desarrollo de un protocolo para el fraccionamiento de
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DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA EL FRACCIONAMIENTO DE
EXTRACTOS METANÓLICOS DE Cordyceps nidus USANDO
CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA Y DE CAPA DELGADA
Proyecto de grado
Por
JULIANA ROJAS RODRÍGUEZ
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Departamento de Ingeniería Química
Junio 2016
Desarrollo de un protocolo para el fraccionamiento de extractos metanólicos de
Cordyceps nidus usando cromatografía de columna y de capa delgada
Copyright 2016 Juliana Rojas Rodríguez
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA EL FRACCIONAMIENTO DE
EXTRACTOS METANÓLICOS DE Cordyceps nidus USANDO
CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA Y DE CAPA DELGADA
Proyecto de grado
Por
JULIANA ROJAS RODRÍGUEZ
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.
Co-Asesor, Juan Sebastián Chiriví Salomón, M.Sc.
Co-Asesor, Clara Elizabeth Quijano Celis, Ph.D.
Jurado, Felipe Salcedo Galán, Ph.D.
Director del Departamento, Oscar Álvarez Solano, Ph.D.
Departamento de Ingeniería Química
Junio 2016
iii
ABSTRACT
Development of a protocol for the division of methanolic extracts of Cordyceps nidus
using chromatography in opened column and thin-layer chromatography (June 2016).
Juliana Rojas Rodríguez, Universidad de los Andes, Colombia
Advisors: Rocío Sierra Ramírez, Ph.D., Juan Chiriví, M.Sc, Clara Elizabeth Quijano Celis,
Ph.D.
Species from the genus Cordyceps sensu lato have been traditionally used in
medicine since 300 years ago. Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris and
Cordyceps pruinosa are the most studied species. However, in this study we became
interested in the new species Cordyceps nidus, which is phylogenetically related with
these last two species and is pathogen of trapdoor spiders. In previous studies, raw polar
extracts from its mycelium showed the potential in pharmaceutical applications, and also
to enhance the ligninolytic activity of Pleurotus ostreatus. Nevertheless, chemical
complexity of these extracts has hindered the detection of their bioactive compounds. So
we aimed to develop a protocol for the separation of methanol raw extracts of C. nidus by
opened column chromatography. A gradient of n-hexane, n-hexane/ethyl acetate, ethyl
acetate, ethyl acetate/methanol, and methanol was chosen for an efficient separation of
raw methanol extracts of C. nidus when is cultured in brown rice medium. The resulting
fractions were analyzed by thin-layer chromatography and we also tested their effect when
iv
are supplemented in P. ostreatuss’substrate. Six groups of metabolites were identified
based on their polarity in thin-layer chromatography. Subsequently, we grouped the
resulting fractions in five fractions according to these six groups. Those, that are most
polar, presented the high activity in P. ostreatus. Nevertheless, the activity of these
fractions not reached the activity of controls made with the raw extracts (without
chromatography separation), suggesting a synergic activity between the most polar
fractions. We need to further study the synergy of these fractions to prove this last
hypothesis. In addition, we need to explore a specialized separation of these fractions to
identify the bioactive metabolites. This project opens the possibility to further study the
extracts of this fungus to guarantee its efficient application in any industry.
v
RESUMEN
Desarrollo de un protocolo para el fraccionamiento de extractos metanólicos de
Cordyceps nidus usando cromatografía de columna y de capa delgada (Junio 2016)
Juliana Rojas Rodríguez, Universidad de los Andes, Colombia
Co-Advisors: Juan Chiriví, M.Sc, Clara Elizabeth Quijano Celis, Ph.D., Rocío Sierra
Ramírez, Ph.D.
Los hongos que conforma el género Cordyceps sensu lato tienen un uso tradicional
desde hace 300 años en el campo médico. Dentro de las especies más estudiadas se
encuentran Ophiocordyceps sinensis, Cordyceps militaris y Cordyceps pruinosa. Sin
embargo, este estudio se ha centrado en una nueva especie, Cordyceps nidus, que es
patógena de arañas y está relacionada filogenéticamente con estas dos últimas. Estudios
anteriores han mostrado el potencial de sus metabolitos en el campo farmacéutico, así
como su aplicación para promover la actividad lignoceulolítica de Pleurotus ostreatus.
Sin embargo, la complejidad química de los extractos de esta especie de Cordyceps
presenta gran complejidad, debido a la posible presencia de diferentes surfactantes. Es por
esto, que la presente investigación buscó desarrollar un protocolo para el fraccionamiento
de los extractos metanólicos de C. nidus por medio de cromatografía en columna abierta.
Se definió un gradiente de n-hexano, n-hexano/acetato de etilo, acetato de etilo, acetato de
etilo /metanol, y metanol para la separación utilizando esta columna. Posteriormente, las
fracciones resultantes fueron analizadas por cromatografía de capa delgada y se probó su
vi
actividad al suplementarlos en el cultivo de P. ostreatus. Los resultados muestran que
existen 6 grupos globales de metabolitos, distribuidos en 5 grupos de fracciones. Los
mayores valores de actividad ligninolítica fueron encontrados en aquellos cultivos que
fueron inoculados con las fracciones más polares, siendo 2222.029 ± 262.105 U/L y
2551.101 ± 335.072 U/L correspondiente a los de mediana y alta polaridad,
respectivamente. Sin embargo, la actividad sumada de estas fracciones no superó la del
control realizado con el extracto más crudo, lo que sugiere una posible actividad sinérgica
por parte de los diferentes grupos de metabolitos. A futuro trabajo se requiere una
comprobación y una mayor caracterización de esta actividad sinérgica, así como la
separación más fina para identificar los compuestos bioactivos.
vii
AGRADECIMIENTOS
El principal agradecimiento se lo doy a mi familia, por el apoyo que me han
brindado a lo largo de mi carrera y sobre todo por el acompañamiento que me dieron
durante el desarrollo de este proyecto de grado. Así mismo por su amor incondicional,
fuente de inspiración parar lograra un trabajo realizado con perseverancia y cariño.
Adicionalmente agradezco muy especialmente a la Dra. Rocío Sierra Ramírez, ya
que sin su apoyo y sus consejos el proyecto no hubiera tomado un rumbo tan enriquecedor
en cuanto a conocimiento y aprendizaje. De igual forma a mis dos co-asesores: Juan
Sebastián Chiriví y a la Dra. Clara Elizabeth Quijano; quienes con su conocimiento y
paciencia me orientaron para realizar un trabajo con un alto nivel académico. Siendo lo
anterior un reto muy agradable de aceptar, al tener su apoyo incondicional para cualquier
inconveniente que se presentara en el camino. Agradezco al Dr Felipe Salcedo Galán, por
la retroalimentación realiza y por la atención e interés prestado a la investigación. Así
mismo a la Dra. Chiara Carazzone, quien brindó los reactivos necesarios para que la
investigación fuera realizada con éxito y la Dra Tatiana Sanjuan al ser una persona quien
con su conocimiento fundamentó y complementó el trabajo de investigación. Cabe realizar
un agradecimiento a Colciencias por el financiamiento de la investigación.
Un agradecimiento al Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de
los Andes por el apoyo en el desarrollo experimental al brindar los espacios y equipos
necesarios para lograr el resultado esperado. Igualmente, a Luis Miguel López Pérez,
quien como técnico de los laboratorios de Bioquímica docente y biotecnología, asesoró y
asistió el trabajo realizado en términos experimentales.
Finalmente, agradezco a mi grupo de trabajo; Norymar Becerra, Bárbara Valeria
Mejía, Juan Fernando Gamboa y a Simón Tadeo Haydar. Al estar acompañándome
viii
durante todo el proceso, aconsejándome y compartiendo opiniones para lograr el objetivo
planteado.
ix
NOMENCLATURA
ε Coeficiente de extinción del ABTS a 436 nm
𝜀0 Fuerza de elución
λ Distancia recorrida por el haz de luz
ABTS 2,2 azino bis (3-etilbenzo tiazolin-6 sulfónico)
Al2O3 Alúmina
A/t Pendiente de la curva: absorbancia / tiempo
BR Medio de arroz integral
°C Grados Celsius
CC Cromatografía de columna
CCF Cromatografía de capa delgada
CH Control de n-hexano
CN Cordyceps nidus
Cm Centímetros
CM Control de metanol
CSE Control sin extracto
Cu Cobre
EtOAc Acetato de etilo
F1 Fracción en n-hexano
F2 Fracción de Acetato de etilo
F3 Fracción de metanol
𝐹𝑑 Factor de dilución
x
G Gramos
μL Microlitro
LAMFU Laboratorio de Micología y Fitopatología
μm Micrometro
MeOH Metanol
Min Minutos
mL Mililitros
mM Milimolar
nm Nanometros
P/V Peso/Volumen (Concentración)
PO Pleurotus ostreatus
Rf Rate factor
rpm Revoluciones por minuto
SDAY Sabouraud Dextrose Yeast Agar
s.l. sensu lato
U/L Unidades de actividad/Litro
Vm Cantidad de la muestra del medio de cultivo
xi
TABLA DE CONTENIDO
ABSTRACT ..................................................................................................................... iii
RESUMEN ......................................................................................................................... v
AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................vii
NOMENCLATURA ......................................................................................................... ix
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xiii
LISTA DE TABLAS ....................................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 15
OBJETIVOS ..................................................................................................................... 17
MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 18
2.1 Género Condyceps sensu lato ............................................................................ 18
2.1.1 Actividad biológica de Cordyceps nidus .................................................... 18
2.2 Métodos de fraccionamiento ............................................................................. 19
2.2.1 Cromatografía en columna abierta ............................................................. 21
2.2.2 Cromatografía en capa delgada .................................................................. 23
2.2.3 Fraccionamiento de extracto en hongos ..................................................... 24
2.3 Pleurotus ostreatus y su actividad ligninolítica ................................................ 24
METODOLOGÍA ............................................................................................................ 26
3.1 Cepa de Cordyceps nidus .................................................................................. 26
3.2 Inóculo y cultivo de Cordyceps nidus ............................................................... 26
3.3 Extracción de metabolitos de Cordyceps nidus ................................................. 26
3.3.1 Pruebas de solubilidad ................................................................................ 27
3.3.2 Extracción por disolventes ......................................................................... 27
3.4 Cromatografía .................................................................................................... 28
3.4.1 Cromatografía de columna ......................................................................... 28
3.4.2 Cromatografía de capa delgada (CCF) ....................................................... 29
3.5 Evaluación preliminar de fracciones de Cordyceps nidus en Pleurotus
ostreatus. ....................................................................................................................... 29
3.5.1 Inóculo Pleurotus ostreatus y montaje en medio de cascarilla .................. 29
xii
3.5.2 Bioquímica de Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido: determinación de
glucosa 30
3.5.3 Bioquímica de Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido: medición de
actividad enzimática. ................................................................................................. 30
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................... 32
4.1 Pruebas de solubilidad ....................................................................................... 32
4.2 Elección del gradiente de disolvente y análisis de cromatografía en placa
delgada .......................................................................................................................... 33
4.3 Protocolo de separación de los extractos de Cordyceps nidus. ......................... 35
4.4 Actividad biologica de los extractos sobre Pleurotus ostreaus. ........................ 36
CONCLUSIONES ........................................................................................................... 39
TRABAJO FUTURO Y RECOMENDACIONES .......................................................... 40
REFERENCIAS ............................................................................................................... 41
ANEXOS .......................................................................................................................... 45
Anexo1: Medios de cultivo ........................................................................................... 45
Anexo 2: Proceso de extracción de metabolitos de Cordyceps nidus .......................... 47
Anexo 3: Cromatografía ............................................................................................... 48
Anexo 4: Montaje de Pleurotus ostreatus en cascarilla de arroz ................................. 50
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Adaptación de ciclo de vida de un hongo entomopatógeno del orden
Hypocreales ...................................................................................................................... 19
Figura 2. Fundamento del proceso de una cromatografía ................................................ 20
Figura 3. Montajes para realizar cromatografía de columna y esquema de separación de
dos componentes ............................................................................................................. 22
Figura 4. Estructura molecular de la sílica gel ................................................................ 22
Figura 5. Determinación de Rf, en donde A y B son compuestos diferentes .................. 23
Figura 6. Reacción enzimática de la lacasa. ..................................................................... 25
Figura 7. Diagrama del proceso de extracción. ................................................................ 28
Figura 8. Prueba de solubilidad del extracto metanólicos de C. nidus mediante: n-
hexano, cloroformo, acetona, EtOAc. .............................................................................. 32
Figura 9. Cromatografía en placa delgada de configuración de alta polaridad y
configuración de baja polaridad ....................................................................................... 33
Figura 10. Cromatografía en placa delgada para identificar los grupos en las fracciones
recolectadas. ..................................................................................................................... 35
Figura 11. Gráficas de actividad enzimáticas y concentración de glucosa Vs. tiempo .... 37
xiv
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Valor de Rf para cada grupo identificado ........................................................... 34 Tabla 2. Experimentos del procedimiento. ....................................................................... 36
15
INTRODUCCIÓN
El género Cordyceps sensu lato (s.l.) se encuentra conformado por organismos entomopatógenos
y aracnopatógenos del filo Ascomycota, por lo que algunas especies son utilizadas en control
biológico de plagas (Hard, 1906). Sin embargo, su aplicación en el campo médico ha sido mucho
más notorio, pues posee metabolitos con actividad biológica asociada a efectos nutracéuticos
(Zhao et al., 2014). En China, Ophiocordyceps sinensis (comúnmente denominado como “Dong
Chong Xia Cao” o Cordyceps sinensis) tiene un uso tradicional desde hace 300 años y lo utilizan
ampliamente para aliviar problemas renales, hepáticos y cancerígenos, entre muchos otros (Li et
al., 2006) (Holliday & Cleaver, 2008). Desafortunadamente, esta especie se encuentra en peligro
debido a la sobre-explotación de las especies silvestres y además de su enorme dificultad para
cultivarlo in vitro y a gran escala (Shrestha et al., 2012). Es por esto que otras especies se han
venido estudiando para utilizarlas como alternativa. Cordyceps militaris y Cordyceps pruinosa
son los candidatos más prometedores, pues su uso ha venido incrementándose y a sus extractos se
les atribuyen múltiples actividades biológicas. Por ejemplo, la cordycepina (3’-desoxiadenosina)
es utilizada como agente anticancerígeno, además se han mostrado efectos antimicrobianos,
antimetásticos y de carácter inmunológico e inflamatorio (Patel & Ingalhalli, 2013, Shrestha et al.,
2012). Sin embargo, estas especies se encuentran principalmente en Asia. En Colombia se cuenta
con una gran diversidad de Cordyceps spp., y dentro de las cuales resalta un clado asociado a
tarántulas (Sanjuan et al., 2015). Este grupo no ha sido descrito completamente, pero se encuentra
relacionado filogenéticamente con C. militaris y C. pruinosa. Cordyceps nidus, que infecta arañas
tramperas de la familia Idiopidae, pertenece a este grupo y presenta una ecología similar a la de
O. sinensis, pues la infección se da bajo suelo (Chiriví Salomón et al., 2015).
Con el objetivo de estudiar el potencial farmacéutico de C. nidus, Chiriví-Salomón y colaboradores
(2015) mostraron que los extractos metanólicos de este hongo presenta actividad antibacterial y
antioxidante, lo que al relacionarlo con el metaboloma se encontró que estos extractos presentan
más de 3000 metabolitos diferentes. Por otro lado, Rodríguez & Vega (2016) confirmaron que
estos extractos mejoraban la actividad lignícola de Pleurotus ostreatus al cultivarlo en cascarilla
de arroz. A pesar del gran potencial de esta especie, aún falta elucidar los compuestos bioactivos
16
que se relacionan con las actividades reportadas. Es así, como la presente investigación toma como
punto de partida las condiciones utilizadas previamente para estandarizar un protocolo de
fraccionamiento de los extractos metanólicos de C. nidus, y de esta manera entender sus
propiedades con mayor claridad.
17
OBJETIVOS
Objetivo general
Desarrollar un protocolo para el fraccionamiento de extractos metanólicos de Cordyceps nidus,
que pueda ser usado en estudios posteriores tendientes a determinar los metabolitos constituyentes
de dicho extracto.
Objetivos específicos
1. Evaluar la solubilidad de los extractos metanólicos de Cordyceps nidus a partir de la utilización
de diferentes disolventes variando la polaridad, con el fin de obtener mejor separación de
grupos de constituyentes.
2. Determinar el gradiente de disolventes adecuados para lograr el fraccionamiento de los
extractos metanólicos de Cordyceps nidus con base en los resultados obtenidos en
cromatografía de capa delgada.
3. Evaluar diferentes fracciones obtenidas de los extractos metanólicos de Cordyceps nidus en la
actividad lignícola de Pleutorus ostreatus para establecer cuáles fracciones son de interés, por
presentar las mayores actividades enzimáticas.
18
MARCO TEÓRICO
2.1 Género Condyceps sensu lato
Los hongos pertenecientes al género Cordyceps s.l. son organismos entomopatógenos y
aracnopatógenos, uno de los más diversos presentes en el trópico, debido a que estas especies
pueden causar epizootias1 en las poblaciones de arácnidos e insectos (Sanjuan et al., 2001). Una
de las principales características de estos hongos es la habilidad para producir esporas en diversos
ambientes, mediante lo cual se puede lograr diversas aplicaciones en campos de investigación
como lo es el control biológico (Hard, 1906). Por otro lado, el hongo ha sido utilizado en la
medicina China durante 300 años y fue inicialmente hallado por WangAng en 1894, en China el
hongo se conoce comúnmente como “Dong Chong Xia Cao” o Cordyceps sinensis, pero
filogenéticamente se ha propuesto un nombre más adecuado, Ophiocordyceps sinensis (Li et al.,
2006). Estos hongos se caracterizan por parasitar diferentes órdenes de artrópodos y presenta un
ciclo de vida complejo (Figura 1) (INBio, 2006).
Además, se han realizado diversos estudios debido a la diversidad de metabolitos secundarios y a
la presencia de compuestos biológicamente activos (sacáridos, nucleósidos, ácidos orgánicos
simples y esteroles), dichos metabolitos se han considerado promotores de diversos procesos como
la regulación en producción de enzimas (incrementado la actividad lignocelulolítica) (Zhao et al.,
2014). Diversos compuestos provenientes de Cordyceps spp. han sido caracterizados y analizados.
La cordycepina, el ácido cordicéptido, el ergosterol, algunos polisacáridos y los nucleósidos son
los compuestos que han sido asociados con actividad nutracéutica (Yue et al., 2013).
2.1.1 Actividad biológica de Cordyceps nidus
Dentro de la familia Cordycipitaceae se encuentra la especie Cordyceps nidus, dicho hongo es
patógeno de arañas juveniles, las cuales provienen principalmente de bosques montano húmedos
del neotrópico. Debido a que el estudio de dicha especie se encuentra en proceso, se puede decir
1 Enfermedad que se contagia simultáneamente a una gran cantidad de animales
19
que existe una cercanía a nivel molecular con las especies Cordyceps militaris y Cordyceps
pruinosa. Asimismo, se considera que la ecología del hongo se asemeja a la infección causada por
Ophiocordyceps sinensis, a pesar de darse en hospederos diferentes (Chiriví Salomón et al., 2015).
En cuanto al ciclo de vida del hongo, se evidencia una fase parasítica en donde se infecta a un
hospedero arácnido hasta causarle la muerte y en donde eventualmente se producen esporas para
realizar una nueva infección o para entrar en una fase saprofítica.
Figura 1. Adaptación de ciclo de vida de un hongo entomopatógeno del orden Hypocreales (Chiriví Salomón et al., 2015).
2.2 Métodos de fraccionamiento
Las técnicas de separación se pueden considerar como una operación que consiste en dividir una
mezcla en distintas partes con determinadas composiciones, con el objetivo de incrementar la
fracción molar de un componente de la mezcla (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988). Para
lograrlo, es necesario tener presente la técnica de separación a utilizar (filtración, decantación,
cristalización, sublimación, destilación, extracción o cromatografía), teniendo en cuenta el
fundamento de cada uno (López Sánchez et al., 2005). La importancia de dichas técnicas se
evidencia a la hora de su aplicación, que va desde análisis químicos hasta actividades de la vida
cotidiana (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988).
20
Una de las técnicas más utilizadas es la cromatografía, históricamente se reporta que desde 1905
W. Ramsey separó una mezcla de gases y vapores de un sólido adsorbente, utilizando carbón
activado (Satinder, 2003). A partir de esto se empieza un desarrollo de la técnica en donde el
objetivo es separar una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de
estos al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa), a través de un lecho cromatográfico
conocido como fase estacionaria (líquida o sólida) (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988),
mostrado en la Figura 2. Dentro del método de separación es necesario tener presentes dos
fundamentos; el remoto y el próximo. En el primero se identifican algunas propiedades de la
sustancia a analizar, bien sean físicas o físico-químicas; dentro de las cuales está la solubilidad,
adsorción, volatilidad, tamaño, carga, reactividad química, entre otras. Además se debe cumplir
que los componentes se encuentran en contacto entre sí y el equilibrio establecido entre estos debe
ser completo (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988). En cuanto al segundo fundamento, se
establece que las dos especies presenten dos de las propiedades identificadas, debido a que dichas
propiedades determinan la movilidad entre sí con respecto a la fase móvil. Por ende, se puede
decir que el fundamento de la separación en la cromatografía está dado por la diferencia de la
velocidad de migración de los componentes del sistema (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988).
Figura 2. Fundamento del proceso de una cromatografía (Portilla Salinas, 2009a).
21
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según sea el mecanismo de separación (tipos de
cromatografía) o dependiendo de la forma de operación (técnicas de cromatografía). Mediante el
primero se tienen los siguientes clases de métodos; cromatografía de adsorción (gas-sólido o
líquido-sólido), cromatografía por reparto (gas-líquido o líquido-líquido), cromatografía por
exclusión (gas-sólido o líquido-sólido), cromatografía de intercambio iónico (intercambio iónico
en resinas, material celulósico o inorgánico) y cromatografía por afinidad (Satinder, 2003). En
cuanto a la segunda clasificación, dependiendo de la forma en la que se separe se presentan 2
técnicas: en columna y capa delgada (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988). De igual forma se
pueden tener dos objetivos específicos a la hora de realizar el proceso, uno de ellos es conocer el
número de componentes que existen en la mezcla e identificarlos mediante una comparación
(cromatografía analítica) y el otro se basa en la separación de los componentes en la mezcla
(cromatografía preparativa)(Portilla Salinas, 2009a).
2.2.1 Cromatografía en columna abierta
Los principales elementos de una cromatografía de columna son las dos fases presentes, la
estacionaria y la móvil. La primera es un sólido poroso que se ubica en el interior de la columna,
la segunda fase hace referencia a la solución que de manera lenta va pasando por la fase
estacionaria. La fase móvil (eluyente) que pasa por la columna genera un flujo gracias a la presión,
la capilaridad y la gravedad (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988). El eluyente es seleccionado
según una serie eluotrópica en donde se listan los disolventes según su poder de elución, lo anterior
es medido mediante la fuerza de elución (𝜀0) (facilidad para formar enlaces de hidrógeno), en
donde se determina la energía de adsorción del disolvente con respecto a un compuesto de
referencia (alúmina, pentano-sílice, entre otros) (Reichardt & Welton, 2011) .En la Figura 3, se
puede observar que los compuestos que van eluyendo se van recogiendo en pequeñas fracciones
de pequeño volumen y se analizan según el método escogido (Portilla Salinas, 2009a). El uso de
esta técnica se hace a una escala preparativa (Portilla Salinas, 2009a). La columna es por lo general
un tubo cilíndrico, es necesario tener en cuenta que la columna se utiliza en procedimiento
relacionado con cromatografía liquida y de gases (Valcárcer Cases & Gómez Hens, 1988).
22
Figura 3. Montajes para realizar cromatografía de columna y esquema de separación de dos componentes (Portilla Salinas,
2009b).
En el proceso se puede utilizar una fase estacionaria en estado sólido de carácter polar (adsorbente).
La fase estacionaria es un sólido poroso (granulado) con centros activos polares en la superficie,
lugar en el cual son adsorbidas las moléculas de los compuestos a analizar (Portilla Salinas, 2009a).
El proceso se da gracias a las interacciones moleculares dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido y
enlaces de hidrógeno entre el absorbente y el soluto. Su aplicación tiene como objetivo el análisis
de la separación de los componentes en una mezcla, determinado por las interacciones polares de
cada uno con las fases estacionaria y móvil. Dentro de los absorbentes más utilizados se encuentra
la sílica gel y en menos medida la alúmina (Al2O3), en la primera las interacciones se dan en los
grupos Si-OH y Si-O-Si, su estructura se puede observar en la Figura 4 (Portilla Salinas, 2009a).
Figura 4. Estructura molecular de la sílica gel (Portilla Salinas, 2009a).
23
2.2.2 Cromatografía en capa delgada
El desarrollo del proceso se basa en que la fase estacionaria se coloca en una superficie plana
(tridimensional). El flujo de la fase móvil se consigue por capilaridad y gravedad (Satinder, 2003).
La fase estacionaria (adsorbente) forma una capa delgada de un espesor uniforme sobre una placa
de vidrio, plástico o una lámina de metal. La mezcla que se desea analizar es depositada en un
capilar a una pequeña distancia del borde y luego se introduce en una recipiente donde se encuentra
la fase móvil (eluyente) (Portilla Salinas, 2009a). Este último va a ascender por capilaridad a lo
largo de la capa y así van eluyendo los componentes de la mezcla a diferentes velocidades para
lograr la separación deseada. Además, existe un factor que relaciona las distancias recorridas por
los compuestos y por el disolvente desde el origen del cromatograma (resultado gráfico de la
cromatografía), que se representa como Rf (rate factor), esto evidenciado en la Figura 5 (Portilla
Salinas, 2009a). Un aspecto importante a tener en cuenta es que cada compuesto a ciertas
condiciones presenta un valor característico del factor, por lo que sólo se pueden hacer
comparaciones entre los factores de dos compuestos cuando los dos se eluyen juntos en la misma
placa (Portilla Salinas, 2009a). De igual forma al comparar los valores del factor de cada
compuesto se define la polaridad de estos.
Figura 5. Determinación de Rf, en donde A y B son compuestos diferentes (Portilla Salinas, 2009a).
24
2.2.3 Fraccionamiento de extracto en hongos
Debido a las múltiples aplicaciones de Cordyceps sp. en campos de medicina y ciencia, gracias a
la presencia de metabolitos promotores (enhancers) en procesos de ADN, caracterización celular
y demás (Kuo et al., 1994); se ha visto la necesidad de realizar procesos de extracción para
caracterizar e identificar aquellos metabolitos que intervienen en aquellas actividades biológicas,
y a los cuales se les atribuye múltiples beneficios medicinales. En estudios previos de C. sinensis,
con el fin de extraer metabolitos de interés, se realizan extracciones del micelio del hongo por
medio de disolventes para una posterior separación por medio de cromatografía de columna en
sílica gel (Kuo et al., 1994). Además, se ha evaluado la extracción disolvente-disolvente en C.
militaris variando la polaridad de estos (n-hexano, cloroformo y n-butanol) con el fin de determinar
la relación volumétrica mediante la cual se da una mejor extracción, y por ende la separación del
metabolito a analizar (Tuli et al, 2014). Asimismo se reportan análisis especializados para
purificar y aislar en aquellos compuestos previamente identificados, como lo es cromatografía
líquida en contracorriente “high-speed counter-current chromatography” (HSCCC, por sus siglas
en inglés) (Huichun et al, 2011), o la implementación de método de cromatografía por afinidad o
“high-performance countercurrent chromatography” (HPCCC) (Lin et al., 1999).
2.3 Pleurotus ostreatus y su actividad ligninolítica
Dentro del género Pleurotus, familia Pleurotaceae, se encuentra Pleurotus ostreatus, un hongo
que se desarrolla en la naturaleza preferiblemente sobre residuos de material leñoso o ricos en fibra
como troncos, ramas y bagazos (López-Rodríguez et al., 2008). Para el cultivo de P. ostreatus se
pueden utilizar materiales en donde se tengan sustratos lignocelulósicos, ya que el hongo se
caracteriza por su gran capacidad de degradación de estos, al presentar dos tipos de enzimas
oxidasa capaces de realizar dicho proceso: las peroxidasas y las lacasas (El-Batal et al., 2015).
Siendo un organismo de gran estudio para procesos de biodegradación de residuos, al presentar un
sistema enzimático extracelular con la capacidad de romper diferentes tipos de enlaces y así
degradar material orgánico (Rodríguez, Fernández, Bermúdez, & Morris, 2003). Es así, como se
25
ha identificado que las lacasas poseen una eficiencia como agente desintoxicante, generando el
desarrollo de tratamiento ecológicos para eliminar en un gran porcentaje el uso de productos
químico en procesos de degradación de material lignocelulódico, así mismo es considerado un
procedimiento económicamente viable (Sindhu, Binod, & Pandey, 2015). Mediante la Figura 6, se
puede decir que en cuanto a los mecanismos de reacción se sabe que la reacción de oxidación que
ocurre entre la lacasa y la lignina, se da al tener al oxígeno como aceptor de electrones para
reducirse a agua (generalmente como un sustrato fenólico) (Thurston, 1994). Finalmente se obtiene
la liberación de un electrón, para someter el proceso a un segundo proceso catalítico de la enzima
(Thurston, 1994). Dicha acción catalítica es favorecida por compuestos como 2,2-azino-bis-(3-
etilbenzotiazolin-6 sulfónico) (ABTS) y ácido 3-hidroxiantranílico, mediante los cuales se
obtienen mediciones de la reacción redox (Sindhu et al., 2015) , para así cuantificar la actividad
enzimática.
.
Figura 6. Reacción enzimática de la lacasa (Thurston, 1994).
26
METODOLOGÍA2
3.1 Cepa de Cordyceps nidus
Las cepa de los microorganismos a estudiar corresponde a cultivos monospóricos del hongo
Cordyceps nidus ANDES-F 1080, facilitado por el Laboratorio de Micología y Fitopatología de la
Universidad de los Andes (LAMFU). La cepa es mantenida en subcultivos en Agar Sabouraud y
Dextrosa suplementado con extracto de levadura al 1.00 % (P/V) (SDAY) a temperatura ambiente.
3.2 Inóculo y cultivo de Cordyceps nidus
El inóculo de C. nidus consistió en preparar una suspensión ajustada a 105 𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠 𝑚𝐿−2, que
son adicionados al caldo Sabouraud con dextrosa suplementado con extracto de levadura al 1.0 %
(P/V) (SDY) e incubados durante 3 días a 25 °C en oscuridad. Posteriormente los inóculos
incubados son agregados a medio de arroz integral (BR) para obtener biomasa suficiente para la
elaboración del extracto. Los cultivos se mantuvieron a 25 °C durante 4 semanas.
3.3 Extracción de metabolitos de Cordyceps nidus
La extracción de metabolitos globales de C. nidus se realizó mediante la utilización de metanol
como disolvente. Inicialmente el micelio del hongo es colectado y lavado con agua Milli-Q para
remover el medio de cultivo, y posteriormente se liofilizó y pulverizó con el fin de mejorar el
proceso de extracción de metabolitos intracelulares. La extracción consistió en la adición de 1 mL
de disolvente en 50 mg del micelio pulverizado, ayudando la lisis celular con un macerador de
plástico. El extracto se sonicó a 20 °C durante 6 min, centrifugó a 2000 rpm durante 10 min y filtró
por un poro de 0.22 𝜇𝑚 (Oh et al., 2014).
2 Las cantidades, reactivos y procedimientos se encuentran en Anexo1: Medios de cultivo., Anexo 2: Proceso de extracción de metabolitos de
Cordyceps nidus y Anexo 4: Montaje de Pleurotus ostreatus en cascarilla de arroz
27
3.3.1 Pruebas de solubilidad
Con el fin de purificar el extracto metanólico obtenido, además de determinar los disolventes a
utilizar en el proceso de cromatografía, se realizaron pruebas de solubilidad variando la polaridad
de los disolventes seleccionados. Partiendo del extracto metanólico (1 mL) se agregó 1 mL de
cada disolvente: n-hexano, acetato de etilo (EtOAc), metanol (MeOH), cloroformo y acetona.
Durante 3 minutos se agitó la solución para homogenizarla, posteriormente se centrifugaron a 20
°C a 13000 rpm durante 10 min. Aquellas muestras que no mantuvieron la emulsión fueron
seleccionadas para el fraccionamiento.
3.3.2 Extracción por disolventes
El extracto metanólico crudo se llevó a sequedad por medio de un baño tesmostatado en donde se
pone en contacto la muestra sólo con el vapor del baño (alcanzando una temperatura entre 60 °C
y 65 °C). Posteriormente, el deshidratado obtenido es mezclado con cada uno de los disolventes
seleccionados con base en su solubilidad. Los disolventes seleccionados fueron ordenados de
menor a mayor polaridad y la mezcla con 1 mL del disolvente fue asistida por un macerador. Una
vez se mezclaba el disolvente se sonicó a 20°C durante 6 min y centrifugó a 2000 rpm durante 10
min y hasta obtener dos fases: una líquida (fracción en n-hexano) y una sólida (precipitado). El
precipitado resultante es sometido al siguiente disolvente y se repitió el procedimiento hasta agotar
los disolventes (obteniendo así el número de fracciones). Al precipitado final se le realizó una
última extracción con metanol con el fin de recuperar los metabolitos que no fueron extraídos con
los disolventes anteriores, el procedimiento se puede observar en la Figura 7.
28
Micelio de C.nidus
Extractos
metanólicos crudos.
Disolvente 1
Sólido (Precipitado)
Disolvente 2
Sólido (Precipitado)
Sólido (Precipitado)
Disolvente n
Liofilizar y
pulverizar
Adición de MeOH y
maceración
Sonicar y centrigufar
Filtrar
Secar por
evaporación
Líquido
(Fracción 2)
Líquido
(Fracción n)
Líquido
(Fracción 1)
MeOH
Líquido (Extracto
purificado)
Figura 7. Diagrama del proceso de extracción.
3.4 Cromatografía
3.4.1 Cromatografía de columna
Se utilizaron 0.1 gr del extracto metanólico crudo del hongo llevado a sequedad por medio de
evaporación. El proceso se realizó en una columna de sílica gel 60, empacada con n-hexano,
utilizando un gradiente de concentración de los disolventes seleccionados en la sección 2.3.1
29
Pruebas de solubilidad. Las fracciones del proceso se colectaron y concentraron por medio de
evaporación, poniendo la mezcla en contacto sólo con el vapor (60 °C - 65 °C) (ver Anexo3); para
observar la composición mediante cromatografía en capa delgada.
3.4.2 Cromatografía de capa delgada (CCF)
Mediante una placa cromatográfica TLC Sílica gel 60 (20 x 20 cm) activada, se aplicaron las
diversas fracciones en la placa mediante un minicapilar (1.15 mm de diámetro), la cámara fue
saturada con la mezcla de disolventes escogidos n-hexano, EtOAc y MeOH, como fase móvil. La
cantidad de muestra aplicada fue ensayada previamente, dejando secar entre cada gota, una vez
aplicada la muestra se procedió a hacer la separación cromatográfica, durante aproximadamente
15 min, de modo que la longitud de corrida de la fase móvil llegara a 2 cm del borde, distancia que
permitió observar la separación de grupos de compuestos de acuerdo a la polaridad.
Posteriormente se dejó secar la placa a temperatura ambiente y se observó bajo la luz de una
lámpara UV a 234 nm (ver Anexo3).
3.5 Evaluación preliminar de fracciones de Cordyceps nidus en Pleurotus ostreatus.
3.5.1 Inóculo Pleurotus ostreatus y montaje en medio de cascarilla
Para el crecimiento del hongo se realizó inicialmente un pre-inóculo desde la cepa facilitados por
el Laboratorio de Micología y Fitopatología de la Universidad de los Andes (LAMFU) en medio
basal de agar y malta. Se tomaron 2 plugs de 10 mm cada uno y a agregaron a 100 mL de medio
basal-YMDA, se incuba en un shaker a 25 °C con agitación durante 5 días.
Para el montaje de P. ostreatus en medio de cascarilla de arroz, esta se preparó tamizándola
(tamices mesh: 8, 10, 12) para agregar 5.3 g a cada medio. Asimismo, para evitar contaminaciones
y eliminar impurezas se esterilizó en tres ciclos; dos ciclos cortos (15 min a 121 °C cada uno) y un
30
ciclo largo de 1 h a 121 °C). Posteriormente se tomó 1 mL del cultivo crecido de P. ostreatus en
medio basal de agar y malta. Adicionalmente se preparó 1 L de medio basal-YMDA; para esto, en
primer lugar se preparó un buffer citrato 20 mM ajustando un pH de 4.5 con HCl o NaOH
dependiendo de la acidez o alcalinidad de este, luego se adicionaron los demás reactivos.
Finalmente se esterilizó, para conserva se almacenó en una nevera a 6 °C.
3.5.2 Bioquímica de Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido: determinación de glucosa
Para determinar la cantidad de glucosa de los diferentes medios de cultivo se utilizó el Kit de
glucosa de Spinreact, que consiste en mezclar 1 mL del kit y 10 𝜇𝐿 de la muestra en una celda de
vidrio de espectrofotometría. Después de 10 min de reacción a 37 °C se midió la absorbancia en
el espectrofotómetro UV/visible Genesys con una longitud de onda de 505 nm (Berdugo
Arciniegas et al., 2014). Debido a la sensibilidad de la prueba, el procedimiento se realizó por
duplicado. Para determinar la concentración de glucosa se utilizó la Ecuación 1.
Ecuación 1 𝑨𝒃𝒔𝒐𝒓𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝑨𝒃𝒔𝒓𝒐𝒃𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒑𝒂𝒕𝒓ó𝒏 ∗ 𝟏𝟎𝟎 ∗ 𝟎. 𝟎𝟏 = 𝑪𝒐𝒏𝒄𝒆𝒏𝒕𝒓𝒂𝒄𝒊ó𝒏𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂 [𝒈/𝑳]
3.5.3 Bioquímica de Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido: medición de actividad enzimática.
La actividad enzimática de Pleurotus ostreatus se midió mediante el protocolo de ABTS (2,2-
azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6 sulfónico)) incoloro por espectrofotometría , teniendo en cuenta
que el ABTS se oxida cuando la lacasa se encuentra en actividad (Berdugo Arciniegas et al., 2014).
Se emplearon celdas de vidrio, en donde se agregaron 950 𝜇𝐿 de la solución de ABTS a 5 mM en
buffer acetato (20 mM y pH = 5.0) y 50 𝜇𝐿 de la muestra del extracto. Se leyó la absorbancia en
el espectrofotómetro UV/visible Genesys cada minuto por 10 min a una longitud de onda de 436
31
nm (Galhaup, Goller et al., 2002). Mediante la Ecuación 2 se puede determinar la actividad
enzimática.
Ecuación 2 𝑼
𝑳=
𝑨∗𝑽𝒕∗𝑭𝒅
𝒕∗𝜺∗𝝀∗𝑽𝒎
Donde A/t es la pendiente de la curva que relaciona la absorbancia con respecto al tiempo, Vt es
el volumen de la celda del espectrofotómetro (1 mL), 𝛆 el coeficiente de extinción del ABTS a 436
nm (29.3 [mM ∗ cm]) (Galhaup, Goller et al., 2002), λ es la distancia recorrida por el haz de luz
(1 cm) , Vm es la cantidad de la muestra del medio de cultivo y finalmente 𝐹𝑑 se refiere al factor
de dilución empleado (ver Anexo4). Lo anterior se da porque en ocasiones las muestras estaban
muy concentradas, siendo necesario diluirlas.
32
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Pruebas de solubilidad
Incialmente se realizó una prueba de solubilidad del extracto metanólico de Cordyceps nidus
obtenido, con el objetivo de determinar los disolventes a utilizar en la cromatografía en columna.
Se seleccionaron cuatro disolventes de distinta polaridad teniendo en cuenta la serie eluotrópica
de Snynder (fuerza de elución con respecto a alumina) (Reichardt & Welton, 2011) (ver Anexo3),
con el fin de asegurar la separación por polaridad del extracto a analizar. Aquellos disolventes en
los que se observaron dos fases fueron seleccionados para realizar el proceso de cromatografía, así
como aquellos que se usaron en el proceso de extracción por disolventes del extracto crudo del
hongo (Figura 8). Esto debido a que si son miscibles en el extracto metanólico no existiría
separación alguna, que se explica debido a que la diferencia de polaridad entre los disolventes
utilizados no es suficiente para observar una separación efectiva. En este caso fueron n-hexano y
EtOAc, cabe aclarar que la prueba no fue realizada para metanol porque el extracto crudo es
realizado a partir de este disolvente.
Figura 8. Prueba de solubilidad del extracto metanólicos de C. nidus mediante: A) n-hexano B) cloroformo C) acetona
D) EtOAc.
33
4.2 Elección del gradiente de disolvente y análisis de cromatografía en placa delgada
Una vez seleccionado los disolventes a utilizar, se procedió a escoger la relación de estos para la
cromatografía en columna, ya que son la fase móvil del procedimiento. Para esto, se realizó una
cromatografía de capa delgada (CCF) del extracto crudo metanólico de C. nidus, en donde se
evaluaron dos configuraciones de polaridad; en la primera la fase móvil (eluyente) fue de carácter
polar agregando una relación de n-hexano, EtOAc y MeOH (3:6:6) respectivamente. En cuanto a
la segunda configuración se evaluó una fase con una menor polaridad, teniendo una relación de n-
hexano, EtOAc y MeOH (5:4:1) respectivamente. De igual forma se determinaron la cantidad de
gotas a aplicar de la muestra con la ayuda de un minicapilar; en la primera sección (1) se aplicó 1
gota, en la segunda (2) se aplicaron 3 gotas y por último se en la tercera (3) se utilizaron 5 gotas.
Figura 9. Cromatografía en placa delgada de: A) configuración de alta polaridad B) configuración de baja polaridad
Mediante la cromatografía (Figura 9) se puede observar que la mejor configuración de disolventes
es aquella en donde se tiene una menor polaridad, debido a que existe una separación y por ende
se visualiza la agrupación de metabolitos del extracto del hongo. Por tanto el gradiente de polaridad
(concentración) de la columna abierta debe ir desde los disolventes menos polares a los más polares
(n-hexano: EtOAc: MeOH). Así mismo se determina que la cantidad de gotas a utilizar son 5, es
34
decir, que en la tercera aplicación (3) tanto para la primera configuración como en la segunda se
observan los grupos de compuestos. Finalmente se puede decir que mediante la cromatografía en
CCF se pueden identificar 6 grupos globales de compuestos o agrupaciones de estos. Cabe aclarar
que los compuestos de los grupos 2 y 3 don divididos en dos agrupaciones ya que las manchas de
estos están tan cerca que a simple vista no se alcanzan a percibir.
Para determinar la polaridad de los grupos identificados se calculan los Rf “rate factor” de cada
grupo observado, en la Tabla 1 se reportan los valores obtenidos. Esto es fundamental para decir
que en el grupo 6 se encuentran aquellos compuestos con una mayor polaridad, hacia la mitad de
la placa (grupo 5 y 4) aquellos que presentan una mediana polaridad y finalmente en los grupos 1,
2 y 3 se encuentran aquellas agrupaciones con menor polaridad.
Tabla 1. Valor de 𝑹𝒇 para cada grupo identificado
Sección Grupo
Distancia
(cm) Origen (cm) 𝐑𝐟 Polaridad
1
1 7.8 8 0.969 Menos polar
2 7.2 8 0.897 Menos polar
3 6.5 8 0.811 Menos polar
4 5.6 8 0.705 Medianamente polar
5 5.1 8 0.632 Medianamente polar
6 0.1 8 0.017 Más polar
2
1 7.8 8 0.974 Menos polar
2 7.2 8 0.900 Menos polar
3 6.8 8 0.854 Menos polar
4 5.6 8 0.704 Medianamente polar
5 5.0 8 0.626 Medianamente polar
6 0.2 8 0.019 Más polar
3
1 7.8 8 0.977 Menos polar
2 7.2 8 0.904 Menos polar
3 6.9 8 0.863 Menos polar
4 5.8 8 0.722 Medianamente polar
5 5.1 8 0.641 Medianamente polar
6 0.1 8 0.013 Más polar
35
4.3 Protocolo de separación de los extractos de Cordyceps nidus3.
Al determinar los disolventes a utilizar, así como el gradiente de concentración para la
cromatografía de columna, se procede a realizar el montaje experimental. La columna seleccionada
fue de 15 cm de largo por 1.24 cm de ancho, de sílica gel 60 empacada en n-hexano. Para realizar
la separación del extracto metanólico de C. nidus se utilizó 0.1 g de muestra. Inicialmente se dejó
correr n-hexano para verificar que no existiera alguna obstrucción en el sistema, posteriormente se
procedió a colocar la muestra concentrada en la parte superior de la columna y a continuación se
empezó a pasar la fase móvil seleccionada. Para este caso se seleccionó un gradiente de n-hexano,
n-hexano-EtOAc, EtOAc, EtOAc-MeOH, MeOH, en seguida se empezaron a colectar las
fracciones de 2 mL cada una. Al cabo de 5 hr se obtuvieron 50 fracciones, con las cuales se desean
identificar los grupos de metabolitos presentes en el extracto.
Figura 10. Cromatografía en placa delgada para identificar los grupos en las fracciones recolectadas.
Para identificar los grupos de compuestos obtenidos en las fracciones recolectadas (Figura 10)
luego de realizar cromatografía en capa delgada, se escogieron 5 fracciones (7, 12, 24, 36, 42), en
donde se corrobora lo descrito en la sección 4.2 (Elección del gradiente de disolvente y análisis de
cromatografía en placa delgada) al identificar que los compuestos menos polares se encuentran
3 El protocolo detallado se encuentra como documento adjunto: Protocolo para el fraccionamiento de extractos metanólicos de Cordyceps nidus
usando cromatografía de columna y de capa delgada.
36
dentro de las primeras 12 fracciones. Lo anterior debido a que al inicio del proceso se utilizó una
relación de disolvente con menor polaridad (n-hexano y EtOAc). En cuanto a las fracciones que
presentan una mediana polaridad se encuentran hacia la mitad de la placa (fracciones 13-35), al
utilizar un disolvente con mediana polaridad (EtOAc). Finalmente se puede decir que el grupo de
compuestos con mayor polaridad están al final del proceso (fracciones 36-50), en donde se utilizó
un disolvente extremadamente polar (MeOH). De igual forma, se corrobora lo obtenido calculando
los 𝑅𝑓 de las agrupaciones de compuestos observados; aquellos que están dentro de un rango
superior a 0.8 se consideran los de menor polaridad, los que se encuentran entre 0.79 y 0.3 se
clarifican como medianamente polares y finalmente aquellos que tienen un factor inferior a 0.29
son los de mayor polaridad (ver Anexo3).
4.4 Actividad biologica de los extractos sobre Pleurotus ostreaus.
Para tener una aproximación de aquellos grupos de metabolitos del extracto metanólico de
Cordyceps nidus, que presentan una mayor actividad enzimática en Pleurotus ostreatus. Se
utilizaron los disolventes seleccionados para realizar la cromatografía de columna (n-hexano,
EtOAc, MeOH). Una vez realizada la extracción descrita en la sección 2.3.2 Extracción por
disolventes, se obtienen tres fracciones; fracción en n-hexano (F1), fracción de EtOAc (F2) y una
última fracción de MeOH (F3). Así mismo se fijaron tres controles; control sin extracto (CSE),
control de n-hexano (CH) y control de MeOH (CM), la elección de estos se muestra en la
Tabla 2. Este último corresponde al extracto metanólico crudo del hongo. El procedimiento se
realiza con 4 réplicas, dando un total de 24 experimentos.
Tabla 2. Experimentos del procedimiento.
Fracción Control
n-hexano (F1) Control de n-hexano (CH)
EtOAc (F2) Control sin extracto (CSE)
MeOH (F3). Control sin extracto (CSE)
n-hexano (F1), EtOAc (F2), MeOH (F3). Control de metanol (CM)
37
Figura 11. Gráficas de actividad enzimáticas y concentración de glucosa Vs. tiempo de: A) CH B) F1 C) CSE D) F2 E) CM
F) F3
Mediante la Figura 11 se observa que el comportamiento de la glucosa tiende a ser descendente a
lo largo del tiempo, a diferencia de la actividad enzimática la cual incrementa a través de los días.
Lo anterior es un resultado esperado ya que el hongo va realizando un proceso de degradación de
lignina por parte de las lacasas. De igual forma se evidencia que la fracción de n-hexano (F1) tiene
una actividad de 1485.490 ± 388.317 U/L en el último día, y al compararla con su respectivo
control (CH) (2155.135 ± 691.076 U/L) se observa que la actividad en menor, lo anterior lleva a
descartar dicha fracción pues lo esperado es que se observe un aumento de la actividad enzimática.
38
Por otra parte se presenta que tanto la fracción de EtOAc (F2) como la fracción de MeOH (F3)
tienen una actividad enzimática similar; 2222.029 ± 262.105 U/L y 2551.101 ± 335.072 U/L
respectivamente. Además, con respecto al control sin extracto (CSE) se tiene un leve aumento de
la actividad, este último es de 2129.010 ± 1123.500 U/L. Además, si se comparan estas dos últimas
fracciones con respecto al control de MeOH (CM), en donde se tiene una actividad de 2625.814 ±
1086.414 U/L, se tienen valores muy cercanos. A pesar de no tener una mayor actividad que dicho
control, se puede decir que la actividad enzimática de interés está en aquellos grupos de
metabolitos pertenecientes las fracciones F2 y F3 (mediana y alta polaridad). Esto se debe a que
posiblemente las interacciones entre los grupos de metabolitos de alta y mediana polaridad sean
los que promuevan la actividad enzimática en P. ostreatus. Por lo cual los grupos obtenidos
mediante cromatografía de columna e identificados mediante cromatografía de placa delgada,
serían el 4, 5 y 6.
39
CONCLUSIONES
El fraccionamiento realizado a partir del extracto metanólico crudo de Cordyceps nidus, muestra
una agrupación de metabolitos en 6 grupos globales según sea su polaridad, teniendo en cuenta el
𝑅𝑓 “ratio factor” obtenido mediante cromatografía en placa delgada. Análogamente, al aplicar las
fracciones del extracto obtenidas mediante extracción con disolvente en Pleurotus ostreatus se
identifica que la acción delignificante de este se ve incrementada con aquellos compuestos que
presentan una mediana y alta polaridad. Siendo la fracción de EtOAc (F2) (2222.029 ± 262.105
U/L) y la fracción de MeOH (F3) (2551.101 ± 335.72 U/L) las que presentaron una actividad
enzimáticas similar al control del extracto metanólico crudo de C. nidus (CM) (2625.814 ±
1086.414 U/L). A diferencia de aquellos grupos de metabolitos que tienen una baja polaridad
1485.490 ± 388.317 U/L (1485.490 ± 388.317 U/L), pues se observa que la actividad enzimática
es inferior que el control CM.
Adicionalmente, en comparaciones realizadas con el experimento al cual no se le realiza ninguna
adición de extracto de C. nidus (CSE), con respecto a aquellos que tienen fracciones con mediana
y alta polaridad, se evidencia un incremento en la actividad enzimática del hongo en los
experimentos con dicha adición. Los resultados anteriores llevan a afirmar que los extractos de C.
nidus como alternativa de pre-tratamiento biológico de cascarilla de arroz con P. ostreatus, son
potenciadores de la actividad de degradación en material lignocelulósico y por ende de gran
viabilidad en términos ambientales.
Finalmente, de las pruebas de solubilidad se determinaron los disolventes a utilizar en los procesos
de separación, teniendo en cuenta que estos presentaran diferencias de polaridad. Dando como
resultado el uso de n-hexano, EtOAc y MeOH. Adicionalmente, se desarrolló un protocolo de
fraccionamiento de extractos de C. nidus mediante cromatografía en columna abierta. Utilizando
como fase móvil un gradiente de los disolventes seleccionados, el cual se determinó mediante
cromatografía en capa delgada.
40
TRABAJO FUTURO Y RECOMENDACIONES
En cuanto a trabajo futuro se recomienda realizar un análisis de separación especializado a aquellas
fracciones (F2 y F3) del extracto de Cordyceps nidus que mostraron una mayor actividad
enzimática en Pleurotus ostreatus. Al ser aquellas que tienen entre mediana y alta polaridad. Par
esto se propone purificar el extracto mediante cromatografía de columna y extracciones con
diversos disolventes.
Además, se plantea la posibilidad de utilizar métodos cromatográficos como HPLC preparativa
para obtener las fracciones en pequeña cantidad, siendo un procedimiento que requiere menor
tiempo y menor cantidad de disolventes. Así mismo, para identificar aquellos metabolitos
candidatos que promueven la actividad delignificante de Pleurotus ostreatus en medio de
cascarilla de arroz, se recomienda HLPC acoplado a espectofotómetría de masas.
41
REFERENCIAS
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45
ANEXOS
Anexo1: Medios de cultivo
Tabla.A1. 1: Cantidades de los reactivos para el medio de germinación de conidios de Cordyceps nidus
Reactivo Cantidad
Glucosa 30 g
Peptona 7.5 g
Levadura 7.5 g
Agua destilada 750 mL
Tabla.A1. 2: Cantidades de los reactivos para la preparación del medio arroz integral.
Medio de arroz integral
Reactivo Cantidad
Agua destilada 600 mL
Agar 9 g
Arroz integral 400 g
Tabla.A1. 3: Cantidades de los reactivos para la preparación del medio basal- Agar, malta
Medio basal- Agar, malta
Reactivo Cantidad
Levadura 3 g
Peptona 5 g
Agar 1.5 g
Malta 3 g
Glucosa 10 g
K2HPO4 1 g
MgSO47H2O 1 g
CaCO3 (2%) 0.2 g
Cloranfenicol 0.25 g
46
Tabla.A1. 4 Cantidades de los reactivos para la preparación del medio basal
Medio basal para P. ostreatus en cascarilla
Reactivo Cantidad
Glucosa 0.5 g
KH2PO4 2 g
MgSO47H2O 0.25 g
(NH4)SO4 0.9 g
CaCl2 0.1 g
KCl 0.5 g
Agua destilada 1000 mL
Tiamina 0.5 g
Ácido cítrico 2.1 g
Citrato de sodio
dihidratado
2.94 g
HCl 100 mL
Na OH 0.08 g
47
Anexo 2: Proceso de extracción de metabolitos de Cordyceps nidus
Figura.A2. 1: Procedimiento para realizar la extracción de C. nidus; A) Separar del micelio del medio de arroz B) liofilizar del
micelio C) Pulverizar el micelio liofilizado D) Agregar el metanol y macerar E) Sonicar y centrifugar la muestra para luego
filtrarla F) Evaporación del metanol G) Extracto metanólico crudo del hongo H) Extracción con n-hexano I) Extracción con
acetato de etilo.
48
Anexo 3: Cromatografía
Prueba de solubilidad
Tabla.A3. 1: Índices de polaridad de los disolventes seleccionados (Reichardt & Welton, 2011).
Disolvente Fórmula Fuerza de elución 𝜺𝟎 Índice de polaridad
n-hexano C6H4 0.01 0.009
EtOAc C4H8O2 0.57 0.228
Cloroformo CHCl3 0.4 0.259
Acetona C3H6O 0.56 0.355
MeOH CH4O 0.95 0.762
Cromatografía de columna abierta
Figura.A3. 1: Procedimiento en cromatografía de columna; A) Empacar la columna B) Agregar la muestra C) agregar n-
hexano D) Agregar acetato de etilo E) Agregar metanol F) Fracciones recolectadas.
49
Cálculo de 𝑹𝒇 de las fracciones colectadas
Tabla.A3. 2. Valores de 𝑹𝒇
Fracción Grupo Distancia Origen 𝑹𝒇 Polaridad
7 G1 7.80 8 0.975 Menos polar
7 G2 7.21 8 0.901 Menos polar
12 G1 7.70 8 0.963 Menos polar
12 G3 6.61 8 0.826 Menos polar
24 G4 3.64 8 0.455 Medianamente polar
24 G5 2.90 8 0.363 Medianamente polar
36 G6 0.14 8 0.018 Más polar
42 G6 0.12 8 0.015 Más polar
Cromatografía de placa delgada
Tabla.A3. 3: Procedimiento para realizar cromatografía de placa delgada: A) Realizar los tubos microcapilares B) aplicación
en la placa cromatográfica C) Montaje de la placa en el disolvente D) Separación de la muestra.
50
Anexo 4: Montaje de Pleurotus ostreatus en cascarilla de arroz
Figura.A4. 1: Procedimiento para el montaje y análisis de medio de cascarilla de arroz de Pleurotus ostreatus ; A) Preparar los
medios del experimento B) Inóculo del hongo C) Crecimiento del hongo al realizar los experimentos D) Prueba de glucosa E)
Prueba de ABTS.
Tabla.A4. 1.Valores de los factores de dilución para los experimentos de ABTS
Día Experimento Réplicas con dilución Fd
4 Ninguno Ninguno -
7 F2 1 y 4 20
11 CSE, CH, CM, F1, F2, F3 Todas 20
14 CSE, CH, CM, F1, F2, F3 Todas 30
Protocolo para el fraccionamiento de
extractos metanólicos de Cordyceps nidus
usando cromatografía de columna y de
capa delgada.
Universidad de los Andes
J., Rojas.
Título del procedimiento: Separación por
cromatografía en columna abierta de
extractos de C. nidus.
1. Introducción
1.1. La cromatografía es una técnica de separación propuesta inicialmente por el botánico ruso
M. Twest en la separación de pigmentos de plantas en 1905 (Satinder, 2003). Años más
tarde Stahl desarrolló la Cromatografía en capa fina (CCF) también llamada en capa delgada
muy usada tanto para resolver problemas de investigación como análisis de rutina. Se basa
en la repartición de los constituyentes que componen la mezcla entre dos fases una inmóvil
(llamada fase estacionaria), y otra móvil (fase móvil) la cual interacciona con la fase
estacionaria. De esta forma ocurre en cada momento muchos procesos de adsorción y
desorción a través de la fase estacionaria y de arrastre por la fase móvil (elución),
produciéndose la separación debido a las diferencias de las constantes de distribución de los
componentes de las mezclas entre estas dos fases (Satinder, 2003). De las clases de
cromatografía posibles como: cromatografía de adsorción, de reparto, por tamaño
molecular, de intercambio iónico, se escogió la cromatografía de adsorción en capa delgada
y en columna abierta, usando como fase estacionaria Silica Gel G-60 en cromatofolios
(Merck) y disolventes de diversa polaridad.
1.2. El procedimiento se basa en una separación por polaridad de los constituyentes que
conforman el extracto metanólico de Cordyceps nidus.
1.3. En el presente documento se muestran los procedimientos preliminares para el pre-
tratamiento de la muestra que permita obtener las mejores condiciones en la separación de
la mezcla de compuestos del extracto metanólico, que de acuerdo a ensayos preliminares
muestraron posible bioactividad en Cordyceps nidus.
2. Alcance
2.1. La clase de compuestos que se pueden separar mediante esta técnica son diversos, muy
rápidos, versátiles y económicos. Alternativas cromatográficas pueden ser usadas
dependiendo de la matriz a analizar y gracias al desarrollo de tecnología de punta estas
técnicas se pueden usar en diversos equipos, no sin antes haber realizado las pruebas
preliminares que permitan una óptima separación de la mezcla original o de sus fracciones.
2.2. No está dirigido a muestras tipo proteínico cuya separación ocurre por tamaño molecular
o biopolímeros.
3. Significancia y uso.
3.1. El procedimiento está diseñado, para muestras biológicas, en este caso específico para
obtener información que contribuya al conocimiento del tipo de compuestos que la
conforman.
3.2. Se muestran procesos de extracción, disolventes usados en las pruebas, gradiente de
disolventes para observar las mejores condiciones de separación de los compuestos que
conforman la matriz en estudio.
4. Aparatos
4.1. Cabina extractora de gases marca Labconco
4.2. Horno para activación de las placas Marca Thermo Fisher Scientific
4.3. Baño de maría eléctrico con regulador de Temperatura marca Gemmyco
4.4. Una unidad de lámpara ultravioleta para lectura de cromatoplacas a dos longitudes de onda
(254 nm y 365 nm) Cole-Parmer
4.5. Balanza analítica marca Vibra As220 ,sensibilidad 0,1 mg
5. Reactivos y materiales
5.1 Reactivos
5.1.1. Cromatoplacas de Sílica gel 60, base de aluminio, Marca Merck de 20 x 20 cm.
Granulosidad 5 – 6 𝜇𝑚
5.1.2. Silica Gel G-60 Marca Merk, granulosidad (0.063 – 0.0200 mm)
5.1.3. Hexano grado 1RA (40 mL)
5.1.4. Acetato de etilo grado 1RA (60 mL)
1 RA. Es reactivo analítico
5.1.5. Metanol grado 1RA (50 L)
5.2. Materiales.
5.2.1. Cámara de vidrio de borosilicato con tapa para placas desarrollo de cromatografía
ascendente en capa fina (CCF) de 20 x 20 cm. Las dimensiones del tanque son: 27
cm de ancho, 7 cm de profundo y 26 de alto, provisto de tapa.
5.2.2. Vasos de precipitado de 250, 150, 100 mL.
5.2.3. Embudos de vidrio con pistilo de 8 cm (2 unidades)
5.2.4. Columna cromatográfica de 15 cm de largo por 1,24 cm de ancho provista con llave
de paso en teflón y vidrio sinterizado.
5.2.5. Tubos de ensayo de 10 mL por 1 cm de diámetro (100 unidades) para recolectar
fracciones. Si se usa la columna más grande se aconseja un número superior a 400
unidades de tubos de ensayo. (Como alternativa se puede usar en recolector de
fracciones automático)
5.2.6. Caja de tubos capilares para aplicación de muestras que deben ser elaboradas
manualmente con temperatura, para angostarlas.
5.2.7. Tubos Eppendorf de 0.5 a 2ml con tapa y de material resistente a los disolventes de
100 a 400 unidades, según la cantidad de muestra a separar y la columna de
cromatografía a usar.
5.2.8. Pipetas de Pasteur provistas de goma (1 caja de 100 unidades)
5.2.9. Un rollo de papel aluminio
5.2.10. Gradillas para tubos de ensayo
5.2.11. Agitador de vidrio macizo (15 a 18 cm x 5 mm)
5.2.12. Minicapilares (1.15 mm de diámetro)
5.2.13. Mechero Bünsen
5.2.14. Probetas de 25 y 10 mL.
6. Consideraciones de seguridad.
6.1. Debido a la volatilidad de los disolventes es necesario trabajar dentro de la cabina de
extracción, para evitar intoxicación especialmente por Metanol.
6.2. Guantes de nitrilo para evitar el contacto con el disolvente
6.3. Uso de gafas de protección
6.4. Recolector de residuos de disolventes.
6.5. No colocar mechero cerca del sistema de disolventes. Guardar los reactivos en frascos
oscuros y en sitio frio.
6.6. Manipular la cromatoplaca siempre con guantes, no tocar la sección de sílica gel con las
manos.
7. Procedimiento.
7.1. Siga el diagrama expuesto en la Figura 1 para ver el procedimiento adecuado según la
muestra que desea analizar2.
Figura 1. Diagrama del proceso de cromatografía por columna abierta.
7.2. Observar la separación cromatográfica en capa delgada por medio de lámpara UV a una
longitud de onda de 254 nm (Figura 2).
2 Importante no dejar secar la columna en la parte superior, mantenerla con disolvente de elución.
Mediante CCF
escoger el sistema
de disolventes
Observar la separación del
extracto original.
Montaje de la columna
cromatográfica en n-hexano
Aplicación de 0.1 g de
muestra disuelta en 0.3 mL
Metanol en la columna.
Eluir con n-hexano 3
volúmenes de la capacidad
volumétrica de la columna (42
gotas/min)
Agregar 1 volumen (mL) de
n-hexano (15)
Agregar 2 volúmenes (mL)
de n-hexano: acetato de etilo
(15:15)
Agregar 1 volumen (mL) de
acetato de etilo (30)
Agregar 2 volúmenes (mL)
de acetato de etilo: metanol
(11:5)
Agregar 2 volúmenes (mL)
de metanol (15)
Colectar
fracciones
de 2 mL
Colectar
fracciones
de 2 mL
Colectar
fracciones
de 2 mL
Colectar
fracciones
de 2 mL
Colectar
fracciones
de 2 mL
Concentrar las fracciones por
evaporación (40 °C del vapor)
Concentrar las fracciones por
evaporación (40 °C del vapor)
Concentrar las fracciones por
evaporación (40 °C del vapor)
Concentrar las fracciones por
evaporación (40 °C del vapor)
Concentrar las fracciones por
evaporación (40 °C del vapor)
Recolección de todas las
fracciones
Prueba para determinar la
cantidad de gotas a aplicar
Activar la cromatoplaca a 60°C
durante 1 hr
Con los tubos minicapilares aplicar de
las 5 muestras la cantidad de gotas
determinadas a 1.2 cm de la parte
inferior, separadas 1 cm entre cada una.
Dejando secar entre cada aplicación
Distancia recorrida del frente del
disolvente hasta 7 cm, desde el origen
Mediante lámpara UV
identificar los grupos de
compuestos a 254 nm
Figura 2. Procedimiento para cromatografía en capa delgada (CCF3).
8. Reporte de resultados
8.1. Los resultados obtenidos deben tener reporte fotográfico
8.2. Mediante el uso de la lámpara UV, demarcar el grupo de compuestos obtenidos con un
lápiz de punta fina y suave.
9. Consideraciones adicionales
9.1 Como una alternativa, se recomienda utilizar una columna cromatográfica refrigerada para
separación de muestras más grandes que puedan llegar a ser termolábiles, de 50 cm a 70
cm x 2 cm de diámetro, provista de una frita en la parte inferior antes de la llave de paso de
teflón, en la parte superior preferiblemente con boca esmerilada (24/40) para ajustar un
embudo de alimentación. Esta se usaría para muestras de 1 g,
9.2 A futuro, usar aspersor con perilla para revelado de placas con el fin de analizar tipo de
compuestos presentes en la muestra.
9.3 Como alternativa de proponer introducir las cromatoplacas en cámara de iodo, con el fin de
utilizarlo como reactivo revelador de compuestos orgánicos.
3 Demarcar con un lápiz de punta fina y suave (se puede romper la cromatoplaca) el origen, los puntos de aplicación de la muestra y el
frente del solvente.
10. Cálculos
10.1 Determinar factor que relaciona las distancias recorridas por los compuestos y por el
disolvente desde el origen del cromatograma: 𝑅𝑓 (rate factor)
10.1.1 Demarcar en la cromatoplaca la distancia desde el punto de origen hasta el frente
del disolvente
10.1.2 Medir las distancias desde el origen hasta los compuestos separados, en la Figura 3
se ilustra el procedimiento
Figura 3. Distancias recorridas por cada compuesto en la cromatoplaca (Dupont Durst & Gokel, 2007)
10.1.3 Calcular el Rf mediante Ecuación 1.
Ecuación 1
𝑃𝑎𝑟𝑎 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝐴: 𝑅𝑓 =𝐴
𝐹𝑆
𝑃𝑎𝑟𝑎 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝐵: 𝑅𝑓 =𝐵
𝐹𝑆
Si 𝑅𝑓(𝐴) > 𝑅𝑓 (𝐵) → 𝐴 𝑚𝑒𝑛𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑙𝑎𝑟
10.1.4 Realizar una tabla con los valores obtenidos y determinar si los compuestos son de
poca, mediana o alta polaridad.
Compuesto 𝑹𝒇 Polaridad
A N° Menos polar
B N° Más polar
n N°| -
11. Referencias.
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