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©2015 Waters Corporation 2

" Desarrollo de Métodos LC robustos: la combinación óptima

columna-plataforma instrumental HPLC/UHPLC/UPLC "

Presentadora: Olatz Mitxelena Chat: Elena Chiquero

Dpto. Columnas y Accesorios


Comunicación a través del chat Q&A (durante la presentación y/o turno de preguntas tras presentación) Encuesta al finalizar la sesión


Maximizar prestaciones Columnas

1kk

α1α

4NRs

+−

=

Contribuciones mecánicas

Baja dispersión: combinación óptima instrumento

Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula

Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas

Contribuciones físico-químicas

Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos

Trabajar a pH extremos Aumentar la retención


Introducción: plataformas LC actuales

Desde 2004 la tecnología LC ha evolucionado con gran contribución de Waters en constante innovación teniendo como base las necesidades de nuestros clientes para la obtención de resultados robustos, fiables y en cumplimiento de las normativas


Introducción: plataformas LC actuales

Alliance HPLC

ACQUITY Arc

ACQUITY UPLC H-Class


Contribución a la dispersión

Sistema Cromatográfico: diseño y diámetro de tubos, fluídicas inyector y celda detector

Columna Cromatográfica: tamaño de partícula y geometría


Contribución del Instrumento


Contribución Instrumento

Avances y desarrollo de ingeniería han reducido dispersión – Diseño inyector – Volúmen reducido tubos – Células de detector de dispersión reducida

2222,

2,

2,

2,

2, Fdetectordetectorv,postcolumnvcolumnvprecolumnvinjectorvtotalv ⋅+++++= τσσσσσσ

Volumen inyección

+ Ensan-

chamiento inyector

Tubo Entre

inyector Y

columna

Volumen columna

+ Diseño

columna

Tubo entre

columna y

detector

Ensan- chamiento

Celda detector

+ tubos

Ensan- Chamiento

en tiempo en detector (Veloc.

adquisición; Constante

tiempo)


Contribución Instrumento

Alliance HPLC

ACQUITY Arc

ACQUITY UPLC H-Class

> 30 µL

12-30 µL

< 12 µL


Contribución Instrumento: Columna CORTECS 2.1 x 50 mm 1.6 µm

N5σ : 18,000

Minutes 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40

N5σ : 14,900

N5σ : 12,000

-33%

-17%

5.5 µL band spread

14 µL band spread

29 µL band spread

1. Acetone, 2. Naphthalene, 3. Acenaphthene


Contribución de la Columna (ecuación de van Deemter):

-Tamaño de partícula dp -Longitud de Columna L

-Diámetro interno de columna I.D.


Contribución Columna: tamaño de partícula dp

Disminuir tamaño de partícula conlleva aumentar eficacia (clave Empaquetamiento) “estilizado de picos”

Consecuencia: presiones mayores

Ecuación de van Deemter: eficacia en función de la velocidad lineal

1.7 µm 2.5 µm 5 µm 10 µm 3 µm


Contribución Columna: tamaño de partícula dp


Contribución Columna: longitud de columna L

Aumentar longitud de columna conlleva aumentar eficacia

Consecuencia: tiempos de retención mayores y mayores presiones


Contribución Columna: diámetro interno de columna ID

El diámetro interno de la columna incide en el caudal de trabajo: para mantener velocidad lineal, disminuir diámetro interno conlleva a trabajar a caudales menores


Influencia dispersión de Sistema en ID: Sistema HPLC ~50 µL

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

Minutes 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50

CORTECS HILIC, 2.7 µm

4.6 x 50 mm


3.0 x 50 mm


2.1 x 50 mm

7200

4800

2900

Rs(1,2)=3.6

Rs(1,2)=2.5

Rs(1,2)=1.4

Efficiency

-33%

-60%


Contribución Columna: diámetro interno de columna ID

Mayor impacto de la dispersión del sistema en diámetros internos menores


Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfica óptima

Combinación Sistema LC y Columna adecuados


Seleccionar el tamaño de partícula adecuado a la dispersión que generará el Sistema LC

Combinar Instrumento y Columna: Separación cromatográfoca óptima


Adecuar el tamaño de partícula con el ID de la columna que mejor se ajuste al sistema cromatográfico



Seleccionar el caudal de trabajo para la velocidad lineal óptima para maximizar la eficacia de la columna (van Deemter)



El sistema LC debe ser capaz de trabajar contra la presión resultante de las condiciones óptimas seleccionadas en función de la columna



Impacto en prestaciones para combinaciones inadecuadas Sistema y Columna

UHPLC UPLC HPLC A

U

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

2.1 mm ID 1.6 μm 50mm length

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00

AU

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

Minutes0.50 1.00 1.50 2.00 2.50




Combinación adecuada Sistema y Columna = Mejor Prestación Cromatográfica


Combinar Sistema LC y Columna

La calidad de la separación cromatográfica queda definida por la combinación de Instrumento y Columna

Caudal y presión no son causa sino consecuencia de la optimización de las condiciones de la separación cromatográfica

Sistema HPLC UHPLC UPLC Dispersión > 30 μL 12 – 30 μL <12 μL

Tamaño Partícula 3.5 μm, 5 μm, 10 μm (Prep) 2.x μm, 3.5 and 5 µm < 2 μm

Presión rutina < 4000 psi < 10000 psi < 18000 psi (I-Class)

ID Columna 4.6 mm (3.0 mm) 3.0 mm (2.1 mm) 2.1mm (1.0 mm)

Longitud Columna 75 - 250 mm 50 mm - 100mm ≤ 150 mm


Maximizar prestaciones Columnas

1kk

α1α

4NRs

+−

=

Contribuciones mecánicas

Baja dispersión: combinación óptima instrumento

Velocidad lineal óptima Morfología de la partícula

Disminuir el tamaño de partícula Columnas bien empaquetadas

Contribuciones físico-químicas

Fases enlazadas complementarias Naturaleza de los substratos

Trabajar a pH extremos Aumentar la retención


Tecnología Partículas

Tecnología CORTECS Solid-Core

Mayor eficacia y

resolución

Productividad mejorada a resolución similar

Mayor prestación a igual

presión

Tecnología BEH

Estabilidad pH sin precedentes

Versatilidad fase móvil y

temperatura

Escalabilidad incomparable UPLC a HPLC

Tecnología HSS

Máxima Retención

Selectividad partícula y ligando


Tecnología CSH

Capacidad de carga excepcional

Forma de pico superior para analitos básicos


TODAS disponibles en tamaños de partícula HPLC, UHPLC, y UPLC


La gama más amplia de columnas LC

Siete partículas base • BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: 125Å , 130Å, 200Å y 300Å • CSH [Charged Surface Hybrid] y HSS [High Strength Silica] • Sílica Núcleo Sólido

Selección amplia y creciente de químicas de columna • 19 fases estacionarias escalables

• BEH 130Å C18, C8, Shield RP18, Phenyl, HILIC y Amide • BEH 300Å C18 y C4

• HSS C18, T3, C18 SB, PFP y CN • CSH C18, Fluoro-Phenyl y Phenyl-Hexyl • Sílica Núcleo sólido C18, C18+, HILIC

Soluciones certificadas aplicaciones específicas • SEC, AAA, OST, PST, PrST y Glycan

Transferencia entre HPLC y UPLC XBridge HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC BEH XSelect HSS HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC HSS XSelect CSH HPLC/UHPLC y ACQUITY UPLC CSH CORTECS UPLC y UHPLC

Guarda columnas VanGuard


Constante crecimiento rango Selectividades

ACQUITY UPLC BEH Phenyl XBridge Phenyl

ACQUITY UPLC BEH C18 XBridge C18

ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18

ACQUITY BEH C8 XBridge C8

ACQUITY UPLC HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB

ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18

ACQUITY UPLC HSS T3 XSelect HSS T3

ACQUITY UPLC CSH C18 XSelect CSH C18

ACQUITY UPLC CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl

ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl

ACQUITY UPLC HSS CN XSelect HSS CN

ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP

CORTECS C18

CORTECS C18+

©2015 Waters Corporation 31 Minutes 0.0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00

Conditions : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF3COOH in H2O Mobile Phase B: 0.08% CF3COOH in ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B 0.0 92 8 6 0.1 92 8 6 4.45 50 50 7 4.86 10 90 6 5.0 92 8 6 6.0 92 8 6 Injection Volume: 1.0 µL Sample Diluent: 50:50 H2O: MeOH with 0.05% CF3COOH Sample Conc.: 100 µg/mL Temperature: 40 oC Detection: UV @ 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC®, with ACQUITY UPLC® TUV

Compounds 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid

1 2 4 5 3 BEH C18

BEH C8

BEH Shield RP18

BEH Phenyl

1 2 4 5 3

1 2 4 5 3

1 2 4 5 3

1 2 4 5 3 HSS T3

HSS C18 1 4 3 5 2

Gama amplia Selectividades

1 2 4 5 3 HSS C18 SB

HSS CN

HSS PFP 1 2 3

4 5

1 2

4

3 5

1 2 4 3 5 CSH Phenyl-Hexyl

1 2

4

3

5

CSH Fluoro-Phenyl

CSH C18 1 2

3,4

5

Comparative separations may not be representative of all applications


Avances en Tecnología de partículas: Partículas Porosas vs. Núcleo Sólido

Solid- Core

Solid-Core

Par

ticle

Attribute CORTECS

ρ 0.7

Particle Size 1.6 µm, 2.7 µm

Pore Volume 0.26 cm³/g

Pore Size 90 Å

Surface Area 100 m²/g

FIB SEM Images

Solid- Core

Solid-Core

Par

ticle

1.6 µm 2.7 µm

ρ = 0 → fully porous particle

ρ = 1 → nonporous particle

ρ = core diameter / particle diameter

2.5 µm

Fully Porous


¡Nuevo! Guarda columnas VanGuard

Hasta el momento: – Optimizadas para columnas ACQUITY UPLC – Únicamente en 2.1 mm I.D. – Tamaño partícula Sub 2-µm

NUEVAS Vanguard HPLC

– Optimizadas para columnas HPLC/UHPLC – 2.1 x 5 mm; 3.9 x 5 mm – Tamaños de partícula 2.5/2.7 µm para columnas XP y UHPLC – Tamaños de partícula 3.0 - 5.0 µm para columnas HPLC


Conclusiones

La combinación óptima columna e instrumento: – Maximiza eficacia cromatográfica – Reduce efectos extra-columna que degradan la prestación cromatográfica

o Sensibilidad o Eficacia o Resoución

Recomendación columna óptima según plataforma instrumental basada en la

Dispersión – HPLC (4.6 mm i.d) (>3 µm tamaño de partícula) – UHPLC (3.0 mm i.d.) (2 µm - 3 µm tamaño de partícula) – UPLC (2.1 mm i.d.) (< 2 µm tamaño de partícula)

Columnas XBridge BEH, XSelect HSS, XSelect CSH XP 2.5 µm y CORTECS 2.7 µm compatibles con plataformas HPLC, UHPLC y UPLC – Maximizan eficacia, prestación y productividad en cualquier sistema LC – Amplio rango (escalabilidad) de químicas, longitudes de columna y diámetros

internos


Promoción Vigente


¡GRACIAS!

desarrollo de métodos lc robustos: la combinación óptima …€¦ · · 2015-11-10disminuir el...

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