al. (2015), Pérez-López et al. (2014, 2016a), Davis et al. (2016).

De acuerdo con Montano et al. (2001b), C. roseus es un huésped experimental bien conocido para fitoplasmas, sin embargo, se han reportado pocas incidencias de infecciones naturales y su rol relacionado con la diseminación natural y la diseminación de la enfermedad es incierto. Sin embargo, visto desde otro ángulo, C. roseus puede usarse como un centinela fitosanitario en su entorno geográfico, como muestra este estudio.

En Costa Rica se han detectado razas de fitoplasmas del subgrupo 16SrI-B ('Ca. Phytoplasma asteris') asociadas a enfermedades que afectan a cultivos, árboles de paisaje y arbustos silvestres (Gámez & León 1985, Villalobos et al. 2002, Saborío-Rodríguez et al. 2006, 2007, Moreira et al. 2009). Dos epidemias asociadas con este subgrupo de fitoplasmas causaron pérdidas económicas severas a los productores de chayote (Sechium edule) durante 2001-2002, y a los productores de café durante 2006-2007 debido a la infección de árboles Erythrina poepigiana, que se usan como sombra para la producción de café en Costa Rica (Saborío-Rodríguez et al. 2006, 2007). En este estudio, 'Ca. Phytoplasma asteris' se detectó en el 56.7% de las plantas positivas, de las cuales el 96.4% eran del subgrupo 16SrI-B. Este subgrupo se detectó en seis provincias de Costa Rica (Cuadro 1). Se evidencia que este subgrupo de fitoplasmas es el más extendido en el país, probablemente su presencia durante mucho tiempo ha permitido más interacciones huésped-vector. Recientemente, se han detectado tres especies silvestres en Costa Rica como nuevos huéspedes en las familias Anacardiaceae, Asteraceae / Compositae,

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Euphorbiaceae y Rubiaceae para esta especie de Ca. phytoplasma (Villalobos et al. sin publicar), como ejemplo de lo mencionado anteriormente.

La variante de la raza 16Sr I-P encontrada en Turrialba (Cartago, GenBank MH428961) es un nuevo informe de fitoplasmas para Costa Rica y América Central. Este subgrupo fue informado por Seruga et al. (2003) infectando árboles de Populus nigra en Croacia. Sin embargo, los resultados de BLASTn de la muestra de Turrialba, mostró similitudes del 99% con otros fitoplasmas hallados en América del Norte, incluyendo a C. roseus con virescencia recolectada en Yucatán, México (GenBank EF050085).

Respecto al hallazgo de fitoplasmas del subgrupo 16SrIII-F en C. roseus (cepa relacionada con "Ca. Phytoplasma pruni"), estas detecciones son el primer informe en Costa Rica. Este subgrupo se detectó previamente en un huésped diferente en la provincia de Cartago (Villalobos, datos no publicados) pero Pardo et al. (2015) informó otro subgrupo (16SrIII-L) en cultivos de yuca asociados con la enfermedad de “cuero de sapo” en Costa Rica. El grupo 16SrIII tiene una gran cantidad de subgrupos y diversidad de especies hospedadoras, así como una amplia distribución geográfica (Zhao et al. 2009), como ejemplo, el subgrupo 16SrIII-J se destaca por su presencia en varios hospederos y en varios países de Sur América principalmente (Galdeano et al. 2013, Pérez-López et al. 2016a).

En Costa Rica, la presencia de la enfermedad “Gliricidia little leaf disease” (GLLD), fue reportada por Kenyon et al. (1999); GLLD pertenece al grupo Pigeon Pea Witches Broom (PPWB) (16Sr IX, ´Ca. Phytoplasma phoenicium´). Sin embargo, la comparación de las secuencias aquí obtenidas de dos árboles de G. sepium con síntomas GLLD y C. roseus evidenciaron que el fitoplasma encontrado en C. roseus es diferente del asociado a GLLD y puede representar un nuevo subgrupo tentativo (Lee et al. 2012). Los RFLP in silico mostrados usando RsaI (figura 3c) sugieren un nuevo subgrupo tentativo. Se destaca que las infecciones naturales con 16Sr IX-A se informan por primera vez en el país. Su presencia en Costa Rica, en al menos dos sitios geográficamente distantes, el área sur (Potrero Grande, Puntarenas) y el Valle Central (San Pedro, San José), puede sugerir una alta probabilidad de encontrarse en otras áreas. Los síntomas en ambas ubicaciones geográficas son coincidentes con los informados previamente para el huésped y el subgrupo IX-A, como el enverdecimiento y el color amarillento (Fig. 1, Cuadro 1). Las secuencias obtenidas de las muestras de Costa Rica de GLLD, ahora se encuentran disponibles.

La infección natural de C. roseus por el grupo 16SrIX se informó previamente en Italia (Martini et al., 2007), Colombia (Duduk et al. 2008), Brasil (Barbosa et al. 2012) y Puerto Rico (Caicedo et al. 2015). Los encontrados en Colombia, Brasil y Puerto Rico pertenecen al subgrupo 16SrIX-A (Caicedo et al. 2015),

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mientras que un informe italiano corresponde al subgrupo 16SrIX-C (Martini et al. 2007).

Los fitoplasmas del grupo 16SrXV, 'Ca. Phytoplasma brasiliense', fueron reportados en Brasil infectando a Hibiscus spp. (Montano et al. 2001a) y a otros huéspedes, incluyendo C. roseus, Crotalaria juncea, Brassica oleracea, y Sida rombifolia (Montano et al. 2001b, Eckstein et al. 2011, Bianco et al. 2014, Canale & Bedendo, 2016). Además, está presente en Costa Rica, infectando a Guazuma ulmifolia (Villalobos et al. 2011) y Perú, infectando a Vitis vinifera y Carica papaya (Wei et al. 2017). El subgrupo costarricense ha sido designado 16SrXV-B y se considera que el fitoplasma encontrado en Perú puede ser una variante. Las plantas de C. roseus que muestran infección con 16SrXV se encontraron en diferentes lugares en la península de Nicoya (Guanacaste), donde la presencia de árboles de G. ulmifolia con GWB es frecuente. Aunque, en nuestro estudio, las secuencias mostraron un 99% de identidad con 'Ca. Phytoplasma brasiliense, pero los del subgrupo 16SrXV-B (GenBank HQ258882-3) mostraron sorprendentemente la menor similitud con él, mientras que las variantes 16SrXV-B de Perú (GenBank KX670807-9, KX810334-6) mostraron la mayor identidad. Como se mencionó anteriormente, la infección natural de C. roseus con este grupo de fitoplasmas se informó previamente en Brasil (Montano et al. 2001b), los síntomas reportados fueron coloración amarillenta y escoba de brujas, mientras que en Costa Rica mostró virescencia principalmente. Solo una planta (CR03) recolectada en Samara (Guanacaste) mostró filodia y base floral engrosada.

Los informes de fitoplasmas pertenecientes al grupo 16SrXIII se han concentrado en relativamente pocos hospedadores y ubicaciones geográficas restringidas, dentro de América del Norte y América del Sur, afectando a C. roseus, Solanum tuberosum, Carica papaya, Lycopersicum esculentum, Fragaria sp., Melia azedarach, Turnera ulmifolia, Dimorphandra spp. y Thunbergia erecta (Lee et al. 1998, Harrison et al. 2003, Arneado et al. 2007, Montano et al. 2011, 2015, Melo et al. 2013, Fernández et al. 2015, Alves et al. 2016, de Aquino -Melo et al. 2018). Este grupo se puede considerar como un ejemplo del rango de expansión de hospedantes y las cepas relacionadas en las Américas, ya que se designó en este momento, se han delineado nueve subgrupos (XIII-A a -J, -A / I), dos de ellos han ganado estado de 'Ca. Phytoplasma 'spp., XIII-A, el fitoplasma de la virescencia de “periwinkle“ mexicano (MPVP) y XIII-G, designado 'Ca. Phytoplasma hispanicum' (Davis et al. 2016) y 'Ca. Phytoplasma meliae' (Fernández et al. 2016), respectivamente. En este estudio, solo las plantas con el subgrupo XIII-A se recolectaron en la provincia de Cartago y Guanacaste y no se han detectado otros hospederos en el país para este grupo de fitoplasmas. Se requiere realizar análisis adicionales antes de saber si este fitoplasma representa un nuevo subgrupo, según el patrón de RFLPS virtual que se presenta en esta publicación.

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Como mencionan Gundersen et al. (1996b), la variación genética designada en algunas razas de fitoplasmas parece estar asociada con el aislamiento ecológico, las variantes tentativas y / o los subgrupos tentativos aquí observados en los fitoplasmas secuenciados pueden ser el resultado del aislamiento ecológico en el huésped de C. roseus así como en el área geográfica donde se le ubicó. De esta forma, las relaciones filogenéticas observadas con los representantes de fitoplasmas de 16SrI-B, 16SrI-P y 16SrXV pueden revelar las relaciones con las razas presentes en esta área geográfica. Por otro lado, como se mencionó anteriormente, la introducción accidental o intencional de fitoplasmas a una nueva región geográfica debe evitarse debido a los efectos que estos patógenos pueden causar a la biodiversidad. Ejemplos de esta situación aumentan cada año en los informes científicos sobre nuevas enfermedades, nuevos huéspedes o nuevos rangos geográficos que involucran a estos patógenos.

Este estudio amplía el conocimiento de los subgrupos de fitoplasmas en Costa Rica y en la región Centroamericana. Como se mencionó anteriormente, este es el primer informe de infección natural de C. roseus con los subgrupos de fitoplasmas 16SrI-B, 16SrI-P, 16SrIII-F, 16SrIX-A, 16SrXIII-A, 16SrXV-A. Con excepción del grupo 16SrI-B, ninguno de ellos ha sido reportados previamente en Centroamérica. Estos hallazgos identifican a C. roseus como un reservorio y fuente potencial de inóculos de fitoplasmas, sin embargo, esta especie de planta puede considerarse un centinela para informarnos sobre este tipo de patógenos que rodean nuestros cultivos y nuestra biodiversidad, así como sobre su diversidad genética.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Costa Rica por financiar la investigación a través de los proyectos 801-B3-091 y 801-A1-801.

RESUMEN

Catharantus roseus (Apocynaceae) naturalmente infectada con fitoplasmas en Costa Rica. Se realizó un muestreo desde el año 2012 hasta el 2016 de plantas de Catharanthus roseus que presentaban síntomas similares a los producidos por infecciones con fitoplasmas en difentes regiones de Costa Rica. Se recolectaron un total de 72 plantas con síntomas de virescencia, filodia, proliferación axilar, hojas pequeñas, malformación de las hojas y clorosis. Todas las muestras se analizaron mediante PCR anidada, usando cebadores universales y específicos para amplificar fitoplasmas. Se detectó infección por fitoplasmas en 59 de las plantas colectadas. Los fitoplasmas encontrados

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pertenecen a seis subgrupos, dentro de los grupos: 16Sr-I, -III, -IX, -XIII y -XV, los cuales se identificaron con base en la secuenciación y en el análisis de RFLP in silico. Con este trabajo se reporta la primera evidencia de que los fitoplasmas infectan a este huésped en seis de las siete provincias de Costa Rica. El fitoplasma del grupo 16SrXIII fue detectado por primera vez en el país. Hasta donde conocemos, este es el primer reporte de infección natural de C. roseus con los subgrupos de fitoplasmas 16SrI-B, 16SrI-P, 16SrIII-F, 16SrIX-A, 16SrXIII-A y 16SrXV-B en Costa Rica y en Centroamérica.

Palabras clave: Vinca, PCR anidado, 16SrI, 16SrIII, 16SrIX, 16SrXIII, 16SrXV

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CONCLUSIONES

Con los resultados obtenidos en esta investigación, contribuimos a conocer un poco más de la diversidad de fitoplasmas presentes en Costa Rica. Los datos recabados permitieron determinar que la diversidad presente en el país es mayor a la sospechada. Aquí se informa la presencia de dos nuevos grupos de fitoplasmas (16SrIII y 16SrXIII) y tres nuevos subgrupos (16Sr I-P, 16Sr IX-A y 16Sr XV-A), detectados infectando naturalmente a la especie Catharanthus roseus.

En el país se conocía la presencia de fitoplasmas de los grupos (16Sr I-B, 16Sr IX-H y 16Sr XV-B), sin embargo, el estudio permitió ampliar el ámbito de subgrupos presentes y además reconocer variantes para algunos de ellos que podrían posteriormente ser determinados como nuevos subgrupos.

Esto puede deberse a las interacciones insecto/patógeno o patógeno/planta, debido a la diversidad de insectos vectores que pueden participar en la transmisión de este patógeno y/o a que se han detectado en una especie vegetal diferente.

Se observó que los fitoplasmas del grupo 16SrI, son los más frecuentemente detectados, se encontraron en 6 de las 7 provincias de Costa Rica y desde 1 hasta los 1400 m.s.n.m. Esto nos indica el grado de adaptación del hospedero y este patógeno para su sobrevivencia, ya que este grupo se reconoce presente en el país desde la década de 1970 afectando maíz. Además sugiere que debe haber más de un vector en el país que puede transmitirlo en tan diferentes pisos altitudinales a diferencia de los otros grupos encontrados, la mayoría se encontraron en zonas de altitud más restringidas, sugiriendo menos especies de vectores potenciales o mayor especificidad del vector.

Podemos concluir que ninguno de los síntomas encontrados en las plantas analizadas se puede utilizar como referencia para correlacionar con algún grupo específico de fitoplasmas.

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RECOMENDACIONES

Es necesario realizar más análisis filogenéticos, con imprimadores de otras regiones del gen 16S rRNA, o bien otros genes, para determinar si las variantes genéticas encontradas, corresponden a nuevos subgrupos que deban ser descritos en futuros trabajos.

La hospedera encontrada de estos fitoplasmas es un reservorio para estos fitopatógenos y representan un riesgo potencial para generar enfermedades en cultivos de importancia económica, así como en nuestra flora autóctona acarreando peligro a nuestras áreas protegidas, por lo cual debe de hacerse del conocimiento de los encargados de fitoprotección en el país de la detección de estos patógenos.

Se recomienda mantener vigilancia en las zonas aledañas a los sitios de las detecciones de fitoplasmas realizados para determinar si no hay otros hospederos con síntomas de enfermedades causadas por éstos.

Es recomendable realizar estudios de los vectores asociados a los fitoplasmas detectados en el país para poder conocer un poco sobre eventuales riesgos de acuerdo a si los vectores determinados poseen hábitos de alimentación en pocas o muchas especies vegetales diferentes.

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Anexos:

Cuadro S1: Datos de las Catharanthus roseus incluidas en este estudio, de acuerdo al grupo 16Sr de fitoplasma detectado, se incluyen los síntomas y datos de los lugares de recolección en Costa Rica [localidad por provincia, localización georeferenciada y altitud (metros sobre nivel del mar, msnm)].

Código Síntomas GRUPO 16Sr Localidad Provincia Latitud; Longitud Altitud (msnm) CR01 Enverdecimiento 16SrI Turrialba Cartago 9º54'32.05”N; 83º41'14.60”W 673 CR02 Enlongación de tallos 16SrI Turrialba Cartago 9º54'32.05”N; 83º41'14.60”W 673 CR28 Enverdecimiento 16SrI Turrialba Cartago 9º54'32.05”N; 83º 41'14.60”W 673 CR35 Enverdecimiento 16SrI Dulce Nombre Cartago 9°50'44.46”N; 83°54'34.46”W 1343 CR36 Enverdecimiento 16SrI Dulce Nombre Cartago 9°50'44.46”N; 83°54'34.46”W 1374

CR38 Enverdecimiento, hoja pequeña, proliferación de tallos

16SrI Dulce Nombre Cartago 9°50'44.46”N; 83°54'34.46”W 1374

CR40 Enverdecimiento, hoja pequeña, proliferación de tallos

16SrI Dulce Nombre Cartago 9°50'44.46”N; 83°54'34.46”W 1374

CR13 Enverdecimiento 16SrI Santo Domingo Heredia 9º59'28.60”N; 84º 05'17.21”W 1193 CR04 Enverdecimiento 16SrI Samara Guanacaste 9°52'21.14”N; 85°30'28.11”W 10 CR05 Enverdecimiento 16SrI Samara Guanacaste 9°52'54.95”N 85°31'39.38”W 10 CR12 Enverdecimiento 16SrI Hojancha Guanacaste 10º03'24.02”N; 85º25' 07.39”W 354 CR48 Enverdecimiento 16SrI Hojancha Guanacaste 10º03'24.02”N; 85º25'07.39”W 354 CR26 Amarillamiento 16SrI Filadelfia Guanacaste 10º26'29.03”N; 85º32'57.68”W 22 CR27 Amarillamiento 16SrI Filadelfia Guanacaste 10º26'29.03”N; 85º32'57.68”W 22 CR07 Enverdecimiento 16SrI Paso Canoas Puntarenas 8°31'46.07”N; 82°50'20.42”W 122

CR08 Filodia, hoja pequeña, proliferación de tallos

16SrI Paso Canoas Puntarenas 8°31'46.07”N; 82°50'20.42”W 122

CR09 Filodia, hoja pequeña, proliferación de tallos

16SrI Paso Canoas Puntarenas 8°31'46.07”N; 82°50'20.42”W 122

CR39 Enverdecimiento, filodia 16SrI Potrero Grande Puntarenas 8°57'47.87”N; 83°10'08.09”W 362 CR37 amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84 º02' 41.30W 1228 CR42 Amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02' 41.30”W 1228 CR43 Amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84 º02' 41.30”W 1228

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CR44 Amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02'41.30”W 1228 CR47 Enverdecimiento 16SrI San Pedro San Jose 9°56'21.01”N; 84°02´41.43”W 1228 CR49 Amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02'41.30”W 1228 CR50 Amarillamiento 16SrI San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02'41.30”W 1228 CR78 Enverdecimiento, proliferación 16SrI Barrio Dent San Jose 9°56´16.25”N; 84°03'33.47”W 1191 CR45 Enverdecimiento 16SrI Moravia San Jose 9°57'23.72”N; 84°03'38.93”W 1199 CR41 Enverdecimiento 16SrI Perez Zeledon San Jose 9°21'20.67”N; 83°40'57.26”W 691 CR46 Enverdecimiento, Amarillamiento 16SrI Perez Zeledon San Jose 10º 21'20.82”N; 83º40'57.42”W 691 CR51 Enverdecimiento 16SrI Cahuita Limon 9°44´11.16”N; 82°50'25.09”W 7 CR11 Enverdecimiento 16SrIII Paraiso Cartago 9º50'24.24”N; 83º53'19.23”W 1374 CR20 Enverdecimiento 16SrIII Santo Domingo Heredia 9º59'28.60”N; 84º05' 17.21”W 1193 CR18 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02'41.30”W 1228 CR19 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02'41.30”W 1228 CR21 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02'41.30”W 1228 CR22 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02'41.30”W 1228 CR23 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02' 41.30”W 1228 CR24 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02' 41.30”W 1228 CR29 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02' 41.30”W 1228 CR30 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02' 41.30”W 1228 CR31 Amarillamiento 16SrIII San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84°02' 41.30”W 1228

CR32 Enverdecimiento, acortamiento de entrenudos, hoja pequeña

16SrIII Sabanilla San Jose 9°56'22.70”N; 84°01'51.84”W 1273

CR33 Enverdecimiento, acortamiento de entrenudos, hoja pequeña

16SrIII Sabanilla San Jose 9°56'23.63”N; 84°01'54.09”W 1273

CR34 Enverdecimiento, acortamiento de entrenudos, hoja pequeña

16SrIII Coronado San Jose 9°58'11.76”N; 84°00'03.72”W 1433

CR06 Enverdecimiento 16SrIX Potrero Grande Puntarenas 9º54'32.05”N; 83º41'14.60”W 168 CR16 Amarillamiento 16SrIX San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02' 41.30”W 1228 CR17 Amarillamiento 16SrIX San Pedro San Jose 9º56'21.41”N; 84º02'41.30”W 1228

CR10 Enverdecimiento, hoja pequeña, proliferación de tallos

16SrXIII Dulce Nombre Cartago 9°50'44.46”N; 83°54'34.46”W 1343

CR25 Enverdecimiento 16SrXIII Hojancha Guanacaste 10º03'24.02"N; 85º25'07.39”W 354 CR03 Enverdecimiento, big bud 16SrXV Samara Guanacaste 9°52'50.81”N; 85°32'06.42”W 10 CR14 Enverdecimiento, filodia 16SrXV Santa Cruz Guanacaste 10º15'24.43”N; 85º33'53.93”W 56 CR15 Enverdecimiento 16SrXV Hojancha Guanacaste 10º03'24.02”N; 85º25'07.39”W 354

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Anexo 2. Carta de aceptación de la Revista Biología Tropical, UCR.