desarrollo de metodologías para la diferenciación de ...de iones producto de cada isómero a...

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Tesis Doctoral

Desarrollo de metodologías para laDesarrollo de metodologías para ladiferenciación de compuestos aromáticosdiferenciación de compuestos aromáticos

isómeros por espectrometría de masaisómeros por espectrometría de masaempleando técnicas de ionización a presiónempleando técnicas de ionización a presión

atmosféricaatmosférica

Butler, Matías

2013-08-09

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Butler, Matías. (2013-08-09). Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestosaromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presiónatmosférica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Butler, Matías. "Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticosisómeros por espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presiónatmosférica". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2013-08-09.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Orgánica

Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por

espectrometría de masa empleando técnicas de ionización a presión atmosférica

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en

el área Química Orgánica

Matías Butler

Director de tesis: Gabriela M. Cabrera Director Asistente: Pau Arroyo Mañez Consejero de Estudios: Gabriela M. Cabrera Buenos Aires, 2013

Desarrollo de metodologías para la diferenciación de compuestos aromáticos isómeros por espectrometría de masa empleando técnicas

de ionización a presión atmosférica

Resumen:

Se realizaron estudios para diferenciar isómeros de posición en compuestos

aromáticos, empleando un espectrómetro de masa híbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo

acoplado con distintas fuentes de ionización a presión atmosférica, en modo positivo.

Se utilizaron inicialmente dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina comerciales, que

sirvieron luego como sistema modelo para el análisis de una serie de 1- y 4- N-óxidos

de pirazinas monosustituídas sintetizados. Se investigaron dos metodologías para la

diferenciación. La primera metodología consideró el comportamiento disociativo,

comparando la relación de intensidades entre los iones observados en los espectros

de iones producto de cada isómero a diferentes energías de colisión. En la otra

metodología, la formación de iones aducto a partir del empleo de soluciones de

cationes metálicos por electrospray, permitió identificar especies características en los

espectros de masa obtenidos para cada N-óxido isómero. Los alcances de esta

metodología fueron evaluados con isómeros de dihidroxiarenos comerciales, siendo

aplicable como método de detección postcolumna para una mezcla de los mismos

separada por cromatografía líquida. La complementación con cálculos

computacionales permitió interpretar y analizar las diferencias observadas en los

espectros de masa, en términos energéticos y estructurales de los iones. Además, se

pudo confirmar la correcta asignación de las estructuras calculadas para los iones

aducto de uno de los compuestos estudiados por medio de espectroscopía de

disociación multifotónica infrarroja. Se desarrolló una metodología alternativa para

determinar la posición del grupo N-óxido en pirazinas sustituídas, empleando

espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-13, a través del cálculo

de un índice derivado del análisis quimiométrico de los datos.

Palabras clave: diferenciación de isómeros; espectrometría de masa; ionización por electrospray; disociación de iones; complejación con metales; elucidación estructural; cálculos computacionales; N-óxidos de hidroxipiridina; N-óxidos de pirazina; dihidroxiarenos.

Development of methodologies for the differentiation of isomeric aromatic compounds by mass spectrometry employing atmospheric pressure

ionization techniques

Abstract:

Differentiation studies among positional isomers in aromatic compounds were carried

out with a hybrid quadrupole/time-of-flight mass spectrometer coupled with different

atmospheric pressure ionization sources in positive ion mode. Firstly, two commercial

isomeric hydroxypyridine N-oxides were used, which were useful later as a model

system for the analysis of a set of monosubstituted pyrazine 1- and 4- N-oxides

synthesized. Two methodologies for the differentiation were investigated. The first

methodology considered the dissociative behavior, by comparing the ratio of intensities

between the ions observed in the product ion spectra of each isomer at different

collision energies. In the other methodology, upon adduct ions formation from metallic

cations solutions by electrospray, the identification of characteristic species in the mass

spectra obtained for each isomeric N-oxide was possible. The scope of this

methodology was assessed using commercial isomers of dihydroxyarenes, being

applicable as a postcolumn detection method to a mixture of them separated by liquid

chromatography. Complementary computational calculations made possible the

interpretation and analysis of the differences observed in the mass spectra in terms of

the energetics and structures of ions. In addition, the correct assignment of the

calculated structures of the ion adducts of one of the studied compounds could be

confirmed by means of infrared multiphoton dissociation spectroscopy. An alternative

methodology was developed to determine the position of the N-oxide moiety in

substituted pyrazines, employing carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy,

through the computation of an index derived from the chemometric analysis of the data.

Keywords: isomer differentiation; mass spectrometry; electrospray ionization; ion dissociation; metal complexation; structure elucidation; computational calculations; hydroxypyridine N-oxides; pyrazine N-oxides; dihydroxyarenes.

A mi familia,

Agradezco a Gaby su confianza,

apoyo, consejos y enseñanzas.

Quiero agradecer también a todos los que hicieron posible la realización de este

trabajo, en particular:

Al Dr. Pau Arroyo Mañez, por aceptar el compromiso y orientarme en el área de la

química computacional.

A UMyMFOR por facilitarme la utilización de los equipos y a todo su personal, en

especial al Sr. Jorge Aznárez y al Bioq. Gabriel Cases por su buena predisposición y

colaboración permanente, y a los Lic. Gernot Eskuche y Lic. José Gallardo por la

realización de los espectros de RMN.

Al Dr. Philippe Maître, de Laboratoire de Chimie Physique de la Université Paris Sud,

por recibirme en su laboratorio cordialmente, dándome la oportunidad de realizar los

experimentos de espectroscopía IRMPD, y por su generosidad.

Al MSc. Oscar Hernández y Sr. Vincent Steinmetz, de Laboratoire de Chimie Physique

de la Université Paris Sud, y al Dr. George Khairallah, de University of Melbourne, por

compartir su experiencia y su ayuda durante mi estadía.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por

otorgarme una beca para realizar este trabajo.

A la Universidad de Buenos Aires por otorgarme la posibilidad de asistir a un congreso

internacional con los fondos UBA destinados a viajes para congresos.

Al CONICET, UBA y Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica

(ANPCyT) por el financiamiento brindado que hizo posible llevar a cabo este trabajo.

A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales por la formación brindada.

Al Departamento de Química Orgánica por aportarme un ambiente cómodo de trabajo,

donde pude crecer en mi desempeño docente y en la investigación.

Al Dr. Jorge Palermo por su experiencia y aportes en la realización de espectros RMN,

y por sus valiosos puntos de vista en este área.

Al Dr. Gerardo Burton por su asesoramiento en el campo del modelado molecular.

Al Lic. Cristián Huck Iriart por su donación de una muestra de Ga2O3.

A la Sra. María del Carmen Ares y Sra. Nancy Aguirre, por hacerme más fácil y

ayudarme en todos los trámites administrativos, siempre con simpatía y amabilidad.

Al Sr. Sergio E. Jacobo y Sr. Hernán Salcedo y demás personal no docente del

departamento por estar siempre bien dispuestos a prestar su colaboración con buena

onda.

A la Dra. María Florencia Rodriguez Brasco por introducirme al mundo de la

investigación y presentarme mi grupo de trabajo, prestándome siempre su ayuda

desinteresada.

A mis actuales compañeros de equipo, Dra. Adriana Cirigliano, Dr. Gastón Siless y Lic.

Andrés Brunetti por acompañarme con sus canciones, discusiones, historias,

experiencias, aportando buenos momentos diarios.

A mis ex compañeras de equipo, Dra. Gabriela Gallardo y Dra. Brenda Bertinetti, por

haberme prestado asistencia en mis inicios y continuar luego colaborando e

intercambiando ideas, sin importar las distancias.

A la Dra. Marta Maier y todo su grupo de trabajo, en especial, Dra. Valeria Careaga

Quiroga, Dra. Alejandra Fazio, Lic. Victoria Richmond, Lic. Irene Lantos, Lic. Blanca

Gómez y Srta. Ivana Canosa por soportar mi selección de estaciones de radio,

compartir almuerzos y meriendas y contagiarme su buena onda.

Al Dr. Jorge Palermo y su grupo de trabajo, en particular, Dra. Marianela Sánchez, Lic.

Lucía Fernández, MSc. Laura Patiño y Dra. Aurèlie Leverrier por las visitas e

intercambios cotidianos y por su buena voluntad para colaborar frente a la diversidad.

Al Dr. Javier Ramirez y su grupo de trabajo, en especial, Lic. Lorena Acebedo, Lic.

Fernando Alonso y Lic. María Eugenia Dávola, así como al Lic. Javier Eiras, por su

cooperación para la realización de actividades y tareas varias, dentro y fuera del

Departamento, siempre dando una mano con buena predisposición.

A todas las personas que tuve la suerte de conocer dentro (y también fuera) del

Departamento, en especial a Ale, Andrés, Aure, Blan, Fer, Ire, Javi, Lu, Luchi,Mario,

Maru, Pau, Romi, Vicky y Vir por acompañarme en tantos momentos disfrutados.

A Marian y Pipi por su calidez y su paciencia con mis preguntas.

A Bren, Vale y Vicky por bancarme, por su alegría y por más también.

A Marie por tener presentes y recordarme las cosas que se me pasan.

A Pil por compartir una mirada diferente y por su generosidad infinita.

A Andi, Cris, Dani, Ithu, Sil, Vani, Vero y Tam por las experiencias compartidas y por

marcar momentos en cada encuentro.

A mis abuelos, mis padres y mis hermanos que siempre me apoyan, me siguen dando

lo mejor todos los días y los quiero.

¿Qué hacés? ; ¿Cómo andás?

¿Quién es? ; ¿Cuándo nos vemos?

¿Dónde está? ; ¿Cuánto tarda?

¿Para qué lo querés? ; ¿Por qué no?

¿Hay respuestas obvias y preguntas sin respuesta?

Si las preguntas perduran, las respuestas pueden cambiar.

i

Lista de abreviaturas comúnmente utilizadas*

APCI Ionización química a presión atmosférica (atmospheric pressure chemical

ionization)

API Ionización a presión atmosférica (atmospheric pressure ionization)

APPI Fotoionización a presión atmosférica (atmospheric pressure photoionization)

BIRD Disociación por radiación infrarroja de cuerpo negro (blackbody infrared

radiative dissociation)

CAD Disociación por activación colisional (collisionally activated dissociation)

CE Energía de colisión (collision energy)

CI Ionización química (chemical ionization)

CID Disociación inducida por colisión (collision- induced dissociation)

CIS Coordinación por ionspray (ionspray coordination)

Cy Ciclohexano

δ Desplazamiento químico

DFT Teoría del funcional de la densidad (density functional theory)

DMSO Dimetilsulfóxido

ECD Disociación por captura de electrones (electron capture dissociation)

EI Ionización por electrones (electron ionization)

ESI Ionización por electrospray (electrospray ionization)

FEL Láser de electrones libres (free electron laser)

fK- Función electrofílica de Fukui

FM Fórmula molecular

FT Transformada de Fourier (Fourier transform)

FT-ICR Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (Fourier transform-

ion cyclotron resonance)

FWHM Ancho a media altura (full width at half maximum)

GC-MS Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa

HOMO Orbital molecular ocupado más alto (highest occupied molecular orbital)

HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia (high performance liquid

chromatography)

http://goldbook.iupac.org/C01157.html





ii

HR alta resolución (high resolution)

IMS Espectrometría de Movilidad Iónica (ion mobility spectrometry)

IR Infrarrojo

IRC Coordenada de reacción intrínseca (intrinsic reaction coordinate)

IRMPD Disociación multifotónica infrarroja (infrared multi-photon dissociation)

J Constante de acoplamiento

LC-MS Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masa

LUMO Orbital molecular desocupado más bajo (lowest unoccupied molecular orbital)

m/z Relación masa/carga

MALDI Desorción/ionización por láser asistida por matriz (matrix assisted laser

desorption/ ionization)

MPA Análisis de poblaciones de Mulliken (Mulliken population analysis)

MS Espectrometría de Masa

MS/MS Espectrometría de Masa Tándem

MSn Espectrometría de Masa Tándem en múltiples etapas (secuencial en el tiempo)

NC Número de coordinación

NPA Análisis de poblaciones naturales (natural population analysis)

OPA Amplificador paramétrico óptico

OPO Oscilador paramétrico óptico

PCA Análisis de componentes principales (principal component analysis)

Pf Punto de fusión

PFP Pentafluorofenilo

ppm Parte por millón

Q Cuadrupolo

q Cuadrupolo de colisión en instrumentos híbridos

QIT Trampa iónica cuadrupolar (quadrupole ion trap)

QqQ Triple cuadrupolo

QqTOF Cuadrupolo/ tiempo de vuelo

RF Radiofrecuencia

iii

RMN Resonancia Magnética Nuclear

SEP Superficie de energía potencial

SID Disociación inducida por superficie (surface- induced dissociation)

SY Proporción subsistente (survival yield)

TIC Corriente total de iones (total ion current)

TMAOH Hidróxido de tetrametilamonio

TMS Tetrametilsilano

TOF Tiempo de vuelo (time of flight)

TOF/TOF Instrumento tiempo de vuelo/ tiempo de vuelo

TR Tiempo de retención

UV Ultravioleta

ZPE Energía de punto cero (zero-point energy)

* La nomenclatura utilizada para espectrometría de masa es la recomendada por IUPAC1. Se utilizaron las abreviaturas en inglés ya que son las corrientemente usadas y la mayoría de los términos no posee traducción al español aún.

1 http://mass-spec.lsu.edu/msterms/index.php/Main_Page


v

Indice

Capítulo 1. Introducción

1.1 Preliminar 1

1.2 Métodos de ionización

1.2.1 Técnicas de ionización suave y fuerte 2

1.2.2 Ionización por electrones (EI) 3

1.2.3 Ionización química (CI) 4

1.2.4 Técnicas de ionización a presión atmosférica (API) 4

1.2.5 Ionización por electrospray (ESI) 5

1.2.6 Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica 7

1.3 Aspectos generales en relación a la generación de los iones

1.3.1 Carga de los iones 7

1.3.2 Formación de iones aducto 8

1.4 Analizadores de masa 9

1.4.1 Cuadrupolo (Q) y trampa iónica cuadrupolar (QIT) 9

1.4.2 Tiempo de vuelo (TOF) 10

1.4.3 Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR) 11

1.5 Aspectos generales en relación a la disociación de los iones

1.5.1 Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS) 12

1.5.2 Métodos de disociación de iones 14

1.5.3 Naturaleza de los iones producto de disociación 15

1.6 Diferenciación de isómeros por MS 16

1.6.1 Espectrometría de movilidad iónica (IMS) 17

1.6.2 Espectroscopía IRMPD 18

1.7 Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa 19

1.8 Objetivos 21

vi

Capítulo 2. Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina

2.1 Introducción 23

2.2 Comportamiento frente a la disociación

2.2.1 Efecto de las fuentes de ionización 25

2.2.2 Efecto de la temperatura 29

2.2.3 Efecto del intercambio H/D 31

2.3 Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional

2.3.1 Sitios de protonación 34

2.3.2 Energía de los iones 38

2.3.3 Caminos de disociación 40

2.4 Complejación con metales 45

2.4.1 Metales trivalentes 45

2.4.2 Metales divalentes (y escandio) 48

2.5 Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional 56

2.5.1 Estructuras de los complejos neutros 57

2.5.2 Sitios de protonación de los complejos 58

2.5.3 Estabilidad de los complejos ionizados 66

2.6 Conclusiones 69

Capítulo 3. Diferenciación de N-óxidos de pirazina


3.2 Síntesis de los compuestos 76

3.3 Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID 78

3.4 Análisis de la formación de complejos con metales 86

3.4.1 Calcio 88

3.4.2 Cobre 103

3.4.3 Aluminio 117

3.5 Análisis por Espectroscopía RMN 132

vii

3.5.1 Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D 133

3.5.2 Análisis quimiométrico de los datos de RMN 13C 140

3.6 Conclusiones 150

Capítulo 4. Diferenciación de dihidroxiarenos


4.2 Complejación con metales por ESI-MS

4.2.1 Estudio preliminar 156

4.2.2 Estudio de la complejación con calcio de 21-24 164

4.3 Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa 170

4.3.1 Estudio preliminar del catecol libre 171

4.3.2 Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados 174

4.3.3 Estructuras de los clusters de calcio(II) con catecol microhidratados 179

4.4 Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional 187

4.5 Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS 195

4.6 Conclusiones 202

Capítulo 5. Detalles experimentales

5.1 Espectrometría de Masa

5.1.1 Equipamiento y metodología 205

5.1.2 Preparación de las muestras 207

5.1.3 Material suplementario de MS 209

5.2 Espectroscopía RMN 211

5.3 Otras técnicas empleadas para la caracterización de los compuestos 211

5.4 Métodos cromatográficos 212

5.5 Tratamiento de los datos para PCA 212

viii

5.6 Síntesis de los compuestos 216

5.7 Métodos computacionales 241

5.7.1 Optimización de geometrías 241

5.7.2 Cálculo de las funciones de Fukui 241

5.7.3 Caracterización de las estructuras calculadas 246

Conclusiones generales y perspectivas 255

Apéndice

1 Funciones de Fukui 257

2 Contaminación de Spin 259

3 Parámetros relacionados con las energías de disociación 260

4 Análisis de Componentes principales (PCA) 261

5 Espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) 262

Anexos

1 Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados 264

2 Modos vibracionales calculados para el benceno identificados usando la notación de Wilson 266

Bibliografía 267

1

Introducción

1.1. Preliminar

La Espectrometría de Masa (MS) es una técnica analítica usada para la

investigación de moléculas y mezclas complejas que ha tenido un crecimiento

vertiginoso en los últimos años en cuanto al desarrollo de nuevos y mejores

instrumentos, lo que ha traído como consecuencia un aumento considerable de su uso

en todas las ramas de la química. El análisis por esta técnica de cualquier sustancia

brinda información única ya que permite, con gran rapidez y óptima sensibilidad,

identificar, cuantificar, aportar datos estructurales e isotópicos.

La Química tiene sus orígenes como una ciencia cuantitativa en el pesado

cuidadoso de productos y reactivos, que realizaban Lavoisier y sus seguidores,

comenzado hace más de 200 años. Desde entonces, el siempre cambiante balance

gravimétrico ha sido un servidor fiel del químico de laboratorio, jugando un rol

importante en el desarrollo de los métodos analíticos sobre los que se fundamenta la

ciencia química contemporánea. Tal vez, la última etapa en la evolución de ese

balance esté representada por el espectrómetro de masa moderno. Éste es capaz de

determinar con alta precisión las masas de átomos individuales y moléculas

transformados previamente en iones, mediante la respuesta de sus trayectorias a

varias combinaciones de campos eléctricos y magnéticos. Claramente, el sine qua non

de dicha determinación de masa es la transformación de los átomos y moléculas de

analito desde su estado inicial en la muestra a iones in vacuo listos para ser

analizados1.

La Figura 1.1 muestra un dibujo esquemático de un espectrómetro de masa. La

muestra es introducida por la entrada del equipo hacia la fuente de ionización. La

fuente genera iones en fase gaseosa a partir de la muestra. Los métodos de ionización

empleados se describirán en la sección 1.2. Los iones generados son transferidos al

analizador de masas, responsable de su separación de acuerdo a su relación

masa/carga (m/z) mediante la interacción con campos eléctricos y/o magnéticos.

Algunos de los analizadores más relevantes para el trabajo se describirán en la

sección 1.4. Por último, el detector registra la intensidad relacionada con la cantidad

1

Capítulo

Capítulo 1 Introducción

2

de iones que llegan de una dada m/z. Una computadora controla los distintos

componentes electrónicamente, almacenando y permitiendo manipular los datos para

reconstruir el espectro de masa. Todos los espectrómetros cuentan además con un

sistema de vacío que mantiene una baja presión (alto vacío) haciendo más eficiente la

manipulación de los iones e impidiendo que se pierdan por colisiones entre sí.

Entrada de

muestra

Fuente de

Ionización

Analizador

de masas

Detector

Sistema de

Datos

Atmósfera/ vacío

Alto vacío

Figura 1.1. Esquema de un Espectrómetro de Masa

Para una correcta interpretación y entendimiento de los espectros de masa es

necesario conocer las características, comportamiento y posibles mecanismos de

formación de los iones en fase gaseosa, y es este conocimiento el que permite aplicar

los resultados a iones similares más complejos. Ciertos aspectos relacionados con la

generación de los iones se mencionarán en la sección 1.3. Además, es necesario

asignar los iones inequívocamente por medio de EM de alta resolución y exactitud,

teniendo en cuenta los perfiles isotópicos y los patrones de fragmentación que aportan

información estructural adicional, como se discute en la sección 1.5.

1.2. Métodos de ionización

1.2.1. Técnicas de ionización suave y fuerte

De manera general, los métodos de ionización pueden separarse en dos grupos:

de ionización suave y fuerte. En las técnicas de ionización fuerte, los iones generados

poseen un gran contenido de energía interna residual, tendiendo a la disociación de

enlaces químicos y por ende, a la obtención de un gran número de iones fragmento en

Introducción Capítulo 1

3

los espectros de masa. Esto resulta de utilidad desde el punto de vista de la

elucidación estructural al encontrarse iones fragmento diagnóstico de la estructura del

ion precursor. En contraparte, los iones precursores intactos, o sea, aquellos que no

se fragmentaron, son generalmente poco intensos lo que dificulta la determinación de

la masa y la fórmula moleculares. El método de ionización fuerte más común es la

ionización por electrones (EI)2 que se describe en la sección 1.2.2.

Por el contrario, en las técnicas de ionización suave, sólo una pequeña parte de

energía interna residual es retenida en los iones. Así, los espectros de masa obtenidos

exhiben pocos iones fragmento, preservándose la molécula mayormente intacta dando

iones precursores relativamente intensos. A pesar de que esto facilita la determinación

de la masa molecular, en virtud del número reducido de iones fragmento formado, se

obtiene poca información estructural. Entre los métodos de ionización suave se

encuentran la ionización química (CI), la ionización por electrospray (ESI) y la

desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI)3, por nombrar algunos. A

continuación se describirán aquellos métodos de ionización relacionados con el

presente trabajo.

1.2.2. Ionización por electrones (EI)

La ionización por electrones (EI) a 70 eV es el método de ionización más antiguo

para análisis de rutina de moléculas pequeñas, hidrofóbicas y termoestables. La fuente

de ionización consiste en una pequeña cámara (alrededor de 1 cm3 de volumen)

aislada en alto vacío, donde la muestra ingresa vaporizada por calentamiento y se

ioniza por interacción con un haz de electrones acelerado. Como resultado de esta

interacción con electrones a 70 eV, se produce la eyección de un electrón a partir de la

molécula neutra en fase gaseosa, dando lugar a un catión radical, es decir, con un

número impar de electrones. Como este ión radical posee un gran exceso de energía

interna, se escinde dando lugar a numerosos caminos de fragmentación29.

Debido a la energía de ionización constante empleada, los espectros de masa

obtenidos por esta técnica resultan reproducibles y ricos en fragmentos (técnica de

ionización fuerte), lo que permite utilizarlos fácilmente para búsquedas en bibliotecas

de espectros de masa. Una gran desventaja de los espectros de masa obtenidos bajo


4

condiciones EI es la ausencia o baja abundancia del ión molecular, es decir, el ión

formado por remoción de un electrón de la molécula.

1.2.3. Ionización química (CI)

La ionización química2 (CI) se aplica a muestras con características similares a EI,

siendo también similar la fuente de ionización, excepto por la presión en la cámara de

ionización que es mucho mayor (típicamente 0.1-1 torr versus 10-5 torr en EI) por la

presencia de un gas reactivo (por ejemplo, metano o amoníaco) que se ioniza

parcialmente por interacción con el haz de electrones. Así, las moléculas de la muestra

se ionizan a partir de reacciones ión-molécula que ocurren en fase gaseosa con estos

iones presentes.

Siendo una técnica de ionización suave, en general permite obtener iones

correspondientes a la molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado,

positivo o negativo, respectivamente. Tanto CI como EI son métodos de ionización

comúnmente usados en equipos de Cromatografía Gaseosa acoplada a

Espectrometría de Masa (GC-MS) ya que requieren que las moléculas de interés estén

en estado gaseoso.

1.2.4. Técnicas de ionización a presión atmosférica (API)

La Espectrometría de Masa utilizando ionización a presión atmosférica (API-MS)

abarca un conjunto de técnicas útiles para el análisis de muestras bajo condiciones

abiertas al ambiente, a diferencia de las técnicas antes mencionadas donde la muestra

se coloca en una cámara con vacío. A continuación se discutirán las más

representativas, a saber, ionización por electrospray (ESI), ionización química a

presión atmosférica (APCI) y fotoionización a presión atmosférica (APPI).

Las técnicas API-MS4 pueden combinarse con equipos de Cromatografía Líquida

acoplada a Espectrometría de Masa (LC-MS) para obtener condiciones de ionización

suaves que permiten acceder a la masa molecular de moléculas intactas a partir de

mezclas complejas. En la Figura 1.2 se observan las diferentes clases de moléculas

cubiertas por los diferentes métodos de ionización previamente mencionados.


5

GC/MS (EI, CI)

aceites esenciales, derivados alquilsililados,

hidrocarburos

LC/MS (APCI)

esteroides, ácidos grasos, drogas,

aminoácidos,

LC/MS (ESI)

proteínas,

péptidos,

Iones metálicos10

100

1000

10000

100000

1000000

Mr

BAJA POLARIDAD ALTA POLARIDAD

Figura 1.2. Diferentes clases de moléculas cubiertas por las diferentes técnicas de ionización

mencionadas (adaptado de Ref. 5).

1.2.5. Ionización por electrospray (ESI)

La ionización por electrospray6 (ESI) es usada para ionizar directamente los

analitos solubles en muestras líquidas, siendo efectiva para analizar tanto grandes

biomoléculas intactas7 como moléculas orgánicas pequeñas8. Para producir las

moléculas ionizadas en fase gaseosa desde la solución líquida, se requiere un capilar

que conduce un pequeño flujo de un solvente polar, creándose un fino spray de gotas

que resultan altamente cargadas en presencia de un campo eléctrico generado por un

voltaje de 2-5 kV (Ver Figura 1.3a).

Se han propuesto dos modelos para dar cuenta de la formación de iones en fase

gaseosa desde las pequeñas gotas altamente cargadas9. El primer modelo asume que

la carga en la molécula se origina a partir de las cargas en la superficie de la gota, que

quedan en el ion del analito en fase gaseosa al evaporarse el solvente de la misma.

Este modelo se conoce como el modelo de residuos cargados y fue propuesto para

analitos de alta masa molecular. El otro modelo sugiere que los iones se desorben

desde las gotas luego que estas se encogen hasta un valor crítico. Este proceso de

escape de iones fue conocido como modelo de evaporación de iones y fue propuesto

a partir del estudio de analitos iónicos pequeños. Mientras que este modelo está bien

fundamentado para pequeños iones orgánicos o inorgánicos, no es aplicable a


6

grandes iones como macromoléculas, para las que el primer modelo resulta más

plausible.

a)

b)

c)

Figura 1.3. Diagramas esquemáticos de diferentes interfaces API: fuentes de ionización por a)

electrospray (ESI); b) ionización química a presión atmosférica (APCI); c) fotoionización a

presión atmosférica (APPI).

Gas nebulizador

MuestraLíquida

V

Gas de secado

Vacío

MSIones

Gas nebulizador

MuestraLíquida

Gas de secado

Vacío

MSIones

Calor

Calor

Gas nebulizador

MuestraLíquida

Gas de secado

Vacío

MSIones

Calor

Calor

h

Corona


7

1.2.6. Ionización química (APCI) y fotoionización (APPI) a presión atmosférica

La ionización química a presión atmosférica10 (APCI) y la fotoionización a presión

atmosférica11,12 (APPI) son técnicas de ionización a presión atmosférica capaces de

analizar compuestos relativamente poco polares. De manera similar a ESI, los iones

se generan directamente desde una solución en ambas técnicas, sin embargo, el

proceso de ionización ocurre en fase gaseosa y no en la fase líquida. Las gotas no se

encuentran cargadas, sino que se vaporizan pasando a través de un nebulizador

calentado a presión atmosférica (Figura 1.3b y 1.3c).

En el caso de APCI, la ionización ocurre por reacciones ión-molécula con especies

reactivas (por ejemplo, electrones, protones, átomos o moléculas metaestables, iones

hidronio, iones de solvente protonados, etc) generados por una descarga corona a

presión atmosférica. Los iones de analito formados corresponden típicamente a la

molécula protonada o desprotonada, según el modo empleado, positivo o negativo,

respectivamente.

En el caso de APPI, la ionización ocurre a través de fotoionización por irradiación

con una fuente de luz ultravioleta (UV) cuyos fotones tienen una energía próxima a 10

eV. Frecuentemente, se emplean dopantes (modificadores en la fase móvil) como

tolueno para generar el primer evento de ionización que por reacciones ion-molécula

resulta luego en la ionización del analito.

1.3. Aspectos generales en relación a la generación de los iones

1.3.1. Carga de los iones

Cuando la ionización ocurre en fase gaseosa, los iones formados son

monocargados. Esto se debe a que resulta desfavorable, tanto termodinámica como

cinéticamente, que dos o más especies reactivas reaccionen en fase gaseosa con la

misma molécula neutra en un período corto de tiempo para generar un ión

múltiplemente cargado, tanto por la repulsión de cargas como por la probabilidad de

colisiones10.

En cambio, cuando la ionización ocurre en fase líquida como en ESI, la aparición

de iones doble- o múltiplemente cargados es frecuente y puede estar influenciada por


8

la concentración de buffers, analitos, cantidades de modificadores orgánicos o el

flujo13,14. Sin embargo, la mayoría de las moléculas orgánicas pequeñas aparecen

frecuentemente como especies monocargadas en sus espectros de masa de ESI,

probablemente por la fácil fragmentación a partir de iones múltiplemente cargados

debido a la alta energía interna causada por la localización de cargas próximas15.

1.3.2. Formación de iones aducto

De manera general, existen tres procesos químicos principales por los cuales

pueden generarse los iones gaseosos de una muestra por MS. El primero de ellos es

la remoción/ adición de un electrón, del que resultan en iones radicales (M+ o M-). En

segundo lugar, la protonación/desprotonación (reacciones ácido/base) que lleva a la

formación de moléculas protonadas o desprotonadas ([M+H]+ o ([M-H]-,

respectivamente). Finalmente, la formación de aductos con cationes/aniones da como

resultado iones aducto como por ejemplo, [M+Na]+ o [M+Cl]-, respectivamente.

Prácticamente en todos los métodos de ionización mencionados en la sección 1.2

ocurren uno o más de estos procesos químicos para la generación de los iones

gaseosos. Por ejemplo, en los espectros de masa obtenidos con métodos de

ionización como CI, MALDI o ESI, además de la molécula protonada o desprotonada,

se observan múltiples conjuntos de iones aductos. Estos se forman a partir de la

interacción de un ion con otros átomos o moléculas y la correcta detección e

identificación del ión aducto resulta esencial para obtener la masa exacta de la

molécula neutra original.

En el caso de ESI, el solvente y la composición del buffer, pH, propiedades ácido-

base de las sustancias y la acidez en fase gaseosa, son algunos de los factores que

influyen en la formación de iones aductos. También el incremento en la concentración

de iones específicos en la fase líquida permite obtener preferentemente aductos con

esos iones16. La adición de aniones o cationes a una solución de analitos para obtener

aductos cargados es una estrategia bien conocida, en combinación con técnicas de

ionización como ESI o APCI, para inducir la ionización de compuestos poco polares.

La coordinación por ionspray (CIS) es el término usado para describir estas técnicas

que utilizan reactivos iónicos para inducir la coordinación, siendo los aductos de Ag(I)

los más populares17.


9

1.4. Analizadores de Masa

Actualmente están disponibles en el mercado seis tipos básicos de analizadores de

masa: cuadrupolo, trampa iónica, sector magnético/eléctrico, tiempo de vuelo (TOF),

Orbitrap y resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR), junto a

numerosas combinaciones híbridas y variantes de estos analizadores. Típicamente,

los analizadores de masa pueden dividirse en dos grupos de acuerdo a su resolución:

baja versus alta, lo que está relacionado con la precisión y exactitud de la medición de

masa.

El grupo de analizadores de masa de baja resolución incluye a los cuadrupolos (Q)

y a las trampas iónicas de varios tipos, como las cuadrupolares (QIT) que se

describirán brevemente en la sección 1.4.1. Generalmente, se dice que tienen

resolución unitaria, lo que significa que pueden resolver iones que difieren en una

unidad de masa, aunque típicamente su resolución es un poco mejor. Su bajo precio y

tamaño, así como sus altas velocidades de barrido, les provee versatilidad para

aplicaciones en espectrometría de masa tándem, como se describirá en la sección

1.5.1.

El desarrollo de analizadores de alta resolución, como el tiempo de vuelo (TOF), y

de ultra-alta resolución como el Orbitrap18,19 y la resonancia iónica ciclotrónica por

transformada de Fourier (FT-ICR), ha posibilitado medidas de masa precisas (<5 ppm

para el TOF) y ultraprecisas (<1 ppm para el Orbitrap y FT-ICR), siendo la tendencia

actual el reemplazo de los sectores magnéticos de gran tamaño por los otros

analizadores mucho más compactos mencionados con anterioridad. Los analizadores

de masa más relevantes para este trabajo: TOF y FT-ICR se describirán con cierto

detalle en las secciones 1.4.2 y 1.4.3, respectivamente.

1.4.1. Cuadrupolo (Q)2 y Trampa iónica cuadrupolar (QIT)20

Un cuadrupolo consta de cuatro barras cilíndricas o hiperbólicas paralelas en un

arreglo cuadrado a las que se aplica un voltaje dependiente del tiempo a cada par de

barras opuestas. Bajo la influencia de esta combinación de campos electromagnéticos,

los iones que ingresan al cuadrupolo por el espacio axial longitudinal entre las barras

experimentan trayectorias complejas, que sólo son estables dentro de ciertos límites.


10

La transmisión de iones de una dada m/z es permitida para un determinado potencial

aplicado, mientras que iones con diferentes valores de m/z se pierden por colisiones a

causa de trayectorias inestables. Así, el cuadrupolo actúa como un filtro de masas

barriendo un rango de valores de m/z para analizar los iones al barrer el potencial.

La trampa iónica cuadrupolar es la contraparte tridimensional del cuadrupolo y

consiste en un electrodo con forma de anillo con tapas hiperbólicas en la parte

superior e inferior, que por medio de la aplicación de voltajes, permite atrapar los iones

en complicadas trayectorias tridimensionales que resultan estables para iones de un

rango de m/z. Las trayectorias de los iones se estabilizan con una baja presión

constante de helio (0.1 Pa aprox.) en el interior de la trampa. La manipulación de los

potenciales permite desestabilizar la trayectoria de ciertos iones y expulsarlos de la

trampa de acuerdo a su relación m/z.

1.4.2. Tiempo de vuelo (TOF)21

El analizador de tiempo de vuelo (TOF) opera midiendo el tiempo que le toma a un

ión de energía cinética conocida viajar hasta el detector (típicamente 1-2 m). Con el fin

de discriminar los iones con alta resolución en base a sus tiempos de vuelo, se deben

eliminar las colisiones lo que requiere el uso de muy alto vacío (10-5 Pa). Por medio

de una o más mallas (grids) de aceleración se imparten cerca de 100 eV de energía

cinética traslacional a todos los iones, de modo que estos se agrupen de forma más

compacta y tengan la misma energía cinética inicial. Luego, los iones viajan en una

zona libre de campos (un cilindro hueco) por lo que su velocidad se mantiene

constante. Se puede mostrar fácilmente que el tiempo requerido para que un ión de

carga z y energía cinética igual a zeV viaje una distancia L está dado por

t=L/(2zeV/m)1/2, por lo que el tiempo de vuelo medido por circuitos electrónicos rápidos

que comparan el tiempo de salida del conjunto de iones con el de llegada de cada ión

es proporcional a (m/z)1/2.

Como los iones no tienen exactamente los mismos tiempos de salida ni energía

cinética, resulta necesario compensar esas diferencias. El reflectrón es un dispositivo

de óptica de iones, el cual interactúa con los iones en el TOF como un espejo,

revirtiendo el vuelo de los iones por un campo electrostático. Los iones con mayor

energía cinética penetran más en el reflectrón que aquellos con menor energía,


11

requiriendo entonces más tiempo en llegar al detector. De esta manera, el reflectrón

enfoca iones de energías cinéticas diferentes en el tiempo, mejorando la resolución.

Haz iones

Electrodo pulsador

Trayectoria de los iones

Reflectrón

Arreglo de detectores

Figura 1.4. Diagrama esquemático de un analizador TOF ortogonal con reflectrón.

A diferencia de los instrumentos de barrido descritos en la sección 1.4.1., donde se

detecta todo el tiempo sólo parte del rango de m/z, los instrumentos TOF detectan

todo el rango de m/z pero sólo por cierto tiempo. Por esto, en el caso de métodos de

ionización continuos, como ESI y otros descritos en la sección 1.2, se emplea una

adaptación conocida como TOF ortogonal22. El haz continuo de iones se acumula por

unos microsegundos en un pozo de potencial que luego es sometido a un gradiente de

campo eléctrico pulsado ortogonal a la dirección del haz, de manera de generar un

pulso de iones (Figura 1.4). La independencia de los ejes del TOF y el haz tiene dos

ventajas. Por un lado, se reduce la dispersión de velocidades iniciales en la dirección

del TOF alrededor de una media de valor cero mejorando así la resolución. Por otro

lado, aprovechando la independencia de ambos movimientos, la dispersión de

velocidades en la dirección del haz permite aprovechar la colección de todos los iones

por medio de la utilización de un arreglo de detectores mejorando así la sensibilidad99.

1.4.3. Resonancia iónica ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICR)23

La resonancia iónica ciclotrónica (ICR) se basa en la ley de Lorentz que establece

que iones moviéndose a través de un campo magnético B experimentan una fuerza

que es perpendicular a su velocidad. Por lo tanto, en presencia de un campo uniforme

perpendicular a su movimiento, los iones se moverán en una trayectoria circular con


12

una frecuencia angular c. Puede mostrarse fácilmente que c = zeB/m, o m/z=eB/c,

donde c cae en el rango de radiofrecuencias (kHz-MHz) para los valores de campo

usados (> 5 Tesla usualmente). Como la relación m/z se manifiesta como una

frecuencia, un parámetro experimental que puede ser medido muy precisamente, la

resolución alcanzada es inherentemente muy alta24.

Un analizador de ICR básico consiste en una celda colocada en un campo

magnético estático. Al excitar con radiofrecuencias, los iones almacenados dentro de

la celda van a absorber energía cuando la frecuencia coincida con c de acuerdo a

cada m/z particular, aumentando así el radio de sus orbitas. La corriente inducida por

este movimiento circular (corriente imagen) puede luego ser medida por un detector.

La aplicación de la transformada de Fourier (FT) a ICR, provee un modo más

rápido de realizar el experimento. En lugar de realizar un barrido serial de frecuencias,

un pulso de radiofrecuencia de corta duración y de banda ancha es usado para excitar

todos los iones a la vez de manera coherente. La señal detectada (en el dominio

temporal) está compuesta por las múltiples frecuencias correspondientes a todos los

iones presentes. La transformada de Fourier de la señal en el dominio temporal resulta

en una señal en el dominio de frecuencias que puede convertirse en el espectro de

masa aplicando una calibración. Las condiciones experimentales requieren un número

no muy grande de iones en la celda (<107) para evitar colisiones durante el período de

detección, por lo que se requiere muy alto vacío (<10-5Pa).

La alta exactitud de masa, resolución, sensibilidad y rango dinámico de este

analizador no es superado por ningún otro. Sin embargo, los analizadores de FT-ICR

no son muy populares ya que requieren fuertes campos magnéticos de costoso

mantenimiento suministrados por grandes imanes superconductores similares a los

utilizados en los espectrómetros de RMN.

1.5. Aspectos generales en relación a la disociación de los iones

1.5.1. Espectrometría de Masa Tándem (MS/MS)

La dificultad para obtener información estructural empleando métodos de

ionización suave por medio de la espectrometría de masa en una única etapa impulsó

el desarrollo de la espectrometría de masa tándem25. La espectrometría de masa


13

tándem engloba numerosas técnicas donde un ion de m/z específica, llamado ion

precursor, es seleccionado en una primera etapa (MS1) y es activado por métodos

específicos de modo que adquiere energía interna suficiente como para disociarse en

iones fragmento (o iones producto) que son sujetos a un segundo análisis de

espectrometría de masa (MS2). Las diferentes etapas de la espectrometría de masa

tándem pueden estar separadas en el tiempo o en el espacio, de acuerdo a los

analizadores empleados.

Cuando están separados en el tiempo, la selección del ión precursor y el espectro

de masa de los iones producto se registra en un único analizador (por ejemplo, el QIT

o el FT-ICR), pudiendo realizarse múltiples etapas de MS (MSn), secuencialmente

aislando y fragmentando los iones seleccionados en pasos discretos a lo largo del

tiempo. Los experimentos se logran manteniendo sólo iones de cierta relación m/z en

el analizador a partir de la expulsión selectiva de todo el resto. Los iones que

permanecen se disocian por alguna técnica (por ejemplo, en QIT, se fragmentan por

colisiones con las moléculas de helio que siempre están presentes). Los iones

fragmento son luego analizados generando el espectro de masa de los iones producto.

Expulsando todos los iones fragmento del analizador excepto alguno de cierta m/z de

interés, y repitiendo el ciclo de disociación y análisis se generan nuevos iones

fragmento a partir del seleccionado lográndose así MS3. Este proceso puede ser

virtualmente repetido n veces (MSn), donde n es el número de ciclos MS/MS

realizados.

Por otro lado, para realizar MS/MS en el espacio se requieren por lo menos 2

analizadores que se hallan separados en el espacio por una región intermedia donde

ocurre la disociación. En general, esta última es una celda de colisión consistente en

un elemento de enfoque, usualmente un cuadrupolo (q), donde ocurre el proceso de

activación. Los iones precursores son seleccionados en el primer analizador, son

disociados en la celda de colisión y los iones producto son transmitidos al segundo

analizador originando el espectro de masa. Son frecuentes configuraciones tales como

triple cuadrupolo (QqQ), o equipos híbridos donde se combinan distintos analizadores,

como cuadrupolo/tiempo de vuelo (QqTOF).


14

1.5.2. Métodos de disociación de iones

El paso de activación de los iones define el tipo de iones productos resultantes y

varios métodos de disociación han sido desarrollados en vista de proveer información

estructural complementaria a partir de la fragmentación. En la Tabla 1, se presentan

algunos tales como la disociación inducida por superficie (SID), disociación por captura

de electrones (ECD), disociación multifotónica infrarroja (IRMPD), disociación por

radiación infrarroja de cuerpo negro (BIRD)26. La disociación inducida por colisión

(CID), o disociación activada colisionalmente (CAD) es el método de activación más

comúnmente empleado para obtener espectros de masa tándem (MS/MS) debido a su

fácil implementación. La activación se basa en la colisión entre el ion precursor y una

especie neutra (típicamente nitrógeno o un gas noble como argón o helio). Como

resultado, parte de la energía cinética del gas se convierte en energía interna del ion,

aumentando así su tendencia a la fragmentación (si la energía sobrepasa el umbral de

disociación). Así, variando el rango de energía cinética del gas resulta posible obtener

información sobre la estabilidad y energía interna del ion precursor bajo CID27.

Tabla 1.1. Descripción general de diferentes métodos de disociación de iones

Método Rango de

Energía Instrumentos Descripción

CID

Bajo

(1–100 eV) QqQ, QIT, QqTOF, FTICR Colisión de iones precursores con

moléculas/ átomos blanco de gases

inertes en una celda de colisión. Alto

(energía ~keV) TOF/TOF, sector magnético

SID Bajo QqQ, QIT, FTICR Colisión entre iones precursores y una

superficie blanco sólida Alto TOF/TOF

ECD Bajo FTICR

Captura de un electrón por los iones

precursores por interacción con haz de

electrones de baja energía.

IRMPD Bajo QIT, FTICR

Activación de los iones precursores por

absorción de múltiples fotones emitidos

por un láser infrarrojo.

BIRD Bajo QIT, FTICR

Activación térmica de baja energía de

los iones precursores, ideal para

cálculos termodinámicos.


15

Debido a las implicancias para el trabajo, se describirá también el método de

disociación IRMPD. Los iones precursores pueden ser excitados y subsecuentemente

fragmentados por la absorción de uno o más fotones usando láseres de diferentes

longitudes de onda. La baja energía de los fotones en el infrarrojo (IR), requiere de

múltiples fotones para alcanzar el umbral de disociación a diferencia del UV donde la

absorción de un fotón puede proveer suficiente energía para disociar los iones

precursores. Por este motivo, se requieren instrumentos con FT-ICR o trampas

iónicas28, donde los iones pueden ser atrapados por largos períodos de tiempo durante

el cual pueden absorber múltiples fotones. Con el fin de observar fotodisociación, los

iones además deben poseer una transición permitida en el rango de longitudes de

onda accesibles por el láser y deben tener también caminos de disociación

energéticamente permitidos desde los estados excitados que son alcanzados luego de

la absorción de fotones. Los espectros de masa resultantes suelen ser similares a los

obtenidos con CID de baja energía.

1.5.3. Naturaleza de los iones producto de disociación

La mayoría de los procesos de fragmentación de iones están dirigidos por el sitio

de carga o por el sitio de radical29. En general, a partir de moléculas protonadas o

desprotonadas (iones con un número par de electrones) se espera obtener iones

producto con un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en lugar

de iones producto de un número impar de electrones (por pérdida de radicales), ya

que esta última ruta de disociación es generalmente más energética, lo que constituye

el fundamento de la regla de paridad de electrones (even electron rule).

A modo de ejemplo, a partir del análisis de 100 pesticidas por EI y ESI, se observó

que la formación de especies con un número impar de electrones es significativamente

mayor bajo EI en comparación con ESI en modo positivo, donde la mayoría de los

iones fragmento informados tienen un número par de electrones30. Sin embargo, hay

que tener en cuenta que la pérdida de radicales puede también ocurrir bajo ESI en el

caso de compuestos aromáticos31, si los iones fragmento conservan la capacidad de

estabilizar electrones desapareados.


16

1.6. Diferenciación de isómeros por MS

La diferenciación de isómeros por MS permanece como un desafío analítico ya que

la confirmación de la identidad de cada isómero resulta difícil aun cuando puedan ser

separados adecuadamente de mezclas. Esto se debe a que tienen exactamente el

mismo peso molecular, y frecuentemente sus caminos de fragmentación son similares.

Así, la información estructural limitada de las medidas de MS, en comparación con

otras técnicas como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la cristalografía de

rayos X, ha generado un interés creciente en la implementación de herramientas

adicionales para superar este problema específico.

En la actualidad, existen numerosas técnicas que intentan incrementar la

información estructural de las mediciones de MS midiendo propiedades adicionales de

los iones además de su relación m/z, que incluyen la espectrometría de movilidad

iónica (sección 1.6.1), la espectroscopía IRMPD (sección 1.6.2), así como otras que se

muestran en la Figura 1.5 y se discuten brevemente a continuación.

Aductos con metales(u otras especies)

Caracterización complejos

Espectro IRMPD

EspectrosFotodisociación

MS/MS

Disociación

Intercambio H/D

Cinética de Intercambio

Rx ión-molécula

Reactividad

Mobilidad iónica

Separación por Sección eficaz

Figura 1.5. Esquema de técnicas disponibles para obtener información estructural por MS.

Históricamente, las reacciones unimoleculares que conducen a la disociación de

los iones se han empleado para obtener información estructural en experimentos de

MS/MS. Hoy en día, la disociación de los iones causada por la energía extra provista

por la ionización o por los métodos de disociación comentados en la sección 1.5.2,


17

especialmente por colisiones de los iones con moléculas o átomos neutros (CID), es la

técnica más frecuentemente utilizada para proveer información estructural. Teniendo

en cuenta lo anterior, la diferenciación de isómeros por medio de MS/MS se basa

muchas veces en diferencias en las abundancias relativas de los productos de

disociación32,33.

Las reacciones en fase gaseosa ión-molécula resultaron interesantes como

herramientas para la caracterización estructural a partir de la introducción de la

ionización química (CI) y de la utilidad mostrada por este método de ionización para

distinguir isómeros a partir de la utilización de ciertos gases reactivos34. El uso de

reacciones bimoleculares ion/molécula en fase gaseosa permite distinguir entre varios

isómeros estructurales iónicos, basándose en su reactividad diferencial frente a

reactivos selectivos, frecuentemente introducidos empleando equipos con

analizadores de FT-ICR o QIT35,36.

Un caso particular es el uso de reacciones de intercambio hidrógeno/deuterio en

fase gaseosa. Los iones pueden ser atrapados en una QIT o FT-ICR por diferentes

períodos de tiempo mientras se liberan solventes deuterados, como D2O o CD3OD. De

esta manera, pueden diferenciarse isómeros estudiando la cinética de intercambio37.

La adición de moléculas auxiliares como iones metálicos, en combinación con

métodos de ionización en solución como ESI, permite producir complejos de

coordinación estables para diferentes clases de compuestos. La facilidad con la que

estos complejos son transferidos a la fase gaseosa por ESI ha sido utilizada para la

caracterización de los aductos formados con diferentes iones metálicos. Así, la

complejación con metales combinada con ESI ha permitido distinguir isómeros sin

ambigüedades en ciertos casos38,39.

1.6.1. Espectrometría de Movilidad Iónica (IMS)40

La espectrometría de movilidad iónica (IMS) tradicional de “tiempo de arrastre”

(drift time) mide el tiempo que le toma a un ión migrar, en presencia de un campo

eléctrico débil, a través de un tubo conteniendo un gas inerte a una dada presión

(entre 1 Torr y presión atmosférica según la configuración del equipo). La condición

principal que debe cumplirse es que la energía térmica suministrada por las colisiones

con el gas sea mayor que la energía que los iones obtienen del campo eléctrico. Así,


18

la energía de los iones va a ser similar a la de las moléculas de gas y van a

predominar los procesos de difusión. Bajo estas condiciones, la velocidad de los iones

es directamente proporcional al campo eléctrico por una constante de proporcionalidad

llamada constante de movilidad iónica, que está relacionada con la sección eficaz de

colisión de los iones (relacionada con la forma y el tamaño). De esta manera, es

posible obtener la sección eficaz de colisión de los iones a partir de mediciones

directas del tiempo de arrastre, con la potencial derivación de información estructural y

conformacional41.

Como ejemplo de aplicación, esta técnica se utilizó para estudiar la isomerización

del catión radical benceno generado por EI, seleccionado por su valor de m/z antes de

efectuar IMS42. Las secciones eficaces de colisión de los cationes benceno y fulveno

(5-Metilen-1,3-ciclopentadieno) son muy similares, haciendo difícil la separación de

ambos iones usando helio como gas. Sin embargo, ambos iones isómeros pudieron

ser separados en presencia de benceno neutro en la celda, a pesar de poseer

movilidades similares, debido a su distinta reactividad frente a la asociación con el

precursor neutro por formación de dímeros.

1.6.2. Espectroscopía IRMPD

El uso de láseres UV, visibles o IR para fotodisociar iones gaseosos es otro

enfoque promisorio para la diferenciación de isómeros. Dada la imposibilidad de medir

el espectro de absorción de un ión de manera directa por la baja concentración en el

interior del espectrómetro, la fragmentación puede ser usada como huella de

absorción de fotones. La aplicación más frecuente utiliza fotones en el rango del IR,

como ya se comentó en relación a IRMPD. A modo de ejemplo, usando un láser

infrarrojo de baja potencia (CO2) se diferenciaron iones isómeros de hidrocarburos

oxigenados originados a partir de distintos precursores por EI, observándose distintos

productos de disociación43.

Cuando es posible variar la longitud de onda del láser, como ocurre en las

facilidades que cuentan con un láser de electrones libres (FEL) infrarrojo, y seguir la

fotodisociación en función de la longitud de onda, este tipo de experimento abre la

posibilidad de la diferenciación de isómeros sobre la base del espectro de

fotodisociación infrarrojo observado44. Cuando la longitud de onda del láser coincide


19

en energía con alguna transición permitida a los niveles vibracionales de los varios

modos normales del ion, la excitación y luego la disociación se favorecerá,

observándose un máximo en el gráfico de abundancia total de iones fragmento versus

longitud de onda (es decir, en el espectro IRMPD). De esta manera, se puede obtener

el espectro de fotodisociación de varios isómeros estructurales, el cual puede

compararse luego con los espectros simulados de IR de varias estructuras de iones

isómeros, confirmando así la estructura de los iones utilizando esta espectroscopía45.

1.7. Uso de química computacional para modelar iones en fase gaseosa

La química computacional puede ayudar a la comprensión tanto de los fenómenos

de generación de los iones como de los procesos de fragmentación de los mismos en

conexión con la termodinámica y la cinética. Las condiciones de bajas presiones en el

interior del espectrómetro de masa, donde los iones se encuentran en fase gaseosa,

poseen similitudes con las condiciones comúnmente utilizadas en los estudios

computacionales donde se utilizan como modelo moléculas aisladas en vacío.

Respecto de los procesos de ionización es posible obtener parámetros como la

energía de ionización adiabática, basicidad46 y afinidad protónica47, entre otros. El

primer paso en la interpretación del espectro de masa de moléculas ionizadas por

protonación, desprotonación, o formación de aductos, es la determinación del sitio

donde estos procesos ocurren, ya que pueden perturbar significativamente la densidad

electrónica y afectar la formación de iones y subsecuente fragmentación de enlaces en

la molécula48.

Los métodos mecánico-cuánticos proveen de dos piezas importantes de

información: la termoquímica de los iones y las estructuras de los estados de

transición, que junto con las estructuras de los iones, permiten obtener las superficies

de energía potencial (SEP) para los caminos de fragmentación e isomerización de

iones49. En algunos casos, este enfoque puede conducir a un mejor entendimiento de

los caminos de fragmentación. Como ejemplo, el estudio computacional aplicado a los

iones producto en espectros de masa, ha permitido el análisis de caminos de

fragmentación competitivos en flavonas, determinándose las condiciones de

prevalencia de uno u otro mecanismo según las características estructurales y la

energía de colisión50.


20

En la última década, el uso de métodos computacionales ha ayudado a interpretar

los espectros de masa para lograr una correcta asignación de las estructuras de iones,

siendo hoy en día una parte integral en la exploración de nuevas estructuras51. Para

llevar a cabo esto es necesario realizar tres ejercicios computacionales básicos:

optimización de geometrías de equilibrio y de estructuras de estados de transición,

análisis de frecuencias vibracionales y determinación de datos termoquímicos para

todas las especies.

Para que una estructura sea significativa debe representar un punto estacionario

de la SEP, es decir, un estado de equilibrio (mínimo) o un estado de transición (punto

de ensilladura de primer orden). El proceso de identificar tales estructuras involucra la

optimización de distancias de enlaces, ángulos y ángulos diedros para minimizar la

energía de las especies en cuestión. En el caso de estados de transición, se optimizan

todos los grados de libertad salvo el responsable del movimiento atómico que conecta

una estructura de equilibrio con la otra.

El cálculo de frecuencias vibracionales sirve a dos propósitos: verificar que una

especie es una estructura de equilibrio (todas las frecuencias reales) o estado de

transición (una única frecuencia imaginaria) y calcular la energía vibracional de punto

cero (ZPE) para la estructura optimizada. Esta última es necesaria para la

determinación de energías relativas más precisas. Cabe destacar que a partir del

cálculo de frecuencias vibracionales de cada estructura se obtiene el espectro IR que

puede compararse con el espectro IRMPD (sección 1.6.2).

La información más relevante obtenida para estructuras de equilibrio y estados de

transición son sus energías relativas. Para una dada SEP, cada nivel de teoría

empleado producirá un conjunto único de energías relativas. El nivel de teoría

comprende los dos componentes principales del método computacional: el método

para el tratamiento de la correlación electrónica y el conjunto de funciones base para

describir los orbitales moleculares. El nivel de teoría se selecciona buscando el mejor

compromiso entre la consistencia de los resultados y el tiempo de cálculo. Por otra

parte, el tiempo de cálculo puede alivianarse seleccionando un sistema químicamente

equivalente pero más pequeño que el sistema original.


21

1.8. Objetivos

El objetivo general de este trabajo es contribuir a la mejora de los métodos de

análisis de drogas farmacéuticas y agroquímicos, tanto de origen natural como

sintético así como también productos alimenticios, a través del desarrollo de nuevas

metodologías de análisis. Esto traería aparejado una mejora en la calidad de dichos

productos o en el desarrollo de nuevos.

El objetivo específico del presente trabajo es el desarrollo de nuevas metodologías

de análisis para la diferenciación de isómeros en compuestos aromáticos empleando

espectrometría de masa. La hipótesis de que es posible desarrollar nuevos métodos

analíticos mediante el empleo de la espectrometría de masa para diferenciar isómeros,

ha sido puesta a prueba para numerosas moléculas, mejorando así los métodos

preexistentes para su identificación. Sin embargo, aún es limitada su aplicación para

la diferenciación de isómeros de posición en compuestos aromáticos. Además, se

busca mediante estudios computacionales lograr una comprensión más cabal de los

procesos que tienen lugar para lograr una interpretación correcta de los espectros de

masa, dilucidar las diferencias entre isómeros y poder aplicar los resultados a sistemas

similares más complejos.

El interés del trabajo está centrado en la identificación unívoca de pares de

regioisómeros de compuestos aromáticos. En particular, se trataron los N-óxidos de 2-

y 3-hidroxipiridina (capítulo 2), utilizados como sistema prototipo para el estudio

posterior de los 1- y 4- N-óxidos de pirazinas monosustituídas (capítulo 3), evaluando

luego la extensión de la metodología a otra familia relacionada de compuestos, los

dihidroxiarenos (capítulo 4).


22

23

Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina

2.1. Introducción

Si bien son conocidos y empleados desde hace mucho tiempo, los compuestos

heterocíclicos aromáticos nitrogenados han recibido mucha atención recientemente,

debido a su presencia en el ambiente y su potencial impacto ambiental. En particular,

la piridina y sus derivados tienen mucha relevancia a causa de sus conocidas

propiedades tóxicas y carcinogénicas y sus efectos letales en el ambiente biogénico

natural52. Los N-óxidos heterocíclicos están presentes en productos naturales, drogas

farmacéuticas, agroquímicos e intermediarios sintéticos53, aunque también son

metabolitos comunes que pueden formarse por oxidación en el átomo de nitrógeno

durante la biotransformación metabólica de muchas drogas y xenobióticos54.

La diferenciación por espectrometría de masa de N-óxidos heterocíclicos y sus

metabolitos isómeros hidroxilados es de interés ya que, en general, los espectros de

masa tándem de baja energía suelen ser similares cuando la N-oxidación o

hidroxilación ocurren en el mismo anillo aromático. Por ejemplo, la similitud de los

espectros de masa tándem de las moléculas protonadas de la 8-hidroxiquinolina y el

N-óxido de quinolina obtenidos por ESI, reveló que estos compuestos isómeros

oxigenados son indistinguibles por este método55. Por este motivo, un entendimiento

detallado de la ionización y fragmentación de los N-óxidos heterocíclicos puede

resultar valioso para el desarrollo de metodologías alternativas para su diferenciación

por MS.

Teniendo en cuenta estos precedentes, se seleccionaron como sistema de estudio

prototipo dos compuestos comerciales (Figura 2.1), N-óxidos de la 2-hidroxipiridina 1 y

la 3-hidroxipiridina 2, con el objetivo de diferenciar ambos isómeros por espectrometría

de masa con el fin de extender la metodología posteriormente a otros heterociclos más

complejos. Mientras que el N-óxido de piridina56 y las hidroxipiridinas han sido

estudiadas extensivamente por espectrometría de masa57,58, sus N-óxidos hasta ahora

habían escapado del análisis.

2

Capítulo

Capítulo 2 Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina

24

Figura 2.1. Estructuras de los N-óxidos estudiados.

El N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1 existe como una mezcla de los tautómeros 1a y

1b, siendo 1a el principal tautómero en solución y en sólidos cristalinos59. Asimismo,

se han informado las propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1

comportándose como un análogo heterocíclico de ácidos hidroxámicos, por métodos

potenciométricos y espectrofotométricos, para varios metales divalentes y

trivalentes60,61,62.

El estudio del comportamiento por espectrometría de masa tándem (MS/MS) de los

N-óxidos de hidroxipiridina protonados, empleando distintas fuentes API (ESI, APCI y

APPI) acopladas a un espectrómetro de masa híbrido QqTOF se presenta en la

sección 2.2. Para ello, empleando CID como método de activación, se caracterizaron

los iones fragmento obtenidos al utilizar diferentes energías de colisión.

El comportamiento de ambos isómeros como agentes complejantes, analizando los

aductos que se generan entre estas moléculas con cationes metálicos por ESI, se

estudia en la sección 2.4. Entre otros, se incluyeron los iones metálicos trivalentes

hierro (III), galio (III) y aluminio (III), por su capacidad de formar complejos estables al

asociarse con hidroxamatos63, y el escandio (III) por fines comparativos, ya que son

poco comunes los estudios de complejación con este ion64. Además, se emplearon

iones metálicos divalentes ambientales: magnesio (II), calcio (II), cobalto (II), níquel

(II), cobre (II) y zinc (II), y debido a la relevancia biológica de los complejos del N-óxido

de la 2-hidroxipiridina 1 con vanadilo (IV) como compuestos insulinomiméticos65, se

utilizó también este catión diatómico.

Con el fin de alcanzar un mejor entendimiento del mecanismo de fragmentación y

de las diferencias observadas en los espectros de masa con metales se realizaron

cálculos computacionales. La caracterización de los principales iones obtenidos y el

análisis de la estabilidad relativa de los posibles productos de disociación y de los

complejos formados en fase gaseosa, constituye una herramienta importante para

entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los N-

Diferenciación de N-óxidos de hidroxipiridina Capítulo 2

25

óxidos de hidroxipiridina. Los cálculos realizados en relación a los mecanismos de

disociación estudiados se exponen en la sección 2.3, mientras que en la sección 2.5,

se exponen los relativos a los complejos metálicos, explorándose a modo de ejemplo

aquellos formados con calcio con abundancias relativas importantes para ambos

isómeros.

2.2. Comportamiento frente a la disociación

2.2.1. Efecto de las fuentes de ionización

A partir de las moléculas neutras 1 y 2 fueron fácilmente producidos los

correspondientes cationes protonados en fase gaseosa usando ESI, APCI o APPI. Las

condiciones empleadas para los experimentos se describen en el capítulo 5. El

propósito buscado fue mantener los parámetros lo más similares posible con el fin de

determinar el efecto de las diferentes fuentes sobre la disociación.

En primer lugar, se estudió la fragmentación empleando CID de los cationes

protonados isoméricos producidos por ESI. En los espectros de masa tándem, sólo se

observaron dos iones producto, uno de masa par [M+H-H2O]+ y otro de masa impar

[M+H-OH]+, que corresponden a la pérdida de una molécula neutra y de un radical,

respectivamente. En la Figura 2.2 se presentan los espectros de masa de los iones

producto a partir de los cationes protonados isoméricos obtenidos por CID a 15 eV.

Como puede verse en estos espectros, la abundancia relativa de los iones es

claramente diferente para cada isómero a esta energía de colisión.

En la Figura 2.3 se observa la evolución de la abundancia de los iones precursores

de las moléculas 1 y 2 protonadas (m/z 112) y de los iones fragmento (m/z 94 y m/z

95) que representan dos caminos de disociación competitivos, en función de la energía

de colisión. La señal a m/z 95 (pérdida de radical OH) domina el espectro de iones

producto del precursor protonado de 2 a energías de colisión superiores a 13 eV

mientras que la pérdida de agua es poco significativa en todo el rango de energías de

colisión estudiado. Por otro lado, el catión precursor protonado de 1 domina el

espectro a toda energía de colisión, siendo la abundancia de los iones fragmento

provenientes de la pérdida del radical y de agua comparables hasta 10 eV, cuando el

ion de m/z 95 se vuelve ligeramente más importante.


26

Figura 2.2. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores de m/z 112 (N-óxidos de

hidroxipiridina protonados producidos por ESI) con energía de colisión de 15 eV.

Figura 2.3. Diagramas de abundancia de iones precursores y producto (unidades

arbitrarias) versus energía de colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de

hidroxipiridina protonados producidos por ESI. (m/z 112 = [M+H]+ ; m/z 95 = [M+H-OH]+ ; m/z 94 = [M+H-H2O]+).

6 8 10 12 14 16 18 20 221

10

100

1000

10000

100000

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)

Energía de colisión (eV)

m/z 112 m/z 95 m/z 94

1

6 8 10 12 14 16 18 20 221

10

100

1000

10000

100000

2

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)


m/z 112 m/z 95 m/z 94

[M+H-OH]+ 95.0363

[M+H]+ 112.0395

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225

+MS2(112.0400) 2

m/z

[M+H-OH]+ 95.0364

[M+H]+ 112.0392

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225

+MS2(112.0400)

[M+H-H2O]+ 94.0293

1

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


27

Es interesante notar que en los espectros de masa tándem de las 2- y 3-

hidroxipiridinas protonadas ([M+H]+, m/z 96) obtenidos por otros autores empleando

altas energías de colisión, 8.2 keV58 y 10 keV66, respectivamente, fueron observados

entre los iones fragmento, aquellos originados por la pérdida de agua (m/z 78). En

cambio, los perfiles de fragmentos aquí observados resultaron casi idénticos para

ambas moléculas, difiriendo la intensidad relativa de los mismos. Sin embargo, las

intensidades relativas de los fragmentos no pueden ser comparadas debido a las

diferentes condiciones experimentales con que fueron obtenidos los espectros entre el

presente trabajo y el citado. Por otro lado, la pérdida del radical OH ya había sido

observada56 en el espectro de iones producto de la molécula protonada del N-óxido de

la piridina obtenido por ESI a una energía de colisión de 20 eV así como para otros N-

óxidos derivados de quinolinas67.

Cabe destacar que este comportamiento frente a la disociación constituye una

excepción a la regla de paridad electrónica (even electron rule), que como se comentó

en la sección 1.5.3, expresa que a partir de moléculas protonadas se espera obtener

iones producto de un número par de electrones por pérdida de moléculas neutras, en

lugar de iones producto de un número impar de electrones por pérdida de radicales.

Sin embargo, es conocido que esta predicción empírica puede no ser válida para

compuestos cuyos iones fragmento conservan la capacidad de estabilizar electrones

desapareados68,69. En estos casos, la formación de dos especies de capa abierta por

CID a partir de un catión precursor puede estar más favorecida que la pérdida de una

molécula neutra de capa cerrada y la formación de un catión producto70.

Los espectros de iones producto obtenidos con APCI y APPI resultaron

estrechamente similares a aquellos obtenidos con ESI, excepto por las intensidades

absolutas que difieren de acuerdo a la sensibilidad de cada método de ionización. ESI

y APCI mostraron intensidades absolutas comparables, siendo APCI ligeramente

superior en sensibilidad, en cambio APPI exhibió cerca de la mitad de los valores

absolutos de las otras fuentes. En la Figura 2.4 se muestran los diagramas de

abundancia relativa de los iones precursores y producto obtenidos a partir de las

moléculas 1 y 2 representando los dos caminos de disociación competitivos en función

de la energía de colisión de manera comparativa para los distintos métodos de

ionización.


28

En un trabajo donde se compara la eficiencia de los mismos tres métodos de

ionización con cinco fármacos71 se había encontrado una mayor abundancia de las

moléculas protonadas empleando ESI, mientras que APCI y APPI fallaban en producir

la ionización de uno de los compuestos. Teniendo en cuenta que la ionización por ESI

ocurre a partir de la solución9, mientras que en APCI y APPI ocurre en fase gaseosa

luego de la vaporización del solvente10,11 (sección 1.2.6, pág. 7), no es de sorprender

la obtención de respuestas selectivas de acuerdo a la naturaleza del compuesto.

Asimismo, aunque podría esperarse que la energía interna suministrada a los iones

fuera distinta según el método de ionización, la influencia de este efecto no resulta

significativa para los compuestos estudiados, como se observa en las curvas de

disociación de la Figura 2.4.

Figura 2.4. Diagramas de abundancia relativa (como fracción de iones) versus energía de

colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina protonados

producidos por ESI, APCI y APPI. (m/z 112 = [M+H]+ ; m/z 95 = [M+H-OH]+ ; m/z 94 =

[M+H-H2O]+).

Sobre la base de estos resultados puede concluirse que se pueden diferenciar

fácilmente ambos isómeros a energías de colisión superiores a 13 eV comparando la

relación de intensidades del ión precursor de m/z 112 y el fragmento de m/z 95. Así,

una relación [M+H]+/[M+H-OH]+ mayor a 1 es indicativa del isómero 1, mientras que

un valor menor a 1 es indicativo del isómero 2, independientemente de las fuentes de

ionización empleadas.

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,01

m/z 94m/z 95

m/z 112

Fra

cció

n de

ione

s


ESI APCI APPI

4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 2

m/z 94m/z 95

m/z 112

Fra

cció

n de

ione

s


ESI APCI APPI


29

Por primera vez, fue investigado el comportamiento disociativo en modo positivo

del par de N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina, pudiendo diferenciar los mismos por

este método (MS/MS) usando diferentes técnicas de ionización API-MS. El empleo con

éxito de la espectrometría de masa tándem para la diferenciación de otros compuestos

isómeros ya había sido informada con anterioridad, como en el caso de los

regioisómeros de ácidos benzoilbenzoicos32 empleando APCI-MSn. Sin embargo, se

había informado55 acerca de la inefectividad de los métodos MS/MS para la distinción

de los isómeros 8-hidroxiquinolina y el N-óxido de quinolina estudiados por ESI en

modo positivo, debido a la similitud de sus espectros de masa tándem. Resulta

interesante entonces que en los compuestos isómeros estudiados, moléculas muy

emparentadas con las anteriores, se hayan observado diferencias.

2.2.2. Efecto de la temperatura

En trabajos previos, se habían realizado estudios variando la temperatura de la

fuente de APCI (200-400°C), para derivados de N-óxidos de quinolina y otros

compuestos con la función N-óxido55,72. En ellos se observó una fragmentación

característica de los N-óxidos bajo estas condiciones, producto de la desoxigenación

de los compuestos. Esta descomposición térmica fue usada72 por ejemplo, para

distinguir un N-óxido de su metabolito hidroxilado utilizando espectros de masa

obtenidos con APCI a diferentes temperaturas.

Teniendo en cuenta lo anterior, se estudió el efecto de la temperatura en los

espectros de masa APCI de los compuestos 1 y 2, así como en el comportamiento

frente a la disociación de los iones precursores isoméricos. La elección de este

método de ionización reside en la posibilidad de variar la temperatura del vaporizador

desde 180 hasta 400ºC y en la mayor sensibilidad antes observada. Cabe destacar

que con la fuente de ESI no se utiliza un vaporizador (sección 1.2.5, pág 5).

En los espectros de masa APCI, se encontró la sensibilidad máxima en la

abundancia de iones para ambos compuestos entre 200 y 225ºC. Además, se observó

la aparición del ion de m/z 96, originado por la pérdida de un átomo de oxígeno, cuya

intensidad se incrementó a temperaturas superiores a 300ºC, como se muestra en la

Figura 2.5. En la Figura 2.5 se observa además que el aumento en la desoxigenación

asociado con la elevación de la temperatura, difiere porcentualmente entre los dos

compuestos.


30

150 200 250 300 350 400

0

10

20

30

40

50

60

Inte

nsid

ad r

elat

iva

(%)

Temperatura (ºC)

m/z 95 de 1 m/z 96 de 1 m/z 95 de 2 m/z 96 de 2

Figura 2.5. Relación entre las intensidades relativas de los iones [M+H-OH]+ (m/z 95) y

[M+H-O]+ (m/z 96) frente a [M+H]+ (m/z 112) de 1 y 2 obtenida a diferentes temperaturas

del vaporizador en los espectros de masa de los N-óxidos de hidroxipiridina producidos por

APCI.

Los espectros MS/MS de los cationes protonados de 1 y 2 fueron también

registrados a distintas temperaturas y los mismos mostraron una dependencia de la

temperatura no significativa. La ausencia de cambios observables, sugiere que la

activación térmica no es un factor importante en los caminos de disociación

estudiados.

Los resultados anteriores se encuentran de acuerdo con los informados

previamente55,72, donde se sugiere que la fragmentación de los N-óxidos que conduce

a la pérdida de oxígeno es causada por la activación térmica y no es inducida por la

activación colisional, sobre la base de la completa falta de formación de iones

fragmento desoxigenados observada en los espectros de APCI MS/MS a 200°C (o a

temperaturas menores).

Los experimentos realizados en relación al efecto de la temperatura sobre la

fragmentación de los compuestos estudiados confirman los resultados obtenidos

previamente por otros autores en cuanto al comportamiento observado para otros N-

óxidos. Además, en este trabajo, se muestra que el uso de temperaturas mayores a

300°C del vaporizador en APCI puede ser empleado para la diferenciación de los N-

óxidos isómeros estudiados observando las diferencias en el porcentaje de los

productos de desoxigenación.


31

2.2.3. Efecto del intercambio H/D

Se realizaron además estudios de marcado isotópico de los compuestos 1 y 2

reemplazando los átomos de hidrógeno intercambiables por átomos de deuterio y

empleando los mismos disueltos en solventes deuterados (Capítulo 5, sección 5.1.2,

pág. 208). De esta manera, empleando ESI se estudió el comportamiento frente a la

disociación de los compuestos deuterados denotados 1d y 2d (Figura 2.6) para

obtener información adicional. Los experimentos de marcado con deuterio se utilizan

en general para explorar mecanismos de fragmentación propuestos. Por ejemplo, en

iones parcialmente deuterados obtenidos a partir de ácidos carboxílicos de la 9-

fluorenona32 disueltos en metanol deuterado, se evidenciaron transposiciones 1,2 de

iones hidruro alrededor del anillo aromático en los espectros APCI-MSn.

En los espectros de masa de los compuestos deuterados 1d y 2d, se observaron

dos iones con uno o dos átomos de deuterio incorporados (m/z 113 y 114,

respectivamente), los que fueron seleccionados para realizar los espectros de masa

tándem a diferentes energías de colisión. El ión de m/z 113 corresponde a [Md+H]+, o

eventualmente a [M+D]+, mientras que el ion de m/z 114 corresponde a [Md+D]+. En la

Figura 2.7, se reproducen los diagramas que muestran los iones producto obtenidos a

partir de cada ion precursor seleccionado para los compuestos deuterados 1d y 2d en

función de la energía de colisión.

Figura 2.6. Estructuras de los compuestos deuterados estudiados.

Al comparar la Figura 2.7 con la Figura 2.3 (pág. 26) obtenida para los compuestos

no deuterados, se puede observar que en general se conserva la forma de las curvas

lo que permite una interpretación más directa. En el caso del compuesto 1d, el ion

precursor dideuterado [1d+D]+ (m/z 114) pierde el radical OD y la molécula neutra

D2O dando los iones producto de m/z 96 y m/z 94, respectivamente. De manera

análoga, el ion precursor de m/z 113 ([1d+H]+ o [1+D]+) se fragmenta perdiendo los

radicales OH y OD así como la molécula neutra HDO, originándose los iones


32

fragmento de m/z 96, 95 y 94, respectivamente. En este caso, los iones fragmento de

m/z 96 y 95 resultan muy similares en intensidad lo que podría sugerir una distribución

uniforme del átomo de deuterio incorporado entre los átomos de oxígeno que se

encuentran próximos en la molécula, facilitando así el intercambio H/D entre esas

posiciones. Esto resulta consistente con la coexistencia de dos estructuras en

equilibrio (Figura 2.6).

Figura 2.7. Diagramas de abundancia de iones (unidades arbitrarias) versus energía de

colisión (eV) para los espectros MS/MS de los N-óxidos de hidroxipiridina deuterados 1d y

2d producidos por ESI (m/z 113 y 114= iones precursor mono- y di- deuterados,

respectivamente).

Por otro lado, el ion precursor de m/z 114 correspondiente al compuesto 2d

presenta como ion producto sólo aquel de m/z 96, formado a partir de la pérdida del

radical OD, mientras que el ion precursor de m/z 113 presenta como iones producto a

6 8 10 12 14 16 18 201

10

100

1000

10000

100000

1d

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)


m/z 114 m/z 96 m/z 94

6 8 10 12 14 16 18 201

10

100

1000

10000

100000

2d

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)


m/z 114 m/z 96

6 8 10 12 14 16 18 201

10

100

1000

10000

100000

1d

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)


m/z 113 m/z 96 m/z 95 m/z 94

6 8 10 12 14 16 18 201

10

100

1000

10000

100000

2d

Abu

ndan

cia

de io

nes

(u.a

.)


m/z 113 m/z 96 m/z 95


33

aquellos originados por la pérdida de los radicales OH y OD, de m/z 96 y 95,

respectivamente. A diferencia de la muestra 1d, en este caso no se observaron iones

fragmento de intensidad apreciable originados por la pérdida de moléculas neutras.

Además, se observaron diferencias en la intensidad de los iones fragmento m/z 96 y

95 en una relación ~2:1. Se puede notar que como los átomos de oxígeno no se

encuentran próximos en la molécula 2, el intercambio de H/D entre esas posiciones

luego de la deuteración no es probable como en el compuesto 1. Luego, se sugiere

que la incorporación diferencial de deuterio en ambas posiciones, recordando que el

ion precursor m/z 113 puede provenir de [1d+H]+ o [1+D]+, podría ser la causa de las

diferencias observadas en las intensidades de los iones de m/z 96 y 95.

Es interesante notar que en experimentos previos realizados56 utilizando el N-óxido

de piridina-d5, disuelta en solventes no deuterados, fue observada la pérdida del

radical OH como principal canal de fragmentación aunque también se observó la

pérdida del radical OD, en una relación de iones producto de ~4:1, en el espectro de

masa tándem obtenido a partir del ion precursor protonado (m/z 101). Por lo tanto,

teniendo en cuenta estos resultados no puede excluirse la ocurrencia de reacciones de

intercambio H/D con los átomos de hidrógeno aromáticos.

Esta información adicional acerca del mecanismo de fragmentación podría

obtenerse realizando experimentos de marcado con deuterio en los átomos de

hidrógeno aromáticos, estudiando el comportamiento frente a la disociación de los

iones protonados de los N-óxidos de la 2 y 3- hidroxipiridina-d4 disueltos en solventes

no deuterados, de manera análoga a lo ya realizado con el N-óxido de piridina-d5. Por

otro lado, experimentos MS/MS sobre los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2

pero marcados con 18O (C-18O o N-18O), podrían proveer información útil respecto a la

pérdida preferencial del radical OH. Sin embargo, la realización de dichos

experimentos implica la síntesis no trivial de los compuestos marcados y escapa de los

objetivos planteados.

La formación de los iones fragmento obtenidos a partir de los iones precursores

deuterados en función de la energía de colisión resultó similar a la obtenida para los

compuestos sin deuterar. La pérdida del radical OD y/o OH constituyó el principal

camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a la que

prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin


34

deuterar. De esta manera, los resultados obtenidos corroboraron aquellos antes

obtenidos en la sección 2.2.1.

2.3. Estudio del mecanismo de disociación por simulación computacional

2.3.1. Sitios de protonación

Las geometrías de las estructuras 1a, 1b y 2 fueron optimizadas usando el nivel de

teoría híbrido B3LYP73,74 de la teoría del funcional de la densidad (DFT) usando el

conjunto de funciones base 6-31++G(d,p). Este conjunto de funciones base que

presenta tanto orbitales difusos como polarizados sobre cada átomo ha demostrado

ser adecuada para la investigación de sistemas similares con cargas deslocalizadas75.

Las estructuras optimizadas fueron caracterizadas por análisis de frecuencias

armónicas en los mínimos locales (todas las frecuencias reales) o puntos de

ensilladura de primer orden (una frecuencia imaginaria). En los valores de energía que

aparecen a lo largo del trabajo se encuentra incluída la corrección para la energía

vibracional de punto cero (ZPE) usando el mismo nivel de teoría.

Con el fin de identificar los sitios más probables de protonación de 1a, 1b y 2 se

emplearon índices de reactividad local, en particular, la función electrofílica de Fukui

(fK-)76 (Apéndice A.1, pág. 257). Recientemente, esta metodología ha sido empleada

para identificar los sitios de protonación en una serie de compuestos naturales77 y

sintéticos78. En este caso, para la estimación de la función condensada de Fukui se

emplearon tres aproximaciones: la aproximación de diferencias finitas79, usando las

cargas provistas por el análisis de población de Mulliken (MPA)80 y el análisis de

población natural (NPA)81, así como la aproximación directa de orbitales moleculares

frontera, relacionada con la densidad electrónica y la localización del orbital molecular

ocupado más alto (HOMO) en la molécula, despreciando el término de solapamiento82.

Los sitios probables de protonación obtenidos a partir de la estimación de la

función condensada de Fukui por los métodos antes descritos se muestran en la

Figura 2.8. En el capítulo 5 se encuentran los valores obtenidos a partir de los cálculos

(Tabla 5.9, pág. 243) para una lectura detallada de los mismos. Como se observa en la

Figura 2.8, los sitios de protonación más probables corresponden al átomo de oxígeno

del grupo N-óxido en 1b y 2, y del carbonilo en 1a. Debido a que para estos átomos se

obtiene el mayor valor de fK- se infiere que estas posiciones corresponden a los sitios


35

de protonación preferidos. Es interesante mencionar que aunque se notan ligeras

diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias finitas (MPA

y NPA) así como la de orbitales moleculares frontera (HOMO), ambas aproximaciones

mostraron la misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación.

Además, y con el fin de corroborar las predicciones obtenidas por las funciones

condensadas de Fukui, se calculó la energía de todos los cationes producidos por la

protonación de 1a, 1b y 2 en cada uno de los sitios posibles y a partir de la diferencia

entre la energía de cada catión y su correspondiente precursor neutro se obtuvieron

las energías de protonación en las distintas posiciones de cada compuesto. En la

Figura 2.9 se pueden ver los resultados obtenidos a partir del cálculo de energías de

protonación (Tabla 5.10, pág. 243). Las posiciones más favorables de protonación,

correspondientes a aquellas con menor energía, resultaron coincidentes con las

N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Fu

nci

ón

co

nd

ensa

da

de

Fu

kui (

f k

- )

Sitio (k)

1a

N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6 1b

Sitio (k)

MPA NPA HOMO

N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 N-O C-O

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6 2

Fu

nci

ón

co

nd

ensa

da

de

Fu

kui (

f k

- )

Sitio (k)

MPA NPA HOMO

Figura 2.8. Índices de las

funciones condensadas de Fukui

para el ataque electrofílico (fK-)

para los N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina 1a, 1b y 2

calculadas con las aproximaciones

de diferencias finitas (MPA y NPA)

y de orbitales moleculares frontera

(HOMO) para las geometrías

optimizadas al nivel de teoría

B3LYP/6-31++G(d,p).


36

predichas por los índices locales de la función electrofílica condensada de Fukui

(Figura 2.8) confirmando así los resultados.

Figura 2.9. Energía de protonación (kcal mol-1) para la protonación en diferentes

posiciones atómicas de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina 1a, 1b y 2 calculadas en

diferentes posiciones al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).

La protonación de 1a (-217.6 kcal mol-1) y 1b (-219.8 kcal mol-1) considerando las

posiciones más favorables (Figura 2.9) condujo al mismo catión producto. Las

conformaciones estables desde 1a y 1b, fueron nombradas I+H y II+H,

respectivamente. A partir de la protonación de 2 (-225.7 kcal mol-1) se encontraron dos

conformaciones estables, III+Ha y III+Hb. Los valores calculados de energías de

protonación se encuentran próximos a los valores calculados para la afinidad protónica

del N-óxido de piridina, 219 o 225 kcal mol-1, hallados por dos métodos de cálculo

distintos56. En la Figura 2.10, se muestran las estructuras obtenidas a partir de la

optimización de geometría al nivel B3LYP/6-31++G(d,p).

La protonación en el oxígeno ya protonado del grupo N-óxido (N-O) en 1a y en el

oxígeno del grupo hidroxilo (C-O) en 1b originó iones inestables que durante la

optimización de geometría, reordenaron a los iones más estables II+H y I+H,

respectivamente. De manera similar, la protonación en los átomos N-1, C-3 y C-5 de

1b no produjo iones estables, ya que durante la optimización de geometría

reordenaron a través de la migración de un protón del grupo OH hacia el oxígeno del

grupo N-óxido a las estructuras respectivas encontradas para 1a. Esto no resulta


37

sorprendente dado que como resultado de la protonación, los tautómeros del

compuesto 1 convergen a tautómeros del mismo ion.

Figura 2.10. Geometrías optimizadas de los cationes protonados de 1 y 2, mostrando las

distancias de enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O1-N1-C2 en

grados, obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).

Como se ve en la Figura 2.10, el grupo hidroxilo sustituyente se encuentra

coplanar con el anillo aromático en las conformaciones más estables de las

estructuras estudiadas. Esto muestra la efectividad de la interacción del par libre de

electrones del átomo de oxígeno con los orbitales del anillo aromático. Por otro

lado, el grupo oxígeno protonado de la función N-óxido se encuentra orientado casi

perpendicular al anillo aromático, excepto para I+H, donde el grupo se encuentra

coplanar. En ambas conformaciones del isómero 1 protonado, los grupos hidroxilo

están orientados cis respecto al otro, hecho que posiblemente facilita la ocurrencia de

interacciones estabilizantes adicionales.

Los índices de las funciones condensadas de Fukui permitieron determinar por

primera vez el sitio de protonación más probable de los compuestos 1 y 2 estudiados,

obteniéndose coincidencia con los resultados obtenidos mediante el cálculo de energía

de protonación. A partir de este análisis fue posible luego caracterizar las estructuras

correspondientes a los mínimos de energía de los compuestos 1 y 2 protonados.


38

2.3.2. Energía de los iones

La caracterización de las estructuras iónicas relevantes en la disociación de los

cationes I+H, II+H, III+Ha y III+Hb se llevó a cabo por medio de cálculos

computacionales de optimización de geometría de los iones producto primarios de las

principales reacciones de disociación (pérdida del radical OH). De esta forma, a partir

de los N-óxidos de hidroxipiridina isómeros protonados, se obtuvieron las

conformaciones más estables de los respectivos productos. Debido al carácter

radicalario de estas especies, se utilizaron métodos sin restricciones de spin (UB3LYP)

adecuados para sistemas de capa abierta. Para evitar el efecto de la contaminación de

spin83 (Apéndice A.2, pág. 259) introducida típicamente al emplear los métodos

anteriores, se realizaron cálculos puntuales de energía (single-point) utilizando

métodos restringidos de capa abierta (ROMP2)84 para el conjunto completo de

estructuras previamente optimizadas. De todas formas, los resultados obtenidos para

todos los valores de spin <S2> de los sistemas de capa abierta confirmaron una

desviación menor al 2% del valor esperado (Tabla 5.13, pág. 247), mostrando que la

función de onda obtenida por B3LYP no sufre contaminación de spin apreciable. La

combinación del uso de los métodos UB3LYP (DFT) y ROMP2 permite así evitar el

problema de la contaminación de spin observada en las funciones de onda obtenidas

por UMP2, que en algunos casos ha resultado importante, como se ha encontrado en

los radicales estudiados del 3-metilbutanal85.

Los perfiles de energía obtenidos se presentan en la Figura 2.11 junto con los

parámetros geométricos más relevantes de las estructuras calculadas. La

caracterización fue completada realizando e l análisis de frecuencias de las estructuras

correspondientes a puntos estacionarios. Dada la similitud en los resultados obtenidos

con las conformaciones III+Ha y III+Hb (diferencias de energía relativas entre

estructuras respectivas menores a 1 kcal mol-1 en todos los casos), cualquiera de ellas

resulta igualmente representativa y fue subsecuentemente nombrada III+H. Por otro

lado, la interconversión entre las estructuras I+H y II+H tiene asociada una barrera

energética pequeña de unas 5 kcal mol-1, por lo que ambos confórmeros podrían

interconvertirse, si cuentan con suficiente energía interna, lo que resulta probable en

las condiciones experimentales empleadas.


39

Figura 2.11. Perfiles de energía de los N-óxidos isómeros protonados de las

hidroxipiridinas y sus productos de disociación primarios, mostrando las distancias de

enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo diedro H-O1-N1-C2 en grados. Las

geometrías optimizadas y las energías fueron obtenidas al nivel de teoría UB3LYP/6-

31++G(d,p) y todos los valores están en kcal mol-1. Los valores entre paréntesis

corresponden a lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores.

Para el cálculo de las energías relativas se tuvieron en cuenta los valores de las

energías totales y de punto cero (ZPE) (Tabla 5.13, pág. 247). La comparación entre

los dos conjuntos de datos de energías sugiere que las lecturas de energía

ROMP2//UB3LYP/6-31++G(d,p) entre los distintos iones fragmento (Figura 2.11) son

en todos los casos mayores por unas pocas kcal mol-1 que aquellos directamente

obtenidos con UB3LYP/6-31++G(d,p). En ambos casos, puede concluirse que el grupo

hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido y no a partir del anillo

aromático.

En trabajos previos, se midió mediante experimentos calorimétricos86 la entalpía de

disociación del enlace N-O de los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2

obteniéndose valores de 67 y 61 kcal mol-1, respectivamente. Posteriormente, se

realizaron también estudios computacionales87 donde se obtuvieron valores


40

comparables pero encontrándose variaciones de hasta 10 kcal mol-1, según el nivel de

teoría empleado. Si bien los valores mencionados de entalpías no son directamente

comparables con las energías calculadas para la pérdida del radical OH a partir de los

compuestos protonados, la tendencia obtenida experimentalmente resulta interesante

ya que muestra diferencias de ~10% entre ambos isómeros, favoreciendo la

disociación del isómero 2 frente al 1, tal como se observa experimentalmente (Figura

2.3, pág. 26). Como se observa en la Figura 2.11, no resulta evidente cuál es la

energía de disociación asociada a la estructura 1 protonada que debe ser comparada

en relación a su isómero. Por este motivo, los caminos de disociación se investigaron

con mayor profundidad, presentándose la discusión a continuación.

2.3.3. Caminos de disociación

Los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H fueron explorados

mediante la localización de las estructuras de transición entre puntos estacionarios,

que fueron caracterizadas por el cálculo de frecuencias vibracionales.

Desafortunadamente, todos los intentos para localizar una estructura de transición

para la pérdida del radical hidroxilo a partir de los reactivos protonados desde el

estado fundamental electrónico (singulete) fallaron. Más aún, el barrido de la superficie

de energía potencial (SEP) para I+H, II+H y III+H tampoco mostró estructura transitoria

alguna que diera cuenta de la pérdida del radical.

A veces puede ocurrir que en la formación de radicales esté involucrado un estado

electrónico excitado como el estado triplete, como fue propuesto por ejemplo, para las

disociaciones homolíticas en iones piridinio88. En el caso particular de los N-óxidos

heteroaromáticos existe evidencia de la implicación del estado triplete en las

reacciones de desoxigenación fotoquímicas89. En particular, en el estado fundamental

de una serie de N-óxidos de quinolina se observó que la forma protonada era

fotoquímicamente estable exhibiendo fosforescencia90. Por lo anterior, se estudiaron

los caminos de disociación de los cationes I+H, II+H y III+H desde el estado excitado

triplete. En la Figura 2.12 se presentan los perfiles de energía potencial obtenidos para

los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de

disociación principales.

Diferen

ciación

de N

-óxid

os d

e hid

roxip

iridin

a C

apítu

lo 2

41

Figura 2.12. Perfiles de energía potencial de los N-óxidos isómeros protonados de las hidroxipiridinas a lo largo de sus caminos de disociación principales obtenidos al nivel de teoría UB3LYP/6-31++G(d,p). Todos los valores están en kcal mol-1. Las energías se obtuvieron a partir de cálculos UB3LYP/6-31++G(d,p) y los valores entre paréntesis a partir de lecturas de energía (single point) ROMP2 sobre los anteriores. Las estructuras señaladas por s y t corresponden a las estructuras iniciales (iones precursores) de los compuestos protonados en los estados singulete y triplete, respectivamente.


42

La caracterización de la SEP para el estado excitado triplete permitió obtener una

estructura de transición para la pérdida del radical hidroxilo desde los reactivos

protonados I+H y III+H, pero no para II+H, cuya estructura de transición era

responsable de la pérdida de agua (Figura 2.12), como se confirmó por cálculos de

coordenada de reacción intrínseca (IRC)91. Los cálculos IRC fueron llevados a cabo

con el fin de verificar que las estructuras de los estados de transición localizados

estuvieran conectadas con los correspondientes puntos estacionarios mínimos

asociados con reactivos y productos. Otra estructura de transición para la pérdida de

agua también fue encontrada desde el estado fundamental singulete de II+H, mientras

se estaba buscando la correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo (Figura 2.12).

Recientemente se han realizado estudios computacionales sobre el ion producto de

esta fragmentación [II+H-H2O]+, 2-piridinil oxenio, en los estados electrónicos singulete

y triplete92 y utilizando cálculos a un nivel de teoría elevado (CASPT2/pVTZ); se estimó

un salto de 16.4 kcal mol-1 entre el estado fundamental singulete y el primer estado

excitado triplete de este ion.

Las diferencias relativas entre los valores UB3LYP y ROMP2 ascienden como

máximo a 18 kcal mol-1, lo cual es bastante aceptable para el propósito cualitativo

buscado. Resulta interesante notar que estas diferencias se hacen evidentes en las

estructuras calculadas en el estado electrónico triplete. Asimismo, al comparar las

energías de los saltos singulete-triplete para iones fenil oxenio y piridinil oxenio92

calculadas por B3LYP y métodos de mayor nivel de teoría como CASPT2/pVTZ, se

han encontrado diferencias de >10 kcal mol-1. Sin embargo, como se observa en la

Figura 2.12, ambos métodos de cálculo coinciden en predecir una mayor barrera para

la pérdida del radical hidroxilo en I+H respecto a III+H cercana a 10 kcal mol-1 a partir

del estado excitado triplete. Esta diferencia en la barrera energética podría ser

responsable de las diferencias en las intensidades relativas de los iones fragmento

observadas previamente en los espectros de masa de cada compuesto para una dada

energía de colisión (Figuras 2.2 y 2.3, pág. 26).

En la Figura 2.13, se encuentran los parámetros geométricos de las estructuras

optimizadas involucradas en los perfiles de energía potencial de la Figura 2.12. Al

comparar la estructura de los reactivos protonados en los estados singulete (cf. Figura

2.10, pág. 37) y triplete, puede verse que la longitud del enlace N-O es mayor en este

último, perdiéndose la coplanaridad del enlace con el anillo aromático, es decir,

presentando una deformación en el ángulo diedro O-N1-C2-C3. Con respecto a las


43

estructuras de los estados de transición, puede verse que se parecen a los cationes

precursores tripletes pero con una longitud mayor del enlace N-O. Por otro lado, para

los productos provenientes de la pérdida de agua, la corta distancia encontrada para el

enlace C-O (~1.21 Å) sugiere estructuras quinoidales para estos iones con

deslocalización de carga sobre el carbono para al oxígeno (es decir, estructuras

semejantes a cationes azaciclohexadienonilos), en acuerdo con las estructuras

descritas para el ion 2-piridinil oxenio92.

Figura 2.13. Detalles geométrícos de las estructuras optimizadas más relevantes de la

Figura 2.12, mostrando las distancias de enlace C2-C3, N1-C2, C-O y N-O en Å y el ángulo

diedro O1-N1-C2-C3 en grados obtenidas al nivel de teoría B3LYP/6-31++G(d,p).

En la Figura 2.14 se muestran las SEPs de los cationes I+H y III+H para los

estados fundamental singulete y excitado triplete, exploradas aumentando paso a paso

la longitud del enlace que se rompe (N-O) y variando el ángulo diedro O1-N1-C2-C3,

mientras se optimizaban todo el resto de las coordenadas a cada dada longitud de

enlace y ángulo diedro. A lo largo de la elongación del enlace N-O, la SEP explorada

para el estado fundamental singulete y el estado excitado triplete se cruzan en un


44

cierto punto que corresponde a una longitud del enlace N-O de aproximadamente 2.0

Å (Figura 2.14). Sin embargo, los valores de energía en estos puntos de cruce son

muy similares para ambos isómeros, ya que se encuentran cerca de los respectivos

productos y así, este mecanismo no provee justificación para las diferencias

observadas. Por otro lado, la transición vertical singulete-triplete, a pesar de ser más

energética, reproduce las diferencias encontradas previamente para las barreras

energéticas de disociación a partir de las estructuras I+H y III+H.

Figura 2.14. Exploración de las SEP para las estructuras: I+H (gráficos a y b) y III+H

(gráficos c y d), comprendiendo los estados electrónicos excitado triplete (gráficos a y c) y

fundamental singulete (gráficos b y d). En los gráficos se representa la energía (en kcal

mol-1) versus la distancia N1-O1 (en Å) y el ángulo diedro O1-N1-C2-C3 (en °).

Los resultados obtenidos respaldan la implicación del estado excitado triplete de

menor energía en la disociación del radical hidroxilo para los compuestos estudiados.

Este estado excitado ya ha sido invocado para explicar la pérdida de radicales

halógeno en halopiridinas protonadas93 y la pérdida de radicales bencilo a partir de

iones piridinio sustituídos88. El mecanismo presentado resulta consistente con los

datos experimentales aunque no es posible excluir la ocurrencia de otros caminos. Por


45

el momento, no se cuentan con datos de otros estudios mecanísticos en N-óxidos para

contrastar los resultados.

2.4. Complejación con metales

A causa de las conocidas propiedades quelantes del N-óxido de la 2-hidroxipiridina

1, análogo heterocíclico de los ácidos hidroxámicos, los complejos con metales

divalentes y trivalentes de este compuesto han sido estudiados por diversos métodos

en solución60,61,62. Por otro lado, resulta interesante la posibilidad de estudiar

complejos metálicos formados en solución a través del empleo de técnicas de análisis

en fase gaseosa como la espectrometría de masa94 debido a que la caracterización de

los aductos formados con distintos iones metálicos por ESI en combinación con

espectrometría de masa tándem ha permitido la distinción de isómeros, por ejemplo en

trinorbornanodioles38 y diglicósidos de flavonoides39. Teniendo en cuenta todo lo

anterior, se estudiaron por ESI los complejos formados por los compuestos 1 y 2 con

distintos cationes metálicos trivalentes y divalentes con el fin de evaluar su

diferenciación por esta metodología. Para esto, se registraron los espectros de masa

de mezclas preparadas a partir de soluciones metanólicas de cada compuesto con

soluciones acuosas de las sales de los distintos metales estudiados. Las condiciones

experimentales empleadas se describen en el capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208).

2.4.1. Metales trivalentes

La característica clave de los espectros de masa obtenidos usando ESI con los

iones metálicos trivalentes: aluminio, hierro y galio, fue la presencia de una especie

predominante para cada isómero. Para el isómero 2, la especie predominante fue la

molécula protonada, mientras que el aducto constituido por dos ligandos (L)

desprotonados unidos al catión metálico (M) dominó los espectros del isómero 1 que

se pueden observar en la Figura 2.15. Previamente, este mismo aducto [M+2L-2H]+,

había sido informado en los espectros de masa obtenidos por ESI de soluciones de

aluminio (III) con otro ligando isomérico, 2,3-dihidroxipiridina95.


46

Figura 2.15. Espectros de masa ESI del N-óxido de 2-hidroxipiridina 1 (L) en presencia de

una solución de metal trivalente (M): a) aluminio; b) hierro; c) galio; contra-ion (X): cloruro.

La estabilidad relativa de los iones precursores diagnóstico [M+2L-2H]+ obtenidos

para el isómero 1 fue investigada además por CID. Para ello, se emplearon dos

enfoques, determinando el valor de los parámetros E1/296

, definido como la energía de

colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor seleccionado cae al 50%, y

CE5027, definido como la energía de colisión en la que la proporción subsistente del ion

precursor seleccionado al total de iones (SY, survival yield) es de la mitad.

[M+2L-2H]+ 247.0301

[2M+3L+ X+H2O-H]+ 436.0059

[2M+4L+ H2O-5H]+ 511.0628

[2M+5L-5H]+ 604.0848

0

20

40

60

80

100 [%]

100 200 300 400 500 600

a)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

[L+H]+ 112.0408

[M+L+X+ H2O-H]+ 218.9392

[M+2L-2H]+ 275.9834

[2M+4L+X-4H]+ 586.9386

0

20

40

60

80

100 [%]

100 200 300 400 500 600

b)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

[L+H]+ 112.0396

[M+L+X+ H2O-H]+ 231.9281

[M+2L-2H]+ 288.9731

0

20

40

60

80

100 [%]

100 200 300 400 500 600

c)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


47

El parámetro E1/2 fue extraído de las curvas de disociación graficando la

abundancia relativa en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de

referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para una

abundancia del 50% del ion precursor. Análogamente, el parámetro CE50 fue extraído

de las curvas de disociación graficando la proporción subsistente del ion precursor

(SY) en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de referencia

laboratorio, luego de linealizar las mismas mediante una transformación lineal que

permite una lectura más precisa del valor de la energía de colisión para una proporción

subsistente del 50% del ion precursor. Los detalles acerca de estos parámetros se

encuentran en el Apéndice A.3 (pág. 260).

En la Figura 2.16 se muestran las curvas de disociación de los iones precursores

[M+2L-2H]+ a partir de las cuales se estimaron los parámetros mencionados

anteriormente. Los valores estimados de E1/2 obtenidos para los iones precursores

[M+2L-2H]+ con M: Fe(III), Al(III) y Ga(III) resultaron 16, 23 y 25 eV, respectivamente,

mientras que los valores de CE50 10, 17.5 y 20 eV, respectivamente. Por lo tanto,

ambos enfoques son concordantes arrojando la misma tendencia relativa: Ga(III) >

Al(III) > Fe(III).

Resulta interesante comparar la estabilidad frente a la disociación en fase gaseosa

de los aductos iónicos anteriores con respecto a la constante de estabilidad en

solución de los mismos complejos. El orden relativo de constantes de estabilidad para

los complejos compuestos por dos ligandos desprotonados de 1 y un metal trivalente

sigue la tendencia: Fe(III)>Ga(III)>Al(III)61, considerando ya sea la disociación de un

ligando o de ambos del complejo. La discrepancia entre esta tendencia y las obtenidas

por E1/2 o CE50 puede entenderse teniendo en cuenta que la estabilidad en fase

gaseosa tiene en cuenta todos los caminos de disociación accesibles por la energía

interna del ion, y no sólo la pérdida intacta de los ligandos como ocurre en solución.

La diferenciación por ESI-MS entre los compuestos 1 y 2 fue puesta de relieve

empleando soluciones de los mismos adicionadas con soluciones de los metales

trivalentes aluminio, hierro y galio. Así, en el caso del isómero 1, se observó en los

espectros un ion aducto predominante [M+2L-2H]+, cuya estabilidad fue caracterizada

para cada metal a partir de la energía de disociación en fase gaseosa, mientras que en

el caso del isómero 2, no se observaron iones aducto con metales en los espectros de

masa ESI de las soluciones sino simplemente la molécula protonada.


48

5 10 15 20 25 30 350,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

a)

Abu

ndan

cia

rela

tiva

ion

prec

urso

r (

%)


m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga

Figura 2.16. Curvas de abundancia relativa (a); curvas de proporción subsistente (SY) (b);

y transformación lineal de las curvas de proporción subsistente (SY) (c) de los iones

precursores [M+2L-2H]+ en función de la energía de colisión correspondiente al sistema de

referencia laboratorio medidas para el compuesto 1.

El tratamiento con escandio (III) se discute separadamente en la sección 2.4.2 a

continuación, junto con los metales divalentes, por las características que presentó en

común con ellos.

2.4.2. Metales divalentes (y escandio)

Los espectros de masa obtenidos con cationes metálicos divalentes exhibieron

varias especies características para cada isómero. La confirmación de las

asignaciones se basó en las relaciones masa/carga (m/z) obtenidas con alta

resolución/precisión, en los espectros de masa de iones producto obtenidos por CID y

5 10 15 20 25 30 350,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

b)

Pro

porc

ión

subs

iste

nte

del i

on p

recu

rsor

(S

Y)


m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga

5 10 15 20 25 30 350

1

2

3

4 m/z 276 Fe m/z 247 Al m/z 289 Ga

ln[(

1-S

Y)/

SY

]


c)


49

en el análisis de los patrones isotópicos característicos de ciertos metales. Se muestra

como ejemplo en la Figura 2.17 el perfil isotópico del ion [M+2L-H]+ (siendo M: Zn(II) y

L: el compuesto 1), correspondiente a una ampliación del espectro de la Figura 2.21-

1b). Este perfil característico se origina debido a los cinco isótopos naturales que

presenta el zinc en relación 100/57.4/8.4/38.7/1.2 para M/M+2/M+3/M+4/M+6. En el

Anexo 1 (págs. 264-265) se pueden observar los perfiles isotópicos de los elementos

químicos usados en este trabajo.

Figura 2.17. Ampliación del espectro de masa ESI obtenido a partir del N-óxido de

hidroxipiridina 1 (L) en presencia de una solución del metal divalente zinc (M), mostrando el

patrón isotópico del ion aducto [M+2L-H]+.

Los cationes de metales alcalino-térreos mostraron un comportamiento ligeramente

diferente que los de metales de transición. Esto se ilustra en los espectros de masa

mostrados en la Figura 2.18, donde se muestran el calcio y el cobre como ejemplos.

Las principales características de los espectros de masa obtenidos con los distintos

iones metálicos estudiados se encuentran resumidas en las Tablas 2.1 y 2.2 y los

espectros de masa restantes se muestran en las Figuras 2.19-2.21.

Los principales aductos con cationes metálicos observados para el isómero 1 con

metales alcalino térreos (calcio y magnesio) fueron iones mono cargados con hasta

tres ligandos incluyendo una molécula de agua. En cambio, los metales de transición

con el isómero 1 presentaron aductos con dos centros metálicos y tres ligandos

desprotonados, además de una importante abundancia de iones mono cargados con

hasta dos ligandos incluyendo una molécula de agua.

284.9840

285.9859

286.9807

287.9817

288.9788

289.9825

0

20

40

60

80

100

[%]

284 285 286 287 288 289 290 291 292 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


50

En el caso del isómero 2, los iones aducto doblemente cargados, [M+2L+2H2O]++ y

[M+3L+H2O]++, fueron predominantes con los metales alcalino térreos, mientras que

las especies mono cargadas con cloruro unido, [M+L+Cl+H2O]+ y [M+2L+Cl]+,

resultaron importantes para metales de transición como el cobalto y zinc (Figuras 2.20

y 2.21. 2b). Un comportamiento similar en la complejación ha sido informado

previamente para un ligando monodentado diferente, 3-azidopropionitrilo97,98 con

metales como calcio, magnesio, cobalto y níquel.

Como casos excepcionales, iones mono cargados resultantes de la reducción de

Cu (II) a Cu (I) fueron detectados para el isómero 2 en el caso del cobre, el cual es

conocido por su facilidad para reducirse durante el proceso de electrospray99. En el

caso del níquel, fueron detectadas las especies doblemente cargadas antes

mencionadas, aunque mucho menos intensas en comparación con la molécula

protonada del isómero 2 (Figura 2.21. 2a).

El vanadilo (Figura 2.20a) exhibió varios aductos mono cargados resultantes de la

reducción (pérdida de oxígeno) u oxidación en el caso del isómero 1, de manera

consistente con la variedad de estados de oxidación alcanzables por el vanadio100,

mientras que para el isómero 2 se observó principalmente la molécula protonada.

Los iones aducto exhibidos con escandio en los espectros de masa fueron

reminiscentes de aquellos observados con los sistemas de metales divalentes con

cloruros, donde el contra-ion permanece unido en el aducto, a pesar de la naturaleza

trivalente de este catión metálico. Más aún, la incorporación adicional de varias

moléculas de solvente (es decir, agua y metanol) en los iones aducto observados con

este metal complicó el aspecto de los espectros de masa (Figura 2.19. 2b).

A pesar de la similitud en estequiometría entre los iones aducto con cationes

metálicos observados para los isómeros 1 y 2, al comparar las Tablas 2.1 y 2.2 se

puede notar que los aductos de 1 contienen ligandos desprotonados mientras que los

de 2 mostraron a los ligandos en su forma neutra. Estas diferencias entre ambos

compuestos podrían explicarse considerando la capacidad del isómero 1 de formar

quelatos estables actuando como un ligando bidentado al desprotonarse (tipo

“hidroxamato”), en contraste a su isómero 2.


51

Tabla 2.1. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos

por ESI del isómero 1 (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Metal M 24Mg 40Ca 51VO 59Co 58Ni 63Cu 64Zn 45Sc

[L+H]+ 112.0398

(4.2)

[M+L-H]+ 149.9866 (2.1)

160.9680 (2.2)c

168.9568 (0.6) 172.9532

(0.4) 173.9527

(0.7)

[M+L+H2O-H]+ 178.9787 (3.1)c

186.9674 (0.1)

185.9700 (2.3)

190.9640 (0.7)

191.9634 (0.0)

[M+L+MeOH-H]+ 205.9790 (0.4)

335.9570 (2.5)b

[M+L+2H2O-H]+ 196.9881 (3.5)c

204.9782 (1.1) 208.9743

(0.2) 339.9517 (3.1)b

[M+2L-H]+ 245.0404 (1.2)

261.0178 (2.0)

271.9992 (1.5)c

279.9879 (3.4)

278.9903 (2.6)

283.9843 (3.5)

284.9841 (2.4)

[M+2L-2H]+ 286.9864

(1.2)

[M+2L+H2O-H]+ 263.0507 (2.3)

279.0280 (3.1)

290.0096 (2.0)c

[M+3L-H]+ 356.0723

(1.3) 372.0486

(3.7)

[2M+3L-3H]+ 463.9507

(1.8) 447.9384

(0.1) 455.9313 (0.1)

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observaron: 353.9675 (2.5) [M+L+X+H2O+MeOH-H]+ y 204.0088 (1.3) [M+L+H2O+MeOH-H]+. c Se observan iones implicando la pérdida de un átomo de oxígeno.


por ESI del isómero 2 (L) con metales (M); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Metal M/ Contra-ion X

24Mg Cl

40Ca Cl

51VO SO4

59Co Cl

58Ni SO4

63Cu SO4

64Zn Cl

45Sc CF3SO3

[L+H]+ 112.0392 (1.0)

112.0394 (1.1)

112.0397 (3.2)

112.0400 (6.2)

112.0391 (2.2)

112.0402 (8.1)

112.0397 (3.8)

112.0397 (3.8)

[M+L+H2O-H]+ 191.9718 (0.7)c

191.9629 (2.4)

[M+L+X]+ 204.9345 (4.7)

209.9304 (4.2)

[M+L+X+H2O]+ 222.9448

(3.3) 227.9397 (1.4)

471.9022 (0.3)b

[M+2L]+ 284.9925 (2.3)c

[M+2L+2H2O]2+ 141.0343 (1.6)

149.0235 (0.9)

[M+2L+X]+ 315.9653

(0.8) 320.9607

(2.5) 564.9225

(1.7)b

[M+2L+H2O+X]+ 299.0263 (5.5)

[M+3L+H2O]2+ 187.5450 (1.4)

195.5341 (0.1) 205.0195

(0.6) 204.5198

(3.4) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 25%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan iones conteniendo un contra-ion adicional triflato (X). Además se observa: 353.9670 (3.9) [M+L+X+H2O+MeOH-H]+. c Se observan iones conteniendo especies de Cu(I).


52

[L+H]+ 112.0397

[M+L-H]+ 149.9866

[M+2L-H]+ 261.0178

[M+3L-H]+ 372.0489

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

a)

m/z

1

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

[L+H]+ 112.0394

[M+2L+2H2O]2+ 149.0235

[M+3L+H2O]2+ 195.5341

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

a)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

2

[L+H]+ 112.0395

[M+L+H2O-H]+ 190.9640

[M+2L-H]+ 283.9843

[2M+3L-3H]+ 455.9313

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

b)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

1

[L+H]+ 112.0402

[M+L+H2O]+ 191.9718

[M+2L]+ 284.9925

[M+4L-H]+ 506.0486

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

b)

m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

2

Figura 2.18. Espectros de masa ESI-MS para los N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1 y 2 (L) en

presencia de una solución de metal divalente (M): a) calcio; b) cobre.


53

[L+H]+ 112.0404

[M+2L+H2O-H]+

263.0507

[M+3L-H]+ 356.0723

[2M+4L-3H]+ 489.0723

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

a) 1

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

[L+H]+ 112.0392

[M+2L+2H2O]2+ 141.0343

[M+3L+H2O]2+ 187.5450

[M+2L+X+H2O]+ 299.0263

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

a) 2

[M+F+2CH3OH-H]+ 126.9983

[M+L+CH3OH+H2O-2H]+ 204.0088

[M+L+X+CH3OH+H2O-H]+

353.9675

[M+2X+2CH3OH]+

406.9100

0

20

40

60

80

100 [%]

100 200 300 400 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 1

[L+H]+ 112.0397

[M+X+2CH3OH+H2O-H]+

274.9623

[M+L+X+H2O CH3OH-H]+ 353.9670

[M+2X+2CH3OH]+ 406.9116

[M+L+2X+H2O]+ 471.9022

[M+2L+2X]+ 564.9225

0

20

40

60

80

100 [%]

100 200 300 400 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 2


presencia de una solución de metal divalente (M): a) magnesio; b) escandio; contra-iones

(X): a) cloruro; b) triflato.


54

[M+2CH3OH-H]+ 129.9827

[M+L+H2O-H-O]+ 178.9787

[M+2L-2H]+ 286.9864

[M+3L-3H-O]+ 381.0152

[2M+3L-3H]+ 463.9507

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

a) 1 In

ten

sid

ad r

elat

iva

[L+H]+ 112.0397

[M+X+H2O+H]+ 213.9349

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

a) 2

[M+L+H2O-H]+ 186.9674

[M+2L-H]+ 279.9879 [2M+2L+X+

H2O-2H]+ 390.8932

[2M+3L-3H]+ 447.9384

[3M+2L+3X +H2O-2H]+ 519.7644

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 1

[L+H]+ 112.0400

[M+L+X+H2O]+ 222.9448

[M+2L+X]+ 315.9653

[2M+L+3X+2H2O]+ 369.8247 [2M+2L+3X]+

446.8344

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 2


presencia de una solución de metal divalente (M): a) vanadilo; b) cobalto; contra-iones (X):

a) sulfato; b) cloruro.


55

[L+H]+ 112.0398

[M+L+H2O-H]+ 185.9700

[M+2L-H]+ 278.9903

[2M+3L-3H]+ 445.9411

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

a) 1

[L+H]+ 112.0391

[M+3L+H2O]2+

204.5198 [M+4L]2+

251.0303 [M+2L+H2O-H]+ 297.0009

[M+3L-H]+ 390.0214

[M+4L-H]+ 501.0536

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

a) 2

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

[L+H]+ 112.0398

[M+L+H2O-H]+ 191.9634

[M+2L-H]+ 284.9841

[2M+3L-3H]+ 457.9298

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 1

[L+H]+ 112.0397

[M+L+X]+ 209.9304

[M+2L-H]+ 284.9844

[M+2L+X]+ 320.9607

[M+3L+X]+ 431.9921

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a

b) 2


presencia de una solución de metal divalente (M): a) niquel; b) zinc; contra-iones (X): a)

sulfato; b) cloruro.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


56

De manera general, ambos isómeros pudieron diferenciarse en todos los casos por

sus espectros de masa ESI sin importar la identidad del catión metálico utilizado para

obtenerlos. A diferencia de otros trabajos que emplearon la complejación con metales

en combinación con ESI38,39, en este caso, no fue necesario recurrir al empleo

adicional de la espectrometría de masa tándem para lograr la diferenciación de

isómeros, ni al empleo de ligandos adicionales, simplificando de esta manera el

análisis de los compuestos estudiados.

2.5. Estudio de los complejos con calcio por simulación computacional

Se buscó el respaldo de cálculos teóricos con el fin de comprender mejor el

comportamiento diferente de los isómeros 1 y 2 frente a la complejación con los

distintos metales. En particular, se escogió el calcio (II) como arquetipo ya que este

metal, entre los cationes metálicos estudiados, presenta un número de electrones

intermedio, simplificando el sistema y así disminuyendo los tiempos de cálculo,

destacándose además por los resultados antes provistos. Vale la pena recordar, como

se observa en la Figura 2.18a, que los principales y únicos complejos observados en

los espectros de masa de 1 con calcio fueron cationes mono cargados con hasta 3

ligandos, incluyendo hasta una molécula de agua. En cambio, en el caso de 2

resultaron importantes los cationes dicargados con dos ligandos, con una baja

abundancia relativa de cationes monocargados consistentes en complejos

coordinados a un único ligando y más de una molécula de agua.

Por razones comparativas, entre el conjunto de iones obtenido para ambos

isómeros, se escogió la estequiometría de los complejos con dos ligandos debido a la

abundancia relativa que presentaron estas especies en los espectros de masa de

ambos compuestos y por presentar una complejidad intermedia entre los complejos

más pequeños con 1 ligando y los más grandes con 3 ligandos observados (Tablas 2.1

y 2.2). A pesar de la intervención de las moléculas de agua en muchos complejos,

como se observa en las Tablas 2.1 y 2.2, las mismas fueron excluidas de este modelo.

Esta simplificación apunta a capturar las características esenciales de los sistemas

con la ventaja de una reducción en los grados de libertad y así en el tiempo de cálculo.

El propósito de este estudio fue obtener un conjunto de estructuras y energías de

los posibles complejos neutros, monocargados y dicargados de calcio con dos


57

ligandos para determinar la estabilidad de los diferentes iones aducto formados con

cada isómero y explicar los resultados obtenidos experimentalmente. Como punto de

partida para facilitar los cálculos subsiguientes, se comenzó con los complejos sin

carga neta (neutros), ya que los complejos con carga pueden obtenerse por

protonaciones sucesivas a partir de los primeros.

2.5.1. Estructuras de los complejos neutros

La caracterización de las estructuras relevantes de los complejos de calcio con dos

ligandos correspondientes a los isómeros 1 o 2, fue llevada a cabo empleando el

mismo nivel de teoría descrito en la sección 2.3.1, B3LYP, pero sin incorporar

funciones difusas sobre los átomos de hidrógeno, aligerando así el tamaño de la base,

6-31+G(d,p). El análisis de frecuencias armónicas de las estructuras estacionarias

obtenidas fue realizado para completar la caracterización de los mínimos locales.

A partir de las optimizaciones de geometría realizadas para los complejos neutros

se obtuvieron las estructuras que se muestran en la Figura 2.22. Los prefijos I (N-O) y

II (C-O) son usados para indicar cuáles son los átomos de oxígeno involucrados en los

diferentes modos de coordinación obtenidos para el isómero 2, que se comporta como

un ligando monodentado. Los ángulos y longitudes de enlace más relevantes para

caracterizar las estructuras halladas se encuentran resumidos en el Capítulo 5 (Tabla

5.14, pág. 248).

Dos complejos enantioméricos 1C fueron hallados para el isómero 1 (se muestra

solo uno en la Figura 2.22), conteniendo ambos ligandos coordinados al ion metálico a

través de todos los átomos de oxígeno. De esta forma, la geometría que presenta el

complejo resulta de tipo tetraédrica, con un ángulo de 93º entre los planos de los

anillos aromáticos. Dicha coordinación inusual ha sido informada recientemente para

complejos de calcio con cafeatos101.

Por otro lado, la exploración exhaustiva de los complejos del isómero 2 reveló la

imposibilidad de este ligando de coordinarse de modo bidentado usando ambos

átomos de oxígeno. En cambio, se encontraron tres complejos distintos, I,I’-2C, I,II’-2C

y II,II’-2C, que presentaban modos de coordinación alternativos con el catión calcio

unido a los dos ligandos a través de un único átomo de oxígeno de cada uno (Figura

2.22).


58

Figura 2.22. Geometría optimizada de las estructuras de los complejos neutros con calcio y

dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas

al complejo más estable del isómero 2 en kcal mol-1.

De esta manera, fueron obtenidas una y tres estructuras para los complejos

neutros de calcio formados a partir de los compuestos 1 y 2, respectivamente.

Desafortunadamente, no se cuenta con datos de literatura referidos a la estructura de

estos complejos para comparar con las estructuras aquí calculadas. A continuación se

presenta la generación de las estructuras de los complejos mono- y dicargados a

partir de las estructuras previas calculadas.

2.5.2. Sitios de protonación de los complejos

La identificación de los sitios de protonación más probables se llevó a cabo

aplicando la misma metodología empleada en la sección 2.3.1 (pág. 34), con la

excepción de que se omitió la estimación de la función condensada electrofílica de

Fukui a partir de orbitales moleculares frontera para alivianar los cálculos. Por lo tanto,

empleando la aproximación de diferencias finitas con las cargas obtenidas a partir de

MPA y NPA, se estimó la función condensada de Fukui para las estructuras 1C; I,I’-2C;

I,II’-2C y II,II’-2C (Figura 2.23). En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores

obtenidos a partir de los cálculos (Tabla 5.11, pág. 244).


59

Figura 2.23. Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico

(fK-) para los complejos neutros con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA)

para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).

A la vista de los resultados mostrados en la Figura 2.23, se puede ver cómo los

átomos de oxígeno son los sitios de protonación más probables en todos los casos,

difiriendo la identidad de los mismos según el complejo. Es interesante notar que

aunque se observan ligeras diferencias en algunas posiciones entre las

aproximaciones de diferencias finitas obtenidas por MPA y NPA, ambas mostraron la

misma tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación. Cabe destacar que los

sitios más favorables, en el caso del complejo formado con el isómero 1, son los

átomos de oxígeno del grupo N-óxido mientras que para el isómero 2, son los átomos

de oxigeno no coordinados al calcio.

N-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O(I)O(II) Ca N-1'C-2'C-3'C-4'C-5'C-6'O(I')O(II')

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20 1CF

unci

ón c

onde

nsad

a de

Fuk

ui (f

K

- )

Sitio (k)


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20 I,I'-2C

Sitio (k)

MPA NPA


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20 I,II'-2C

Fun

ción

con

dens

ada

de F

ukui

(fK

- )

Sitio (k)


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20 II,II'-2C

Sitio (k)

MPA NPA


60

Luego, se produjeron los cationes precursores por protonación de 1C, así como de

I,I’-2C; I,II’-2C y II,II’-2C, de acuerdo a las posiciones más probables previamente

calculadas. En cada caso, se exploró más de una conformación de partida luego de la

protonación. De acuerdo a los estudios conformacionales realizados para los N-óxidos

de hidroxipiridina 1 y 2 protonados y presentados en la sección 2.3.1 (pág. 34), en

caso de protonarse el oxígeno del sustituyente aromático, las conformaciones estables

corresponden a la ubicación del hidroxilo coplanar con el anillo aromático, mientras

que el oxígeno protonado del grupo N-óxido puede orientarse casi perpendicular al

anillo aromático, o ubicarse coplanar con el mismo. Por ende, en todas las geometrías

de partida para cada uno de los complejos monocargados, se tuvieron en cuenta estos

antecedentes.

Las estructuras optimizadas de las conformaciones estables encontradas para los

complejos monocargados se muestran en las Figura 2.24. Los sufijos IH (N-O) y IIH

(C-O) son usados para indicar la identidad del átomo de oxígeno protonado, mientras

que las distintas conformaciones correspondientes a modos de coordinación y átomos

protonados idénticos, es decir, aquellas cuyos nombres poseen iguales prefijos y

sufijos, se distinguen con una letra minúscula. Las longitudes de enlace más

relevantes de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos

ligandos de 1 y 2 se muestran en el Capítulo 5 (Tablas 5.16 y 5.17, págs. 249-250).

La protonación de 1C de acuerdo a las posiciones más probables condujo a tres

conformaciones: 1C-IHa, 1C-IHb y 1C-IHc (Figura 2.24). Además, la protonación en el

átomo de oxígeno del sustituyente del anillo aromático, luego de las optimizaciones de

geometría, resultó en tres conformaciones adicionales, 1C-IIHa, 1C-IIHb y 1C-IIHc,

que se calcularon a fin de comparar sus energías relativas con las anteriores. A partir

de la protonación de los complejos de 2C con distintos modos de coordinación, de

acuerdo a las posiciones más favorables, se obtuvieron seis conformaciones con

distintas estabilidades relativasμ I,I’-2C-IIHa, I,II’-2C-IIHa, I,II’-2C-IIHb, II,II’-2C-IHa,

II,II’-2C-IHb y II,II’-2C-IHc (Figura 2.24). El análisis de los resultados energéticos

obtenidos para las conformaciones encontradas de los complejos monocargados de

cada isómero (Figura 2.24), revela que las más estables corresponden a geometrías

donde es posible la formación de un puente de hidrógeno intermolecular entre ambos

ligandos.

Diferen

ciación

de N

-óxid

os d

e hid

roxip

iridin

a C

apítu

lo 2

61

Figura 2.24. Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol-1.


62

En el caso de los complejos de calcio con el isómero 1, se hallaron dos

conformaciones que presentaban este tipo de interacción (1C-IHa y 1C-IHb), mientras

que en las restantes, ambos ligandos se encontraban cerca de la coplanaridad, ya sea

con número de coordinación (NC) 4 (1C-IIHa y 1C-IIHb), o NC 3 (1C-IHc y 1C-IIHc).

Cuatro conformaciones con puentes de hidrógeno intermoleculares fueron halladas

para los complejos de calcio con el isómero 2, una para cada uno de los modos de

coordinación encontrados en los complejos neutros (I,I’-2C-IIHa; I,II’-2C-IIHa y II,II’-

2C-IHa), además de II,II’-2C-IHb, que resultó muy similar y ligeramente superior en

energía que II,II’-2C-IHa. En este caso, las estructuras sin puentes de hidrógeno (I,II’-

2C-IIHb y II,II’-2C-IHc) resultaron más extendidas como cabe esperar de la ausencia

de interacciones adicionales entre ambos ligandos.

En la siguiente etapa, las estructuras de los complejos dicargados fueron

optimizadas luego de protonar los complejos monocargados de acuerdo a las

posiciones más probables calculadas. Con el fin de reducir el número de cálculos, se

seleccionaron dos estructuras distintivas y representativas entre aquellas de menor

energía para los complejos monocargados de cada isómero, 1C-IHa y 1C-IHb para 1 y

I,II’-2C-IIHa y II,II’-2C-IHa para 2. Los índices de las funciones electrofílicas

condensadas de Fukui fueron obtenidos de manera análoga a la descrita previamente.

En el capítulo 5, se encuentran resumidos los valores obtenidos a partir de los cálculos

(Tabla 5.12, pág. 245).

En la Figura 2.25 se muestran los índices obtenidos a partir de estos cálculos que

muestran nuevamente que los átomos de oxígeno son los sitios de protonación más

probables en todos los casos, y en particular aquellos pertenecientes al ligando que

previamente no se hallaba protonado debido a que para estos átomos se obtiene el

mayor valor de fK-. Sin embargo, es interesante notar que algunos átomos de carbono,

pertenecientes al ligando no protonado en la primera etapa, exhiben valores altos

también, aunque menores que los correspondientes a los átomos de oxígeno. Este

comportamiento podría atribuirse al bien conocido fuerte efecto orto- y para- director

del grupo hidroxilo (o hidroxilo desprotonado) que incrementa el carácter nucleofílico

en las posiciones orto y para del anillo aromático. Nuevamente, a pesar de notar

ligeras diferencias en algunas posiciones entre las aproximaciones de diferencias

finitas obtenidas por MPA y NPA, se observa que ambas muestran la misma

tendencia, prediciendo los mismos sitios de protonación.


63

Figura 2.25. Índices de las funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fK-)

para los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina calculadas usando las aproximaciones de diferencias finitas (MPA y NPA)

para las geometrías optimizadas al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).

De manera análoga a lo realizado con anterioridad, a partir de la protonación en

las posiciones más probables de los correspondientes complejos monocargados

fueron exploradas diferentes conformaciones de partida. En esta ocasión, se

encontraron menos conformaciones para cada complejo dicargado que para sus

precursores. En el caso de I,II’-2C-IIHa, se protonó también el oxígeno del sustituyente

del anillo aromático, resultando una estructura dicargada adicional (I,II’-2C-II,II’Ha)

calculada a fin de comparar su energía relativa con las restantes. Las estructuras

encontradas se muestran en la Figura 2.26.


0,0

0,1

0,2

0,3 1C-IHaF

unci

ón c

onde

nsad

a de

Fuk

ui (f

K

- )

Sitio (k)


0,0

0,1

0,2

0,3 1C-IHb

Sitio (k)

MPA NPA


0,0

0,1

0,2

0,3 I,II'-2C-IIHa

Fun

ción

con

dens

ada

de F

ukui

(fK

- )

Sitio (k)


0,0

0,1

0,2

0,3 II,II'-2C-IHa

Sitio (k)

MPA NPA


64

Como puede verse en la Figura 2.26, en lo que respecta a las diferencias de

energía entre las conformaciones encontradas para los complejos dicargados de cada

isómero, se nota que las más estables corresponden a geometrías donde ya no se

favorece la interacción mediada por la formación de puentes de hidrógeno entre

ambos ligandos. Este comportamiento es contrario al observado previamente para los

complejos monocargados. Las longitudes de enlace más relevantes de las estructuras

de los complejos dicargados con calcio y dos ligandos de 1 y 2 se resumen en el

Capítulo 5 (Tabla 5.18, pág. 250).

En conexión con las conformaciones obtenidas, los complejos del isómero 1

mostraron ambos ligandos coplanares, resultando más estables aquellas

conformaciones de NC 4 y sin puentes de hidrógeno (1C-I,II’Ha y 1C-I,I’Ha), que

aquellas de NC 3 con un puente de hidrógeno intramolecular (1C-I,II’Hb). Por otra

parte, los complejos del isómero 2 que presentan un valor próximo a 90° en el ángulo

diedro entre los anillos aromáticos de ambos ligandos y que poseen conformaciones

extendidas colineales (I,II’-2C-I’,IIHa, II,II’-2C-I,I’Ha y II,II’-2C-I,I’Hb) presentaron

energías menores que aquellas más compactas, donde uno de los átomos de oxígeno

protonados se halla coordinado al calcio (I,II’-2C-II,II’Ha y II,II’-2C-I,II’Ha).

Como se comentó anteriormente, el sitio de protonación más probable de los

complejos neutros y monocargados de calcio con los compuestos 1 y 2 fue

determinado a partir del análisis de las funciones condensadas de Fukui para el

ataque electrofílico, obteniendo luego las estructuras correspondientes a los mínimos

de energía de los complejos de calcio con los compuestos 1 y 2 mono- y dicargados,

respectivamente. En la literatura se pueden encontrar aplicaciones previas de las

funciones condensadas de Fukui, como por ejemplo, para estudiar los sitios de

oxidación y reducción en complejos metálicos macrociclícos de níquel(II)102. Sin

embargo, no se encontraron antecedentes del empleo de esta metodología de cálculo

para la obtención de complejos metálicos de distinta carga a causa del estado de

protonación de sus ligandos, como en este caso.


65

Figura 2.26. Geometrías optimizadas de las estructuras de los complejos dicargados con

calcio y dos ligandos de 1 y 2. Los valores entre paréntesis son las diferencias de energía

relativas al complejo más estable de cada isómero en kcal mol-1.


66

2.5.3. Estabilidad de los complejos ionizados

Contando con las estructuras de los complejos de calcio mono- y dicargados

conteniendo los compuestos estudiados como ligandos, resta el análisis de su

estabilidad relativa para comprender las diferencias observadas en los espectros de

masa de cada isómero (Figura 2.18a, pág. 52). En un primer lugar, se analizó la

estabilidad relativa de las especies dicargadas frente a la desprotonación por una

molécula neutra, generándose así dos moléculas monocargadas. Las posibles

moléculas neutras relevantes son los complejos neutros, así como moléculas de

solvente presentes en el medio, metanol y agua. Esto conduce a plantear las

ecuaciones (2.1), (2.2) y (2.3), donde dE1 es la diferencia de energía entre el complejo

neutro y el correspondiente complejo monocargado y dE2 es la diferencia de energía

entre el complejo monocargado y el correspondiente complejo dicargado, mientras que

dEH2O y dECH3OH corresponden a la energía de desprotonación de los iones oxonio del

agua y metanol, respectivamente.

[CaL2]++ + [CaL2 – 2H] 2 [CaL2 – H]+ dE = dE2 – dE1 (2.1)

[CaL2]++ + H2O [CaL2 – H]+ + H3O

+ dE = dE2 – dEH2O (2.2)

[CaL2]++ + CH3OH [CaL2 – H]+ + CH3OH2

+ dE = dE2 – dECH3OH (2.3)

Los valores de energías de desprotonación calculados para los distintos complejos

mono- y dicargados encontrados con cada isómero se muestran en las Tablas 2.3 y

2.4, respectivamente. Puede notarse que los valores hallados para las energías de

desprotonación de los complejos monocargados (Tabla 2.3) se encuentran cercanos a

los valores absolutos calculados previamente en la sección 2.3.1 (Figura 2.9, pág. 36)

para las energías de protonación de los compuestos 1 (~218-220 kcal mol-1) y 2 (~226

kcal mol-1). En cambio, las energías de desprotonación de los complejos dicargados

resultaron mucho menores que las de los respectivos complejos monocargados.

Reuniendo los valores de la Tablas 2.3 y 2.4 junto a la ecuación (2.1), puede

concluirse que en todos los casos, dE1 > dE2, indicando por ende, la incompatibilidad

de las especies dicargadas y neutras que, como es esperable, convergen a especies

monocargadas.

Por otra parte, en ausencia de complejos neutros, deben ser consideradas las

moléculas de solvente circundantes. Los valores de literatura103 para las afinidades


67

protónicas del agua y metanol son 165.2 kcal mol-1 y 180.3 kcal mol-1,

respectivamente. De manera análoga a la empleada para el cálculo de los valores de

la Tabla 2.3, las energías de desprotonación de los iones oxonio del agua y el metanol

fueron calculados, arrojando los valores de 163.6 kcal mol-1 y 179.1 kcal mol-1,

respectivamente. La concordancia entre los valores calculados (energías a 0 K) y los

valores de literatura (entalpías a 298 K) aporta sustento al modelo utilizado para los

cálculos, en el cual el efecto de las correcciones térmicas y entálpicas parecería

cancelarse al calcular la diferencia de energías. Sin embargo, la omisión de la entalpía

traslacional del protón (5/2RT), que es la contribución térmica más importante (1.5 kcal

mol-1)104, probablemente explicaría los valores sistemáticos menores de las energías

calculadas en comparación con las afinidades protónicas.

Tabla 2.3. Energías de desprotonación (kcal mol-1) para los complejos de calcio

monocargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.

Complejo dE1 Complejo dE1

1C-IHa 219.9

I,I’-2C-IIHa 259.1

1C-IHb 218.7 I,II’-2C-IIHa 256.4

1C-IHc 214.1 I,II’-2C-IIHb

249.5

1C-IIHa 214.4 II,II’-2C-IHa 255.3

1C-IIHb 214.4 II,II’-2C-IHb

252.3

1C-IIHc 210.2 II,II’-2C-IHc 238.1

dE1: diferencia de energía entre el complejo neutro y el correspondiente complejo monocargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).

Tabla 2.4. Energías de desprotonación (kcal mol-1) para los complejos de calcio

dicargados con dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.

Complejo dE2 Complejo dE2

1C-I,II’Ha 146.1

I,II’-2C-I’,IIHa 182.3

1C-I,II’Hb 136.8

I,II’-2C-II,II’Ha 142.5

1C-I,I’Ha 146.1

II,II’-2C-I,II’Ha 139.5

II,II’-2C-I,I’Ha 179.1

II,II’-2C-I,I’Hb 179.0

dE2: diferencia de energía entre el complejo mono- y el correspondiente complejo dicargado calculada al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).


68

Comparando los valores obtenidos para las moléculas de solvente con aquellos

calculados en la Tabla 2.4 para los complejos dicargados más estables de cada

isómero, se observa que los complejos de 2 son estables frente a la desprotonación

por el solvente (dE2-dEsv > 0), mientras que los de 1 no lo son (dE2 < 165 kcal mol-1),

como se deduce a partir de las ecuaciones (2.2) y (2.3). Estos resultados sugerirían

una posible explicación para las diferentes especies cargadas observadas en los

espectros de masa de ambos isómeros, es decir, por qué las especies dicargadas son

las más importantes entre los complejos de 2 con calcio, mientras que no se observan

para 1 (Figura 2.18a, pág. 52).

Finalmente, se investigó la estabilidad de los complejos monocargados relativa a

su formación a partir de los dos ligandos neutros más el catión Ca(II), según la

siguiente expresión:

EC = EC + EH – ECa(II) – 2 EL (2.4)

donde EC es la energía calculada del complejo, EH la energía del protón, ECa(II) la

del catión calcio aislado, y EL la de la conformación más estable del correspondiente

ligando neutro. Cabe notar que para balancear la masa y carga es necesario incluir un

protón entre los productos aunque como la energía electrónica del protón es cero no

afecta el resultado.

Comparando los valores de energías de complejación EC de la Tabla 2.5 para

cada isómero puede observarse la mayor estabilidad de los complejos monocargados

formados con calcio a partir de dos ligandos neutros de 1 frente a los formados a partir

de 2. Dicha estabilización puede comprenderse en términos de las estructuras y

modos de coordinación hallados en los complejos monocargados formados con cada

isómero (Figura 2.24). Vale la pena recordar que en el caso de los complejos del

isómero 1, el calcio presentó NC entre 3 y 4, mientras que los complejos del isómero 2

presentaron al calcio con un NC máximo de 2. Es interesante notar también que, en el

espectro de masa del isómero 2 con calcio, los aductos monocargados presentaron

una abundancia relativa baja, mientras que fueron las especies más importantes

observadas en el caso del isómero 1 (Figura 2.18a, pág. 52). Así, las energías de

complejación calculadas podrían ser un indicio para explicar la diferencia observada

entre los espectros de masa de ambos isómeros.


69

Tabla 2.5. Energías de complejación (kcal mol-1) para los complejos de calcio

monocargados con dos ligandos.

Complejo EC Complejo EC

1C-IHa -29.9

I,I’-2C-IIHa 3.23

1C-IHb -28.8

I,II’-2C-IIHa -2.74

1C-IHc -24.1

I,II’-2C-IIHb 4.19

1C-IIHa -24.4

II,II’-2C-IHa -6.96

1C-IIHb -24.4

II,II’-2C-IHb -4.01

1C-IIHc -20.3

II,II’-2C-IHc 10.2

EC: diferencia de energía entre el complejo monocargado y sus dos ligandos neutros más el ión calcio calculada de acuerdo a la ecuación (2.4) al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).

El análisis de la estabilidad relativa de las estructuras en fase gaseosa de los

posibles complejos de calcio formados con cada isómero constituyó una herramienta

valiosa para comprender las diferencias observadas en los espectros de masa

obtenidos a partir de las soluciones de este metal y cada compuesto. Si bien este es

un caso particular donde fue posible explicar los resultados experimentales obtenidos

mediante cálculos sobre un sistema modelo y no se encontraron antecedentes de un

análisis similar en otros estudios, los resultados son alentadores y sugerirían que

podría aplicarse la metodología de manera análoga a sistemas formados con otros

iones metálicos.

2.6. Conclusiones

El comportamiento disociativo en modo de iones positivo de dos N-óxidos isómeros

de hidroxipiridina protonados utilizando CID mostró dos caminos de fragmentación: la

pérdida del radical hidroxilo y la pérdida de agua. Contrariamente a lo que cabría

esperar de la regla de paridad electrónica, el primer camino dominó los espectros de

masa tándem a diferentes energías de colisión para cada isómero. Sin embargo,

ambos isómeros pudieron ser diferenciados comparando la relación de intensidades

del ion precursor y del ion fragmento correspondiente a la pérdida del radical hidroxilo

a energías de colisión mayores a 13 eV.


70

El comportamiento con las distintas fuentes de ionización utilizadas (ESI, APCI y

APPI) resultó similar, confirmando los resultados obtenidos. A partir de experimentos

variando la temperatura de la fuente de APCI se observó además que la activación

térmica no es un factor importante en los caminos de disociación estudiados. Por otra

parte, al repetir los experimentos de espectrometría de masa tándem con los

compuestos marcados con deuterio, la pérdida del radical OD y/o OH constituyó el

principal camino de disociación, observándose diferencias en la energía de colisión a

la que prevalece este proceso para cada isómero al igual que en los compuestos sin

deuterar.

La pérdida preferencial del radical hidroxilo y los principales caminos de

disociación de los isómeros protonados de los N-óxidos de hidroxipiridina fueron

explorados a partir de cálculos computacionales. Analizando la estabilidad relativa de

los posibles isómeros y sus productos de disociación primarios, se determinó que el

grupo hidroxilo se pierde preferentemente desde el grupo N-óxido, que resultó el sitio

de protonación más favorable de los N-óxidos de hidroxipiridina, y que ya se encuentra

protonado en el tautómero 1a, 1-hidroxipiridina-2-ona.

La exploración de la SEP que comprende el estado fundamental singulete y el

primer estado excitado triplete para los compuestos protonados permitió observar una

diferencia en la barrera energética para la pérdida del radical hidroxilo entre ambos

isómeros cercana a 10 kcal mol-1. Los resultados de los cálculos sugieren que la

fragmentación podría ocurrir desde el primer estado excitado triplete de los

compuestos protonados. Si bien no se pueden excluir otros mecanismos, el estudiado

permite interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa tándem de

cada isómero.

La complejación con iones metálicos permitió la diferenciación de ambos isómeros

a partir de los iones aductos generados por electrospray. En el caso del N-óxido de la

2-hidroxipiridina 1, se observaron principalmente aductos monocargados conteniendo

uno o dos ligandos desprotonados con metales divalentes y trivalentes,

respectivamente. En cambio, para el N-óxido de la 3-hidroxipiridina 2 con metales

divalentes se observaron aductos mono- o dicargados con el ligando siempre en su

forma neutra, y sólo la molécula protonada fue observada cuando se emplearon

metales trivalentes.


71

La exploración del caso particular de la complejación diferencial del calcio (II) con

ambos isómeros mediante cálculos computacionales permitió lograr un mejor

entendimiento de las diferencias observadas en los espectros de masa de cada

isómero con metales. De esta manera, el análisis de la estabilidad relativa de los

posibles complejos de calcio formados con cada isómero se relacionó con la

observación de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada

compuesto.

Los resultados de los cálculos sugieren que la capacidad del isómero 1 de formar

quelatos estables actuando como ligando bidentado estabilizaría la formación de

especies monocargadas debido a la presencia de interacciones de puente de

hidrógeno intermoleculares. Sin embargo, estas interacciones (puentes de hidrógeno)

se pierden en las especies dicargadas, resultando éstas inestables frente a la

desprotonación por moléculas de solvente. Por el contrario, el isómero 2 se comporta

como un ligando monodentado, y los cálculos de energías sugieren una formación

desfavorable de los complejos monocargados a partir de los ligandos neutros y el

catión calcio. En cambio, los complejos dicargados mostraron ser estables frente a la

desprotonación por moléculas de solvente, dando un indicio de la importancia de estas

especies en el caso del compuesto 2.

Los resultados presentados en este capítulo dieron origen a 2 publicaciones:

Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. An experimental and computational study on

the dissociation behavior of hydroxypyridine N-oxides in atmospheric pressure ionization mass

spectrometry (2010) Journal of Mass Spectrometry 45, pp. 536–544.

Butler, M., Arroyo Mañez, P., Cabrera G. M. Differentiation of isomeric hydroxypyridine N-

oxides using metal complexation and electrospray ionization mass spectrometry. (2011) Journal

of the American Society for Mass Spectrometry 22, pp. 545-556.


72

73

Diferenciación de N-óxidos de pirazina

3.1. Introducción

Los N-óxidos de pirazina son heterociclos aromáticos con dos átomos de nitrógeno

en las posiciones 1- y 4-, donde uno de ellos, o ambos, pueden estar oxidados. Son

componentes frecuentes en productos naturales y drogas farmacéuticas (Figura 3.1),

por ejemplo, el ácido aspergílico105 y el pigmento pulcherrimina106 son antibióticos

biosintetizados por diversos microorganismos incluyendo hongos y bacterias, y el

acipimox es una droga sintética, análogo de la niacina, usado como hipolipidémico107.

Las pirazinas son ubicuas en la naturaleza108 mostrando diversas actividades

biológicas109. Además, han sido detectadas tanto en alimentos frescos como

calentados o tostados y debido a sus diversas propiedades, las pirazinas sintéticas

son usadas como aditivos en la manufactura110 de alimentos (por ejemplo,

metilpirazina 5 y acetilpirazina 6) mientras que otras son importantes drogas

farmacéuticas, como el agente antituberculoso pirazinamida111 13 (Figura 3.2).

Figura 3.1. Estructuras de algunos N-óxidos de pirazinas.

El análisis y elucidación estructural de estos compuestos resulta importante en el

caso de medicamentos para estudiar su metabolismo y modo de acción, y en el caso

de aditivos, para detectar su presencia en alimentos y regular su consumo. Cabe

mencionar que en muchos de estos productos, o en sus derivados metabólicos, un

3

Capítulo

Capítulo 3 Diferenciación de N-óxidos de pirazina

74

nitrógeno heteroaromático se encuentra como N-óxido y que hay una carencia de

métodos generales sencillos que permitan identificar unívocamente cuál es el átomo

de nitrógeno oxidado.

La confirmación de la estructura final de un compuesto orgánico desconocido es

siempre realizada mediante un conjunto de métodos independientes tales como la

espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) uni- (1D) y bi- dimensional

(2D) o la cristalografía de rayos X, así como otros métodos espectroscópicos.

El término elucidación estructural se refiere generalmente a la identificación estructural

de novo, resultando en un conjunto de datos completo con conexiones

intramoleculares y las asignaciones estereoquímicas correctas. Tal proceso de

identificación sin suposiciones o conocimiento previo alguno es comúnmente el

dominio de la espectroscopía RMN.

Por ejemplo, el patrón de sustitución de pirazinas di- y tri-sustituídas puede

elucidarse por una combinación de métodos de RMN112. No obstante, cuando se llega

a la asignación de la estructura final de N-óxidos de pirazinas sustituídas, una tarea

importante es determinar cuál de los dos átomos de nitrógeno se encuentra oxidado, lo

cual por lo general es bastante difícil de resolver por otros métodos espectroscópicos o

químicos.

Es interesante notar que los únicos análisis sistemáticos por MS de N-óxidos de

pirazinas se refieren a técnicas de ionización fuerte como EI113,114, mientras que la

mayoría de las metodologías que se desarrollan en la actualidad emplean técnicas de

ionización a presión atmosférica. Por consiguiente, se vuelve relevante el desarrollo de

estudios con técnicas de ionización más suaves que generan iones precursores

menos energéticos.

Teniendo presente el objetivo de desarrollar metodologías alternativas para el

análisis de compuestos isoméricos, se utilizaron los dos isómeros de N-óxidos de

hidroxipiridinas comerciales estudiados en el capítulo 2 como modelo para abordar el

estudio de un conjunto de 1- y 4- N-óxidos de pirazina sustituídas en la posición 2

(Figura 3.2) con 11 sustituyentes diferentes (cloro, amino, metilo, acetilo, carboxilo,

hidroxilo, metoxilo, acetamido, 1-hidroxietilo, metoxicarbonilo y carbamoílo). Estos

compuestos fueron sintetizados a partir de pirazinas comerciales como se presenta en

la sección 3.2. Estas moléculas difieren en el sustituyente del anillo aromático y en la

identidad del átomo de nitrógeno oxidado.

Diferenciación de N-óxidos de pirazina Capítulo 3

75

a b

Figura 3.2. Estructuras de los 1-N-óxidos a y 4-N-óxidos b de pirazinas 2-sustituídas.

Las dos metodologías desarrolladas en el capítulo 2, se aplicaron al estudio de la

diferenciación entre los N-óxidos isoméricos de pirazinas 2-sustituídas por MS en las

secciones 3.2 y 3.3. Por un lado, se comparó el comportamiento frente a la disociación

observada en los espectros de masa tándem de ambos isómeros (sección 3.3) y por el

otro, se registraron espectros de masa de cada N-óxido en presencia de soluciones de

los cationes metálicos, calcio (II), cobre (II) y aluminio (III), caracterizando y asignando

los iones aducto observados por ESI (sección 3.4).

Por otra parte, debido a que se pudo contar con los datos espectroscópicos de

RMN de los 22 compuestos sintetizados, en la sección 3.5 se empleó la

espectroscopía RMN para la diferenciación del conjunto de 1-N-óxidos de pirazinas 2-

sustituídas y sus 4-N-óxidos isoméricos. Para esto, se realizó inicialmente la

asignación de los átomos de hidrógeno y carbono así como la posición del grupo N-

óxido sin ambigüedades usando técnicas de RMN 2D para cada compuesto del

conjunto.

Dada la cantidad de compuestos analizada, la varianza de los resultados obtenidos

resultó difícil de interpretar de manera convencional. Se decidió entonces realizar un

estudio quimiométrico de los resultados. El análisis exploratorio de datos junto a

técnicas de reconocimiento de patrones115 son ampliamente empleados para la

interpretación de conjuntos de datos multivariados, puesto que reducen la complejidad

de los datos y permiten elucidar rasgos característicos. La aplicación del análisis de

componentes principales (PCA)116 (Apéndice A.4, pág. 261) a la espectroscopía en

general y a la espectroscopía de RMN en particular, ha aumentado recientemente con

el objetivo de proveer representaciones gráficas valiosas para el análisis de datos

multivariados117,118,119,120,121.

R Cl NH2 CH3 COCH3 CO2H OH OCH3 NHAc CHOHCH3 CO2CH3 CONH2

N° 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


76

La técnica quimiométrica de PCA, en este trabajo de tesis, se empleó para explorar

posibles tendencias que permitan clasificar el comportamiento de los compuestos, así

como para racionalizar las diferencias observadas (de acuerdo al sustituyente y

posición del N-óxido), tanto en los espectros de masa obtenidos con cada ion metálico

(sección 3.4), así como en el conjunto de datos de desplazamientos químicos de 13C

(sección 3.5).

3.2. Síntesis de los compuestos

Los compuestos sintetizados son 1-N-óxidos (denotados con a) y 4-N-óxidos

(denotados con b) de las siguientes pirazinas: 2-cloropirazina (3), 2-aminopirazina (4),

2-metilpirazina (5), 2-acetilpirazina (6), 2-carboxipirazina (7), 2-hidroxipirazina (8), 2-

metoxipirazina (9), 2-acetamidopirazina (10), 2-(1-hidroxietil)pirazina (11), 2-

(metoxicarbonil)pirazina (12) y 2-carbamoilpirazina (13). Las pirazinas 3, 4, 5, 6 y 7

fueron obtenidas comercialmente, en tanto que 10, 11 y 12 fueron sintetizadas a partir

de 4121, 6122 y 7123, respectivamente. No fue necesario sintetizar los precursores 8, 9 y

13, ya que los productos respectivos se obtuvieron por otras vías. Excepto por los

compuestos 6a, 11a y 11b, los compuestos restantes han sido previamente

sintetizados aunque en algunos casos por metodologías distintas. En el Capítulo 5,

(sección 5.6, págs. 216-240) se encuentran los detalles de las síntesis empleadas.

Dos métodos de N-oxidación difiriendo en el agente oxidante, persulfato de

potasio (Método A)124,125 y ácido 3-cloroperoxibenzoico (Método B)126 fueron usados.

La regioespecificidad en la oxidación por persulfato de potasio en H2SO4 son causadas

por los efectos de los sustituyentes atractores de electrones en el C-2 que reducen la

basicidad de los átomos de nitrógeno, en particular en la posición orto (N-1)125. En

otras palabras, se favorece la protonación del átomo de nitrógeno más básico (N-4) en

ácido sulfúrico resultando en la oxidación preferencial del átomo de nitrógeno restante

para formar 1-N-óxidos. El mecanismo de la N-oxidación con ácido 3-

cloroperoxibenzoico involucra un ataque nucleofílico del par de electrones libre del

nitrógeno sobre el oxígeno más externo del perácido126. En este caso, la orientación

está gobernada por la basicidad relativa de los átomos de nitrógeno.

El Método A proporcionó los compuestos 3a, 12a y 12b, a partir de 3 y 12,

respectivamente. La falta de selectividad del grupo metoxicarbonilo en 12 fue atribuida


77

a la pequeña diferencia entre las basicidades de los átomos de nitrógeno que induce

este sustituyente125. Sin embargo, el método no fue adaptable para su empleo con los

otros sustituyentes con grupos atractores de electrones como 6, y ya se habían

informado previamente intentos fallidos en su utilización con los compuestos 7 y 13125.

Por otro lado, por el Método B se obtuvieron los compuestos 3b, 4a, 5a, 5b, 6b,

10a, 10b, 11a y 11b, a partir de las respectivas pirazinas. Las diferencias en las

condiciones de reacción empleadas (sección 5.6, págs. 216-240), es decir, el solvente

y tiempo de reacción, se debieron a diferencias en la solubilidad y reactividad de los

distintos compuestos. Como se deduce a partir de los productos obtenidos, los grupos

atractores de electrones (3 y 6) favorecen la formación de 4-N-óxidos por la reducción

de la basicidad que provocan en el átomo de nitrógeno vecino antes discutida. En

cambio, el grupo amino (4) dador de electrones aumenta la basicidad del átomo de

nitrógeno adyacente resultando en la formación exclusiva del 1-N-óxido126. Los efectos

electrónicos de los sustituyentes restantes (5, 10 y 11), dadores débiles de electrones,

resultaron en una formación competitiva de ambos N-óxidos isómeros. En la Tabla 3.1

se resumen los procedimientos empleados.

Tabla 3.1. Derivados sintetizados de los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídasa.

N° Sustituyente

R Precursor

Reacción 1-óxido

Producto 1-óxido

Precursor Reacción 4-óxido

Producto 4-óxido

3 Cl 3 Método A124 3a 3 Método B126 3b

4 NH2 4 Método B126 4a 3b Amonólisis127 4b

5 CH3 5 Método B126 5a 5 Método B126 5b

6 COCH3 11a Oxidación132 6a 6 Método B126 6b

7 CO2H 12a Hidrólisis127 7a 12b Hidrólisis128 7b

8 OH 3a Hidrólisis128 8a 3b Hidrólisis128 8b

9 OCH3 3a Metanólisis129 9a 3b Metanólisis130 9b

10 NHCOCH3 10 Método B126 10a 10 Método B126 10b

11 CHOHCH3 11 Método B126 11a 11 Método B126 11b

12 CO2CH3 12 Método A125 12a 12 Método A125 12b

13 CONH2 12a Amonólisis131 13a 12b Amonólisis131 13b

a Los 1-N-óxidos están indicados con a y los 4-N-óxidos con b.


78

Como se deduce a partir de lo anterior, las N-oxidaciones generalmente produjeron

mezclas de diferentes N-óxidos, los cuales fueron separados y purificados por técnicas

cromatográficas. En general, fue necesario recurrir a cromatografía en capa delgada

preparativa de sílica gel con desarrollos sucesivos de la misma placa para conseguir

una separación entre los isómeros que permita obtenerlos puros.

Algunos de los productos puros de los N-óxidos fueron usados como precursores

para la síntesis de los restantes que no pudieron ser obtenidos por los métodos de N-

oxidación antes descritos. De esta manera, por simples sustituciones nucleofílicas

usando los N-óxidos de la cloropirazina (3a o 3b) como precursores se obtuvieron los

derivados con los grupos amino (4b)127, hidroxilo (8a y 8b)128 y metoxilo (9a y 9b)129,130.

Por otra parte, utilizando los N-óxidos de la metoxicarbonilpirazina (12a o 12b) como

precursores se obtuvieron los productos de hidrólisis (7a128 y 7b127) y de amonólisis

(13a y 13b)131 de manera directa. Finalmente, para la obtención del compuesto 6a a

partir del compuesto 6, fue necesaria una secuencia de reacciones rédox en

combinación con N-oxidaciones implicando la utilización del compuesto 11a132.

3.3. Análisis de las fragmentaciones por ESI-CID

A partir de las moléculas neutras 3a-13a; 3b-13b fueron producidas las

correspondientes moléculas protonadas en fase gaseosa usando ESI. Las condiciones

empleadas para los experimentos fueron idénticas a las empleadas previamente para

el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y 2 y están descritas en el capítulo 5

(sección 5.1.1, pág. 205). El análisis de los espectros de masa tándem obtenidos a

partir de los iones precursores [M+H]+ de los compuestos 3a-13a y 3b-13b proporciona

una primera aproximación a la posible discriminación entre los N-óxidos isómeros de

cada par. La estabilidad relativa de estos iones precursores obtenidos para cada

compuesto fue investigada por CID a través de la determinación del parámetro E1/296,

definido como la energía de colisión a la cual la intensidad relativa del ion precursor

seleccionado cae al 50%, como ya fue realizado en la sección 2.4.1 (pág. 46). Este

parámetro fue extraído a partir de las curvas de disociación graficando la abundancia

relativa del ion precursor en función de la energía de colisión correspondiente al

sistema de referencia laboratorio, determinando el valor de la energía de colisión para

una fracción de 50% del ion precursor. Los valores de E1/2 obtenidos para los iones


79

precursores [M+H]+ de los compuestos 3a-13a y 3b-13b, junto a los principales

canales de fragmentación observados se resumen en la Tabla 3.2.

Tabla 3.2. Valores de E1/2 obtenidos para los iones precursores [M+H]+ de los

compuestos 3a-13b junto a sus principales caminos de fragmentación observados.

N°

Sustituyente R 1-N-óxido a 4-N-óxido b

E1/2 (eV) Fragm. Ppal. E1/2 (eV) Fragm. Ppal.

3 Cl 14.5 -OH 14 -OH

4 NH2 22 -OH/-H2O 21 -OH/-H2O

5 CH3 14.5 -OH/-H2O 23 -OH/-H2O

6 COCH3 16.5 -CH2CO 17.5 -CH2CO

7 CO2H * -H2O * -H2O-CO

8 OH * -OH * -OH

9 OCH3 15 -OH/-H2O 15 -OH/-H2O

10 NHCOCH3 8.5 -CH2CO 10 -CH2CO

11 CHOHCH3 13 -OH/-H2O 9 -H2O/-2H2O

12 CO2CH3 12.5 -CH3OH+H2O 11.5 -CH3OH+H2O

13 CONH2 10.5 -NH3+H2O 10.5 -NH3+H2O

* No se observó caída de la intensidad relativa del ion precursor seleccionado.

Como se observa en la Tabla 3.2, los N-óxidos isómeros de 5 y 11 pudieron

diferenciarse, ya que presentaron una clara diferencia mayor a 2 eV entre sus valores

de E1/2, así como los N-óxidos isómeros de 7, dado que el isómero 4-N-óxido exhibió

un canal de fragmentación característico. En el resto de los casos, cada par de N-

óxidos isómeros compartió el mismo canal de fragmentación principal, así como

valores muy similares de E1/2, impidiendo así la distinción del sitio de N-oxidación por

este método. Estos resultados pueden verificarse al comparar las curvas de

disociación de los iones precursores [M+H]+ para cada par de isómeros, que se

muestran en la Figura 3.3 para los compuestos 3a-6a y 3b-6b y en la Figura 3.4 para

los compuestos 9a-13a y 9b-13b.

Los iones precursores de los compuestos sustituídos con un grupo amino (4a;4b),

ácido carboxílico (7a;7b) o hidroxilo (8a;8b) resultaron los más estables en relación a

la familia de compuestos estudiados, siendo predominante el ion precursor para todas


80

las energías de colisión en los dos últimos compuestos. Por este motivo, en estos

casos, no pudo hallarse el valor de E1/2, y en su lugar se muestran las curvas de

abundancia relativa de los principales iones fragmento respectivos en la Figura 3.5.

Figura 3.3. Curvas de abundancia relativa de los iones precursores [M+H]+ en función de la

energía de colisión correspondiente al sistema de referencia laboratorio de los 1-N-óxidos y

4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas con los grupos cloro 3, amino 4, metilo 5 y acetilo 6,

5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


3

5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

4

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

5

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

6

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)



81

5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

9

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

10

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

11

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

12

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

13

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

recu

rsor

(%

)


Figura 3.4. Curvas de abundancia

relativa de los iones precursores

[M+H]+ en función de la energía de

colisión correspondiente al sistema de

referencia laboratorio, de los 1-N-

óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-

sustituídas con los grupos metoxilo 9,

N-acetilo 10. 1-hidroxietilo 11,

metoxicarbonilo 12 y carbamoílo 13.


82

Figura 3.5. Curvas de abundancia relativa de los principales iones producto obtenidos a

partir de los iones precursores [M+H]+, en función de la energía de colisión correspondiente

al sistema de referencia laboratorio, de los 1-N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-

sustituídas con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.

En términos generales, los espectros CID de los iones [M+H]+ de los compuestos

estudiados compartieron algunas características. A modo de ejemplo, en la Figura 3.6,

pueden observarse los espectros MS/MS obtenidos por CID a 15 eV para los iones

precursores [M+H]+ de los compuestos 6a; 9a y 12a y en la Figura 3.7, los

correspondientes a los compuestos 6b, 9b y 12b para su comparación. Vale la pena

mencionar que un camino de fragmentación recurrentemente observado es la pérdida

del radical hidroxilo y la pérdida de agua, como se observa para los compuestos 9a y

9b en las Figuras 3.6 y 3.7, respectivamente. Este comportamiento ya había sido

previamente informado en los estudios CID de N-óxidos de hidroxipiridina en la

sección 2.2.1 (pág. 25). No obstante, también se observaron otros caminos de

fragmentación en los compuestos sustituídos con un grupo carbonilo. Con el grupo

acetilo (compuestos 6a, 6b y 10a, 10b), predominó la pérdida de cetena (H2C=C=O)

como canal de fragmentación primario, mientras que en derivados de ácidos

carboxílicos (compuestos 12a, 12b y 13a, 13b), se observaron especies atribuibles a

la hidrólisis de estos grupos (Figuras 3.6 y 3.7).

De manera semejante, en experimentos de espectrometría de masa tándem por

electrospray, a partir de la molécula protonada de N-óxidos derivados de quinolinas67,

la pérdida del radical hidroxilo, si bien resultó característica del grupo N-óxido, no fue

invariablemente el proceso de fragmentación primario, sino que también fueron

5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

7

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

rodu

cto

(%)


5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

8

1NO 4NO

Abu

ndan

cia

rela

tiva

del i

on p

rodu

cto

(%)


[M+H-OH]+

[M+H-OH]+ [M+H-H2O]+

[M+H-H2O-CO]+


83

observados otros caminos de fragmentación que prevalecieron sobre el anterior

cuando el anillo heterocíclico presentaba sustituyentes con grupos carbonilo en su

estructura. Por otra parte, la pérdida de moléculas neutras de cetena fue informada,

como único proceso de fragmentación a partir de experimentos CID de iones N-

alquilacil-4-(dimetilamino)piridinio133. Por otro lado, se ha encontrado empleando ESI

con analizadores como QIT o FT-ICR, que cationes fragmento acilio pueden asociarse

con moléculas residuales de solvente (como agua o metanol), dando origen a

artefactos inesperados (iones fragmento derivados de ácidos)134. Por ejemplo, en

estudios por CID de la molécula isoquinolina-3-carboxamida protonada, fueron

observados iones producto que eliminan nominalmente fragmentos de 11 u, que

fueron atribuidos a la pérdida neutra de CH2NH (-29 u) y una adición de agua (+18 u)

al resultante catión acilio para dar el ion producto correspondiente al ácido carboxílico

protonado135. La adición de agua a iones fragmento fue también observada en

analizadores híbridos QTOF, aunque en este caso, el origen fue atribuído a la

adsorción de humedad por las tuberías de acero conectadas a la celda de colisión136.

Al considerar los iones fragmento de menor intensidad para los compuestos cuyo

camino de fragmentación principal no era la pérdida del radical hidroxilo o agua, se

notó la presencia de especies útiles para diferenciar entre ambos isómeros. Por

ejemplo, los N-óxidos isómeros de los compuestos con sustituyentes acetilo (6) y

metoxicarbonilo (12), pueden diferenciarse a partir de iones fragmento que involucran

la pérdida de agua y la pérdida de CO y metanol, respectivamente, [M+H-H2O]+ y

[M+H-CH3OH-CO]+, que sólo se observaron en los 4-N-óxidos (Figura 3.7). De manera

similar, se encontraron los iones producto análogos, en los isómeros 4-N-óxidos de los

compuestos sustituídos con un grupo N-acetilo (10) y carbamoílo (13) que comparten

además el canal de fragmentación con los compuestos 6 y 12, respectivamente. Cabe

mencionar que el ion fragmento correspondiente a la pérdida de CO a partir del ion

acilio [M+H-H2O-CO]+, fue también el canal de fragmentación principal en el 4-N-óxido

del compuesto sustituído con el grupo carboxilo (7), que sirvió además para la

diferenciación de su isómero.

En un trabajo previo113 realizado empleando EI como técnica de ionización se

había encontrado la pérdida característica del átomo de oxígeno en los 1- y 4- N-

óxidos de pirazinas monosustituídas y sobre la base de comparaciones entre la

intensidad relativa de este fragmento y el proveniente de la pérdida del radical

hidroxilo, se observaban diferencias entre algunos N-óxidos isómeros.


84

Figura 3.6. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H]+ de los 1-N-

óxidos de acetilpirazina 6a, metoxipirazina 9a y metoxicarbonilpirazina 12a producidos por ESI

con energía de colisión de 15 eV.

[M+H-H2O]+ 109.0410

[M+H]+ 127.0509

9a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(127.0500)

[M+H-OH]+ 110.0510

[M+H-CH2CO-OH]+ 80.0354

[M+H-CH2CO]+ 97.0369

[M+H]+ 139.0457

6a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(139.0500)

[M+H-CH3OH]+ 123.0234

[M+H-CH3OH+H2O]+ 141.0342

[M+H]+ 155.0503

12a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(155.0500)

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


85

Figura 3.7. Espectros ESI-MS/MS de los iones precursores protonados [M+H]+ de los 4-N-

óxidos de acetilpirazina 6b, metoxipirazina 9b y metoxicarbonilpirazina 12b producidos por ESI

con energía de colisión de 15 eV.

[M+H-CH3OH-CO]+ 95.0249 [M+H-CH3OH]+

123.0209

[M+H-CH3OH+H2O]+ 141.0314

[M+H]+ 155.0469

12b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(155.0500)

[M+H-H2O]+ 109.0415

[M+H]+ 127.0521

9b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(127.0500)

[M+H-OH]+ 110.0510

[M+H-CH2CO]+ 97.0409

[M+H-OH]+ 122.0506

[M+H]+ 139.0507

6b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

+MS2(139.0500)

[M+H-H2O]+

121.0406

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


86

En este trabajo, a partir de la inspección de las intensidades relativas de los iones

fragmento obtenidos por la pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula

protonada, se encontraron pequeñas diferencias entre los N-óxidos isómeros de los

compuestos sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8), mientras que los

sustituídos con un grupo cloro (3) y metoxilo (9), resultaron indistinguibles por este

método, pudiendo observarse este último caso en las Figuras 3.6 y 3.7. Otros pares de

N-óxidos sustituídos con los grupos metilo (5) y 1-hidroxietilo (11) que mostraron estos

mismos canales de disociación pudieron ser diferenciados por el valor del parámetro

E1/2 (Tabla 3.2, pág. 79).

Teniendo en cuenta todo lo anterior, se lograron diferenciar entre sí nueve del total

de once pares de N-óxidos isómeros, a partir del análisis de las fragmentaciones por

ESI-CID, ya sea por la estabilidad de la molécula protonada frente a la disociación

medida con el valor del parámetro E1/2, útil para los compuestos con sustituyentes

alquílicos (5 y 11), por la presencia de iones fragmento característicos en los 4-N-

óxidos de compuestos sustituídos con un grupo carbonilo (6, 7, 10, 12 y 13) o por

ligeras diferencias entre las abundancias de los iones fragmento provenientes de la

pérdida del radical hidroxilo y agua a partir de la molécula protonada para los N-óxidos

isómeros sustituídos con un grupo amino (4) e hidroxilo (8). En este último caso, las

diferencias observadas no fueron tan marcadas como se esperaba por los resultados

obtenidos previamente en la sección 2.2 (pág. 25) relativos a la disociación de los N-

óxidos isómeros de hidroxipiridina 1 y 2, revelando así la influencia de los cambios

estructurales entre ambos sistemas.

3.4. Análisis de la formación de complejos con metales

Como alternativa a la metodología previa para diferenciar cada par de N-óxidos

isómeros, se evaluaron estrategias de complejación con metales basadas en la

formación de iones aducto con cationes metálicos por electrospray. En principio,

considerando los resultados previos de la sección 2.4, sería esperable obtener

diferentes espectros de masa para cada uno de los 2 isómeros de cada compuesto

con diferentes sustituyentes, permitiendo así su distinción sobre la base de las

distintas especies iónicas observadas.


87

Los espectros de masa fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el

momento de soluciones de cada N-óxido del conjunto de 22 pirazinas monosustituídas

(Figura 3.2, pág. 75) con diferentes soluciones de cationes metálicos (calcio (II), cobre

(II) y aluminio (III)). Estos metales fueron seleccionados como representantes del

grupo de metales alcalino-térreos, divalentes de transición y trivalentes, de acuerdo a

las diferencias características antes observadas en la sección 2.4, en relación con los

iones aducto formados con los N-óxidos de hidroxipiridinas.

Las moléculas protonadas de los N-óxidos de las pirazinas sustituídas 3a-13a y

3b-13b así como aductos mono- o dicargados, formados a partir del catión metálico

divalente o trivalente y los ligandos en su forma neutra o desprotonada, fueron

observados en fase gaseosa usando ESI. Las especies observadas en los espectros

de masa fueron caracterizadas y asignadas, confirmando las asignaciones sobre la

base de las relaciones m/z medidas con alta resolución y precisión, a los espectros de

masa tándem obtenidos por CID y al análisis de los patrones isotópicos característicos

en el caso del cobre y del contra-ion cloruro (Anexo 1, págs. 264-265).

Dado el número de compuestos analizados y de iones aducto identificados con

cada metal, la interpretación de los resultados resultó difícil. Por ello, se exploraron los

resultados obtenidos en busca de tendencias para clasificar el comportamiento de los

compuestos en función de sus estructuras moleculares con la asistencia del análisis

de componentes principales (PCA). Los estudios137,138,139 que emplean PCA para la

distinción de isómeros por espectrometría de masa aún son relativamente pocos. En

particular, en los casos citados, el análisis fue aplicado a las abundancias relativas de

iones fragmento, empleándose técnicas de ionización fuerte como EI.

En este caso, el análisis fue aplicado utilizando como datos de entrada de la

matriz, los rangos de intensidades relativas que se muestran en las Tablas 3.3-3.14.

Estos rangos representados en las tablas con colores (rojo: 5-25%; naranja: 25-50%;

verde: 50-75% y amarillo: 75-100%) fueron a su vez, codificados con números enteros

(rojo=1, naranja=2, verde=3, amarillo=4). De esta manera, se tuvo en cuenta la

variabilidad en la intensidad relativa de los iones, ya que varía dentro de un rango para

distintas réplicas, y de este modo los valores obtenidos en los experimentos replicados

quedaron comprendidos en los rangos propuestos.

Los iones observados (variables) se colocaron como columnas de la matriz de

PCA mientras que las filas (muestras) correspondieron a cada uno de los compuestos


88

estudiados 3a-13a y 3b-13b. Por consiguiente, fueron obtenidas tres matrices

conteniendo 26, 17 y 19 variables, para el calcio, cobre y aluminio, respectivamente

(Las tablas con los datos de estas matrices se encuentran en el capítulo 5, págs. 213-

215). Los primeros dos componentes principales obtenidos a partir de la aplicación de

PCA a cada matriz de datos describieron al menos el 80% de la varianza de los datos

para el cobre y aluminio, mientras que para el calcio, estuvo descrita el 75% de la

varianza por los primeros dos componentes y fue necesario considerar el tercero para

superar el 80%. Por lo tanto, aunque los dos primeros componentes principales (PC1 y

PC2), podrían no ser suficientes para describir la varianza completa de los datos,

sobre todo en el caso del calcio, por propósitos comparativos entre metales, se

realizará el análisis con los mismos.

Con el fin de simplificar la interpretación visual de las representaciones gráficas

obtenidas por PCA, se utilizó un código numérico para identificar los iones. El primer

dígito indica la carga del ion (ya sea 1 o 2) mientras que los subsiguientes se refieren a

los coeficientes estequiométricos del compuesto ligando, ion metálico, moléculas de

agua y contra-ion del metal, respectivamente en el ion aducto. Esto puede ser ilustrado

en el caso de un ion aducto genérico [(M)b(Z)c(H2O)d(X)e]a+, cuyo código sería abcde,

donde M representa al compuesto (3a-13a y 3b-13b), Z al catión metálico (calcio,

cobre o aluminio) y X al contra-ion del metal (cloruro o sulfato). Con el fin de reconocer

la presencia de especies desprotonadas a través del código numérico, la carga del ion

aducto (primer dígito) debe balancearse con las cargas del metal y su contra-ion. En el

caso particular del cobre, donde se observaron dos estados de oxidación, para evitar

la ambigüedad y diferenciar los iones aducto conteniendo Cu(I) de aquellos con Cu(II)

y especies desprotonadas, se antepuso un * al código numérico de las especies de

Cu(I).

3.4.1. Calcio

Las características principales de los espectros de masa obtenidos con calcio para

los compuestos 3a-13a y 3b-13b, se listan en las Tablas 3.3-3.6 donde se muestran

los iones aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas

(con error entre paréntesis). De manera general, los espectros de masa obtenidos con

calcio exhibieron varios iones aducto para cada compuesto. Los iones aducto de

mayor abundancia incluyeron tanto a cationes dicargados así como monocargados,


89

conteniendo ya sea un ligando desprotonado o el contra-ion cloruro unido. Asimismo,

se encontraron diferencias en la identidad de alguno/s de los iones aducto para cada

isómero del par de N-óxidos como se describe a continuación.

Al inspeccionar las Tablas 3.4 y 3.6 puede notarse que en el caso de los 4-N-

óxidos, en general, resultaron predominantes las especies correspondientes a la

molécula protonada [M+H]+ y/o al ion aducto dicargado formado por calcio junto a 2

moléculas de agua y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+2H2O]++. En el caso de los

1-N-óxidos (Tablas 3.3 y 3.5), además de las especies anteriores que prevalecieron

para los compuestos 3a, 5a y 9a, se agregaron otras. Así, el ion aducto monocargado

formado por calcio y una molécula del compuesto desprotonada [M+Ca-H]+ se destacó

para 4a, 8a y 10a, el ion aducto dicargado [2M+Ca+H2O]++ para 6a, 12a y 13a, y

finalmente, el ion aducto monocargado que incluye al calcio junto al contra-ion cloruro

y 2 moléculas del compuesto [2M+Ca+Cl]+ predominó para 9a y 11a.

La mayoría de los compuestos estudiados no mostraron evidencia de productos de

descomposición en sus espectros de masa en presencia de los iones metálicos. Sin

embargo, en ciertos casos se observaron los iones producto de los canales de

fragmentación estudiados en la sección 3.3 (pág. 78). Por ejemplo, para los

compuestos 10a y 10b, se evidenciaron iones aducto producto de la pérdida de

cetena, que coincide con el canal de fragmentación de menor energía de la molécula

protonada. Por otra parte, los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b, mostraron

iones aducto con calcio (Tablas 3.3-3.4) y cobre (Tablas 3.7-3.8) involucrando al

ligando descarboxilado. Curiosamente, ha sido informada la descarboxilación de

pirazincarboxilatos140 de cobre y calcio (II) bajo condiciones de pirólisis.

En la Figura 3.8 a) se muestra el gráfico de puntuaciones (scores plot) de los

compuestos estudiados y tratados con calcio (II) a partir de la aplicación de PCA a los

datos obtenidos en las Tablas 3.3-3.6, con el fin de visualizar la agrupación (o

separación) entre pares de compuestos isoméricos, así como entre compuestos con

distintos sustituyentes. Además, en la Figura 3.8 b) aparece el gráfico de pesos

(loadings plot) de los iones observados con calcio. Para la interpretación del gráfico de

pesos debe tenerse en cuenta que aquellas variables que se sitúan en el mismo

cuadrante presentan similar contenido de información. Es más, a partir del valor

numérico absoluto de los pesos es posible estimar cuánto contribuye una variable

individual a cada componente principal, y así identificar las variables más influyentes.


90

Tabla 3.3. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos por

ESI de los compuestos (M) 3a-7a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 3a C4H3ClN2O

4a C4H5N3O

5ab C5H6N2O

6a C6H6N2O2

7ac

C5H4N2O3

[M+Ca]++ 84.9771 (3.7) 89.0024

(2.4)

[M+Ca+H2O]++ 93.9833 (6.4)

98.0077 (2.1)

[M+Ca+2H2O]++ 102.9900 * 107.0126

(2.1)

[M+Ca+3H2O]++ 111.9939 (5.4)

116.0178 (1.9)

[M+Ca+4H2O]++

[M+H]+ 131.0012 (4.0)

112.0510 (3.8)

111.0558 (4.3)

139.0499 (2.5)

141.0294 (0.4)

[M+Na]+ 152.9826 (0.2) 161.0317

(3.0)

[M+Ca-H]+ 149.9983

(5.4) 176.9997 (14.5)

178.9777 (7.0)

[M+Ca+H2O-H]+ 168.0081 (0.1)

167.0127 (0.8)

195.0086 (4.4)

196.9886 (8.3)

[M+Ca+2H2O-H]+ 186.0174 (6.5)

185.0209 (13.3)

213.0184 (0.6)

214.9984 (4.1)

[M+Ca+Cl]+ 204.9252 (4.6) 212.9721

(8.1)

[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9351 (1.0) 230.9854

(4.5)

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 240.9448 (2.6)

[2M+Ca]++ 149.9747 (3.8) 158.0239

(1.3)

[2M+Ca+H2O]++ 158.9805 (6.6)

167.0296 (3.7)

[2M+Ca+2H2O]++ 167.9860

(7.5) 148.0387 (4.2)

176.0348 (3.2)

[2M+Ca+3H2O]++ 176.9903 (1.9)

[2M+Ca-H]+ 261.0412 (1.6) 315.0412

(3.5)

[2M+Ca+H2O-H]+ 279.0519 (2.3)

277.0589 (6.8) 337.0111

(5.9)

[2M+Ca+2H2O-H]+

[2M+Ca+Cl]+ 334.9153 (7.0) 351.0168

(0.1)

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9279 (1.0)

[3M+Ca]++ 214.9684 (11.4) 227.0457

(2.5)

[3M+Ca+H2O]++ 223.9759 (0.9)

[3M+Ca+Cl]+

[4M+Ca]++

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 94.0525 (0.6) [M+H-OH]+ c Se observan además 123.0189 (0.2) [M+H-H2O]+, 134.9869 (2.0) [M+Ca-CO2-H]+, 152.9978 (4.3) [M+Ca+H2O-CO2-H]+, 171.0086 (5.2) [M+Ca+2H2O-CO2-H]+ y 249.0298 (1.0) [2M+Ca-2CO2+H2O-H]+. * Se observa solapamiento de picos.


91


ESI de los compuestos (M) 3b-7b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 3bb C4H3ClN2O

4b C4H5N3O

5b C5H6N2O

6b C6H6N2O2

7bc

C5H4N2O3

[M+Ca]++ 84.9777 (3.0) 89.0027

(5.2)

[M+Ca+H2O]++ 93.9825 (2.3)

98.0077 (1.7)

[M+Ca+2H2O]++ 102.9875 (5.0) 107.0131

(3.0) 108.0016

(7.8)

[M+Ca+3H2O]++ 111.9928 (4.3)

116.0184 (2.7)

117.0059 (15.6)

[M+Ca+4H2O]++ 120.9979 (5.3)

[M+H]+ 130.9996 (8.3)

112.0523 (16.1)

111.0561 (7.3)

139.0508 (4.5)

141.0301 (4.4)

[M+Na]+ 134.0332 (5.4) 161.0313

(5.1) 163.012

(3.6)

[M+Ca-H]+ 150.0000 *

176.9995 (13.3)

178.9787 (13.0)

[M+Ca+H2O-H]+ 168.0090 (5.8) 195.008

(1.5) 196.9884

(7.4)

[M+Ca+2H2O-H]+ 213.0154 *

214.9984 (4.0)

[M+Ca+Cl]+ 204.9253 (4.8)

185.9790 *

184.9816 *

212.9691 *

[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9349 (0.2)

203.9864 (8.2)

202.9911 (8.2)

230.9856 (5.3)

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 240.9448 (2.7)

221.9965 (5.6)

221.0012 (5.1)

248.9945 (1.7)

[2M+Ca]++ 149.975 (5.5)

131.0237 (2.5)

130.0288 (0.6)

158.0235 (1.0)

[2M+Ca+H2O]++ 158.9793 (0.7)

140.0292 (0.8)

139.0346 (3.7)

167.0298 (5.2)

[2M+Ca+2H2O]++ 167.9845

(1.2) 149.0353

(4.7) 148.0406

(8.6) 176.0348

(3.1)

[2M+Ca+3H2O]++ 176.9895 (2.8)

158.0400 (0.8)

157.0451 (2.9)

[2M+Ca-H]+

[2M+Ca+H2O-H]+ 337.0094 (0.8)

[2M+Ca+2H2O-H]+ 355.0197 (4.3)

[2M+Ca+Cl]+ 334.9130 (14.0)

297.0197 (7.6)

295.0284 (5.0)

351.0172 (1.4)

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9302 (14.8)

315.0286 (2.0)

313.0379 (1.5)

[3M+Ca]++ 186.5466 (5.1)

185.049 *

227.0462 (4.8)

[3M+Ca+H2O]++ 195.5519 (4.8)

194.0589 (4.4)

236.0508 (1.8)

[3M+Ca+Cl]+ 408.0598 (2.2)

[4M+Ca]++

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b Se observa 113.9979 (7.1) [M+H-OH]+ c Se observan además 123.0193 (3.4) [M+H-OH]+, 134.9865 (0.8) [M+Ca-CO2-H]+, 152.9980 (5.5) [M+Ca+H2O-CO2-H]+, 171.0087 (5.8) [M+Ca+2H2O-CO2-H]+, 180.9896 (13.4) [M+Ca+H2O-OH]+, 199.0028 (0.9) [M+Ca+2H2O-OH]+, 233.0055 (11.2) [M+Ca+3H2O-H]+, 269.9486 (3.4) [2M+3Ca+2Cl+4H2O-2H]++, 278.9534 (1.6) [2M+3Ca+2Cl+5H2O-2H]++, 312.9651 (0.1) [3M+3Ca+Cl+3H2O-3H]++, 321.9699 (1.7) [3M+3Ca+Cl+4H2O-3H]++, 410.9328 (1.8) [2M+2Ca+Cl+H2O-2H]+, 496.9652 (5.0) [3M+2Ca-3H]+. * Se observa solapamiento de picos.


92


ESI de los compuestos (M) 8a-13a con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 8a C4H4N2O2

9a C5H6N2O2

10ab C6H7N3O2

11ac C6H8N2O2

12a C6H6N2O3

13a C5H5N3O2

[M+Ca]++ 83.0019 (3.3) 90.0104

(4.1) 96.9998

(0.8) 89.4996

(2.2)

[M+Ca+H2O]++ 92.0069 (6.0)

99.0151 (2.7)

106.0053 (3.3)

98.5049 (2.7)

[M+Ca+2H2O]++ 101.0124 (3.7)

114.5180 (1.7)

108.0206 (0.1)

115.0108 (5.2)

107.5105 (0.7)

[M+Ca+3H2O]++ 110.0195 (13.0)

123.5233 (1.4)

117.0259 (0.3)

124.0159 (2.9)

116.5159 (2.1)

[M+Ca+4H2O]++

[M+H]+ 113.0349 (3.4)

127.0495 (5.9)

154.0593 (11.4)

141.0660 (1.2)

155.0444 (4.9)

140.0450 (3.0)

[M+Na]+ 135.0160 (3.4)

149.0312 (6.7)

176.0406 (14.1)

163.0468 (5.8)

177.0272 (0.8)

162.0277 (0.2)

[M+Ca-H]+ 150.9821

(4.3) 192.0087 (3.6)

179.0139 (6.0)

177.9904 (11.2)

[M+Ca+H2O-H]+ 168.9923 (1.3)

210.0196 (4.9)

197,0234 (0.5)

211.0042 (7.4)

196.0039 (4.6)

[M+Ca+2H2O-H]+ 187.0024 (1.2) 228.0268

(10.4) 215.0281

* 229.0147

(6.6) 214.0107

(13.2)

[M+Ca+Cl]+ 186.9590 (4.4)

200.9747 (4.4) 214.9909

(6.6) 228.9667

(8.9) 213.9642

*

[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9650 *

218.9852 (3.9) 233.0019

(8.0) 246.9816

(9.2) 231.9808

(4.8)

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 236.9954 (1.7)

[2M+Ca]++ 146.0231 (4.1) 160.0399

(0.0) 174.0192

(3.7) 159.0190

(0.2)

[2M+Ca+H2O]++ 141.0125 (5.7)

155.0286 (2.5) 169.0444

(0.9) 183.0251

(6.9) 168.0250

(4.6)

[2M+Ca+2H2O]++ 164.0340

(1.3) 178.0494 (2.8)

192.0297 (3.0)

177.0283 (6.6)

[2M+Ca+3H2O]++

[2M+Ca-H]+ 263.0098 (3.8) 345.0611

(2.3) 319.0716

(0.8) 317.0314 (2.5)

[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0201 (2.8) 337.0816

(1.1) 365.0405

(0.2)

[2M+Ca+2H2O-H]+

[2M+Ca+Cl]+ 327.0183

(4.8) 355.0489

(2.5) 383.0076

(2.7) 353.0071

(0.5)

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 345.0271 (0.7)

[3M+Ca]++ 209.0460 (4.0) 230.0686

(0.0) 251.0378

(1.2) 228.5391

(4.7)

[3M+Ca+H2O]++

[3M+Ca+Cl]+

[4M+Ca]++

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b Se observan además 112.0512 (5.8) [M+H-COCH2]

+, 149.9981 (4.4) [M+Ca-H-COCH2-H2O]+, 168.0090 (6.4) [M+Ca-H-COCH2]

+, 186.0187 (0.5) [M+Ca+H2O-H-COCH2]+ y 303.0503 (3.3) [2M+Ca-H-COCH2]

+. c También se observan 106.0529 (2.9) [M+H-H2O-OH]+, 123.0553 (1.9) [M+H-H2O]+, 134.9866 (2.0) [M+Ca-H-C2H4O]+, 152.9967 (2.6) [M+Ca+H2O-H-C2H4O]+, 249.0298 (1.2) [2M+Ca+H2O-H-2(C2H4O)]+, 275.0457 (2.1) [2M+Ca-H-C2H4O]+, 293.0552 (1.6) [2M+Ca+H2O-H-C2H4O]+. * Solapamiento de picos observado.


93


ESI de los compuestos (M) 8b-13b con calcio (Ca); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 8b C4H4N2O2

9b C5H6N2O2

10bb C6H7N3O2

11bc C6H8N2O2

12b C6H6N2O3

13bd C5H5N3O2

[M+Ca]++ 96.5077 (10.2) 96.9992

(4.9) 89.4993

(6.0)

[M+Ca+H2O]++ 105.5139 (9.0)

106.0047 (2.6)

98.5044 (7.1)

[M+Ca+2H2O]++ 114.5188 (4.7) 115.0103

(0.7) 107.5105

(0.8)

[M+Ca+3H2O]++ 123.524 (4.1)

124.0157 (1.3)

116.5153 (3.4)

[M+Ca+4H2O]++ 132.5286 (1.5)

133.0210 (1.2)

125.5204 (4.4)

[M+H]+ 113.0353

(6.3) 127.0497

(4.3) 154.0611

(0.2) 141.0663

(3.4) 155.0445

(3.8) 140.0449

(4.0)

[M+Na]+ 135.0160 (3.7) 176.0422

(4.7) 163.0481

(1.7) 177.0269

(0.6)

[M+Ca-H]+ 150.9832 (11.5)

179.0152 (13.2)

[M+Ca+H2O-H]+ 168.9923 (1.5) 210.0201

(7.0) 197.0236

(1.4) 196.0036 (3.1)

[M+Ca+2H2O-H]+ 186.9980 * 228.0260

(13.9) 215.0361

(10.1) 229.0092

* 214.0120

(7.1)

[M+Ca+Cl]+ 186.9550 *

200.9746 (3.9)

227.9877 (13.1)

214.9896 (0.6)

228.9708 (9.1)

213.9656 *

[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9682 (2.6) 245.9928

(10.1) 232.9973

(11.8) 246.9805

(4.7) 231.9812

(6.7)

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 222.9800 (3.0) 264.0073

(5.5) 264.9914 (5.8)

249.9894 (3.1)

[2M+Ca]++ 146.0232 (3.5) 174.0193

(4.0)

[2M+Ca+H2O]++ 141.0133 (0.1)

155.0289 (0.4)

182.0391 (4.3)

169.0444 (1.1)

183.0245 (3.3)

168.0219 (13.9)

[2M+Ca+2H2O]++ 150.0178 (5.6)

164.0348 (3.5)

191.0456 (2.5)

178.0497 (1.3)

192.0299 (3.7)

177.0300 (2.8)

[2M+Ca+3H2O]++ 159.0224 (9.1)

173.0393 (1.4)

200.0515 (5.5)

187.0557 (3.1)

[2M+Ca-H]+ 263.0097 (3.4) 319.0706

(2.3)

[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0189 (1.6) 363.0705

(5.3) 337.0809

(3.1)

[2M+Ca+2H2O-H]+

[2M+Ca+Cl]+ 298.9858 (1.2)

327.0184 (4.9) 355.0486

(1.6) 383,0064

(0,4)

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 316.9952 (2.6)

345.0278 (1.4) 373.0575

(2.9) 401.0170

(0.4)

[3M+Ca]++ 209.0465 (6.7) 230.0688

(0.7) 251.0376

(0.5)

[3M+Ca+H2O]++ 218.0498

(2.9) 239.0747 (3.4)

[3M+Ca+Cl]+ 495.1061 (1.0)

[4M+Ca]++ 300.0987 (2.6)

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observan 112.0512 (6.3) [M+H-COCH2]

+, 149.9999 (16.1) [M+Ca-H-COCH2-H2O]+, 168.0093 (7.5) [M+Ca-H-COCH2]

+, 186.0166 (11.0) [M+Ca+H2O-H-COCH2]+.

c Se observan además 123.0554 (1.2) [M+H-H2O]+ y 152.9973 (0.9) [M+Ca+H2O-H-C2H4O]+, d Se observa 122.0348 (0.7) [M+H-H2O]+. * Solapamiento de picos observado.


94

Por ejemplo, en la Figura 3.8 b) todas las variables presentan pesos del mismo

signo en el primer componente principal (PC1), coincidiendo los mayores valores para

aquellas variables que presentan con mayor frecuencia altas intensidades, como

sugiere la comparación entre la identidad de estas variables y las especies

predominantes antes mencionadas como por ejemplo [M+H]+ y [2M+Ca+2H2O]++. Por

otro lado, el segundo componente principal (PC2) parece contrastar la ocurrencia de

especies desprotonadas entre las variables, como se nota al advertir que las variables

que presentan pesos positivos contienen especies desprotonadas (a excepción de la

molécula protonada), mientras que aquellas con pesos negativos, no.

En las Figuras 3.9-3.14, se muestran los espectros de masa representativos

obtenidos para los N-óxidos 3a-13a y 3b-13b con calcio, donde se observan los

perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de

cada par de N-óxidos isómeros. A continuación, se discuten las diferencias halladas

interpretándolas, cuando resulta posible, a partir de la información provista por la

aplicación de PCA que se muestra en la Figura 3.8.

En primer lugar, todos los pares de N-óxidos presentaron diferencias entre sus

espectros de masa que permiten la distinción de cada isómero, lo cual puede

observarse también en la Figura 3.8 a). Los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b

(Figura 3.9), 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura 3.10), 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y

12b (Figura 3.13) y 2-carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.14), exhibieron

principalmente iones aducto con calcio dicargados, como [2M+Ca+2H2O]++, así como

aductos monocargados con calcio y cloruro unidos, por ejemplo, [M+Ca+Cl+H2O]+,

especies ubicadas en la mitad inferior de la Figura 3.8 b). Como puede notarse estos

compuestos comparten el mismo cuadrante (inferior) en la Figura 3.8 a), poniéndose

de relieve la influencia de los pesos negativos (loadings) de las variables anteriores en

sus puntuaciones (scores). Si bien se observan perfiles similares conformados por

muchas especies comunes a ambos isómeros para cada par de N-óxidos, la

intensidad relativa de ciertas señales permite diferenciarlos. Por ejemplo, el aumento

en la intensidad relativa del ion correspondiente a la molécula protonada, permite

distinguir los 4-N-óxidos de los compuestos 3, 6 y 13 de sus isómeros, mientras que la

mayor abundancia relativa de la especie [2M+Ca+2H2O]++, permite la distinción del 4-

N-óxido del compuesto 12, como se nota en la Figura 3.8 a).


95

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

b)

PC

2

PC1

0 2 4 6 8-6

-4

-2

0

2

4

6

BP

C2

PC1

Figura 3.8. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y de

los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales PC1-

PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con calcio.

En cuanto a los los espectros de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b

(Figura 3.9), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.10) y 2-acetamidopirazina 10a y 10b

(Figura 3.12), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de la

identidad de las especies observadas. Así, en los espectros de los 1-N-óxidos se

observaron iones aducto con calcio monocargados conteniendo principalmente las

moléculas del compuesto desprotonado, como [M+Ca+H2O-H]+, a diferencia de los 4-

Código Ion

211 [M+Ca]++

2111 [M+Ca+H2O]++

2112 [M+Ca+2H2O]++

2113 [M+Ca+3H2O]++

2114 [M+Ca+4H2O]++

11 [M+H]+

110 [M+Na]+

111 [M+Ca-H]+

1111 [M+Ca+H2O-H]+

1112 [M+Ca+2H2O-H]+

11101 [M+Ca+Cl]+

11111 [M+Ca+Cl+H2O]+

11121 [M+Ca+Cl+2H2O]+

221 [2M+Ca]++

2211 [2M+Ca+H2O]++

2212 [2M+Ca+2H2O]++

2213 [2M+Ca+3H2O]++

121 [2M+Ca-H]+

1211 [2M+Ca+H2O-H]+

1212 [2M+Ca+2H2O-H]+

12101 [2M+Ca+Cl]+

12111 [2M+Ca+Cl+H2O]+

231 [3M+Ca]++

2311 [3M+Ca+H2O]++

13101 [3M+Ca+Cl]+

241 [4M+Ca]++

a)

b)


96

N-óxidos, donde en general, los iones aducto presentaron a las moléculas del

compuesto en su forma neutra, siendo los mismos monocargados o dicargados, según

contengan o no el contra-ion cloruro. Esta observación se evidencia también en la

Figura 3.8 a), donde se observan los 1-N-óxidos en el cuadrante superior izquierdo y

sus 4-N-óxidos desplazados hacia el cuadrante inferior derecho en coincidencia con

las zonas de influencia de las especies antes mencionadas tal como se muestra en la

Figura 3.8 b).

Los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa

con calcio (Figura 3.11) perfiles muy similares con muchos iones producto de

reacciones de descarboxilación que aumentan la complejidad y dificultan su

interpretación. Asimismo, en la Figura 3.8 a) se nota que ambos isómeros se

encuentran próximos con valores similares en PC2, lo que sugiere la presencia de

especies similares en ambos espectros. En cambio, los perfiles similares entre los N-

óxidos isómeros de 2-hidroxipirazina 8a y 8b (Figura 3.11), se pueden distinguir a

partir de la mayor intensidad relativa del ion [M+H]+ en el 4 N-óxido, así también como

por la mayor intensidad relativa del ion [2M+Ca-H]+ en el 1-N-óxido isómero. Como se

puede notar en la Figura 3.8 b), la variable correspondiente a la molécula protonada se

encuentra en la mitad derecha, en concordancia con la orientación como se separa el

4-N-óxido 8b respecto de su isómero 8a (Figura 3.8 a).

Los N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.12) y los de la 2-(1-

hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.13) mostraron un comportamiento distintivo en

relación al resto de los compuestos estudiados. Para el primer par (9a y 9b), ambos

isómeros se distinguieron por la mayor preponderancia de iones aducto con calcio

monocargados, conteniendo el contra-ion cloruro en el caso de 9a, como [2M+Ca+Cl]+.

Además 9b presentó iones aducto con calcio dicargados, como [3M+Ca+H2O]++. En el

segundo par (11a y 11b), se encontraron en los espectros diferencias en la cantidad

de moléculas incluídas en los principales iones aducto con calcio, que fueron

dicargados así como monocargados, y que incluyeron especies neutras o

desprotonadas. En el caso de 11a, los iones aducto incluyeron hasta dos moléculas

del compuesto, mientras que para 11b se observaron iones aducto con tres y hasta

cuatro moléculas. Sin embargo, esta diferencia no es revelada por los componentes

principales estudiados en la Figura 3.8 a), y a pesar de exhibir espectros de masa bien

diferenciados, la compensación por efectos opuestos en las otras variables hace que

sus puntuaciones sean similares y entonces se ubiquen próximos.


97

[M+Ca]++ 84.9771

[M+H]+ 131.0012

[2M+Ca+2H2O]++ 167.9860

[M+Ca+Cl]+ 204.9252

[2M+Ca+Cl]+ 334.9153

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

3a [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento

[M+Ca+3H2O]++ 111.9928

[M+Ca+Cl+H2O]+ 222.9349

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 352.9302

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

3b

[M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento

[M+H]+ 130.9996

[2M+Ca+2H2O]++ 167.9845

[M+H]+ 112.0510

[M+Ca-H]+ 149.9983

[2M+Ca-H]+ 261.0412

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 112.0523

[2M+Ca+2H2O]++ 149.0353

[M+Ca+Cl+H2O]+ 203.9864

[2M+Ca+Cl]+ 297.0197

[3M+Ca+Cl]+ 408.0598

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

4b [M+H]+ [M+Na]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-4) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+Ca+Cl+y(H2O)]+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento

Figura 3.9. Espectros de masa representativos de los aductos metálicos producidos por

electrospray con calcio (Ca) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)

de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo cloro 3 y amino 4.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


98

[M+H]+ 111.0558

[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0209 [2M+Ca+H2O-H]+

277.0589

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[2M+Ca+2H2O]++ 148.0387

[2M+Ca+2H2O]++ 148.0406

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 221.0012

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 313.0379

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 111.0561

[3M+Ca+H2O]++ 194.0589

[M+Ca+3H2O]++ 116.0178

[2M+Ca+H2O]++ 167.0296

[M+Ca+H2O-H]+ 195.0086

[2M+Ca-H]+ 315.0412 [2M+Ca+Cl]+

351.0168

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Ca+3H2O]++ 116.0184

[M+H]+ 139.0508

[2M+Ca+2H2O]++ 176.0348

[M+Ca+Cl+H2O]+ 230.9856

[2M+Ca+Cl]+ 351.0172

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


99

[M+Ca+H2O-CO2-H]+ 152.9978

[M+Ca+2H2O-H]+ 214.9984

[2M+Ca-2CO2+H2O-H]+ 249.0298

[2M+Ca+H2O-H]+ 337.0111

7a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 141.0294

[M+Ca+H2O-CO2-H]+ 152.9980

[M+Ca+2H2O-H]+ 214.9984

[2M+3Ca+2Cl+4H2O-2H]++ 269.9486

[3M+3Ca+Cl+4H2O-3H]++ 321.9699

[2M+2Ca+Cl+H2O-2H]+ 410.9328 [3M+2Ca-3H]+

496.9652

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 141.0301

[M+H]+ 113.0349

[M+Ca-H]+ 150.9821

[2M+Ca-H]+ 263.0098

8a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 113.0353

[M+Ca-H]+ 150.9832

[2M+Ca+H2O-H]+ 281.0189

8b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Ca+Cl+H2O]+ 204.9682



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


100

[M+Ca+3H2O]++ 110.0195

[2M+Ca+2H2O]++ 164.0340

[M+Ca+Cl+H2O]+ 218.9864

[2M+Ca+Cl]+ 327.0183

9a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[2M+Ca+2H2O]++ 164.0348

[M+Ca+Cl+H2O]+ 218.0498

[2M+Ca+Cl+H2O]+ 345.0278

9b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 127.0497

[M+H-COCH2]+

112.0512

[M+H]+ 154.0593

[2M+Ca+H2O-H]+ 210.0196

[2M+Ca-H]+ 345.0611

10a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Ca+4H2O]++ 132.5286

[M+H]+ 154.0611

[2M+Ca+3H2O]++ 200.0515

[M+Ca+Cl+H2O]+ 245.9928

[2M+Ca+H2O-H]+ 363.0705

10b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

re

lati

va


101

[2M+Ca+3H2O]++ 124.0159

[2M+Ca+H2O]++ 183.0251

[M+Ca+Cl+H2O]+ 246.9816

[2M+Ca+Cl]+ 383.0076

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Ca+3H2O]++ 124.0157

[2M+Ca+2H2O]++ 192.0299

[M+Ca+Cl+2H2O]+ 264.9914

[2M+Ca+Cl]+ 383.0064

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 155.0445

[2M+Ca+H2O]++ 169.0444

[2M+Ca-H-C2H4O]+ 275.0457

[2M+Ca-H]+ 319.0716

[2M+Ca+Cl]+ 355.0489

11a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-H2O]+ 123.0553

[M+H]+ 141.0663

[M+Ca+H2O-H]+ 197.0236

[3M+Ca+H2O]+ 239.0747

[4M+Ca]++ 300.0987

[2M+Ca+Cl]+ 355.0486

[3M+Ca+Cl]+ 495.1061

11b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


102

Los 1- y 4- N-óxidos de los compuestos estudiados pudieron distinguirse entre sí, a

partir de la comparación de las especies observadas (y en algunos casos, sus

intensidades relativas), en los espectros de masa obtenidos con calcio. La

metodología empleada permitió exhibir diferencias entre los pares de isómeros

empleando espectrometría de masa utilizando electrospray como método de

ionización. Cabe mencionar que no se conocen en la actualidad metodologías que

permitan la diferenciación de los 1- y 4- N-óxidos isómeros por espectrometría de

masa.

[M+Ca+3H2O]++ 116.5159

[M+Ca+H2O]++ 168.0250

[M+Ca+Cl+H2O]+ 231.9808

[2M+Ca-H]+ 317.0314

[2M+Ca+Cl]+ 353.0071

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Ca+2H2O]++ 116.5153

[M+H]+ 140.0449

[Ca2Cl3]+

184.8321 [M+Ca+Cl+2H2O]+ 249.9894

13b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.


103

3.4.2. Cobre

En las Tablas 3.7-3.10 se listan las características principales de los espectros de

masa obtenidos para los compuestos 3a-13a y 3b-13b con cobre, mostrando los iones

aducto identificados con este catión metálico, junto a sus masas observadas (con su

error entre paréntesis). A diferencia de los resultados obtenidos con calcio, los

espectros de masa con cobre para algunos pares de N-óxidos isómeros resultaron

más similares, observándose además un menor número de iones aducto. Asimismo,

se observaron menos especies dicargadas (principalmente, conteniendo 2 cationes

metálicos junto al contra-ion sulfato), y en general, con bajas intensidades relativas.

Las especies mono cargadas registradas no sólo resultaron a partir de iones

aducto conteniendo un ligando desprotonado, como en el caso del calcio, sino también

por contener Cu(I) proveniente de la reducción de Cu(II), la cual ya había sido

observada previamente en la sección 2.4.2 (pág. 50). Estas especies conteniendo

Cu(I) se señalan con un * precediendo al ion aducto en las Tablas 3.7-3.10. En

algunos compuestos, también fue identificado el catión radical (M+). Se ha informado70

que estas especies radicalarias pueden producirse a partir de reacciones de

disociación de los iones aducto de Cu(II) dando lugar también a especies de Cu(I).

A partir de la inspección de las Tablas 3.8 y 3.10, puede notarse que en la mayoría

de los 4-N-óxidos, las moléculas protonadas [M+H]+ resultaron ser las especies

predominantes. Este comportamiento se repitió también para algunos 1-N-óxidos

(Tablas 3.7 y 3.9), mientras que para otros (4a, 5a y 8a), el aducto monocargado de

cobre conteniendo una molécula de agua y una molécula del compuesto, con alguno

de los dos desprotonado, [M+Cu+H2O-H]+, constituyó la especie más abundante.

En la Figura 3.16 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos

(loadings plot) confeccionados a partir de la aplicación de PCA al conjunto de datos

obtenido en las Tablas 3.7-3.10, con el fin de interpretar las diferencias halladas entre

pares de compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes

sustituyentes. Al comparar las Figuras 3.16 y 3.8 pueden observarse las diferencias

antes notadas relativas al comportamiento observado con cobre y calcio,

respectivamente. Así, la mayor concentración en el centro de muchos de los

compuestos en la Figura 3.16 a) supondría un comportamiento más similar entre los

mismos.


104


ESI de los compuestos (M) 3a-7a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 3ab

C4H3ClN2O 4a

C4H5N3O 5ac

C5H6N2O 6ad

C6H6N2O2 7ae

C5H4N2O3

[M]+ 129.9919 (7.0)

110.0484

(8.4)

[M+H]+ 131.0004

(1.9) 112.0507

(1.1) 111.0566

(12.1) 139.0503

(0.8) 141.0301

(4.7)

[M+Cu-H]+

172.9654 (5.2)

171.9689 (1.8)

*[M+Cu]+ 192.9227

(1.1) 173.9722

(0.8) 172.9760

(6.2) 200.9719

(0.3)

[M+Cu+H2O-H]+ 209.9260

(3.9) 190.9754

(1.6) 189.9800

(1.2) 217.9754

(3.0) 219.9550

(9.4)

*[M+Cu+H2O]+ 210.9330

(0.2) 191.9823

(3.3) 190.9870

(3.1) 218.9823

(1.2) 220.9630

(5.5)

[M+Cu+2H2O-H]+ 227.9341

(7.3)

237.9645 (5.5)

[M+H+Cu+SO4]+

297.9313 (0.7)

[2M+Cu-H]+ 284.0082

(1.7) 282.0156

(5.7)

341.9680 (7.1)

*[2M+Cu]+ 322.9158

(0.1)

283.0238 (4.6)

[2M+Cu]++ 169.5076

(2.5)

[2M+2Cu+SO4]++

248.9489 (4.3)

[2M+2Cu+H2O+SO4]++

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++ 258.9025

(2.5)

[3M+Cu+H2O]++

[3M+2Cu+SO4]++

[3M+2Cu+H2O+SO4]++

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9972 (6.5) [M+H-OH]+. c También se observa 94.0528 (2.2) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 97.0399 (2.9) [M+H-CH2CO]+,184.9769 (0.9) [M+Cu-O]+, 201.9798 (0.3) [M+Cu+H2O-OH]+ y 202.9880 (1.8) [M+Cu+H2O-O]+. e Se observan 123.0189 (0.2) [M+H-H2O]+ e iones involucrando la pérdida de CO2 (44u): 157.9536 (0.3) [M+Cu-CO2]

+, 175.9646 (2.4) [M+Cu+H2O-CO2-H]+ y 297.9759 (0.5) [2M+Cu-CO2-H]+.


105


ESI de los compuestos (M) 3b-7b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).


4bc C4H5N3O

5b C5H6N2O

6bd C6H6N2O2

7be

C5H4N2O3

[M]+ 129.9916 (9.6)

110.0481

(5.4)

[M+H]+ 131.0001

(4.2) 112.0512

(6.1) 111.0559

(5.7) 139.0517

(11.0) 141.0296

(1.0)

[M+Cu-H]+

172.9630 (8.6)

*[M+Cu]+ 192.9224

(7.8) 173.9744

(12.0) 172.9769

(0.9) 200.9732

(6.2)

[M+Cu+H2O-H]+ 209.9247

(2.3) 190.9754

(1.6) 189.9809

(5.8) 217.9760

(5.8)

*[M+Cu+H2O]+ 210.9319

(5.1) 191.9825

(2.2) 190.9882

(3.2) 218.9836

(4.7) 220.9592

(11.9)

[M+Cu+2H2O-H]+ 227.9338

(8.4)

207.9898

(2.9)

[M+H+Cu+SO4]+

[2M+Cu-H]+ 284.0078

(3.4)

338.0086 (4.4)

*[2M+Cu]+ 322.9149

(2.8)

283.0265 (5.0)

[2M+Cu]++ 169.5081

(5.5)

[2M+2Cu+SO4]++

248.9497 (7.5)

[2M+2Cu+H2O+SO4]++

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++

238.9666 (12.8)

[3M+Cu+H2O]++

[3M+2Cu+SO4]++

[3M+2Cu+H2O+SO4]++ 314.8984

(6.1) a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9971 (7.2) [M+H-OH]+ c También se observa 95.0479 (1.4) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 201.9776 (10.9) [M+Cu+H2O-OH]+ y 202.9856 (10.0) [M+Cu+H2O-O]+. e Se observan iones involucrando la pérdida de CO2: 175.9637 (2.4) [M+Cu+H2O-CO2-H]+.


106


ESI de los compuestos (M) 8a-13a con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).


9ab C5H6N2O2

10ac C6H7N3O2

11ad C6H8N2O2

12ae C6H6N2O3

13af C5H5N3O2

[M]+

139.0379

(1.8)

[M+H]+ 113.0346

(0.3) 127.0500

(1.8) 154.0591

(13.1) 141.0667

(5.8) 155.0444

(4.6) 140.0458

(2.7)

[M+Cu-H]+ 173.9494

(5.4)

214.9730 (9.7)

201.9811 (6.3)

200.9600

(3.0)

*[M+Cu]+ 188.9710

(5.4)

202.9886 (4.7)

216.9664 (2.1)

201.9677 (2.5)

[M+Cu+H2O-H]+ 191.9595

(2.3) 205.9740

(3.4) 232.9838

(7.9) 219.9909

(2.6) 233.9691

(2.4) 218.9712

(5.4)

*[M+Cu+H2O]+ 206.9818

(3.7)

220.9946 *

234.9771 (1.3)

219.9773 (2.3)

[M+Cu+2H2O-H]+ 209.9695

(0.4)

250.9937 (10.0)

[M+H+Cu+SO4]+

298.9294

(8.8)

[2M+Cu-H]+ 285.9766

(2.8)

368.0254 (9.5)

342.0394 (2.9)

339.9979

(0.9)

*[2M+Cu]+ 315.0152

(0.9)

371.0048 (0.2)

[2M+Cu]++ 185.5022

(0.5) 170.5032

(4.6)

[2M+2Cu+SO4]++

236.9488 (4.0)

264.9432

(1.8) 249.9445

(5.7)

[2M+2Cu+H2O+SO4]++

245.9541 (4.0)

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++

[3M+Cu+H2O]++

[3M+2Cu+SO4]++

[3M+2Cu+H2O+SO4]++

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 109.0396 (0.5) [M+H-H2O]+, 110.0466 (7.7) [M+H-OH]+. c También se observan los iones 112.0494 (10.5) [M+H-COCH2]

+, 136.0483 (16.5) [M+H-OH]+ y 326.0183 (9.3) [2M+Cu-H-COCH2]

+. d También se observan los iones 123.0560 (6.2) [M+H-H2O]+, 184.9776 (2.9) [M+Cu-H2O]+, 186.9574 (5.7) [M+Cu-H-CH3]

+, 204.9734 * [M+Cu+H2O-H-CH3]+ y 325.0360 (1.1) [2M+Cu-H-OH]+.

e También se observa 116.0576 (3.9) [M+H-COOCH3+H2O]+ y 172.0473 (3.2) [M+H2O]+. f También se observan los iones 123.0197 (6.8) [M+H-NH3]

+, 157.9535 (0.4) [M+Cu-H-CONH2]+, 175.9640 (4.2)

[M+Cu+H2O-H-CONH2]+ y 185.9715 (4.5) [M+Cu-O]+.

* Solapamiento de picos observado.


107

Tabla 3.10. Resumen de los ionesa observados en los espectros de masa obtenidos

por ESI de los compuestos (M) 8b-13b con cobre (Cu); m/z obs. (error en ppm).


9bb C5H6N2O2

10bc C6H7N3O2

11bd C6H8N2O2

12be C6H6N2O3

13bf C5H5N3O2

[M]+ 126.0425

(1.3)

[M+H]+ 113.0350

(3.7) 127.0509

(5.9) 154.0618

(4.3) 141.0668

(6.5) 155.0453

(1.4) 140.0452

(1.5)

[M+Cu-H]+ 173.9506

(12.1)

201.9657 (7.5)

*[M+Cu]+ 215.9853

(11.1) 202.9886

(5.0) 216.9665

(1.8) 202.9748

(1.5)

[M+Cu+H2O-H]+ 191.9619

(14.7) 205.9750

(1.2) 232.9869

(5.3)

233.9703 (3.0)

218.9710 (4.3)

*[M+Cu+H2O]+ 192.9669

(0.1) 206.9831

(2.7) 233.9934

(0.2) 220.9981

(0.1) 234.9772

(1.3) 219.9758

(9.2)

[M+Cu+2H2O-H]+

[M+H+Cu+SO4]+

313.9267 (0.9)

298.9243 (8.4)

[2M+Cu-H]+ 342.0397

(3.9)

340.0011 (10.5)

*[2M+Cu]+ 315.0171

(6.9)

[2M+Cu]++ 185.5019

(1.3)

[2M+2Cu+SO4]++

264.9431 (1.4)

[2M+2Cu+H2O+SO4]++

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++

[3M+Cu+H2O]++ 229.5345

(2.7)

[3M+2Cu+SO4]++ 341.9661

(13.0)

[3M+2Cu+H2O+SO4]++

308.9752 (2.1)

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa el ion 110.0479 (3.8) [M+H-OH]+, 125.0352 (4.8) [M-H]+. c También se observa el ion 112.0512 (6.0) [M+H-COCH2]

+. d También se observan los iones 123.0558 (4.2) [M+H-H2O]+, 186.9586 (12.2) [M+Cu-H-CH3]

+ y 204.9705 * [M+Cu+H2O-H-CH3]

+ y 327.0172 (6.9) [2M+Cu-H-CH3]+.

e También se observa 96.0320 (2.2) [M+H-COOCH3]+ y 141.0296 (0.9) [M+H2O-CH3OH]+.

f También se observan los iones 236.9353 (3.2) [M+Cu+Cl]+ y 254.9477 (4.2) [M+Cu+Cl+H2O]+. * Solapamiento de picos observado.


108

La interpretación realizada de los componentes principales parece mantenerse al

pasar del calcio al cobre. El primer componente principal (PC1) en la Figura 3.16 b)

continúa destacando las variables que con frecuencia son más abundantes mientras

que el segundo componente principal (PC2) contrasta la ocurrencia de especies

desprotonadas, como se deduce al notar que las variables que presentan pesos

positivos contienen especies desprotonadas a diferencia de las que presentan pesos

negativos.

En las Figuras 3.17-3.22, se muestran los espectros de masa representativos

obtenidos con cobre para los N-óxidos 3a-13a y 3b-13b, donde pueden observarse los

perfiles de iones producidos por ESI que permiten comparar el comportamiento de

cada N-óxido isómero. En línea general, los espectros de masa resultaron más

similares entre el par de N-óxidos isómeros aunque en algunos casos, se encontraron

diferencias importantes que se discuten a continuación.

En el caso de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b (Figura 3.17), y de 2-(1-

hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.21), si bien a simple vista se observan perfiles

similares en los espectros de masa, la inspección de las intensidades relativas de las

especies, como por ejemplo [M+Cu+H2O-H]+, que es más abundante en los 1-N-

óxidos, permite encontrar diferencias entre ambos isómeros, como lo evidencia

también la separación que presentan en la Figura 3.16 a). En cuanto a los espectros

de masa de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.17) y 2-hidroxipirazina

8a y 8b (Figura 3.19), la distinción entre isómeros resultó más notoria sobre la base de

la identidad e intensidad relativa de las especies observadas. Por ejemplo, la mayor

intensidad relativa del ion [2M+Cu-H]+ en los 1-N-óxidos y del ion [M+H]+ en los 4 N-

óxidos, permitió distinguir ambos isómeros a partir de sus espectros de masa.

Por otra parte, en los espectros de masa de los N-óxidos de 2-metilpirazina 5a y 5b

(Figura 3.18) y 2-acetamidopirazina 10a y 10b (Figura 3.20) se observaron iones

aducto con cobre monocargados, que en el caso de los 1-N-óxidos, contenían

principalmente a las moléculas del compuesto desprotonado, mientras que los 4-N-

óxidos, presentaban una proporción similar de iones aducto con Cu(I) conteniendo las

moléculas del compuesto neutro, como por ejemplo, [M+Cu+H2O]+. Esta diferenciación

a partir de las especies puede observarse también en la Figura 3.16 a), donde los 1-N-

óxidos se ubican en la mitad superior del gráfico mientras que los 4-N-óxidos se

encuentran cerca de la mitad del mismo, exhibiendo valores casi nulos en PC2.


109

0 2 4 6 8-6

-4

-2

0

2

4

6

B

PC

2

PC1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

E

PC

2

PC1

Figura 3.16. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y

de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales

PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con cobre.

Por otro lado, en los espectros de los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b (Figura

3.18), 2-metoxipirazina 9a y 9b (Figura 3.20) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y 12b

(Figura 3.21) se observaron iones aducto con cobre dicargados, como

[2M+2Cu+SO4]++, además de iones aducto monocargados, que permiten distinguir

entre los perfiles de ambos isómeros. Como puede notarse en la Figura 3.16 a), estos

Código Ion

*11 [M]+ 11 [M+H]+

111 [M+Cu-H]+

*111 *[M+Cu]+

1111 [M+Cu+H2O-H]+

*1111 *[M+Cu+H2O]+

1112 [M+Cu+2H2O-H]+

11101 [M+H+Cu+SO4]+

121 [2M+Cu-H]+

*121 *[2M+Cu]+

221 [2M+Cu]++

22201 [2M+2Cu+SO4]++

22211 [2M+2Cu+H2O+SO4]++

22221 [2M+2Cu+2H2O+SO4]++

2311 [3M+Cu+H2O]++

23201 [3M+2Cu+SO4]++

23211 [3M+2Cu+H2O+SO4]++

a)

b)


110

compuestos se ubican en la mitad inferior del gráfico al igual que las especies de la

Figura 3.16 b) que resultan útiles para su diferenciación. Por ejemplo, la presencia de

iones aducto dicargados con 3 moléculas de los compuestos, [3M+Cu+H2O]++ y

[3M+2Cu+SO4]++, se observa en los espectros de los 4-N-óxidos 9b y 12b,

respectivamente.

Los N-óxidos de la 2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa

con cobre (Figura 3.19) productos de reacciones de descarboxilación al igual que con

calcio, aunque con cobre los espectros obtenidos resultaron más limpios mostrando un

menor número de especies. Cabe mencionar que otros compuestos, como por

ejemplo, 11a y 11b, presentaron también en sus espectros iones aducto producto de

reacciones de fragmentación de los compuestos. Estos iones se listan al pie de las

Tablas 3.7-3.10.

Finalmente, los N-óxidos de 2-carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.22) mostraron

un comportamiento particular en relación al resto de los compuestos estudiados.

Ambos isómeros se distinguieron, por la presencia de iones aducto de cobre

dicargados en el caso de 13a, y por la de iones aducto de cobre monocargados

conteniendo el contra-ion cloruro, en el caso de 13b. Sin embargo, en este último caso

debe notarse que la presencia del contra-ion cloruro proviene de la muestra, por lo que

constituye una contaminación que no permite comparar ambos isómeros en idénticas

condiciones que el resto de los compuestos, poniendo de relieve la importancia de la

presencia de contaminantes en la muestra para llevar a cabo esta clase de análisis.


111

[M+H]+ 131.0004

[M+Cu+H2O]+ 210.9330

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++

258.9025 [2M+Cu]+ 322.9158

3a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento

[M+H]+ 131.0001

[C3H5CuN2O2]+

163.9631

[M+Cu+H2O-H]+ 209.9247

[3M+2Cu+H2O+SO4]++

314.8984

3b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 112.0507

[M+Cu+H2O-H]+ 190.9754

[2M+Cu-H]+ 284.0082

4a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-OH]+ 95.0479

[M+H]+ 112.0512

[M+Cu+H2O]+ 191.9825

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

4b [M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


electrospray con cobre (Cu) y el contra-ion sulfato (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos (b)

de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4.


112

[M+H]+ 111.0566

[M+Cu+H2O-H]+ 189.9800

[2M+Cu-H]+ 282.0156

5a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 111.0559

[M+Cu+H2O]+ 190.9882

[2M+2Cu+2H2O+SO4]++

238.9666

[2M+Cu]+ 283.0265

5b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-CH2CO]+ 97.0399

[M+H]+ 139.0503

[2M+Cu]++ 169.5076

[M+Cu+H2O]+ 218.9823

[M+H+Cu+SO4]+

297.9313 [2M+3Cu+2SO4]++

328.3885

6a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 139.0517

[M+Cu+H2O]+ 218.9835

[2M+2Cu+SO4]++

248.9497

[2M+Cu-H]+ 338.0086

6b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.


113

[M+H]+ 141.0301

[M+Cu+H2O-CO2-H]+ 175.9646

[M+Cu+H2O-H]+ 219.9493

[2M+Cu-H]+ 341.9680

7a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 141.0296

[M+Cu+H2O-CO2-H]+ 175.9637

[M+Cu+H2O]+ 220.9592

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

7b [M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) (z=1-2) iones fragmento

[M+H]+ 113.0346

[M+Cu+H2O-H]+ 191.9595

[2M+Cu-H]+ 285.9766

8a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 113.0350

[M+Cu+H2O]+ 192.9669

8b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z




de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

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dad

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ativ

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ten

sid

ad r

elat

iva


114

[M+H-H2O]+ 109.0396

[M+Cu+H2O]+ 206.9818

[2M+2Cu+H2O+SO4]++

245.9541

[2M+Cu]+ 315.0152

[M+2Cu+H2O+SO4]+

365.8623

9a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 127.0500

[M+H-CH2CO]+ 112.0494

[M+H]+ 154.0591

[M+Cu+H2O-H]+ 232.9838

[2M+Cu-H]+ 368.0254

10a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 154.0618

[M+Cu+H2O-H]+ 232.9869

10b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-CH2CO]+ 112.0512

[M+H]+ 127.0509

[M+Cu+H2O]+ 206.9831 [3M+Cu+H2O]++

229.5345

[2M+Cu]+ 315.0171

[4M+2Cu+SO4]++

362.9915

9b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Inte

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Inte

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sid

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iva



de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.

[M]+ [M+H]+ [xM+Cu+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Cu+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2) [xM+zCu+(z-1)(SO4)+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-2) iones fragmento


115

[M+H]+ 141.0667

[M+Cu+H2O-H]+ 219.9909

[2M+Cu-H]+ 342.0394

11a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 141.0668

[M+Cu+H2O-H-CH3]+

204.9705 [2M+Cu-H]+ 342.0397

11b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Cu+H2O]+ 220.9981

[M+H-CO2CH3+H2O]+ 116.0576

[M+H]+ 155.0444

[2M+Cu]++ 185.5022

[M+Cu+H2O]+ 234.9771

[2M+Cu]+ 371.0048

12a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 155.0453

[2M+Cu]++ 185.5019

[2M+2Cu+SO4]++

264.9431

[M+H+Cu+SO4]+

313.9267

[3M+2Cu+SO4]++

341.9661

12b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z




de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.

Inte

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sid

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iva

Inte

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ten

sid

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iva


116

El empleo de soluciones de cobre junto a soluciones de los 1- y 4- N-óxidos de los

compuestos estudiados permitió distinguir en muchos casos entre ambos isómeros,

comparando las especies observadas y su intensidad relativa en los espectros de

masa obtenidos. Sin embargo, en el conjunto de compuestos estudiado, la utilización

de este metal no arrojó ventajas comparativas respecto al calcio, ya que si bien

produjo espectros más sencillos, las especies observadas en menor número, no

resultaron características de un dado isómero en la mayoría de los casos.

[M+H]+ 140.0458

[2M+Cu]++ 170.5032 [M+Cu+H2O-H]+

218.9712

[M+H+Cu+SO4]+

298.9308

[2M+Cu-H]+ 339.9979

13a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 140.0452

[M+Cu]+ 202.9748

[M+Cu+Cl]+ 236.9353

[M+H+Cu+SO4]+

298.9243

13b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

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ativ

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sid

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elat

iva



de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.


117

3.4.3. Aluminio

Finalmente, se listan en las Tablas 3.11-3.14 las características principales de los

espectros de masa obtenidos con aluminio para los compuestos 3a-13a y 3b-13b,

mostrando los aductos identificados con este catión metálico, junto a sus masas

observadas (con error entre paréntesis). La característica clave de los espectros de

masa obtenidos con aluminio, fue la presencia de tan sólo unas pocas especies

predominantes para cada compuesto a diferencia de los metales antes vistos. Las

especies más abundantes resultaron la molécula protonada [M+H]+, presente casi en

la totalidad de los compuestos, y/o iones aducto con aluminio monocargados

constituidos por dos moléculas del compuesto unidas al catión metálico, ya sea

desprotonado [2M+Al-2H]+, o junto a contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl]+. El primer caso

se observó sólo con ciertos 1-N-óxidos, mientras que el segundo se presentó en

muchos de los 4-N-óxidos estudiados y en sólo unos pocos 1-N-óxidos (Tablas 3.11-

3.14).

En contraste con los otros metales estudiados (calcio y cobre), en el caso del

aluminio no se observaron iones aducto dicargados con intensidades relativas

apreciables. Además, al igual que con el cobre, se observaron para ciertos

compuestos, iones aducto conteniendo más de un catión metálico aunque, en general,

estas especies presentaron una abundancia relativa muy baja. Sólo en el caso de los

compuestos 7a y 7b se identificaron iones aducto de aluminio con moléculas de

metanol como ligandos.

En la Figura 3.23 se muestran el gráfico de puntuaciones (scores plot) y de pesos

(loadings plot) elaborados a partir de la aplicación de PCA a los datos obtenidos en las

Tablas 3.11-3.14, con el fin de interpretar las diferencias halladas entre pares de

compuestos isoméricos, así como entre los compuestos con diferentes sustituyentes.

Como surge de la comparación de la Figura 3.23 con la Figura 3.16, se puede notar

aún una mayor concentración en el centro de muchos de los compuestos en la Figura

3.23 a) y menos especies relevantes en la Figura 3.23 b), como ya se había

anticipado.


118


por ESI de los compuestos (M) 3a-7a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto 3ab C4H3ClN2O

4ac C4H5N3O

5ad C5H6N2O

6ae C6H6N2O2

7af

C5H4N2O3

[M+H]+ 131.0015

(6.0) 112.0513

(7.2) 111.0562

(8.4) 139.0503

(0.9) 141.0299

(3.1)

[M+Al+H2O-2H]+ 185.0141

(1.9)

[M+Al+2H2O-2H]+

[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 215.0245

(0.9)

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 216.9957

(0.9) 218.9730

(8.2)

[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0084

(13.3)

[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+

[M+Al+2Cl]+

[M+Al+2Cl+H2O]+

[2M+Al-2H]+ 247.0531

(5.0)

305.0103 (2.0)

[2M+Al+H2O-2H]+

[2M+Al+Cl-H]+ 283.0298

(4.6)

[2M+Al+Cl+H2O-H]+

[2M+Al+2Cl]+ 356.9040

(4.1)

317.0164 (5.3)

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+

[3M+Al-2H]+ 358.0969

(4.8)

[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+

[3M+2Al+2Cl-3H]+

[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 505.0089 (1.7)

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9981 (1.3) [M+H-OH]+. c También se observa 95.0482 (3.9) [M+H-OH]+. d También se observa 94.0528 (2.7) [M+H-OH]+. e También se observa 97.0401 (4.4) [M+H-CH2CO]+. f También se observa 123.0188 (0.5) [M+H-H2O]+, 362.9670 (3.8) [2M+Al+Na+Cl-2H]+.


119


por ESI de los compuestos (M) 3b-7b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).


4bc C4H5N3O

5bd C5H6N2O

6be C6H6N2O2

7bf

C5H4N2O3

[M+H]+ 131.0013

(3.5) 112.0515

(8.1) 111.0561

(7.3) 139.0509

(5.0) 141.0300

(4.0)

[M+Al+H2O-2H]+

[M+Al+2H2O-2H]+

[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 215.0256

(6.1)

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 218.9756

(3.9)

[M+Al+Cl+2H2O-H]+

[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+ 250.9998

(4.8)

[M+Al+2Cl]+

[M+Al+2Cl+H2O]+ 225.9729

(1.6)

[2M+Al-2H]+

[2M+Al+H2O-2H]+ 323.0200

(0.8)

[2M+Al+Cl-H]+ 340.9864

(0.1)

[2M+Al+Cl+H2O-H]+

[2M+Al+2Cl]+ 356.9053

(0.4) 319.0054

(0.5) 317.0156

(2.6) 373.0032

(3.5)

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+

414.9610 (0.3)

412.9703 (0.8)

[3M+Al-2H]+

[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+

[3M+2Al+2Cl-3H]+

[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 507.9915

(4.6)

505.0066 (2.9)

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 113.9983 (2.2) [M+H-OH]+. c También se observa 95.0481 (3.2) [M+H-OH]+. d También se observa 94.0529 (3.5) [M+H-OH]+. e También se observa 122.0475 (0.2) [M+H-OH]+. f También se observa 123.0187 (1.8) [M+H-H2O]+.


120


por ESI de los compuestos (M) 8a-13a con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).


9a C5H6N2O2

10ab C6H7N3O2

11ac C6H8N2O2

12ad C6H6N2O3

13ae C5H5N3O2

[M+H]+ 127.0507

(3.7) 154.0610

(0.9) 141.0662

(2.8) 155.0453

(1.2) 140.0453

(0.8)

[M+Al+H2O-2H]+

[M+Al+2H2O-2H]+ 173.0142

(2.6)

[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 219.0114

(0.9) 232.9940

(15.3) 217.9902

(2.4)

[M+Al+Cl+2H2O-H]+


[M+Al+2Cl]+ 250.9600

(13.8) 235.9564

(2.1)

[M+Al+2Cl+H2O]+ 240.9723

(0.3)

[2M+Al-2H]+ 249.0212

(5.3)

305.0833 (2.8)

[2M+Al+H2O-2H]+ 267.0319

(5.5)

[2M+Al+Cl-H]+ 339.0172

(3.6)

[2M+Al+Cl+H2O-H]+

[2M+Al+2Cl]+ 349.0065

(5.5)

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+

[3M+Al-2H]+ 361.0474

(0.5)

[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+ 523.0857

(1.4)

[3M+2Al+2Cl-3H]+ 541.0527

(0.5)

[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa 112.0513 (7.0) [M+H-CH2CO]+. c También se observan 97.0400 (3.7) [M+H-C2H4O]+, 123.0557 (3.0) [M+H-H2O]+ y 124.0631 (0.0) [M+H-OH]+. d También se observan los iones 113.0349 (3.3) [M+H-COOCH3+H2O]+, 123.0188 (1.1) [M+H-CH3OH]+, 141.0301 (4.7) [M+H-CH3OH+H2O]+, 177.0271 (0.5) [M+Na]+. e También se observan los iones 97.0399 (2.9) [M+H-NHCO]+, 123.0189 (0.4) [M+H-NH3]

+.


121


por ESI de los compuestos (M) 8b-13b con aluminio (Al); m/z obs. (error en ppm).


9bb C5H6N2O2

10bc C6H7N3O2

11bd C6H8N2O2

12be C6H6N2O3

13b C5H5N3O2

[M+H]+ 113.0347

(1.2) 127.0507

(4.2) 154.0622

(7.0) 141.0664

(4.0) 155.0458

(4.4) 140.0451

(2.8)

[M+Al+H2O-2H]+

[M+Al+2H2O-2H]+


[M+Al+Cl+H2O-H]+ 190.9815

(8.6)

217.9917 (4.1)

[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 208.9906

(0.8)


[M+Al+2Cl]+ 249.9747

(8.6)

250.9551 (5.7)

[M+Al+2Cl+H2O]+ 253.9686

(4.5)

[2M+Al-2H]+

[2M+Al+H2O-2H]+

[2M+Al+Cl-H]+ 341.0587

(1.3)

[2M+Al+Cl+H2O-H]+ 303.009

(6.1)

[2M+Al+2Cl]+ 320.9713

(6.2) 349.0057

(3.2)

377.0349 (2.4)

404.9953 (2.3)

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 505.9501

(0.4)

[3M+Al-2H]+

[3M+2Al+Cl+H2O-4H]+

[3M+2Al+2Cl-3H]+

[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+

a Solo se listan iones con intensidades relativas mayores que 5%. Los valores en negrita indican el ion más abundante. Se muestra el mayor pico de la distribución isotópica. El rango de intensidad relativa se indica con un color: rojo (5-25%); naranja (25-50%); verde (50-75%); amarillo (75-100%). b También se observa el ion 110.0478 (2.6) [M+H-OH]+. c También se observa 112.0520 (12.6) [M+H-CH2CO]+. d También se observan 123.0555 (3.0) [M+H-H2O]+. e Tambiién se observan los iones 123.0187 (1.8) [M+H-CH3OH]+, 141.0300 (3.8) [M+H-CH3OH+H2O]+.


122

Una vez más parecería seguir siendo válida la interpretación antes realizada

acerca del significado de los componentes principales obtenidos. El primer

componente principal (PC1) resalta las variables frecuentemente más intensas

mientras que el segundo componente principal (PC2) contrastaría la ocurrencia de

especies desprotonadas entre las variables (Figura 3.23 b), aunque en este caso no es

estrictamente cierto para las variables que presentan valores pequeños en los pesos

de PC2.

Los espectros de masa representativos obtenidos con aluminio para los N-óxidos

3a-13a y 3b-13b, donde pueden observarse los perfiles de iones producidos por ESI

que permiten comparar el comportamiento de cada N-óxido isómero se muestran en

las Figuras 3.24-3.29. En los espectros de masa de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a

y 3b (Figura 3.24), 2-metilpirazina 5a y 5b (Figura 3.25) y 2-metoxipirazina 9a y 9b

(Figura 3.27), se observaron como especies predominantes las moléculas protonadas

así como los iones aducto con aluminio conteniendo 2 moléculas del compuesto

neutro junto a 2 contra-iones cloruro [2M+Al+2Cl]+, ubicándose todos los compuestos

en la mitad inferior de la Figura 3.23 a). Si bien los perfiles para cada isómero

resultaron muy similares, las diferencias exhibidas entre las intensidades relativas de

las especies antes mencionadas permitieron su distinción.

Para los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b (Figura 3.24), 2-hidroxipirazina 8a y

8b (Figura 3.26) y 2-(1-hidroxietil)pirazina 11a y 11b (Figura 3.28) se hizo evidente la

presencia en los espectros del ion [2M+Al-2H]+ en los 1-N-óxidos y no en los 4 N-

óxidos, así también resultó perceptible la presencia del ion [2M+Al+2Cl]+ en los 4-N-

óxidos y no en los 1-N-óxidos. Este comportamiento se comprobó además en la Figura

3.23 a), donde los 1-N-óxidos se ubicaron en la mitad superior y los 4-N-óxidos en la

inferior, en correspondencia con la posición de las especies respectivas

predominantes de la Figura 3.23 b).

Un comportamiento similar se observó para los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y

6b (Figura 3.25) y 2-(metoxicarbonil)pirazina 12a y 12b (Figura 3.28), donde fueron

también observados los iones aducto con aluminio [2M+Al+2Cl]+ en los espectros de

los 4-N-óxidos y no así en los de los 1-N-óxidos. Sin embargo, el ion aducto con

aluminio [2M+Al-2H]+ no se encontró presente en los espectros de estos compuestos y

en su lugar se observó el ion aducto [M+Al+Cl+H2O-H]+ que aunque presentó una

intensidad relativamente baja en los 1-N-óxidos, no se evidenció en los 4-N-óxidos. De


123

esta manera, la conjunción de especies mutuamente excluyentes facilitó la distinción

entre los isómeros de cada uno de los compuestos anteriores de manera sencilla y

notoria.

0 2 4 6 8-6

-4

-2

0

2

4

6

B

PC

2

PC1

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

E

PC

2

PC1

Figura 3.23. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) (a) y

de los pesos de las variables (loadings plot) (b) en el plano de los componentes principales

PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos obtenidos con aluminio.

Código Ion

11 [M+H]+

1111 [M+Al+H2O-2H]+

1112 [M+Al+2H2O-2H]+


11111 [M+Al+Cl+H2O-H]+

11121 [M+Al+Cl+2H2O-H]+


11102 [M+Al+2Cl]+

11112 [M+Al+2Cl+H2O]+

121 [2M+Al-2H]+

1211 [2M+Al+H2O-2H]+

12101 [2M+Al+Cl-H]+

12111 [2M+Al+Cl+H2O-H]+

12102 [2M+Al+2Cl]+

12223 [2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+

131 [3M+Al-2H]+

13211 [3M+2Al+Cl+H2O-4H]+

13202 [3M+2Al+2Cl-3H]+

13213 [3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+

a)

b)


124

A diferencia de los resultados antes obtenidos con calcio y cobre, los N-óxidos de

2-carboxipirazina 7a y 7b mostraron en sus espectros de masa con aluminio (Figura

3.26) iones aducto, como el ion [2M+Al-2H]+ presente en el 1-N-óxido, que permiten

diferenciarlos sin evidencia de iones producto de reacciones de descarboxilación.

Finalmente, los N-óxidos de 2-acetamidopirazina 10a y 10b (Figura 3.27) y 2-

carbamoilpirazina 13a y 13b (Figura 3.29), presentaron diferencias más sutiles en los

perfiles observados en sus espectros de masa respecto a los otros metales. En estos

casos, fue necesaria la inspección de las intensidades relativas de las especies, por

ejemplo el ion aducto [M+Al+2Cl]+, para encontrar diferencias entre ambos N-óxidos

isómeros. Además, la baja abundancia relativa de los aductos con aluminio de los N-

óxidos de la 2-acetamidopirazina 10a y 10b, resultó en la obtención de espectros muy

similares a los obtenidos en la sección 3.3, donde resultó predominante la molécula

protonada [M+H]+ y el mismo ion producto de fragmentación. Cabe notar que las

moléculas protonadas de estos compuestos habían presentado los menores valores

de E1/2 del conjunto de compuestos estudiado.

La formación de complejos con aluminio para los 1- y 4- N-óxidos de los

compuestos estudiados permitió distinguir claramente ambos isómeros en la mitad de

los casos, al comparar la identidad de las diferentes especies observadas en los

espectros de masa obtenidos con cada uno. Sin embargo, en la mitad restante del

conjunto de compuestos estudiado, la utilización de este metal no resultó ventajosa, ya

que se observaron pocas especies, presentes en ambos isómeros, que sólo diferieron

en sus intensidades relativas.


125

[M+H]+ 131.0015

[2M+Al+2Cl]+ 358.9040

3a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento

[2M+Al+2Cl]+ 356.9053

3b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 131.0013


[M+H]+ 112.0513

[2M+Al-2H]+ 247.0531

[2M+Al+Cl-H]+ 283.0298 [3M+Al-2H]+

358.0969

4a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 112.0515

[2M+Al+2Cl]+ 319.0054

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 414.9610

4b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


electrospray con aluminio (Al) y el contra-ion cloruro (X) de los 1-N-óxidos (a) y 4-N-óxidos

(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos cloro 3 y amino 4.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

[M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) iones fragmento


126

[M+H]+ 111.0590

[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0084

[2M+Al+2Cl]+ 317.0229

[3M+2Al+3Cl+H2O-2H]+ 505.0089

5a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 111.0561

[2M+Al+2Cl]+ 317.0156

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 412.9703

5b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 139.0503

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 216.9957

6a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[2M+Al+2Cl]+ 373.0032

0

20

40

60

80

100 [%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

6b [M+H]+ [xM+Al+2Cl+y(H2O)]+ (x=1-2) (y=0-1) [xM+Al+zCl+y(H2O)-(2-z)H]+ (x=1-3) (y=0-2) (z=0-1) [xM+2Al+zCl+y(H2O)-(5-z)H]+ (x=2-3) (y=0-2) (z=1-3) iones fragmento

[M+H]+ 139.0509

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metilo 5 y acetilo 6.



127

[M+H]+ 141.0299

[M+Al+H2O-2H]+ 185.0141

[2M+Al-2H]+ 305.0103

[2M+Al+Na+Cl-2H]+ 362.9670

7a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 141.0300

[2M+Al+H2O-2H]+ 323.0200

7b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+Al+2H2O-2H]+ 173.0142

[2M+Al-2H]+ 249.0212

[3M+Al-2H]+ 361.0474

8a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 113.0347

[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 208.9906

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[2M+Al+2Cl]+ 320.9713



(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos carboxilo 7 e hidroxilo 8.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva


128

[M+Al+2Cl+H2O]+ 240.9723

[2M+Al+2Cl]+ 349.0065

9a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 127.0507

[2M+Al+2Cl]+ 349.0057

9b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 127.0507

[M+H-CH2CO]+ 112.0513

[M+H]+ 154.0610

10a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-CH2CO]+ 112.0520

[M+H]+ 154.0622

[M+Al+2Cl]+ 249.9747

10b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z




(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos metoxilo 9 y N-acetilo 10.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



129

[M+H]+ 141.0664

[2M+Al+Cl-H]+ 341.0587 [2M+Al+2Cl]+

377.0349

11b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-H2O]+ 123.0555

[M+H-CH3OH]+ 123.0188

[M+H]+ 155.0453

[M+Na]+ 177.0271

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 232.9940

12a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H]+ 155.0458

[M+Al+2Cl]+ 250.9551

[2M+Al+2Cl]+ 404.9953

[2M+2Al+3Cl+2H2O-2H]+ 500.9501

12b

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 141.0662

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 219.0114

[2M+Al-2H]+ 305.0833

[2M+2Al+Cl+H2O-4H]+ 523.0857

11a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z




(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con los grupos 1-hidroxietilo 11 y metoxicarbonilo 12.

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



130

Vale la pena recordar el comportamiento ante la complejación frente a estos

metales, estudiado previamente en el capítulo 2 con ligandos análogos, concretamente

con los N-óxidos isómeros de la 2- y 3- hidroxipiridina 1 y 2. En ese estudio, pudieron

establecerse diferencias entre los dos regioisómeros, considerando la capacidad del

isómero sustituído en la posición 2- de actuar como ligando bidentado y formar

quelatos estables al desprotonarse, formando así principalmente iones aducto

monocargados. En contraste, el isómero sustituído en posición 3- no mostró evidencia

de estructuras desprotonadas en sus iones aducto; en cambio, se observaron iones

aducto dicargados, o monocargados con el contra-ion del metal unido, dependiendo

del ion metálico, aparte de una mayor preponderancia de la molécula protonada.

Cabe mencionar que en el capítulo 2 fue posible diferenciar ambos isómeros sobre

la base de la identidad de las distintas especies exhibidas con cada uno de los

metales. Más aún, la consideración de especies con intensidad relativa mayor a 25%

[M+H]+ 140.0451

[M+Al+2Cl+H2O]+ 253.9686

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


[M+H-NHCO]+ 97.0399

[M+H]+ 140.0453

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 217.9902

[2M+Al+Cl-H]+ 339.0172

13a

0

20

40

60

80

100

[%]

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z


Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva



(b) de pirazinas 2-sustituídas (M) con el grupo carbamoílo 13.


131

fue suficiente para distinguir ambos isómeros con todos los metales empleados. En

cambio, para distinguir los isómeros de algunos N-óxidos de los compuestos 3a-13a

de 3b-13b fue necesario considerar especies con intensidad relativa mayor a 5% y no

resultó lo mismo el empleo de cualquier metal. Incluso, las diferencias encontradas

entre isómeros residieron en muchos casos, no en la observación de distintas

especies sino en diferencias en las intensidades relativas, sobre todo con cobre y

aluminio. De todas formas, en la mayoría de los casos se encontraron diferencias

entre los isómeros, obteniéndose los mejores resultados globales con calcio.

El estudio sobre los N-óxidos isómeros de hidroxipirazina, que sería la

extrapolación directa del trabajo de los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina, arrojó

conclusiones análogas para los 3 metales estudiados, observándose una

predominancia de iones aducto con especies desprotonadas para el 1-N-óxido, y

principalmente, la molécula protonada y iones aducto con especies neutras para el 4-

N-óxido. La transición del estudio por MS de dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina

a un conjunto de 11 pares de 1- y 4-N-óxidos de pirazinas monosustituídas representó

un desafío que aunque reveló diferencias entre isómeros no siempre resultaron fáciles

de interpretar. La aplicación de PCA permitió analizar y racionalizar algunas de las

diferencias encontradas para el conjunto de compuestos estudiado, que resultaron

dependientes de la naturaleza del sustituyente, y en segundo plano de la posición del

N-óxido. Esto resulta razonable ya que ciertos sustituyentes podrían interactuar con el

metal y otros no.

De esta manera, en los espectros de masa de los 1-N-óxidos que presentan

sustituyentes con protones acídicos (válido para los grupos amino y metilo en posición

orto a nitrógeno heteroaromático, carboxilo, hidroxilo y N-acetilo), se observaron iones

aducto monocargados que presentaban un ligando desprotonado junto a los metales, y

no así para la mayoría de los 1-N-óxidos que presentaban un sustituyente sin protones

acídicos. Por otra parte, para la mayoría de los 4-N-óxidos, se observaron iones

aducto dicargados o conteniendo el contra-ion del metal, así como una mayor

preponderancia (respecto de sus 1-N-óxidos isómeros) del ion correspondiente a la

molécula protonada. Estas diferencias observadas podrían explicarse considerando la

capacidad de los 1-N-óxidos de pirazinas con protones acídicos en sus sustituyentes

de formar quelatos estables al desprotonarse, en contraparte a sus isómeros 4-N-

óxidos, de manera análoga a lo observado para los N-óxidos de 2- y 3-hidroxipiridina.


132

3.5. Análisis por Espectroscopía RMN

En paralelo al análisis efectuado por espectrometría de masa, se llevó a cabo la

aplicación de espectroscopía de RMN para la determinación sin equívocos de la

posición de la función N-óxido en el conjunto de N-óxidos de pirazina 2-sustituídos

sintetizados (Figura 3.2, pág. 75).

Ya ha sido demostrado el empleo de la resonancia magnética multinuclear141

incluyendo espectroscopía RMN 14N y 15N para proveer asignaciones inequívocas de

la función N-óxido142. Sin embargo, el análisis de compuestos orgánicos nitrogenados

por técnicas de RMN 14N y 15N está a menudo obstaculizado por la baja sensibilidad de

estos núcleos y la superposición de señales de desplazamientos químicos similares, lo

que complica la interpretación de los espectros de RMN143. Por ejemplo, en los

espectros de RMN 15N de N-óxidos de metilpirazinas144 se observaron diferencias

menores a 1 ppm entre los desplazamientos químicos de 15N de ambos nitrógenos en

los 1- y 4- N-óxidos.

Además, a partir de estudios de desplazamientos químicos de 15N en N-óxidos de

piridinas sustituídas, se advirtió que este núcleo era muy sensible al efecto de los

sustituyentes145. Curiosamente, se ha encontrado que cuando un sustituyente se

encuentra ubicado en el carbono orto al nitrógeno del anillo aromático, el efecto sobre

los desplazamientos químicos de 15N en pirazinas sustituídas y sus N-óxidos146 se

encuentra relacionado con el efecto que un sustituyente idéntico tiene sobre los

desplazamientos químicos de 13C en el carbono orto de bencenos sustituídos.

Por otro lado, en N-óxidos de alquil- y fenilpirazinas147, fue informado que los

desplazamientos químicos de 13C asignados a los carbonos en orto al grupo N-óxido

estaban desplazados a campos altos (~10 ppm) respecto a los compuestos no

oxidados (alquil- y fenilpirazinas). Por lo tanto, si pudiera sacarse provecho de este

efecto del grupo N-óxido sobre los desplazamientos químicos de 13C para otros N-

óxidos de pirazinas sustituídas, podría encontrarse una alternativa conveniente frente

a los experimentos de RMN de nitrógeno para la determinación inequívoca de la

posición del N-óxido.

Otra alternativa que podría servir también para distinguir la posición del N-óxido es

la medición de constantes de acoplamiento protón carbono a larga distancia (nJ(C,H);

n > 1). Por ejemplo, en el caso de N-óxidos de metilpirazinas147, han sido informados


133

valores de 3J(C,H) a través del grupo N-óxido cercanos a ~1.0 Hz mientras que los

valores a través del átomo de nitrógeno no oxidado se encuentran próximos a 12-13

Hz. Sin embargo, se han desatado muchas discusiones alrededor de la precisión,

confiabilidad y simplicidad del análisis de datos y determinación de las constantes de

acoplamiento nJ(C,H)148. Además, el requisito de alta resolución para la medición de

sus pequeños valores (por lo general, 1-10 Hz) implica largos tiempos de adquisición

en los experimentos de RMN. Por lo tanto, teniendo en cuenta las desventajas

anteriores, una alternativa más simple y rápida es deseable.

A continuación, se presentan los resultados obtenidos a partir del análisis por

técnicas de RMN 2D para asignar los átomos de carbono y la posición del grupo N-

óxido de manera inequívoca para cada compuesto del conjunto estudiado (Figura 3.2).

Luego, se evaluó la posibilidad de diferenciar entre 1- y 4- N-óxidos partiendo

únicamente de los desplazamientos químicos de RMN 13C, y para ello se aplicó la

técnica quimiométrica de PCA (Apéndice A.4, pág. 261) al conjunto de datos

espectroscópicos para analizar el efecto de los sustituyentes. De este modo, los

efectos de los sustituyentes y de la posición del N-óxido fueron comparados a partir de

la distribución observada en el gráfico de puntuaciones, y de los valores de los pesos y

fue extraída e identificada la relación existente entre las variables originales

(desplazamientos químicos de 13C) y los componentes principales.

3.5.1. Asignación de los compuestos por espectroscopía RMN 2D

Los espectros RMN 1H, 13C HSQC-DEPT y HMBC de las muestras 3a-13a y 3b-

13b fueron adquiridos a partir de soluciones en deuterocloroformo, a menos que los

compuestos fueran insolubles en este solvente. En caso de ser poco solubles, se

agregaron unas pocas gotas de metanol-d4 (2%) y de lo contrario, se utilizó

dimetilsulfóxido-d6 para disolverlas.

La primera asignación tentativa de las señales en los espectros de RMN 1H de los

N-óxidos de pirazina 2-sustituídas fue realizada considerando el comportamiento del

acoplamiento 1H,1H característico ya conocido para el N-óxido de pirazina149 y N-

óxidos de pirazina 2-sustituídas150 a partir de datos de literatura. La constante de

acoplamiento orto 3J(H-5,H-6) es superior a 4.0 Hz mientras la constante de

acoplamiento para 5J(H-3,H-6) es inferior a 1.0 Hz. La constante de acoplamiento a


134

través del átomo de nitrógeno 4J(H-3,H-5) oscila entre 0-0.5 Hz en los 1-N-óxidos

mientras que varía en el rango de 1.0-2.0 Hz en los 4-N-óxidos.

Figura 3.30. Asignación de los protones aromáticos en los espectros de RMN 1H del par de

N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b realizado en DMSO-d6.


135

Como ejemplo, en la Figura 3.30, se muestra la asignación de los protones

aromáticos en los espectros de RMN 1H del par de N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y

9b, teniendo en cuenta las consideraciones anteriores. Como puede verse en la Figura

3.30, la señal correspondiente al H-3, para 9a y en la mayoría de los 1-N-óxidos,

resulta la señal más desprotegida que suele aparecer a diferencia de las otras dos

señales como un singulete ancho, ya que los pequeños valores de las constantes de

acoplamiento hace que no se vean resueltos en la señal. En el caso de los 4-N-óxidos,

la posición relativa de la señal de H-3 es variable, pero es fácilmente distinguible por

presentarse como un doble doblete con los menores valores de constantes de

acoplamiento. Las señales correspondientes a los H-5 y H-6 aparecen también como

doble dobletes en los 4-N-óxidos, pero se distinguen fácilmente teniendo en cuenta la

magnitud de las constantes de acoplamiento tal y como se mencionó anteriormente.

Sin embargo, esta metodología falla en distinguir entre el H-5 y el H-6, en el caso

de los 1-N-óxidos, ya que se presentan en general como dobletes, y aunque a veces

alguno de ellos se presente como doble doblete (Figura 3.30), no es posible realizar

una asignación inequívoca dada la similitud entre los pequeños valores esperados de 5J(H-3,H-6) y 4J(H-3,H-5), que además pueden aparecer no resueltos en la señal. La

precisión en la medición de constantes de acoplamiento spin-spin de los protones en

la cercanía al nitrógeno se ve reducida por los efectos de ensanchamiento cuadrupolar

de las señales debido a la interacción con el átomo de nitrógeno150. Este efecto es

especialmente importante en el caso de los 1-N-óxidos, provocando que las señales

no aparezcan resueltas y no se pueda medir el 4J(H-3,H-5), en contraste con los 4-N-

óxidos, donde la presencia del átomo de oxígeno unido al nitrógeno elimina en medida

considerable este ensanchamiento cuadrupolar.

No obstante, pudieron lograrse asignaciones confiables del H-5 y el H-6 en los 1-N-

óxidos, considerando las correlaciones observadas en los espectros de HMBC (Figura

3.31). En todos los N-óxidos, el H-5 correlaciona con el C-3 y el C-6 mientras que el H-

6 correlaciona con el C-5 y generalmente no correlaciona (o si lo hace, es muy

débilmente) con el C-3. Las resonancias correspondientes de 13C unidos a cada 1H

fueron atribuidas considerando en un paso previo las correlaciones observadas en el

espectro HSQC. Finalmente, las asignaciones fueron fácilmente confirmadas con el

espectro de HMBC, considerando la señal del C-2, ya que el H-3 y el H-6

correlacionan con este carbono cuaternario, mientras que la correlación con H-5 suele

ser muy débil, si es que se observa (Figura 3.31).


136

Figura 3.31. Correlaciones 1H-13C observadas (en negro) en los espectros de RMN 2D

HMBC de los 1-N-óxidos y 4-N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas (en gris se muestran las

correlaciones débiles).

Las asignaciones de los desplazamientos químicos de RMN 1H y 13C de los

compuestos 3a-13a y 3b-13b se muestran en las Tablas 3.15 y 3.16, respectivamente.

En estas Tablas, se citan además los valores encontrados en la literatura y disponibles

para ciertos compuestos, que permiten la comparación con los aquí obtenidos. En lo

posible, se trató de que coincidan los solventes utilizados, pero en algunos casos esto

no fue posible. Como puede observarse en las Tablas 3.15 y 3.16, y ya se había

mencionado antes, debido a la baja solubilidad de algunos compuestos en CDCl3, los

espectros no se registraron en el mismo solvente para todos los compuestos.

En general, los compuestos que no poseen capacidad de formar enlaces de

hidrógeno exhiben sólo pequeñas diferencias en sus desplazamientos químicos de

RMN 13C en soluciones de DMSO-d6 y CDCl3. Investigaciones con respecto al efecto

de estos solventes comunes sobre los desplazamientos químicos, fueron llevadas a

cabo con el N-óxido de piridina151 y pirazinas sustituídas152, mostrando en todos los

casos desviaciones no mayores a 1.5 ppm (~1%) en los desplazamientos químicos de

RMN 13C entre los distintos solventes. En este trabajo, los compuestos 9a y 9b fueron

disueltos en DMSO-d6 y CDCl3, observándose también desviaciones menores al 1%.

Como puede observarse en la Tabla 3.15, en el caso de los desplazamientos

químicos de RMN 1H, el efecto del solvente presenta una influencia mayor con

desviaciones que alcanzan 0.3 ppm (~4%) en los desplazamientos químicos de RMN 1H. La transición de solventes ligeramente polares del tipo de CDCl3 a más polares

(DMSO-d6), puede dar lugar a la formación de asociaciones e interacciones

intermoleculares con los solventes, afectando en mayor medida a los protones que se

encuentran en posiciones próximas a los grupos que interactúan150.


137

Los valores mostrados en las Tablas 3.15 y 3.16 coinciden dentro de las

desviaciones esperables con los valores de literatura hallados. En cuanto a las

asignaciones de los desplazamientos químicos de 13C, no se encontraron

asignaciones en la literatura excepto para cuatro de los compuestos estudiados. Sin

embargo, se encontraron discrepancias en las asignaciones de los protones H-5 y H-6

en los compuestos 8a y 9a, además de desviaciones sistemáticas de ~0.4 ppm en los

desplazamientos químicos de 1H de 8a (probablemente debido a la calibración). Cabe

destacar que la asignación de literatura del compuesto 8a se hizo por comparación

con los desplazamientos del compuesto 9a, por lo que resulta interesante considerar

primero este caso.

En la Tabla 3.15, puede notarse que para aquellos 1-N-óxidos en los que se

observa un doble doblete, éste resulta coincidente con la señal del H-6 donde se

estaría manifestando 5J(H-3,H-6). Este hecho resulta consistente además con que las

señales de los H-3 y H-5 aparecen como señales anchas, debido al ensanchamiento

cuadrupolar, que explicaría porque no se observan los acoplamientos con valores más

pequeños que involucran estos protones en los 1-N-óxidos. Los argumentos

anteriores, en adición a las correlaciones observadas en los espectros de HMBC

justifican entonces las asignaciones realizadas para los protones H-5 y H-6, que como

ya se había mencionado resultan difíciles de asignar y no es sorprendente que se

encuentren intercambiados en trabajos publicados en los que no se disponía de

técnicas de RMN 2D que asistieran en la asignación de las señales.

Otro argumento a favor de la asignación realizada para el compuesto 8a reside en

la comparación de los desplazamientos químicos de RMN 13C con aquellos del

compuesto precursor no oxidado 8. En un trabajo59 se observó al comparar los valores

de desplazamientos químicos de RMN 13C del N-óxido de la 2-hidroxipiridina 1 con los

de la 2-hidroxipiridina, disueltos ambos en DMSO-d6, una diferencia de 4.7 ppm en el

C-2 mientras que en los C-3, C-5 y C-6, las diferencias observadas resultaron menores

a 1 ppm entre ambos compuestos. Curiosamente, al comparar los valores del

compuesto 8a con los valores de literatura153 de la 2-hidroxipirazina disuelta en DMSO-

d6, se encuentra una diferencia de 4.2 ppm en el C-2 y diferencias menores a 1.3 ppm

en los C-3, C-5 y C-6, de manera análoga a lo observado en el derivado de piridina.


138

Tabla 3.15. Desplazamientos químicos de RMN 1H del conjunto de N-óxidos de

pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-13a y 3b-13b, junto a los valores de literatura

(entre corchetes).

a Soluciones conteniendo 2% metanol-d4.

Comp. Sustit. desplazamiento químico 1H (ppm)

multiplicidad J (Hz) Solvente H-3 H-5 H-6 XH CH3 CH

3a Cl

8.65 [8.62] s.a

8.37 [8.36] d (4.0)

8.23 [8.22] dd (4.0; 0.8) CDCl3

[CDCl3]124

3b 8.16 [8.12] dd (1.5; 1.0)

8.03 [7.96] dd (4.0; 1.5)

8.26 [8.22] d.a. (4.0) CDCl3

[CDCl3]124

4a NH2

8.12 [8.16] d (0.5)

7.70 [7.73] d (4.0)

8.11 [8.14] d (4.0)

7.02 s.a

DMSO-d6

[DMSO-d6]150

4b 7.46 [7.47] dd (1.5; 0.8)

7.45 [7.36] dd (4.0; 1.5)

7.85 [7.80] dd (4.0; 0.8)

6.62 s.a DMSO-d6

[DMSO-d6]150

5a CH3

8.46 [8.49] s.a

8.34 [8.36] d (4.0)

8.14 [8.27] d (4.0)

2.48 s CDCl3

[CDCl3]231

5b 8.00 [8.09] m

7.96 [8.04] m (4.0)

8.36 [8.40] d.a (4.0)

2.53 s.a

CDCl3

[CDCl3]231

6a COCH3

8.89 s.a

8.51 d (4.0)

8.09 dd (4.0; 0.8)

2.79 s CDCl3

6b 8.64 dd (1.5; 0.5)

8.19 dd (4.0; 1.5)

8.51 dd (4.0; 0.5)

2.72 s CDCl3

7a COOH

9.09 [9.17] d.a

8.80 [8.85] d.a (4.0)

8.63 [8.60] d (4.0)

DMSO-d6

[DMSO-d6]129

7b 8.62 [8.64] dd (1.5; 0.5)

8.50 [8.51] dd (4.0; 1.5)

8.63 [8.64] d.a (4.0)

DMSO-d6

[DMSO-d6]129

8a OH

8.11 [8.50] s.a

7.32 [8.36] d (4.5)

7.97 [7.71] d (4.5)

DMSO-d6

[DMSO-d6]232

8b 7.51 [7.49] dd (2.0; 0.8)

7.15 [7.12] dd (5.5; 2.0)

7.56 [7.51] d.a (5.5)

DMSO-d6

[DMSO-d6]233

9a

OCH3

8.29 [8.17] s.a

8.49 [8.50] s.a.

8.17 [8.08] d (4.0)

8.17 [8.36] d (4.0)

8.18 [8.06] dd (4.0; 0.5) 8.33 [8.18]

dd (4.0; 0.5)

4.19 s

4.07 s

CDCl3

[CDCl3]150

DMSO-d6

[DMSO-d6]129

9b

7.78 [7.65] dd (1.3; 0.8) 8.07 [8.06]

dd (1.5; 0.5)

7.75 [7.61] dd (4.0; 1.3) 7.97 [7.97]

dd (4.0; 1.5)

8.00 [7.87] d.a (4.0)

8.14 [8.16] d.a (4.0)

4.00 s

3.91 s

CDCl3

[CDCl3]150

DMSO-d6

[DMSO-d6]129

10a NHCOCH3

9.67 [9.44] d (1.0)

8.24 [8.21] d (4.0)

8.17 [8.38] dd (4.0; 1.0)

2.35 s CDCl3

a

[DMSO-d6]150

10b 9.22 [8.91] s.a

7.88 [7.98] dd (4.0; 1.5)

8.12 [8.24] dd (4.0; 0.5)

2.23 s.a CDCl3

a

[DMSO-d6]150

11a CHOHCH3

8.58 s.a

8.46 d (4.0)

8.13 dd (4.0; 0.8)

4.51 d (5.0)

1.67 d (6.5)

5.16 dq (6.5; 5.0) CDCl3

11b 8.30 dd (1.5; 0.5)

8.01 dd (4.0; 1.5)

8.41 dd (4.0; 0.5)

3.99 s.a 1.55 d (6.5)

4.90 q (6.5) CDCl3

a

12a COOCH3

8.89 [8.90] s.a

8.49 [8.50] d (4.5)

8.15 [8.17] dd (4.5; 0.8)

4.02 s CDCl3

[CDCl3]125

12b 8.76 [8.79] dd (1.5; 0.5)

8.22 [8.26] dd (4.0; 1.5)

8.57 [8.61] dd (4.0; 0.5)

4.06 s CDCl3

[CDCl3]125

13a CONH2

9.14 [9.17] s.a

8.67 [8.68] d.a (4.0)

8.49 [8.48] dd (4.0; 1.0)

9.24 s.a 8.37 s.a

DMSO-d6 [DMSO-d6]

129

13b 8.54 [8.55] dd (2.0; 1.0)

8.48 [8.47] dd (4.0; 2.0)

8.58 [8.59] dd (4.0; 1.0)

8.29 s.a 8.01 s.a

DMSO-d6

[DMSO-d6]129


139

Tabla 3.16. Desplazamientos químicos de RMN 13C del conjunto de N-óxidos de

pirazina 2-sustituídas sintetizadas 3a-13a y 3b-13b junto a los valores de literatura

(entre corchetes).

a Soluciones conteniendo 2% metanol-d4.

Compuesto Sustituyente desplazamiento químico 13C (ppm)

Solvente C-2 C-3 C-5 C-6 CH3 CO

3a Cl

139.5 [139.7]

147.6 [148.5]

144.8 [146.3]

134.7 [135.9] CDCl3

[Acetona-d6]141

3b 151.7 [151.9]

133.5 [134.3]

133.1 [134.6]

145.9 [147.3] CDCl3

[Acetona-d6]141

4a NH2

147.5 132.5 132.8 131.2 DMSO-d6

4b 158.8 118.0 123.4 145.1 DMSO-d6

5a CH3

144.4 [144.4]

147.9 [147.9]

145.2 [145.4]

133.6 [133.6]

14.5 [14.4] CDCl3

[CDCl3]147

5b 158.1 [157.6]

132.9 [132.9]

131.3 [131.3]

146.7 [146.7]

21.7 [21.7]

CDCl3

[CDCl3]147

6a COCH3

141.4 149.6 149.0 134.9 31.2 193.2 CDCl3

6b 152.1 132.6 135.7 146.5 25.8 196.9 CDCl3

7a COOH

134.3 148.7 149.6 133.9 160.3 DMSO-d6

7b 148.2 134.8 135.7 147.5 163.5 DMSO-d6

8a OH

152.3 147.3 122.8 128.5 DMSO-d6

8b 158.9 128.4 120.7 130.9 DMSO-d6

9a OCH3

155.9 155.3

132.0 132.5

139.9 139.6

134.1 133.8

58.0 57.8 CDCl3

DMSO-d6

9b 164.0 163.6

123.1 122.2

129.0 129.0

143.3 143.7

54.6 54.3

CDCl3

DMSO-d6

10a NHCOCH3

141.4 137.7 140.0 131.2 24.3 168.8 CDCl3

a

10b 151.4 125.8 130.0 145.0 24.0 169.4 CDCl3

a

11a CHOHCH3

147.8 145.5 146.6 133.8 18.8 64.2

CDCl3

11b 164.8 131.2 132.4 146.7 23.4 68.3 CDCl3

a

12a COOCH3

136.5 149.5 148.4 135.3 53.4 160.1 CDCl3

12b 147.5 135.8 135.8 147.3 53.6 162.6

CDCl3

13a CONH2

135.7 149.6 148.7 134.5 159.6 DMSO-d6

13b 149.9 132.8 135.6 146.9 163.4 DMSO-d6


140

3.5.2. Análisis quimiométrico de los datos de RMN 13C

El paso siguiente ya contando con los desplazamientos químicos de RMN 13C de

los N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas 3a-13a y 3b-13b fue buscar si existe una

relación entre estos datos para la asignación de la posición del grupo N-óxido

independientemente de la naturaleza y posición del sustituyente. Esta relación sería de

especial utilidad para N-óxidos de pirazinas polisustituídas, donde un menor número

de protones aromáticos impediría la aplicación de la estrategia usada en la sección

anterior para la asignación inequívoca.

Un primer acercamiento a dicha relación consistió en observar la distribución que

toman los datos de desplazamientos químicos de RMN 13C, para ver si existe alguna

tendencia que permita distinguir la posición del N-óxido a partir de los mismos. Una

posible representación gráfica de los datos de la Tabla 3.16 correspondientes a los

carbonos del anillo aromático se muestra en la Figura 3.32.

3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b 7a 7b 8a 8b 9a 9b 10a10b11a11b12a12b13a13b110

120

130

140

150

160

170

Des

plaz

amie

nto

quím

ico

RM

N 13

C (

ppm

)

Compuesto

C-2 C-3 C-5 C-6

Figura 3.32. Representación de los desplazamientos químicos RMN 13C de los carbonos

del anillo aromático de los compuestos 3a-13a y 3b-13b a partir de los datos de la Tabla

3.16.

Como se observa en la Figura 3.32, los desplazamientos químicos de RMN 13C

correspondientes a los carbonos del anillo aromático C-2 y C-6 presentan una

tendencia marcada y opuesta a los carbonos C-3 y C-5 al comparar cada 1-N-óxido de

los compuestos 3a-13a con su correspondiente 4-N-óxido isómero 3b-13b. Además,


141

los desplazamientos químicos de RMN 13C de los carbonos C-3 y C-5 siguen en

general un comportamiento muy similar, lo que sugiere que estas variables se

encuentran correlacionadas y que por lo tanto, sería posible reducir el número de

variables para explicar la varianza de los datos. Con este objetivo se aplicó PCA

(Apéndice A.4. pág. 261) al conjunto de datos conformado por los desplazamientos

químicos de RMN 13C de los carbonos C-2, C-3, C-5 y C-6 de los compuestos 3a-13a

y 3b-13b mostrados en la Tabla 3.16.

Los primeros dos componentes principales obtenidos describieron 99.94% de la

varianza de los datos. En la Figura 3.33 se muestra el gráfico de puntuaciones de

PC1-PC2. Las definiciones de cada PC se muestran en las ecuaciones 3.1 y 3.2 junto

con los valores de los pesos (loadings), es decir, los coeficientes que acompañan las

variables.

PC1 = 0.530 C-2 + 0.488 C-3 + 0.487 C-5 + 0.494 C-6 (3.1)

PC2 = -0.614 C-2 + 0.543 C-3 + 0.465 C-5 -0.335 C-6 (3.2)

270 280 290

-20

0

20

1-N-O 4-N-O

PC

2 (0

.27%

)

PC1 (99.68%)

Figura 3.33. Representación gráfica de las puntuaciones de las muestras (scores plot) en

el plano de los componentes principales PC1-PC2 a partir del análisis por PCA de los datos

de la Tabla 3.16.

Como se observa en la ecuación 3.1, el primer componente principal (PC1)

representa esencialmente la suma de los desplazamientos químicos de RMN 13C con

todos los carbonos casi equitativamente ponderados. Por otro lado, el segundo

componente principal (PC2) representa un contraste entre los desplazamientos


142

químicos de RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de

nitrógeno (C-3 y C-5 versus C-2 y C-6), como se deriva a partir de la ecuación 3.2.

A partir de la inspección de la Figura 3.33, puede notarse que PC1 parece separar

los compuestos de acuerdo al sustituyente. Además, la posición del N-óxido no parece

ejercer un efecto significativo sobre las puntuaciones de PC1 ya que ambos isómeros

del par de N-óxidos de cada uno de los compuestos muestran en la mayoría de los

casos valores similares, apareciendo más o menos alineados verticalmente

(diferencias < 1.5 ppm aprox.).

Por otra parte, PC2 parece separar los compuestos en dos grandes grupos, uno

con puntuaciones positivas que incluye la mayoría de los 1-N-óxidos, y otro con

puntuaciones negativas incluyendo a todos los 4-N-óxidos y a unos pocos 1-N-óxidos.

De este modo, la mayor parte de los N-óxidos de las pirazinas 2-sustituídas fueron

separados y diferenciados de acuerdo a la posición del átomo de nitrógeno oxidado.

La separación (diferencia entre las puntuaciones de PC2) entre cada par de N-óxidos

isoméros varía desde 16 ppm para 8a/ 8b hasta 29 ppm para 11a/ 11b.

En relación a la ecuación 3.2 que define a PC2, es interesante notar que los

coeficientes positivos (pesos de C-3 y C-5) resultan muy similares mientras que los

negativos (pesos de C-2 y C-6) están más polarizados probablemente debido al efecto

variable del sustituyente en el C-2 (cf. Figura 3.32). Curiosamente, ya se había

encontrado una tendencia similar al comparar los valores de desplazamientos

químicos de RMN 13C de piridinas sustituídas con los de sus N-óxidos154,155,

observando un efecto protector de cerca de la misma magnitud en los C-2, C-4 y C-6

por la presencia del N-óxido y un efecto opuesto y mucho menor en los C-3 y C-5, no

muy influenciado por la naturaleza o posición del sustituyente. También fue observado

un efecto similar en los espectros de RMN 13C de N-óxidos de alquil- y

fenilpirazinas147, el cual fue racionalizado sugiriendo un aumento de la densidad

electrónica (protección) en los C-2 y C-6 de 1-N-óxidos de pirazinas por retrodonación

electrónica desde el grupo N-óxido.

Las observaciones anteriores sugieren que podría ser propuesto un índice de N-

oxidación para identificar la posición del grupo N-óxido de un modo más general,

confiable y simple, de manera análoga a las puntuaciones de PC2 obtenidas por PCA

que resultaron ser satisfactorias en la identificación de la posición del átomo de

nitrógeno oxidado en la mayoría de los N-óxidos de pirazina 2-sustituídos.


143

Para el cálculo del índice podría introducirse una simplificación considerando sólo

dos coeficientes, uno para la suma de los desplazamientos químicos de RMN 13C de

cada par de átomos de carbono unido a un átomo de nitrógeno, un coeficiente positivo

(C35) para C-3 + C-5 y uno negativo (C26) para C-β + C-6:

INO = C26( C-2 + C-6) + C35 ( C-3 + C-5) (3.3)

Un valor positivo del índice INO indicaría la presencia de un 1-N-óxido mientras un

valor negativo, un 4-N-óxido a semejanza de las puntuaciones de PC2, siempre que el

C-2 sea identificado como el átomo de carbono unido al sustituyente. Valores cercanos

a cero podrían conducir a incertidumbre o errores y por lo tanto deberían evitarse. En

la Figura 3.33 puede observarse que para los 1-N-óxidos con sustiyentes dadores

fuertes de electrones (4a, 8a y 9a), las puntuaciones de PC2 se encuentran cerca de

cero, así como ocurre para los 4-N-óxidos con sustituyentes atractores de electrones

(3b, 6b, 7b, 12b y 13b). De hecho, algunas puntuaciones (scores) en el análisis por

PCA, especialmente notadas para los compuestos 4a y 9a resultaron negativas a

pesar de ser 1-N-óxidos. Este hecho podría estar relacionado con la dispersión de los

datos no distribuidos uniformemente debido a la diferente naturaleza de los

sustituyentes.

Para evitar valores del índice cercanos a cero, los coeficientes C35 y C26 pueden

optimizarse maximizando el valor del índice INO para los N-óxidos isómeros de cada

par, separándose así los valores de cero lo más posible. Así, se podría reformular el

índice como una diferencia entre los promedios de los desplazamientos químicos de

RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos a un átomo de nitrógeno,

incluyendo el efecto del sustituyente a través de un factor x que multiplique al

promedio que contiene el átomo de carbono sustituído (C-2).

INOx = – x ( C-2 + C-6)/2 + ( C-3 + C-5)/2 (3.4)

La ecuación (3.4) se obtuvo fijando el valor de uno de los coeficientes en la ec.

(3.3), C35 = 0.5 (promedio de los pesos de C-3 y C-5 en PC2, cf. ec. (3.2)) y

calculando el valor del factor x (x = 2 C26), imponiendo la condición que los índices INO

para los N-óxidos de cada par se encuentren centrados respecto de cero:

INO1NO + INO4NO = 0 x = [( C-γ + C-5)1NO + ( C-γ + C-5)4NO] (3.5) [( C-β + C-6)1NO + ( C-β + C-6)4NO]


144

En la Tabla 3.17 se presentan los valores optimizados de los factores x obtenidos a

partir de la ec. (3.5) para cada par de N-óxidos del conjunto de compuestos sintetizado

3a-13a y 3b-13b. A partir de los valores obtenidos, puede notarse que los

sustituyentes dadores fuertes de electrones (NH2, OH y OCH3) presentan valores

alrededor de 0.9 mientras que los sustituyentes atractores de electrones (Cl, COCH3,

COOH, COOCH3 y CONH2) adoptan valores cercanos a 1. Para analizar si en verdad

existe una relación con el efecto electrónico del sustituyente, las constantes de

Hammett156 de los sustituyentes fueron también consideradas como se muestra en la

Tabla 3.17.

Tabla 3.17. Factores optimizados xa y constantes de Hammett pb de los sustituyentes

del conjunto de N-óxidos de pirazinas 2-sustituídas sintetizado 3a-13a y 3b-13b.

Sustituyente Factor xa pb

Cl 0.978 0.23

NH2 0.870 -0.66

CH3 0.956 -0.17

COCH3 0.986 0.50

COOH 1.009 0.45

OH 0.910 -0.37

OCH3 0.877 -0.27

NHCOCH3 0.938 0.00

CHOHCH3 0.937 -0.07

COOCH3 1.005 0.45

CONH2 1.000

0.36 a Valores óptimos del factor x calculados usando la ec. (3.5) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.15. b δos datos para p fueron tomados de la Ref. 156.

En la Figura 3.34 se muestra la correlación obtenida entre los factores optimizados

x y las constantes de Hammett de los sustituyentes que, como se observa, puede

aproximarse por una relación lineal. Además, las desviaciones que se observan no

resultan inesperadas si se toma en consideración que las constantes, que sólo toman

en cuenta el efecto electrónico del sustituyente, fueron definidas157 para los primeros


145

ocho grupos funcionales de la Tabla 3.17 sobre la base de constantes de ionización en

agua de ácidos benzoicos sustituídos en para.

Como puede observarse en la Figura 3.34, los valores óptimos de x se encuentran

distribuidos más o menos uniformemente formando tres grupos de acuerdo al efecto

del sustituyente, atractores, dadores fuertes y dadores débiles. Como consecuencia,

podrían emplearse índices generales de acuerdo a la naturaleza del sustituyente,

evitando así el uso de factores específicos para cada sustituyente. Por ejemplo,

considerando tres valores distintos para los factores conforme a los grupos

observados, podrían proponerse tres índices de N-oxidación , es decir, INO0.90 para

sustituyentes dadores fuertes de electrones, INO0.95 para sustituyentes dadores

débiles de electrones y INO1.00 para sustituyentes atractores de electrones. Entonces,

usando la ec. (3.4) puede calcularse el índice, teniendo en cuenta las características

del sustituyente al seleccionar el x adecuado. En la Tabla 3.18, se muestran los

resultados de esta aproximación que fueron más satisfactorios que aquellos

previamente obtenidos a partir de las puntuaciones de PC2 para el conjunto completo

de compuestos.

-0,5 0,0 0,5

0,9

1,0

X

p

Figura 3.34. Gráfico de los factores optimizados (x) versus las constantes de Hammett ( p)

de los sustituyentes a partir de los datos de la Tabla 3.17.

Pero en la Tabla 3.18, puede observarse que si no se realizan suposiciones acerca

de la naturaleza del sustituyente, esto es, si se considera un “valor medio” del factor (x

= 0.95), que se encuentra cercano al valor de efecto nulo del sustituyente (Figura


146

3.34), en general, el signo del índice INO0.95 resulta consistente con la posición del N-

óxido (positivo para 1-N-óxidos y negativo para 4-N-óxidos). No obstante, para algunos

compuestos, los resultados obtenidos a partir del cálculo del índice INO0.95 no fueron

concluyentes, ya que su valor resultó próximo a cero.

Tabla 3.18. Índices de N-oxidación para el conjunto de N-óxidos de pirazinas 2-

sustituídas sintetizado 3a-13a y 3b-13b.

Índice de N-oxidacióna (ppm) Puntuaciones

Compuesto Sustituyente INO0.90 INO0.95 INO1.00 de PC2 (ppm)b

3a Cl

22.8 16.0 9.1 16.7

3b -0.62 -8.06 -15.5 -7.64

4a NH2

7.24 0.27 -6.7 -0.82

4b -16.1 -23.7 -31.3 -24.7

5a CH3

21.5 14.5 7.55 14.4

5b -5.06 -12.7 -20.3 -13.0

6a COCH3

25.0 18.1 11.2 18.5

6b -0.22 -7.69 -15.2 -7.37

7a COOH

28.5 21.8 15.1 23.0

7b 2.19 -5.21 -12.6 -4.11

8a OH

8.69 1.67 -5.35 0.53

8b -5.86 -13.1 -20.4 -15.6

9a OCH3

6.00 -1.27 -9.05 -3.92

9b -12.7 -20.4 -27.6 -21.9

10a NHCOCH3

16.2 9.37 2.55

9.10

10b -5.48 -12.9 -20.3 -12.8

11a CHOHCH3

19.3 12.3 5.25 11.6

11b -8.38 -16.2 -24.0 -17.5

12a COOCH3

26.6 19.8 13.1 21.0

12b 3.14 -4.23 -11.6 -3.02

13a CONH2

27.6 20.8 14.1 22.0

13b 0.64 -6.78 -14.2 -6.09

. a Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando los valores de x= (0.90; 0.95; 1.00) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.15. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita.

b Valores de las puntuaciones de PC2 obtenidos a partir de la ec. (3.2) y los datos de RMN 13C de la Tabla 3.16.


147

Por esta razón, la definición de un valor umbral para el |INOx| mínimo, aunque

arbitrario, mientras sea consistente con la incerteza asociada al cálculo del índice,

ayudaría a decidir en los casos en que los valores del índice se encuentran cercanos a

cero. Teniendo en cuenta que el índice INOx se calcula como una diferencia casi

equitativamente ponderada entre dos desplazamientos químicos de RMN 13C (cf. ec.

3.4), la incerteza esperada para el índice sería cerca del doble de la incerteza de los

desplazamientos químicos RMN de 13C, que además está mayormente influenciada no

por la precisión de la medición, sino por desviaciones causadas por diferentes

condiciones experimentales (solvente, temperatura). Las observaciones realizadas en

la sección anterior relativas al efecto del solvente, despreciando el efecto de la

temperatura, indican que podrían esperarse desviaciones en los valores de los

desplazamientos químicos de hasta 1 ppm. Luego, aún en el peor caso, la incerteza

esperada del índice INOx sería próxima a 2 ppm (~1% de los desplazamientos

químicos promedio de RMN 13C). En consecuencia, podría usarse un valor umbral

superior a 5-6 ppm para evitar valores que induzcan a error.

Resulta interesante examinar en mayor profundidad si los índices aplicados al

conjunto estudiado de N-óxidos de pirazina monosustituídos, son aún útiles para

identificar la posición del grupo N-óxido en pirazinas disustituídas. Vale la pena

mencionar que en el caso de N-óxidos de pirazinas disustituídas sólo son posibles tres

patrones de sustitución, 2,3-, 2,5- y 2,6- (Figura 3.35). En estos casos, el signo del

índice reflejaría la posición de la función N-óxido relativa al sustituyente localizado en

el C-2, el cual puede ser elegido arbitrariamente.

Figura 3.35. Posibles patrones de sustitución en N-óxidos de pirazinas disustituídas.

Cuando los sustituyentes se encuentran en meta (2,6-), como ambos átomos de

carbono sustituídos pertenecen al mismo término promedio (cf. ec. 3.4), no se


148

presenta ambigüedad acerca de la localización del factor que da cuenta del efecto del

sustituyente, dejando claro que el índice INOx se calcularía de manera similar a la

antes empleada. Sin embargo, en los otros patrones de sustitución (2,3- y 2,5-), como

los sustituyentes están localizados en átomos de carbono unidos a átomos de

nitrógeno opuestos, el efecto del sustituyente debería estar igualmente incluído por un

factor que multiplique cada promedio como en la ec. 3.3. Entonces,

INOx,y = – x ( C-2 + C-6)/2 + y ( C-3 + C-5)/2 (3.6)

Mientras el efecto ejercido por ambos sustituyentes sea similar, parecería

razonable usar el mismo valor del factor en ambos promedios, x = y en la ec. 3.6.

En la Tabla 3.19 se muestran algunos ejemplos tomados de la literatura147 junto a

los índices usados para las estructuras que se muestran en la Figura 3.36. Las

constantes de Hammett para los sustituyentes fenilo y metilo son -0.01 y -0.17,

respectivamente156 y por ende, pueden ser considerados como grupos dadores débiles

de electrones. Por consiguiente, puede usarse para ambos el mismo valor del factor

que da cuenta del efecto del sustituyente (x, y = 0.95). Como se muestra en la Tabla

3.19, el índice INO0.95,0.95 calculado a partir de la ec. 3.6 parece más adecuado para

identificar la posición del grupo N-óxido para los compuestos orto y para sustituídos

(15a, 15b, 16a, 16b, 18a y 18b) mientras que el índice INO0.95 calculado a partir de la

ec. 3.4 parece más apropiado para los meta sustituídos (17a, 17b, 20a y 20b) como

era de esperar.

Por primera vez, a partir de los datos de desplazamientos químicos de RMN 13C

se pudo identificar inequívocamente la posición del grupo N-óxido de una serie de N-

óxidos de pirazina 2-sustituídos. A partir de técnicas quimiométricas de análisis

multivariado (PCA) se desentrañaron relaciones útiles que llevaron a la definición de

un índice de N-oxidación. La principal ventaja de la metodología propuesta es su

simplicidad, ya que el cálculo del índice consiste en contrastar los promedios de los

desplazamientos químicos de RMN 13C de cada par de átomos de carbono unidos al

átomo de nitrógeno. El efecto del sustituyente pudo ser incluído mediante un factor

cercano a la unidad que puede ser estimado a través de las constantes de Hammett

de los sustituyentes.

La metodología resultó satisfactoria en reconocer la posición del N-óxido a partir

del signo del índice de N-oxidación INO (positivo para 1-N-óxidos y negativo para 4-N-


149

óxidos) en todos los casos estudiados que incluyen N-óxidos de pirazinas mono- y

disustituídas. En principio, la metodología podría extenderse a N-óxidos de pirazinas

más sustituídas. Sin embargo, para corroborarlo se necesitarían los datos de

desplazamientos químicos de RMN 13C de los carbonos aromáticos asignados, que no

se encuentran disponibles en la literatura actual.

Figura 3.36. Estructuras de los 1-N-óxidos a y 4-N-óxidos b de las pirazinas disustituídas

14-20.

Tabla 3.19. Índices de N-oxidación para una serie de N-óxidos de pirazinas

disustituídasa.

Compuesto

Sustituyentes Desplazamiento químico RMN 13C (ppm)

Índice de N-oxidación (ppm)

R2 R3 R5 R6 C-2 C-3 C-5 C-6 INO0.95b INO0.95,0.95

c

14b Ph H H Ph 155.9 128.7 128.7 155.9 -19.4 -25.8

15a CH3 CH3 H H 142.9 156.2 142.9 131.9 19.0 11.5

15b CH3 CH3 H H 156.2 142.9 131.9 142.9 -4.7 -11.5

16a CH3 H CH3 H 141.1 146.7 154.9 132.3 20.9 13.4

16b CH3 H CH3 H 154.9 132.3 141.1 146.7 -6.6 -13.4

17a CH3 H H CH3 145.3 143.7 143.7 145.3 5.67 -1.50

17b CH3 H H CH3 156.7 130.2 130.2 156.7 -18.7 -25.2

18a CH3 Ph H H 143.7 158.1 143.5 132.1 19.8 12.3

18b CH3 Ph H H 157.1 144.5 132.2 144.9 -5.10 -12.0

19a CH3 H Ph H 142.1 147.2 154.6 130.5 21.4 13.9

20a CH3 H H Ph 144.5 146.0 146.0 144.5 8.73 1.43

20b CH3 H H Ph 157.0 130.7 128.2 155.8 -19.3 -25.6 a Los valores de los desplazamientos químicos de RMN 13C fueron tomados de la Ref. 147. b Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.4) usando el valor de x= 0.95 y los datos de RMN 13C de literatura. c Índice de N-oxidación calculado a partir de la ec. (3.6) usando los valores de x, y = 0.95 y los datos de RMN 13C de literatura. Los mejores valores para la diferenciación entre isómeros se muestran en negrita.


150

3.6. Conclusiones

El análisis de las fragmentaciones por ESI-CID de 1- y 4- N-óxidos isómeros de

pirazina 2-sustituídos mostró caminos de fragmentación dependientes de la naturaleza

del sustituyente. En la mitad de los casos se observó preferentemente la pérdida del

radical hidroxilo, como ya se había observado para los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y

2. En cambio, los compuestos que presentaban un grupo carbonilo exhibieron caminos

de fragmentación alternativos, que prevalecieron en los espectros de masa tándem a

diferentes energías de colisión. La mayoría de los isómeros no pudieron ser

distinguidos sobre la base de la comparación de la relación de intensidades del ion

precursor y del ion fragmento principal, sino que las diferencias se encontraron en

iones fragmento de menor intensidad.

El análisis de la complejación con iones metálicos (calcio, cobre y aluminio)

permitió encontrar diferencias entre cada par de isómeros a partir de los iones aducto

generados por electrospray. No se encontró un comportamiento general atribuible a la

posición del grupo N-óxido sino más bien a particularidades de cada sustituyente. La

aplicación de la técnica de análisis multivariado (PCA), mediante representaciones

gráficas, permitió interpretar las diferencias observadas en los espectros de masa de

cada compuesto con metales, agrupando los compuestos sobre la base de las

distintas especies observadas. De esta manera, se encontraron relaciones entre la

presencia de determinadas especies cargadas en los espectros de masa de cada

compuesto y la presencia de ciertos grupos funcionales y la posición del grupo N-

óxido.

Mediante técnicas de espectroscopia RMN 2D fue posible asignar unívocamente la

posición del N-óxido así como la totalidad de protones y carbonos del conjunto de N-

óxidos isómeros de pirazina 2-sustituídos. Si bien las correlaciones protón-carbono

observadas mediante las técnicas de RMN 2D resultaron útiles para los compuestos

estudiados, su aplicabilidad se restringe a N-óxidos de pirazinas poco sustituídas.

En cambio, el análisis por técnicas quimiométricas de los datos de espectroscopia

RMN 13C proporcionaron una relación útil y general para identificar la posición del N-

óxido en pirazinas sustituídas. Esta relación pudo racionalizarse en términos del ya

conocido efecto del grupo N-óxido de aumentar la densidad electrónica en los átomos

de carbono vecinos. Así, fue posible proponer un índice cuyo signo refleja la posición

del N-óxido y cuyo cálculo consiste simplemente en contrastar desplazamientos


151

químicos de RMN 13C. El efecto variable del sustituyente fue ponderado a través de un

factor relacionado con las constantes de Hammett.

El análisis por espectroscopia RMN 13C de los compuestos estudiados arrojó

resultados más generales y simples, respecto al análisis por MS, para la diferenciación

entre N-óxidos isómeros de pirazinas sustituídas. Sin embargo, debe tenerse en

cuenta que el análisis por esta técnica presenta una menor sensibilidad y los

experimentos requieren mayor tiempo para su realización y mayor cantidad de

muestra comparado a MS. Tampoco podrían aplicarse al análisis de mezclas que

contengan estos compuestos sin separación previa de la muestra. Por lo tanto, pese a

la mayor influencia de los sustituyentes en el análisis por MS de los N-óxidos de

pirazinas, el mismo resultaría competitivo e irremplazable en caso de que se disponga

de poca cantidad de muestra o se precise el análisis de un gran número de muestras

donde la rapidez del análisis se torna un factor importante.

Los resultados presentados en este capítulo dieron origen al momento a una

publicación:

Butler, M., Cabrera G. M. Determination of the position of the N-O function in substituted

pyrazine N-oxides by chemometric analysis of carbon-13 nuclear magnetic resonance data.

(2013) Journal of Molecular Structure 1043, pp. 37–42.


152

153

Diferenciación de dihidroxiarenos

4.1. Introducción

Los dihidroxiarenos son motivos estructurales comunes en agroquímicos, drogas

farmacéuticas y sus metabolitos, siendo de interés además por sus efectos

antioxidantes en sistemas biológicos158,159. A modo de ejemplo, la estructura del

catecol se presenta en varios esteroides y en hormonas como la adrenalina, L-dopa y

dopamina. Además, sus derivados se encuentran ampliamente distribuidos entre

productos naturales como las cumarinas y flavonoides (Figura 4.1). También, pueden

originarse durante la descomposición de sustancias húmicas, taninos y ligninas160, así

como por degradación de herbicidas e insecticidas161. Algunos dihidroxiarenos, como

el catecol y resorcinol, son también considerados contaminantes ambientales162.

Figura 4.1. Estructuras de algunos productos naturales conteniendo por lo menos dos

grupos fenólicos.

En este sentido, la necesidad de identificar diferentes isómeros posicionales radica

en la diferencia de los distintos isómeros tanto en su potencial de riesgo como en su

actividad biológica. El desarrollo de métodos para el análisis simultáneo y

diferenciación de isómeros de dihidroxiarenos más allá de su relevancia, en general

resulta problemático, especialmente por MS. Este inconveniente ha sido abordado de

4

Capítulo

Capítulo 4 Diferenciación de dihidroxiarenos

154

diferentes maneras, algunas más exitosas que otras, dependiendo de la naturaleza

estructural de los isómeros. Las reacciones de disociación en fase gaseosa (CID) a

veces muestran diferencias en los caminos de fragmentación. Por ejemplo, los

espectros de ESI-MS/MS de los iones [M-H]- del catecol y resorcinol mostraron que

estos compuestos podían distinguirse a partir de los iones producto encontrados,

como el ion [M-2H]-, presente en catecol163, resultando además diagnóstico de la

presencia de un núcleo de dihidroxibenceno en polifenoles más complejos. Cabe

mencionar que en el trabajo anteriormente citado se comenta que los espectros en

modo positivo de polifenoles fueron menos informativos que aquellos obtenidos en

modo negativo.

Otra estrategia empleada para la diferenciación de regioisómeros relacionados con

productos de degradación de la lignina36, fue el empleo de reacciones ión-molécula en

fase gaseosa. Para esto fue requerida la introducción, en una de las celdas de un FT-

ICR de celda dual, de un reactivo (trimetilborato), que mostró distinta reactividad frente

a los compuestos isómeros estudiados permitiendo su diferenciación. Asimismo,

diferencias en las reacciones de intecambio hidrógeno/deuterio (H/D) fueron usadas

para diferenciar estereoisómeros de flavonoides, tal como fue probado con

catequinas37. Por otro lado, el acoplamiento de la espectrometría de movilidad iónica

(IMS-MS) ha permitido la diferenciación entre isómeros de posición en compuestos

aromáticos hidroxilados164, productos de biotransformaciones metabólicas.

La formación de iones aducto con metales fue utilizada para diferenciar

compuestos isoméricos en bencenos disustituídos en la década del noventa,

empleando iones monocargados de metales de transición como el Fe(I)165, Cr(I)166 y

V(I)/VO(I)167. Con la llegada de la ionización por electrospray, la complejación con

iones metálicos en solución, seguido del transporte eficiente de los complejos

cargados a la fase gaseosa, representó un método prometedor para la ionización de

una gran variedad de analitos, incluyendo aquellos que no eran directamente

ionizados por ESI8. Así, utilizando iones divalentes de metales de transición para la

formación de complejos, en combinación con CID sobre los iones aducto formados,

fue posible la diferenciación de diastereoisómeros de dioles bicíclicos con Co(II)38 y de

-aminoácidos cíclicos con Ni(II) y Cu(II)168.

Por otra parte, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa (LC-

MS) se ha convertido en una importante herramienta analítica desde que se

Diferenciación de dihidroxiarenos Capítulo 4

155

encuentran disponibles las técnicas de ionización a presión atmosférica (API)169, ya

que permite el análisis de analitos en matrices complejas sin separación previa. Esta

técnica permite además el agregado postcolumna de agentes de derivatización para

mejorar la sensibilidad de la detección. Si bien hay pocos ejemplos aún de la

introducción de iones metálicos como agentes de complejación postcolumna, su

aplicación no sólo permitió ampliar el número de analitos detectables170, sino también

diferenciar isómeros. Por ejemplo, la utilización de Ag(I) posibilitó la diferenciación del

sitio de glicosilación en diglicósidos isoméricos de flavonoides39 por espectrometría de

masa tándem, mientras que el Mn(II) fue usado para caracterizar los hidratos de

carbono en monoglicósidos de flavonoides, así como el sitio de glicosilación por

espectrometría de masa tándem171.

Figura 4.2. Estructuras de los dihidroxiarenos estudiados.

El éxito obtenido en la diferenciación de los isómeros comerciales de N-óxidos de

hidroxipiridina 1 y 2 con metales condujo a la evaluación de los alcances de esta

metodología de análisis para la diferenciación de regioisómeros en otra familia de

compuestos, pero sin la funcionalidad N-óxido en su estructura. En particular, se

trabajó con los compuestos comerciales (Figura 4.2) consistentes en pares de

isómeros orto y meta de dihidroxibenceno (catecol 21 y resorcinol 22),

dihidroxinaftaleno (2,3-naftalendiol 23 y 1,3-naftalendiol 24) y dihidroxicumarina (7,8-

dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7-dihidroxi-4-metilcumarina 26). En la sección 4.2, se


156

mostrarán los resultados sobre la diferenciación de los isómeros de dihidroxiarenos a

partir de los iones aducto con metales generados por ESI, mostrando luego en mayor

detalle el empleo del calcio. En la sección 4.5, se culmina con la evaluación del uso de

metales como agentes complejantes postcolumna en LC/ESI-MS como método de

detección para la distinción de estos isómeros. Para lograr una comprensión más

cabal de la complejación diferencial y de las especies observadas en los espectros de

masa con metales se realizaron cálculos computacionales proponiendo estructuras

para las diferentes especies. La caracterización de los principales iones obtenidos y el

análisis de la estabilidad relativa de los complejos formados en fase gaseosa y sus

posibles productos de disociación primarios, constituye una herramienta valiosa para

entender las diferencias en el perfil de iones observado para cada isómero de los

dihidroxiarenos. Sin embargo, para la correcta asignación entre las estructuras

calculadas y aquellas observadas en los espectros de masa a veces es necesario

tener información estructural directa.

En este escenario, el empleo de la espectroscopía de disociación multifotónica

infrarroja (IRMPD) (Apéndice A.5, pág. 262) se ha convertido en una de las pocas

técnicas que permiten una conexión directa entre los experimentos de MS y los

cálculos computacionales. En la última década, la espectroscopía IRMPD ha provisto

de contribuciones valiosas, complementando la elucidación estructural y electrónica de

complejos organometálicos o iones aducto de metales con moléculas

orgánicas172,173,174. Los resultados del estudio estructural empleando espectroscopía

IRMPD para entender las propiedades complejantes del catecol como representante

de los dihidroxiarenos estudiados y el calcio entre los metales, se expondrá en la

sección 4.3. Sobre la base de las estructuras obtenidas y mediante la realización de

cálculos computacionales se estudiaron los mecanismos de disociación de los iones

aducto dicargados con calcio del catecol 21 y resorcinol 22, de manera similar a lo

realizado en la sección 2.3.3 (pág. 40). Estos resultados se comentarán en la sección

4.4.

4.2. Complejación con metales por ESI-MS

4.2.1. Estudio preliminar

La mayoría de los trabajos publicados sobre complejación con metales por ESI-MS

de compuestos con funcionalidades fenólicas se refieren casi exclusivamente a


157

productos naturales de la familia de los polifenoles. Por ejemplo, los complejos de seis

flavonoides con cobre(II) y hierro(III) fueron estudiados por ESI-MS175 observando

quelatos con distintas estequiometrías así como la ocurrencia de reacciones rédox.

Estas reacciones ocurrieron tanto en los metales por reducción en sus estados de

oxidación, como en los flavonoides por pérdida de 2 átomos de hidrógeno,

especialmente en aquellos con un grupo catecol. En cambio, al estudiar soluciones de

resveratrol (Figura 4.1) con Cu(II) se observaron únicamente iones aducto con Cu(I)

por ESI-MS176. Además, se han realizado estudios177 por ESI-MS con otro flavonoide,

morina (Figura 4.1), que con Al(III) y Ga(III), produjo complejos en fase gaseosa de

variada estequiometría. En cuanto a la diferenciación de isómeros, la complejación con

Co(II) junto a un ligando auxiliar178 fue utilizada para diferenciar isómeros de glicósidos

de flavonoides por ESI-MS/MS. En este caso, los iones aducto formados resultaron

mucho más intensos que los iones observados en modos de ionizacion positivo o

negativo sin metales.

Se inició el estudio de los complejos metálicos en fase gaseosa con isómeros de

dihidroxiarenos, subestructuras presentes en los polifenoles, para analizar las

diferencias observadas. Los compuestos ensayados fueron catecol 21, resorcinol 22,

2,3-naftalendiol 23, 1,3-naftalendiol 24, 7,8-dihidroxi-4-metilcumarina 25 y 5,7-

dihidroxi-4-metilcumarina 26 (Figura 4.2). Cabe destacar que en los espectros de

masa obtenidos empleando ESI en modo positivo, realizados por infusión directa de

los compuestos 21 y 22, no fue observado el ion correspondiente a la molécula

protonada ni otros iones característicos de los compuestos. Los espectros de masa

fueron registrados a partir de mezclas preparadas en el momento de soluciones

metanólicas de cada compuesto con soluciones acuosas de algunos de los cationes

metálicos: aluminio(III), calcio(II), hierro(III), cobalto(II), cobre(II) y galio(III). Las

condiciones experimentales empleadas fueron idénticas a las empleadas

anteriormente para el análisis de los N-óxidos de hidroxipiridina 1 y 2, descritas en el

capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208).

En las Tablas 4.1-4.6, se resumen las especies caracterizadas para cada isómero,

exhibidas en los espectros de masa, obtenidos con los diferentes iones metálicos.

Como se puede observar en las Tablas 4.1-4.6, en general, los isómeros con

sustitución orto (21, 23 y 25) exhibieron mayor preponderancia de iones aducto con los

metales conteniendo ligandos desprotonados, mientras que los isómeros con

sustitución meta (22, 24 y 26) se mostraron mayormente en su forma neutra en los


158

iones aducto con metales. Esta tendencia fue seguida por la mayoría de los

compuestos estudiados con aluminio (Tabla 4.1) y galio (Tabla 4.6), mientras que con

cobalto (Tabla 4.4) y cobre (Tabla 4.5) se identificaron un mayor número de especies

en común entre ambos isómeros. Las especies observadas para los compuestos

estudiados con los metales mencionados anteriormente resultaron análogas a las

observadas y previamente descritas para los N-óxidos en los capítulos precedentes.

Sin embargo, con el calcio (Tabla 4.2) y el hierro (Tabla 4.3), se observaron

peculiaridades que se mencionan a continuación.

En el caso del hierro, se observó la formación de dímeros por acoplamiento

oxidativo para los compuestos 21, 22, 23 y 24, así como complejos con el metal

conteniendo estos dímeros. Un comportamiento similar fue informado para el

resveratrol179, donde en experimentos de ESI-MS a partir de mezclas con hierro se

identificaron dehidrodímeros, cuya formación, mediante cálculos computacionales, fue

sugerida a partir de reacciones de acoplamiento mediadas por radicales fenóxido.

Estas reacciones de acoplamiento oxidativo de fenoles con FeCl3 pueden ocurrir en

solución e incluso en el estado sólido180 como fuera informado para el compuesto 23.

Las especies observadas con calcio resultaron idénticas a las descritas en los

capítulos anteriores aunque no se detectaron especies conteniendo el contraión

cloruro. Sin embargo, lo que resultó más interesante fue que los compuestos 21, 22,

23 y 24 siguieran una tendencia opuesta a la mostrada con los otros metales. Es decir,

para el catecol 21 y el 2,3-naftalendiol 23, capaces de formar quelatos estables, se

observaron predominantemente iones aducto dicargados con calcio, mientras que el

resorcinol 22 y el 1,3-naftalendiol 24, exhibieron principalmente iones aducto

monocargados con calcio por la presencia de un ligando desprotonado. Este

comportamiento resultó llamativo a la luz de los resultados obtenidos hasta el

momento con los isómeros de N-óxidos de hidroxipiridinas y pirazinas, donde

contrariamente, sólo las estructuras capaces de formar quelatos estables exhibieron

iones aducto monocargados con un ligando desprotonado. Como consecuencia, se

decidió investigar en mayor profundidad la complejación diferencial con calcio de los

isómeros de dihidroxibenceno (21 y 22) y dihidroxinaftaleno (23 y 24).


159


por ESI de los compuestos 21-26 (L) con aluminio; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26

[M]+ 160.0510 (5.5)

[M+H]+ 111.0449 (7.6)

161.0589 (4.8)

161.0604 (4.2)

193.0515 (10.2)

193.0491 (2.2)

[M+Al+2H2O-2H]+ 171.0225 (4.4) 221.0368

(9.5)

[M+Al+H2O+CH3OH-2H]+ 185.0389 (6.0) 235.0525

(8.5)

[M+Al+Cl+H2O-H]+ 188.9897 (2.0) 239.0047

(1.4)

[M+Al+Cl+CH3OH-H]+ 203.0052 (1.2)

203.0036 (7.0)

253.0224 (6.9)

[M+Al+Cl+2H2O-H]+ 207.0011 (5.7)

207.0020 (10.0) 257.0143

(4.9)

[M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+ 221.0127 (13.2) 271.0291

(7.7)

[M+Al+2Cl+H2O]+ 224.9642 (8.2) 306.9698

(5.6)

[2M+Al-2H]+ 245.0374 (6.2) 345.0681

(6.2) 409.0489 (2.4)

[2M+Al+H2O-2H]+ 263.0485 (3.6)

363.0792 (4.2)

[2M+Al+Cl+H2O-H]+ 399.0574 (0.0) 463.0366

(1.1)

[2M+Al+2Cl]+ 417.0236 (0.0)

481.0026 (1.2)

481.0013 (3.9)

[3M+Al-2H]+ 601.0938 (2.8)

[3M+Al+Cl-H]+ 541.1006 (2.4)

[4M+2Al-5H]+ 689.1333 (5.8)

[4M+2Al+H2O-5H]+ 707.1448 (1.6)

a Los valores en negrita indican el ion más abundante.


160


por ESI de los compuestos 21-26 (L) con calcio; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26

[M]+ 160.0517 (1.0)

[M+H]+ 111.0443 (1.9)

161.0606 (5.4)

161.0609 (7.7)

193.0501 (2.7)

193.0501 (2.7)

[M+Ca]++ 116.0025 (5.0)

116.0004 (10.6)

[M+Ca+H2O]++ 125.0067 (3.8)

125.0080 (6.4)

[M+Ca+2H2O]++ 134.0125 (0.4)

134.0130 (3.8)

[M+Ca+3H2O]++ 143.0176 (1.2)

143.0184 (4.9)

[M+Ca+4H2O]++ 152.0229 (0.4)

152.0237 (4.4)

[M+Ca-H]+ 148.9920 (6.5)

148.9907 (1.9)

199.0051 (7.8)

[M+Ca+H2O-H]+ 167.0030 (8.7)

167.0005 (6.1)

217.0172 (0.6)

217.0186 (6.2)

249.0063 (3.0)

[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0113 (4.5)

185.0115 (3.4)

235.0246 (13.5)

235.0278 (16.0)

267.0145 (11.7)

[2M+Ca]++ 130.160 (11.6) 180.0333

(0.5) 212.0231 (0.3)

212.0235 (2.6)

[2M+Ca+H2O]++ 139.0220 (5.8) 189.0388

(1.7) 221.0296 (6.1)

221.0292 (4.0)

[2M+Ca+2H2O]++ 148.0279

(1.1) 198.0443

(2.9) 198.0443

(2.7) 230.0337

(0.5) 230.0351

(6.5)

[2M+Ca+3H2O]++ 239.0387 (0.8)

239.0394 (2.3)

[2M+Ca-H]+ 259.0255 (8.7) 359.0584

(1.8) 423.0392 (1.1)

[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0368 (5.7) 377.0686

(2.8) 377.0673

(6.3) 441.0491

(0.5)

[2M+Ca+2H2O-H]+ 395.0803

(0.2) 459.0587

(2.6)

[3M+Ca]++ 260.0597 (1.4) 308.0433

(2.7) 308.0451

(3.1)

[3M+Ca+H2O]++ 269.0635 (4.4)

317.0495 (0.3)

317.0515 (6.5)

[3M+Ca-H]+ 615.0815 (0.8)

[3M+Ca+H2O-H]+ 633.0927

(1.8)

[4M+Ca]++ 404.0658 (1.3)

404.0683 (7.5)



161

Tabla 4.3. Iones más significativosa observados en los espectros de masa obtenidos por ESI de los compuestos 21-26 (L) con hierro; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26

[M]+ 110.0365 (2.8)

160.0515 (2.2)

160.0513 (3.9)

192.0417 (7.9)

[M+H]+ 111.0427 (12.5)

111.0441 (0.0) 161.0583

(8.8) 193.0495

(0.3) 193.0484

(6.0)

[M+Fe+Cl-2H]+ 198.9251 (3.4)

[M+Fe+Cl+H2O-2H]+ 216.9345 (1.9)

[M+Fe+Cl+H2O-H]+ 267.9581 (1.2)

[M+Fe+2Cl+H2O]+ 335.9233 (4.7)

[2M+H-4H]+ 217.0482

(6.0) 217.0481

(6.8) 317.0807

(0.3)

[2M-2H]+ 218.0554 (8.8) 318.0887

(0.0)

[2M+H-2H]+ 219.0642 (4.3)

319.0956 (2.7)

[M+Fe+2Cl+H2O]+ 253.9166 (11.3)

[M+Fe+H2O-2H]+ 456.0110 (6.2)

[2M+Fe+Cl-4H]+ 306.9446 (4.0)

[2M+Fe+Cl-3H]+ 407.9872

(6.4)

[2M+Fe+Cl-2H]+ 408.9919 (1.4) 472.9707

(2.9)

[2M+Fe+Cl-H]+ 473.9760

(8.3)

[2M+Fe+2Cl]+ 509.9541 (4.9)

509.9566 (4.0)



162


por ESI de los compuestos 21-26 (L) con cobalto; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21b 22c 23 24d 25 26

[M]+ 110.0367 (4.3)

110.0370 (7.0)

160.0522 (2.1)

160.0516 (2.0)

192.0416 (0.4)

192.0407 (5.5)

[M+H]+ 111.0438 (2.2)

111.0447 (5.8)

161.0597 (0.1)

161.0595 (1.5)

193.0505 (4.8)

193.0495 (0.1)

[M+Co+H2O-H]+ 185.9725 (1.6)

185.9729 (3.8) 235.9866

(5.0)

[M+Co+Cl]+ 203.9393 (5.0)

203.9367 (7.8)

253.9573 (13.3) 285.9411

(9.3)

[M+Co+H2O+Cl]+ 221.9496 (3.6) 271.9638

(2.7) 271.9643

(0.9) 303.9534 (3.1)

[2M+Co]++ 221.5079 (1.8)

[2M+Co+H2O]++ 230.5141 (2.3)

[2M+Co+2H2O]++ 239.5987

(0.9)

[2M+Co-H]+ 277.9995

(4.0) 277.9981

(1.0) 378.0297

(0.1) 378.0274

(6.0) 442.0089

(1.0)

[2M+Co+H2O-H]+ 460.0205 (1.3)

[2M+Co+Cl]+ 477.9884 (4.9)

477.9853 (1.6)

[2M+Co+H2O+Cl]+ 495.9975 (1.8)

495.9962 (0.8)

[3M+Co+H2O]++ 326.5341 (2.0)

[3M+Co-H]+ 634.0510 (1.0)

[3M+Co+Cl]+ 670.0268 (2.2)

a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observa también el ion 169.9783 (6.9) de fórmula C6H7O2Co. c Se observa también el ion 169.9780 (4.5) de fórmula C6H7O2Co. d Se observa también el ion 219.9912 (7.8) de fórmula C10H8O3Co. .


163


por ESI de los compuestos 21-26 (L) con cobre; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21b 22 23 24 25 26

[M]+ 160.0524 (3.4)

160.0523 (2.4) 192.0409

(4.2)

[M+H]+ 161.0602 (3.1)

161.0587 (6.5)

193.0514 (9.5)

193.0497 (1.0)

[M+Cu-H]+ 171.9587 (4.3)

171.9581 (0.3)

221.9740 (1.6)

[M+Cu]+ 172.9650 (4.6) 222.9797

(7.8)

[M+Cu+H2O-H]+ 189.9700 (6.8)

189.9694 (4.3)

239.9845 (1.0)

239.9826 (6.7)

271.9775 (12.8)

[M+Cu+H2O]+ 190.9759 (2.6)

240.9906 (6.0)

240.9905 (6.4)

272.9825 (2.3)

272.9800 (6.9)

[2M+Cu-H]+ 281.9935 (4.5)

382.0265 (1.2) 446.0085

(6.3)

[2M+Cu]+ 283.0009 (6.2)

383.0339 (0.0)

383.0321 (4.8)

447.0153 (3.8)

447.0115 (4.7)

[M+2Cu+SO4+H2O-H]+ 348.8498 (0.2)

[M+3Cu+2SO4-H]+ 489.7223 (3.3)

a Los valores en negrita indican el ion más abundante. b Se observan también los iones 170.9514 (7.1) y 186.9618 (5.8) de fórmulas C6H4O2Cu y C6H6O3Cu, respectivamente.


por ESI de los compuestos 21-26 (L) con galio; m/z obs. (error en ppm).

Ion/Compuesto M 21 22 23 24 25 26

[M+H]+ 111.0441

(0.7) 161.0591

(3.6) 161.0594

(1.9) 193.0512

(8.8) 193.0512

(8.9)

[M+Ga-2H]+ 176.9455

(3.5)

[M+Ga+Cl-H]+ 212.9251 (10.4) 262.9386

(0.3)

[M+Ga+Cl+H2O-H]+ 230.9335 (0.3) 280.9477

(4.8)

[M+Ga+2Cl+H2O]+ 266.9124 (8.8) 348.9158

(0.6)

[2M+Ga-2H]+ 286.9820 (3.3)

286.9810 (6.7)

387.0122 (5.4) 450.9920

(4.2)

[2M+Ga+H2O-2H]+ 304.9928 (2.4)

304.9916 (6.3)

405.0248 (5.4)

[2M+Ga+Cl-H]+ 486.9700 (1.1)

[2M+Ga+2Cl]+ 358.9350 (3.7)

458.9580 *

522.9467 (1.1)

522.9490 (3.3)

a Los valores en negrita indican el ion más abundante. * Se observa solapamiento de picos.


164

4.2.2. Estudio de la complejación con calcio de 21-24

La investigación de la complejación diferencial con calcio de los isómeros de

dihidroxiarenos se emprendió por dos caminos. Por un lado, se estudió el efecto de

modificaciones en las condiciones de la solución previo a su introducción en el equipo

y, por otro lado, se analizó el efecto de cambios en la fuente de ionización y en el

transporte de los iones en fase gaseosa. De esta manera, se analizó la influencia de

factores relativos a la fase líquida y a los analitos en solución, y relativos a los iones en

fase gaseosa.

En primer lugar, se investigó el efecto del agregado de cantidades crecientes de

hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) a las soluciones de los compuestos 21-24 con

calcio, manteniendo el resto de las condiciones experimentales invariables. Los

detalles experimentales se encuentran en el capítulo 5 (sección 5.1.2, pág. 208). Este

agregado tuvo como objetivo la titulación parcial de los grupos fenólicos de los

compuestos al ir incrementando el número de equivalentes de la base, para ver luego

el efecto sobre las especies observadas en los espectros de masa.

Los cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de los compuestos 21,

23 y 24 con calcio frente al agregado de cantidades crecientes de TMAOH se pueden

observar en la Figura 4.3. En el caso del resorcinol 22, a diferencia de los otros

compuestos estudiados, se observaron solamente pequeñas variaciones en las

intensidades relativas de las especies por lo que no se graficaron. Como se nota en la

Figura 4.3, luego del agregado de aprox. 1 equivalente de TMAOH las especies

predominantes en los espectros ESI-MS son invariablemente las correspondientes a

los iones aducto monocargados con calcio conteniendo un ligando desprotonado.

Como se puede observar en la Tabla 4.2, estas especies coinciden con las

observadas para el resorcinol 22 en ausencia de TMAOH lo que explicaría la ausencia

de cambios frente al agregado de TMAOH. El aumento en la abundancia relativa de

las especies con el ligando desprotonado ocurrió en detrimento de los iones aducto

dicargados en el caso de los compuestos 21 y 23, y de la molécula protonada, para el

compuesto 24.


165

Figura 4.3. Cambios registrados en los espectros de masa ESI-MS de soluciones de los

compuestos (M) 21, 23 y 24 con calcio en el curso de la adición de TMAOH.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 24

Abu

ndan

cia

Rel

ativ

a (%

)

equiv. TMAOH

[M+H]+

[M+Ca-H]+

[M+Ca+H2O-H]+

[M+Ca+2H2O-H]+

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100 23

Abu

ndan

cia

Rel

ativ

a (%

)

equiv. TMAOH

[M+H]+

[M+Ca-H]+

[M+Ca+H2O-H]+

[M+Ca+2H2O-H]+

[2M+Ca+H2O]++

[2M+Ca+2H2O]++

[2M+Ca+H2O-H]+

[3M+Ca]++

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abu

ndan

cia

Rel

ativ

a (%

)

equiv. TMAOH

[M+Ca-H]+

[M+Ca+H2O-H]+

[M+Ca+2H2O-H]+

[2M+Ca+H2O]++

[2M+Ca+2H2O]++

[2M+Ca+H2O-H]+

21


166

El incremento en las abundancias relativas de las especies desprotonadas (Figura

4.3) resultó consistente con el aumento en la concentración de base (TMAOH). Sin

embargo, estos resultados no permiten explicar la diferencia entre isómeros antes

observada (Tabla 4.2). Las variables que afectan la eficiencia con la cual los iones son

transferidos a la fase gaseosa son parámetros instrumentales, mantenidos constantes

durante los experimentos, y la fuerza iónica de la solución181. Además, para complejos

de metales con ligandos, se agrega el pH, debido a que los complejos, en general,

pueden cambiar su estado de protonación y su carga en solución frente a cambios de

pH. Cabe mencionar que el agregado de TMAOH no sólo modifica el pH de la

solución, sino también la fuerza iónica de la misma, por lo que no es posible discernir

cuál es el efecto de cada una de estas variables en el comportamiento observado.

Por ultimo, se realizaron experimentos con soluciones de catecol 21 y resorcinol 22

con calcio optimizando los parámetros instrumentales de modo de minimizar la energía

suministrada a los iones en fase gaseosa durante su transporte hacia el detector. El

propósito buscado fue limitar la cantidad del gas de colisión presente, así como la

energía impartida por el cuadrupolo, para minimizar las colisiones de los iones, y así

disminuir su energía interna reduciendo la disociación de los mismos. La hipótesis era

que ciertas especies observadas en los espectros podían ser iones fragmento

formados a partir de otros iones. Las condiciones empleadas se detallan en el Capítulo

5 (sección 5.1.1, pág. 205). Los espectros de masa ESI obtenidos en estas

condiciones se muestran en la Figura 4.4. En el Capítulo 5 (Tablas 5.2 y 5.5, págs. 209

y 210) se encuentran más detalles acerca de la identidad de los iones con sus

relaciones m/z y error medidos.

Como se puede notar en los espectros de la Figura 4.4 a) y b), para ambos

compuestos se observan iones aducto dicargados y monocargados, aunque los

primeros son más abundantes para el compuesto 21, mientras que para el compuesto

22 se encuentran en relaciones semejantes, predominando la molécula protonada.

Resulta interesante comparar las especies observadas en este caso con las

registradas en condiciones estándar (Figura 4.4 c) y d)). A partir de dicha comparación

puede verse que las condiciones aquí empleadas resultan en la observación de un

mayor número de especies dicargadas para ambos compuestos, las cuales no habían

sido detectadas para el compuesto 22. Estos indicios sugieren que los iones aducto

dicargados de calcio con 22 se fragmentaban en las condiciones estándar, dando

origen a las especies observadas.


167

[Ca2Cl3]+

186.8271

d)

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

[M+H]+ [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-2)

[M+H]+ 111.0443

[M+Ca+H2O-H]+ 167.0005

c)

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

[xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)

[2M+Ca+2H2O]++ 148.0279

[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0113

[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0368

[M+Ca+3H2O]++ 102.0149

[2M+Ca+2H2O]++ 148.0284

[M+Ca+H2O-H]+ 167.0015

[3M+Ca]++ 185.0355

[2M+Ca-H]+ 259.0272

a)

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

[xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)

[M+Ca+H2O]++ 84.0052

[2M+Ca]++ 130.0175

[2M+Ca+4H2O]++ 157.0325

[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0202

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

b) [M+H]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-3) (y=0-4) [xM+Ca+y(H2O)-H]+ (x=1-2) (y=0-2)

[M+H]+ 111.0422

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Figura 4.4. Espectros de masa ESI-MS obtenidos a partir de soluciones con calcio de

los compuestos isómeros (M) 21 (a) y 22 (b) optimizando los parámetros instrumentales

comparados con los respectivos obtenidos en condiciones estándar (c) y (d).


168

Teniendo presente lo anterior, se procedió a investigar la disociación de una de

estas especies dicargadas, presente en los espectros de masa ESI-MS de ambos

compuestos, [2M+Ca+H2O]++ (m/z 139), con el propósito de adquirir una perspectiva

sobre las vías de disociación de estos iones. Para ello, se seleccionó la masa de dicho

ion aducto y se registraron sus espectros de masa tándem barriendo la energía de

colisión del sistema de referencia laboratorio (Elab) desde 5 a 11 eV usando argón

como gas de colisión. Los espectros de masa CID obtenidos a 8 eV se muestran en la

Figura 4.5. En el Capítulo 5 (Tablas 5.3 y 5.4, págs. 209 y 210) se presentan los

detalles acerca de la identidad de los iones con sus relaciones m/z y error medidos.

Como puede verse en la Figura 4.5, para el compuesto 21 se observaron especies

con moléculas adicionales de agua incorporadas, además de los iones aducto

dicargados que corresponden a pérdidas de moléculas neutras a partir del ion

precursor seleccionado. De manera similar para el compuesto 22, se observaron iones

fragmento monocargados que podrían provenir de un proceso de separación de carga,

la molécula protonada [M+H]+ y el ion aducto con calcio conteniendo agua y un ligando

desprotonado [M+Ca+H2O-H]+. La incorporación de moléculas de agua por parte de

los iones producto (o el ion precursor), podría explicar los iones aducto monocargados

restantes observados en los espectros de masa tándem.

Vale la pena mencionar que la presencia de estos iones aducto conteniendo

moléculas de agua adicionales en los espectros MS/MS podría deberse a la

interacción de los complejos con cantidades traza de agua presentes en la celda de

colisión provenientes de la fuente de ionización134 o más probablemente de la celda de

colisión a través de la línea de argón136. Más allá de estos artefactos, los espectros de

masa tándem revelaron dos tipos de procesos de disociación, conducentes a nuevos

iones aducto dicargados formados por pérdidas neutras, o a especies monocargadas

generadas a través de procesos de separación de carga. Mientras ambos procesos

fueron observados para el compuesto 21, sólo el proceso de separación de carga se

evidenció para el compuesto 22. Es interesante notar que para complejos de calcio

dicargados generados por ESI con otros ligandos como el metanol y la piridina182, ya

se habían observado caminos de disociación similares por CID, es decir, la disociación

por pérdida de ligandos neutros y la separación de carga por transferencia de protones

entre los ligandos.


169

Figura 4.5. Espectros de masa CID del ion aducto con calcio [2M+Ca+H2O]++ (m/z 139)

registrados con una energía de colisión de 8 eV para los compuestos isómeros (M) 21 (a) y

22 (c), mostrando una ampliación (b) del espectro de masa ESI-MS/MS del compuesto 21 .

La alta resolución en la medición de la relación m/z permitió la distinción e

identificación sin ambigüedades de iones de intensidad similar en la vecindad de m/z

111.0 y de m/z 185.0. El primer caso se muestra en la ampliación de la Figura 4.5 b),

donde la molécula protonada es exhibida junto a un ion aducto dicargado. El segundo

[M+Ca+H2O]++ 102.0144

[2M+Ca]++ 130.0180

[M+Ca+2H2O-H]+ 185.0115

a)

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

[M+H]+ [xM+Ca+y(H2O)]2+ (x=1-2) (y=0-4) [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-3)

84.9578

[M+H]+ 111.0425

[M+Ca+3H2O-H]+ 203.0183

c)

0

20

40

60

80

100

[%]

50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 m/z

[M+H]+ [M+Ca+y(H2O)-H]+ (y=0-3)

[M+H]+ 111.037

111.5215 112.0423

0

5

10

15

20

[%]

110.4 110.6 110.8 111.0 111.2 111.4 111.6 111.8 112.0 112.2 m/z

b)

[M+Ca+2H2O]++ 111.017

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a In

ten

sid

ad r

elat

iva

Inte

nsi

dad

rel

ativ

a


170

caso se vuelve evidente al observar el ion aducto dicargado [3M+Ca]++ y el

monocargado [M+Ca+2H2O-H]+ en las Figuras 4.4 a) y 4.5 a), respectivamente.

En definitiva, a partir de la optimización de los parámetros instrumentales de

transporte de los iones, se pudieron observar por primera vez iones aducto con calcio

dicargados para el resorcinol. La selección de esos iones para realizar experimentos

CID originó especies monocargadas, por un proceso de separación de carga, que

resultaron consistentes con los iones observados en los espectros de masa

registrados en las condiciones experimentales estándar (menos suaves). Por otra

parte, si bien el catecol mostró iones producto producidos por separación de carga en

menor abundancia, bajo las mismas condiciones también se observaron pérdidas de

ligandos neutros entre los caminos de disociación. Por lo tanto, esto sugiere que las

diferencias observadas entre isómeros frente a la complejación con calcio podrían

deberse a diferentes barreras energéticas en los caminos de disociación de los iones

aducto dicargados formados con calcio.

Luego, para lograr un entendimiento de las energías involucradas en los procesos

mencionados y las diferencias observadas entre ambos compuestos isómeros, se

estudiaron los caminos de disociación en mayor profundidad por cálculos

computacionales (sección 4.4), emprendiendo antes, en la sección 4.3, el estudio

estructural de los clusters dicargados de catecol con calcio.

4.3. Estudio estructural de los clusters de catecol con calcio en fase gaseosa

El catecol 21 y sus derivados se presentan como metabolitos intermediarios

durante la degradación de compuestos aromáticos sintéticos y naturales183, siendo

ubicuos en la química biológica actuando como dadores de electrones o agentes

complejantes184, o como quelantes fuertes de metales de transición185. Por este

motivo, en la literatura se pueden encontrar estudios de las interacciones de metales

con catecol, en solución para el aluminio(III)186,187, en el estado sólido para Ag(I)188, en

solución y en fase sólida para Ni(II)189, por cálculos de química cuántica y estudios en

solución para Pb(II)190 y por espectrometría de masa y estudios en solución para

Fe(III)191, por mencionar algunos de los ejemplos descritos en la literatura.

Sin embargo, el sistema catecol-calcio no ha sido estudiado aún en fase gaseosa

aunque hay estudios recientes en solución que se han concentrado en el efecto del


171

calcio(II) sobre las propiedades ácido base y rédox del catecol192,193. Por otro lado, se

ha observado a partir de la comparación de cálculos computacionales con datos

experimentales obtenidos en un espectrómetro de masa a alta presión194, que la

protonación en fenoles, como el catecol y resorcinol, generalmente ocurre en posición

para al grupo hidroxilo. También se estudiaron complejos obtenidos por ESI de

dipéptidos de fenilalanina con Ca(II)195 y se han propuesto motivos de unión que

involucran interacciones -catión metálico. La motivación del presente estudio reside

en entender las propiedades complejantes del catecol hacia este metal, en particular,

su modo de coordinación (mono o bidentado), la presencia de tautómeros y el número

de coordinación del metal.

La aplicación de la metodología de cálculo computacional previamente empleada

en la sección 2.5 (pág. 56) para los complejos de calcio de N-óxidos de hidroxipiridina,

arrojó numerosas estructuras posibles en el caso de los complejos de catecol con

calcio. Para el análisis de estos sistemas, el empleo de la espectroscopía IRMPD

(Apéndice A.5, pág. 262) resulta imprescindible ya que puede brindar información

estructural directa, permitiendo la asignación correcta y correlación de estructuras

calculadas en fase gaseosa con las observadas en los espectros de masa. En las

regiones espectrales de 800-2000 cm-1, conocida también como zona de la huella

digital, y 3000-3800 cm-1, donde se encuentran los modos de estiramiento O-H, se

presentan bandas de absorción IR asociadas con modos vibracionales del catecol. Por

consiguiente, es esperable observar en los complejos de catecol con calcio, ligeros

corrimientos en las señales que sean característicos del modo de coordinación al

catión metálico. En consecuencia, resulta necesario estudiar la molécula neutra de

catecol libre en primer lugar.

4.3.1. Estudio preliminar de catecol libre

El espectro IR experimental del catecol en fase gaseosa (Figura 4.6) fue tomado

de la base de datos de NIST196. En la Tabla 4.7 se enumeran las frecuencias de las

bandas medidas (señaladas A-J), así como sus asignaciones. Algunas fueron

tomadas de asignaciones previas del catecol197, mientras otras fueron adaptadas de la

literatura más reciente consultada usando la notación de Wilson198 (Anexo 2, pág. 266)

para derivados de bencenos monsustituídos. Aunque la espectroscopía IRMPD


172

acoplada a MS no puede brindar datos experimentales correspondientes a especies

neutras como el catecol libre, los estudios computacionales pueden proveer resultados

útiles a fines comparativos. De manera similar a lo realizado en la sección 2.3.1, a

partir del estudio conformacional del catecol fueron calculadas varias estructuras al

nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Este conjunto de funciones base, que presenta

orbitales tanto polarizados como difusos, ha probado ser adecuada para investigar

esta clase de sistemas199. Los espectros IR calculados de los dos confórmeros de

menor energía del catecol 21a y 21b se muestran en la Figura 4.6. Las estructuras

calculadas mostraron los grupos hidroxilo coplanares con el anillo aromático pero con

diferencias en su orientación espacial, estando caracterizado el confórmero de menor

energía 21a por una orientación de uno de los hidrógenos de un grupo hidroxilo hacia

el otro aunque sin presentar una interacción por puente de hidrógeno de acuerdo a los

estudios realizados que aparecen en la literatura200,201.

Figura 4.6. Comparación del espectro IR en fase gaseosa del catecol196 con los espectros

IR lineales calculados para sus dos confórmeros más estables, obtenidos al nivel de teoría

B3LYP/6-311+G(d,p), junto a las estructuras y diferencias de energía entre las mismas.

1000 1200 1400 1600 1800

0

100

200

300

0

50

100

150

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

número de onda / cm-1

21b

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21a

Abs

orba

ncia

/ u.

a. NIST

C

D

EF

G

HI

J

3400 3500 3600 3700 3800

0

100

200

300

0

50

100

150

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1


21b

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21a

Abs

orba

ncia

/ u.

a. NIST

AB

0.0 kcal mol-1

4.1 kcal mol-1


173

Cabe mencionar que las frecuencias vibracionales calculadas fueron escaladas por

un factor de 0.98 y 0.95, en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H

respectivamente, para su comparación con los espectros IR experimentales. Estos

valores de escalado son similares a otros previamente determinados para mejorar la

concordancia entre las frecuencias de absorción calculadas y observadas

experimentalmente202 y también entre los espectros de absorción IR calculados y los

obtenidos experimentalmente por espectroscopia IRMPD203,204.

Tabla 4.7. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol196 comparadas con los

valores de los confórmeros calculados al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p).

Modo vibracionala

21b b calc / cm-1 21a b calc / cm-1

catecol c, exp / cm-1 (exp-calc21a)

/ cm-1

σOH 3644 (113) 3659 (82) 3658 A -1

σOH 3645 (17) 3602 (104) 3602 B 0

σCC (9a) 1623 (18) 1618 (24) 1608 C

-10

σCC (9b) 1603 (37) 1613 (28) -5

σCC(18b) 1517 (113) 1509 (127) 1508 D -1

σCC (18a) 1463 (25) 1473 (32)

σCC (15) 1345 (51) 1363 (26) 1354 E -9

βCOH 1335(11) 1330 (49) 1316 F -14

σCO (C1-O1) 1276(169) 1270 (183) 1258 G

-12

σCO(C2-O2) 1249 (26) 1238 (106) 20

βCOH 1166 (296) 1179 (43) 1190 H 11

βCH(8b)

βOH 1143 (84) 1158 I 15

βCH(19a) βOH

1082 (70) 1084 (76) 1094 J 10

a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v, asignadas consistentemente en la Ref 198 y adaptadas para catecol. b Frecuencias harmónicas escaladas por 0.98 en el rango de la huella digital y por 0.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol-1 están entre paréntesis. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6, asignadas sobre la base de las Ref. 197 y 198.

Las bandas de estiramiento de O-H del catecol (bandas A y B) observadas en la

Figura 4.6, resultaron señales diagnósticas de la presencia del confórmero 21a. Es

importante notar que la separación entre las bandas (56 cm-1) fue reproducida


174

satisfactoriamente por la simulación computacional realizada. Otras dos bandas

observadas para el catecol a 1158 (I) y 1316 cm-1 (F) resultaron características del

confórmero 21a, con dos bandas predichas a 1143 y 1330 cm-1, asignables a los

modos de flexión de O-H, C-H y C-O-H (βOH βCH y βCOH, respectivamente). Estos modos

podrían ser rasgos útiles más adelante para diferenciar entre ambas conformaciones

del catecol en los complejos con calcio. El confórmero 21b, que tiene una energía 4.1

kcal mol-1 por encima del confórmero 21a, mostró un espectro muy similar (Figura 4.6)

pero con un hombro menos prominente a 1330 cm-1 y bandas agudas a 1166 y 1276

cm-1, que no coincidieron con el perfil del espectro experimental, aunque no se puede

descartar una contribución minoritaria de este confórmero.

Las frecuencias vibracionales de catecol determinadas al nivel B3LYP/6-

311+G(d,p) para el confórmero más estable 21a (Tabla 4.7), concordaron con los

valores experimentales, siendo la diferencia media entre las frecuencias escaladas y

las experimentales próxima a 9 cm-1. Cabe mencionar que los anchos de banda en el

espectro experimental (tomado en un GC/MS/IRD196) fueron típicamente de 20 cm-1 y

algunas señales no se resolvieron bien. En la zona de la huella digital, todas las

frecuencias calculadas concordaron dentro de los 20 cm-1 con los valores

experimentales disponibles.

4.3.2. Espectros IRMPD de los complejos con calcio microhidratados

Los complejos dicargados de calcio compuestos por dos ligandos de catecol más

una o dos moléculas de agua fueron examinados por espectroscopía IRMPD en la

celda de un espectrómetro de masa FT-ICR de 7 Tesla con 2 láseres pulsados

infrarrojos. Estos iones aducto dicargados formados a partir de catecol y calcio(II)

fueron producidos en la fase gaseosa empleando ESI, que de igual modo a como se

ve en la Figura 4.4 a (pág. 167), fueron los iones más abundantes en los espectros de

masa registrados. Los espectros IRMPD de estos iones en fase gaseosa fueron

medidos en la zona de 3450-3750 cm-1 (región de estiramiento de O-H) realizando un

barrido con un sistema láser infrarrojo oscilador / amplificador paramétrico óptico

(OPO/OPA), y en el rango espectral de 900-1700 cm-1 (huella digital) usando el haz

intenso del láser de electrones libres (FEL) de “Centre δaser Infrarouge d’Orsay”

(CLIO) (Capítulo 5, pág. 206).


175

Los iones, seleccionados por su relación m/z, fueron irradiados en la trampa del

ICR, ya sea por el IR-FEL o el OPO/OPA, por 0.25 s o 1-2 s, respectivamente. Cuando

el láser se sintoniza a una transición vibracional, son absorbidos múltiples fotones por

los iones en un proceso progresivo hasta que alcanzan el umbral de disociación

(Apéndice A.5, pág. 262). Registrando las intensidades del ion precursor seleccionado

y de los iones fragmento, en función del número de onda del láser, se calculó la

proporción subsistente (SY) (Apéndice A.3, pág. 260). El espectro IRMPD fue obtenido

al graficar el rendimiento de IRMPD, calculado como el logaritmo natural de la inversa

de SY, en función del número de onda del láser. Los únicos canales de fragmentación

observados como consecuencia de la absorción IR de los iones correspondieron a la

pérdida secuencial de moléculas de agua presentes en los iones aducto.

Los espectros IRMPD medidos en fase gaseosa de los iones aducto dicargados

[Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)]2+ en las regiones de la huella digital y de

estiramiento O-H, se muestran en las Figuras 4.7 y 4.8 respectivamente. Al comparar

los espectros de las Figuras 4.7 y 4.8 de ambos iones puede notarse un perfil casi

idéntico con bandas ligeramente corridas al rojo al pasar de [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ a

[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Sin embargo, resulta interesante notar la ausencia de la banda

A en la Figura 4.8 b).

Sobre la base de investigaciones recientes de espectrocopía IR en fase gaseosa

de cationes metálicos solvatados con agua puede realizarse una primera

interpretación de las características observadas. La coordinación de agua a un catión

metálico induce un corrimiento al rojo de los estiramientos simétrico (sim) y

antisimétrico (asim) del O-H con respecto a sus posiciones en la molécula de agua

libre (3657 y 3756 cm-1, respectivamente)205,206. Este desplazamiento al rojo

evidenciado para numerosos sistemas metálicos microhidratados207,208 puede ser

interpretado como el resultado de una transferencia electrónica parcial desde la

molécula de agua al catión metálico209.

Al adicionarse más moléculas de agua al metal y alcanzarse el máximo número de

coordinación, puede anticiparse la competencia entre la coordinación directa al catión

metálico y la formación de enlaces de hidrógeno agua-agua. Para el catión metálico

Ca(H2O)n2+ , no hay evidencia de la formación de enlaces de hidrógeno para n ≤ 6,

habiéndose observado la aparición de una banda ancha a frecuencias menores a 3500

cm-1 en el espectro IR para n = 7 como resultado de la formación de estructuras con


176

enlaces de hidrógeno entre moléculas de agua de la primer y segunda esferas de

coordinación210. Desde n = 1 a 6, fue observada una disminución progresiva del

corrimiento al rojo de las bandas sim y asim para Ca(H2O)n2+, lo cual resulta

consistente con una reducción en la transferencia de carga desde cada molécula de

agua al ion metálico, al aumentar la solvatación del mismo.

Vale la pena notar que los mismos argumentos discutidos más arriba se aplicarían

de manera similar para los modos de estiramiento de los hidroxilos σOH de los ligandos

de catecol coordinados al catión metálico. De manera análoga, las bandas observadas

en la región de la huella digital para los dos complejos que se muestran en la Figura

Figura 4.7. Espectro IRMPD en fase

gaseosa en la región de la huella digital de

los iones a) [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y b)

[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Las líneas en rojo

punteadas corresponden a bandas de

absorción de catecol libre mostrado en la

Figura 4.6.

Figura 4.8. Espectros IRMPD en fase

gaseosa en la región de estiramiento O-H

de los iones a) [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ y b)

[Ca(catecol)2(H2O)]2+. Las líneas en rojo

punteadas corresponden a los estiramientos

de catecol libre y en azul a los modos

simétrico y antisimétrico de agua libre.

800 1000 1200 1400 1600 1800

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

E

E

C

Ren

dim

ient

o IR

MP

D /

u.a.


b)

CD

F

GH

IJ

D

F

GH

J

Ren

dim

ient

o IR

MP

D /

u.a. a)

3400 3500 3600 3700 3800

0

1

2

0

1

2

Ren

dim

ient

o IR

MP

D /

u.a.

númeo de onda / cm-1

Bb)

Ren

dim

ient

o IR

MP

D /

u.a. B

A

a)


177

4.7, reducen su desplazamiento al rojo (respecto del catecol libre) con el aumento en

el número de coordinación del metal. Al interactuar ligandos adicionales con el metal,

la distribución se torna más simétrica, disminuyendo así el efecto individual de las

interacciones sobre cada ligando.

Teniendo en cuenta lo anterior, y anticipando corrimientos al rojo de los modos

vibracionales en la región de estiramiento del O-H respecto de agua libre, es

interesante notar que la banda A de la Figura 4.8 a), puede tentativamente ser

asignada como el modo de vibración asim de las moléculas de agua coordinadas al ion

metálico. Esta banda que no se observó para el ion [Ca(catecol)2(H2O)]2+ en la Figura

4.8 b), tampoco fue observada en los espectros IRMPD210 de Ca(H2O)42+ y Ca(H2O)5

2+,

volviéndose visible recién para Ca(H2O)62+.Por otra parte, la banda B puede asignarse

al modo de vibración sim de la molécula de agua coordinada al metal, así como a los

modos de estiramiento σOH de los hidroxilos de los ligandos de catecol.

En la Figura 4.8 a, se observa además que la banda B es mucho más intensa que

la A. Una relación semejante entre las intensidades relativas de las bandas asim y sim,

en función del número de coordinación del metal fue observada también para otros

metales de transición divalentes hidratados207. Estos patrones de intensidad podrían

interpretarse en términos de procesos de redistribución vibracional intramolecular

(IVR), como fue propuesto en conexión con iones amonio hidratados211. En un sistema

catión metálico-agua, a partir de la excitación de sim, el átomo de oxígeno se mueve a

lo largo del enlace metal–OH2 y la activación de este enlace permitiría así la

fragmentación subsecuente. Por otro lado, como el átomo de oxígeno se mueve

perpendicular a este enlace a partir de la excitación de asim, la fragmentación inducida

por IR debería ocurrir a través del acoplamiento con otros modos vibracionales. Esta

consideración mecanística sugiere que la eficiencia del acoplamiento a los otros

modos vibracionales podría ser origen de desviaciones entre las intensidades de

absorción esperadas en el IR y los rendimientos de IRMPD registrados.

Para identificar y hacer una asignación tentativa de las diferentes bandas exhibidas

en la Figura 4.7 a) y b), se utilizaron las designaciones C-J empleadas previamente

para el catecol libre (Tabla 4.7). Las frecuencias de las bandas junto a sus

asignaciones se listan en la Tabla 4.8. Las bandas que, en principio, podrían resultar

más relevantes para la caracterización estructural son aquellas asignables a los

modos de estiramiento (G) y flexión (E, F y H) del C-O (σCO y βCOH, respectivamente)


178

en contraposición con los modos de estiramiento C-C (σCC) y los modos de flexión de

C-H (βCH). Esto se debe a que se espera que la coordinación al catión metálico ocurra

a través de los átomos de oxígeno, por lo que el mayor efecto se encontraría en los

modos de vibración involucrando estos átomos. De hecho, se observa que el mayor

desplazamiento al rojo respecto al catecol libre ocurrió para la banda G (asignada al

modo de estiramiento C-O σCO). Para confirmar las asignaciones vibracionales de las

transiciones observadas en los espectros IRMPD se realizaron cálculos

computacionales. A pesar de su naturaleza multifotónica, el espectro IRMPD refleja

predominantemente la absorción del primer fotón (Apéndice A.5, pág. 262). Esta

observación justifica una comparación del espectro IRMPD experimental con los

espectros de absorción IR de un fotón.

Tabla 4.8. Frecuencias vibracionales experimentales de catecol196 comparadas con la

de los iones aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+.

Modo vibracionala

[Ca(catecol)2(H2O)2]2+ exp

b / cm-1

[Ca(catecol)2(H2O)]2+ exp b

/ cm-1 catecol exp

c / cm-1

σCC (9a) 1636 [17] C 1646 [12] C 1608 C

σCC (9b)

σCC(18b) σCC(18a)

1495 [20] D 1489 [10] D 1508 D

σCC (15) 1306 [18] E, F 1300 [15] E, F

1354 E

βCOH 1316 F

σCO 1234 [18] G 1225 [16] G 1258 G

βCOH 1203 [20] H 1198 [17] H 1190 H

βCH(8b)

βOH 1157 I 1158 I

βCH(19a) βOH

1080 [15] J 1071 [10] J 1094 J

a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v asignadas consistentemente en la Ref 198 y adaptadas para las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm-1) está entre corchetes. c Frecuencias de las señales a partir del espectro de la Figura 4.6 asignadas sobre la base de las Ref. 197 y 198.


179

4.3.3. Estructuras de los clusters de calcio(II) con catecol microhidratados

Se emplearon resultados previos de espectroscopía IR informados para el catecol

libre197 y derivados de catecol como la dopamina212, así como clusters de calcio(II) con

agua210 como guías para comenzar los cálculos. Una exploración exhaustiva de la

superficie de energía de potencial de los iones aducto está fuera del objetivo de este

trabajo y la meta es más bien determinar el perfil IR de distintos motivos de unión que

pueden anticiparse para estos clusters con el fin último de conocer sus estructuras

para explicar los espectros de masa. Como aproximación a las estructuras de los

clusters microhidratados de calcio con catecol, inicialmente se consideraron complejos

consistentes en un único ligando de catecol coordinado al catión metálico. Esta

simplificación apuntó a examinar y comparar estructuras que presentaran distintos

motivos de unión al metal así como posibles tautómeros del ligando. La ocurrencia de

tautómeros debió ser considerada en complejos de Pb(II) con nucleobases213 para dar

cuenta de los resultados experimentales IRMPD de los complejos generados por ESI y

por este motivo fueron tenidos en cuenta.

Los espectros IR calculados se muestran en la Figura 4.9 en orden creciente de

energía para las ocho estructuras optimizadas 21Ca-21Ch. Las tres estructuras de

menor energía (21Ca, 21Cb y 21Cc) resultaron ser tautómeros ceto-enólicos de la

estructura 21Cd, en los que al menos uno de los grupos hidroxilo aparece

desprotonado (en su forma ceto) y el protón se encuentra sobre un átomo de carbono

en posición orto o para respecto a este grupo. En las cuatro estructuras 21Ca-21Cd,

ambos átomos de oxígeno coordinan al calcio, es decir, el ligando se coordina al metal

de modo bidentado. Por otra parte, las estructuras 21Cg y 21Ch que presentan una

coordinación similar pero en las cuales ambos grupos hidroxilo están desprotonados

resultaron ser las de mayor energía, mientras que las estructuras 21Ce coordinada a

través de un único átomo de oxígeno y 21Cf mostrando una interacción -catión

metálico195 exhibieron valores de energía intermedios.


180

1000 1200 1400 1600 1800

0

200

400

600

800

0

200

400

0

200

400

0

200

400

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1


21Ch

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cg

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cf

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Ce

3400 3500 3600 3700 3800

0

200

400

600

800

0

200

400

0

200

400

0

200

400

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1


21Ch

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cg

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cf

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Ce 25.2 kcal mol-1

25.7 kcal mol-1

31.3 kcal mol-1

32.9 kcal mol-1

1000 1200 1400 1600 1800

0

200

400

0

200

400

6000

200

400

600

800

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1


21Cd

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cc

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cb

Inte

nsid

ad/

km.m

ol-1

21Ca

3400 3500 3600 3700 3800

0

200

400

0

200

400

6000

200

400

600

800

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1


21Cd

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cc

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Cb

Inte

nsid

ad /

km.m

ol-1

21Ca 0.0 kcal mol-1

3.2 kcal mol-1

4.3 kcal mol-1

8.1 kcal mol-1

Figura 4.9. Comparación de los espectros IR lineales calculados para ocho complejos

dicargados de catecol con calcio 21Ca-21Ch al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) junto a

las estructuras y diferencias de energía relativa entre las mismas. Las líneas en rojo

corresponden a algunas de las bandas de absorción de los iones aducto

[Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ de las Figuras 4.7 y 4.8.


181

El análisis de los espectros IR de la Figura 4.9 reveló como mejor candidato en una

primera aproximación a la estructura 21Cd, al tener en cuenta las frecuencias de las

bandas previamente observadas en los espectros IRMPD obtenidos para los iones

aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ (Figuras 4.7 y 4.8). Más aún,

puede notarse que en aquellas estructuras que presentaban un tautómero ceto del

catecol coordinado al calcio (21Ca, 21Cb, 21Cc, 21Cg, y 21Ch), aparecieron picos

agudos en el rango de 1500-1700 cm-1 correspondientes al modo de estiramiento C=O

(σC=O). Sobre la base de la ausencia de bandas que evidencien este modo en los

espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, se pueden descartar en principio,

estructuras conteniendo tautómeros ceto del catecol. De manera similar, la presencia

de dos bandas intensas en la región de estiramiento O-H, exhibidas por las estructuras

donde el catecol no se encuentra coordinado de modo bidentado (21Ce y 21Cf),

sugeriría que la presencia de estos motivos de unión resulta poco probable.

Contando con los resultados anteriores, se procedió a incorporar las moléculas de

agua y el ligando adicional de catecol a la estructura 21Cd, generando así nuevos

candidatos a estructuras para los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol

denotados 21D y 21E, respectivamente. Considerando estudios previos realizados con

iones metálicos solvatados con agua, como calcio210,214 y magnesio215,216, pueden

anticiparse los diferentes motivos que caracterizan el arreglo de las moléculas de

agua. De acuerdo al número de coordinación (NC) del calcio, 3, 4, 5 o 6, pueden

esperarse estructuras con geometrías trigonal, tetraédrica, piramidal cuadrada u

octaédrica, respectivamente. En la Figura 4.10 pueden observarse las distintas

geometrías que se encontraron para 21D y 21E. Algunos de los ángulos de enlace

más relevantes de las estructuras de los complejos microhidratados dicargados con

calcio y dos ligandos de 21 se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.20, pág. 252).

Como se observa en la Figura 4.10, las estructuras más estables para cada cluster

microhidratado (21Da y 21Ea) resultaron aquellas en las que las moléculas de agua se

encuentran directamente unidas al Ca(II) con ambos ligandos de catecol coordinados

de manera bidentada, alcanzándose así el máximo NC del metal. Las estructuras de

mayor energía del cluster monohidratado, 21Db y 21Dc, exhibieron un puente de

hidrógeno interligando entre la molécula de agua y un grupo hidroxilo, como lo

evidenciaron las distancias relativamente cortas entre ellos (1.62 Å y 1.76 Å para 21Db

y 21Dc, respectivamente). La formación de estos puentes de hidrógeno requiere un

reordenamiento dentro de la esfera de coordinación del metal, reduciéndose así el NC


182

de 5 a 4. Para el cluster dihidratado, fueron caracterizadas dos estructuras, 21Ea y

21Eb, con un NC de 6, difiriendo únicamente en la configuración de los ligandos. Las

longitudes de enlace en estas estructuras resultaron esencialmente similares, como se

observa en la Figura 4.10. La estructura optimizada de menor energía (21Ea) puede

ser considerada como una geometría octaédrica distorsionada, donde ambas

moléculas de agua se encuentran adyacentes, constituyendo por tanto el isómero cis.

Por otro lado, la estructura de mayor energía (21Eb) resultó más simétrica con las dos

moléculas de agua en lados opuestos del átomo metálico central, resultando entonces

el isómero trans.

Los espectros IR calculados de las estructuras correspondientes a los clusters

microhidratados (Figura 4.10) fueron comparados con los espectros IRMPD

experimentales de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ en las Figuras 4.11 y

4.12, respectivamente. A partir de la comparación de los espectros calculados de las

estructuras 21Da, 21Db y 21Dc con el espectro experimental de [Ca(catecol)2(H2O)]2+

(Figura 4.11), resulta claro que éste se encuentra mejor reproducido por el de la

estructura 21Da, que además resulta la estructura más favorecida a priori por su

menor energía respecto de las otras (Figura 4.10). Por otra parte, en la Figura 4.12 se

nota que los rasgos predichos tanto por la estructura 21Ea como 21Eb (ligeramente de

mayor energía), reproducen bien los espectros experimentales IRMPD del ion aducto

[Ca(catecol)2(H2O)2]2+. Resultó llamativo no encontrar diferencias entre los espectros

IR de estos isómeros cis/trans en la región de 1000-4000 cm-1, donde las bandas

están asociadas con los modos vibracionales de los ligandos. Tal vez, a menores

frecuencias podrían encontrarse diferencias en la configuración de 21Ea y 21Eb, por

ejemplo, en la región entre 400-500 cm-1.

Las asignaciones de las frecuencias vibracionales de las estructuras calculadas

21Da, 21Ea y 21Eb se listan en la Tabla 4.9. En general, las desviaciones observadas

entre las posiciones de los máximos de las bandas experimentales respecto a las

frecuencias de los modos más intensos que contribuyen a las mismas fueron menores

a 20 cm-1 en las regiones de la huella digital y de estiramiento O-H, como se nota en la

Tabla 4.9.

Diferen

ciación

de d

ihid

roxiaren

os

Cap

ítulo

4

18

3

Figura 4.10. Estructuras (con grupos de simetría puntual) de los clusters mono y dihidratados de calcio con catecol optimizados al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Las energías relativas a 0 K (mostradas entre paréntesis) estan en kcal mol-1 y las longitudes de enlace estan en Å.


184

Figura 4.11. Espectros de absorción IR de las estructuras 21Da, 21Db y 21Dc optimizados al

nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) comparados con el espectro IRMPD de

[Ca(catecol)2(H2O)]2+ (en negro).

Figura 4.12. Espectros de absorción IR de las estructuras 21Ea y 21Eb optimizados al nivel de

teoría B3LYP/6-311+G(d,p) comparados con el espectro de IRMPD de [Ca(catecol)2(H2O)2]2+

(en negro).

1000 1200 1400 1600 1800

0

200

400

600

0

200

400

600

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

u.a.


21Dc

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Db

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Da

3400 3500 3600 3700 3800

0

200

400

600

0

200

400

600

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

u.a.

número de onda / cm-1)

2c

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Db

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Da

1000 1200 1400 1600 1800

0

200

400

600

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

u.a.


21Eb

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Ea

3400 3500 3600 3700 3800

0

200

400

600

0

200

400

600

Inte

nsid

ad /

u.a.


21Eb

Inte

nsid

ad /

u.a.

21Ea


185

Tabla 4.9. Frecuencias vibracionales experimentales de los iones aducto

[Ca(catecol)2(H2O)]2+ y [Ca(catecol)2(H2O)2]2+ (espectros IRMPD) comparadas con los

valores de las estructuras más estables (21Da, 21Ea y 21Eb) calculados al nivel de

teoría B3LYP/6-311+G(d,p).

Modo vibracionala

[Ca(catecol)2(H2O)]2+ exp b/ cm-1

21Da c calc / cm-1

[Ca(catecol)2(H2O)2]2+

exp b/ cm-1

21Eac calc / cm-1 21Eb c calc / cm-1

asim H2O 3638 (197)

3681 [12] A 3655 (352) 3661 (354)

sim H2O 3606 [20] B

3597 (556) 3613 [20] B

3606 (514) 3604 (513)

σOH 3574 (141) 3586 (228) 3590 (190)

b H2O 1646 [12] C

1645 (138) 1636 [17] C

1639 (257) 1636 (271)

σCC (9b) 1601 (10) 1603 (12) 1603 (12)

σCC(18b)

1489 [10] D 1505 (164)

1495 [20] D 1506 (174) 1506 (175)

σCC (18a) 1477 (42) 1475 (47) 1477 (47)

σCC (15) βCOH

1300 [15] E, F 1334(178)

1306 [18] E, F 1333 (169) 1333 (171)

σCO 1225 [16] G

1238 (74) 1234 [18] G

1243 (106) 1236 (571)

βCH(19b) 1231 (553)

1236 (427)

βCOH 1198 [17] H 1206 (317)

1203 [20] H 1202 (419) 1202 (398)

βCH(14)

1157 I 1168 (14) 1168 (12)

βCH(19a) 1071 [10] J

1083 (107) 1080 [15] J

1086 (97) 1087 (119)

βOH 1075 (17) 1081 (28) a Todos los modos son vibraciones en el plano de acuerdo a la notación de Wilson (ni) (Anexo 2, pág. 266) para moléculas de bencenos monosustituídos con simetría C2v asignadas consistentemente en la Ref. 198 y adaptadas a las especies en estudio. b El ancho de las bandas (en cm-1) está entre corchetes. c Frecuencias armónicas escaladas por 0.98 en el rango de la huella digital y por 0.95 en el rango de estiramiento OH. Las intensidades calculadas de IR en km mol-1 están entre paréntesis.

La banda del espectro IRMPD próxima a 1300 cm-1 resultó ser la peor reproducida

por los cálculos DFT, con frecuencias de absorción calculadas mayores que las

encontradas experimentalmente. Cabe mencionar que el modo que aparece en esta

zona (σCC (15)) ha sido calificado como “problemático” en estudios realizados con el

fenol217. En este modo predominan contribuciones de las vibraciones de estiramiento

C-C y la molécula se distorsiona en el plano conduciendo a una estructura de Kekule

del anillo de benceno, alterando así marcadamente la densidad electrónica entre

átomos de carbono. Curiosamente, cuando fueron comparados los espectros IRMPD

de complejos de salicilato de calcio218 con espectros IR calculados usando varios

funcionales DFT, así como diferentes conjuntos de funciones base, también se


186

observaron las mayores desviaciones en la región próxima a 1300 cm-1. A pesar de

esto, la elección del funcional B3LYP y la base 6-311+G(d,p) mostró el mejor

compromiso entre la precisión en la predicción de las frecuencias vibracionales y el

costo computacional lo que avala nuestra elección y sustenta los resultados obtenidos

para catecol.

Al comparar las asignaciones de los modos vibracionales realizada previamente

considerando el catecol libre (Tablas 4.7 y 4.8) con aquellas predichas para las

estructuras más estables de los clusters (Tabla 4.9) puede notarse que la identidad de

las asignaciones de los modos vibracionales no difiere, excepto por la banda C que

aparece a ~1640 cm-1, correspondiente en forma predominante al modo de flexión del

agua (b) y la banda I que aparece a ~1160 cm-1 para [Ca(catecol)2(H2O)2]2+, donde la

identidad del modo de estiramiento es distinta. Esto último no resulta inesperado dado

que esta banda (I) fue identificada sólo en un confómero de catecol (21a), que además

no corresponde a la geometría que adopta el catecol en las estructuras de los clusters.

De todos modos, las asignaciones tentativas a partir de la comparación directa del

espectro infrarrojo del ligando libre son bastante satisfactorias como primera

aproximación al proporcionar resultados similares que los obtenidos a partir de las

estructuras calculadas.

En términos generales, los espectros de absorción IR calculados para las

estructuras de menor energía de los iones aducto estudiados coincidieron bastante

bien con sus espectros IRMPD obtenidos experimentalmente, permitiendo así su

caracterización estructural así como la asignación de las bandas de absorción en el IR.

De esta manera, se encontró que las geometrías de los iones aducto microhidratados

de calcio(II) con catecol se caracterizaron por presentar el mayor número de

coordinación posible sobre el metal, con los ligandos de catecol coordinados de forma

bidentada y sin evidencia de tautomerización en la estructura de los mismos.

Al intentar repetir los experimentos de espectroscopía IRMPD utilizando resorcinol,

en lugar de catecol, y calcio en las mismas condiciones experimentales (Capítulo 5,

pág. 206), no se obtuvo ninguna señal de los iones aducto dicargados lo cual impidió

su estudio por IRMPD. Por este motivo, las estructuras sugeridas para los iones

aducto con calcio y resorcinol en la sección 4.4, son propuestas de modo tentativo.


187

4.4. Análisis de la disociación de los clusters por simulación computacional

El proceso de reducción o separación de cargas169 puede ocurrir por CID, a lo largo

de la desolvatación en la fuente API o por influencia del solvente219. Esto se observa

cuando un ion múltiplemente cargado deja de ser capaz de estabilizar su carga, lo cual

ocurre por ejemplo al disminuir el número de moléculas de solvente en su esfera de

solvatación220. La desestabilización de la carga puede eventualmente conducir a la

reducción de carga del ion por transferencia de un protón a uno de los ligandos, como

se ejemplifica en la ecuación 4.1 para la reducción de carga de un metal dicargado

microhidratado:

[M(H2O)n]2+ → [M(OH)(H2O)n-2]

+ + [H3O]+ (4.1)

Debe observarse que la reducción de carga se logra por una separación de cargas

mientras que el estado de oxidación del metal permanece invariable. La reacción de

transferencia protónica interligando, de acuerdo a la ecuación (4.1), fue explorada en

detalle por cálculos computacionales para los complejos de calcio221, [Ca(H2O)2]2+,

proponiéndose que la reacción procedía a través de un mecanismo en el cual el primer

paso corresponde a la migración de una molécula de agua desde la esfera de

solvatación interna a la externa. Recientemente, fueron determinados

experimentalmente por primera vez222 los valores umbrales energéticos de este

proceso de separación de cargas en fase gaseosa a partir de estudios CID de

[Ca(H2O)2]2+ y [Ca(H2O)3]

2+, encontrándose valores comparables a los determinados

previamente por cálculos computacionales221.

Con el fin de brindar una perspectiva de la disociación de los iones aducto

dicargados y las estructuras iónicas relevantes para poder interpretar los espectros de

masa obtenidos, se realizaron cálculos computacionales exploratorios. Por este medio,

se investigó la posible justificación de las diferencias observadas en la sección 4.2.2

(pág. 166) respecto a la formación y abundancias relativas de especies mono y

dicargadas formadas en fase gaseosa a partir del calcio (II) con los isómeros catecol

21 y resorcinol 22. Vale la pena recordar que el comportamiento de estos isómeros

había resultado peculiar en comparación con aquel de los isómeros de N-óxidos de

hidroxipiridinas y pirazinas, ya que de manera opuesta, el compuesto capaz de formar

quelatos estables (catecol, en este caso) exhibió iones aducto dicargados (en lugar de

monocargados), mientras que aquel con características de ligando monodentado como


188

el resorcinol, mostró iones aducto monocargados con un ligando desprotonado

mayoritariamente (en lugar de dicargados o con el contraión cloruro).

Entre los iones aducto dicargados microhidratados con calcio se escogió como

modelo [Ca(catecol)2(H2O)]2+, por representar la estructura más sencilla y además ser

estudiada en la sección anterior a partir de la comparación satisfactoria del espectro

IRMPD de este ion aducto con el espectro IR calculado de 21Da. En consecuencia,

esta estructura fue tomada como punto de partida para estudiar los mecanismos de

fragmentación. Respecto al resorcinol, la imposibilidad de obtener el espectro IRMPD

del ion aducto dicargado análogo impidió la confirmación de la estructura del mismo,

denotada 22Da por analogía. En este caso, como la estructura de partida no pudo

definirse con precisión, el objetivo perseguido no consistió en realizar una búsqueda

exhaustiva de la SEP para caracterizar todas las posibles estructuras, sino más bien

encontrar posibles estructuras para realizar un análisis energético con fines

comparativos. En consecuencia, se exploraron diferentes estructuras, teniendo en

consideración y adaptando los motivos favorables hallados para catecol, para el

análisis de los caminos de disociación de este ion aducto.

Figura 4.13. Esquema de distintos mecanismos de disociación propuestos a partir del ion

aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+.

Los mecanismos considerados con origen en la estructura 21Da fueron de dos

clases (Figura 4.13), pérdidas de ligandos neutros, como una molécula de agua o

catecol (caminos A y B, respectivamente) y separación de carga, involucrando la

escisión del ion aducto dicargado en dos iones monocargados. Respecto a este último,

el mecanismo explorado fue aquel por el cual se produce una transferencia de protón

para formar la molécula protonada de catecol y [Ca(catecol)(H2O)-H]+, indicado como

camino C. Para caracterizar las estructuras de los estados de transición,

intermediarios e iones producto primarios de las reacciones de disociación principales,

se llevaron a cabo optimizaciones de geometría de los puntos estacionarios

encontrados al realizar barridos de la SEP (Capítulo 5, pág. 241), completando la


189

caracterización por el análisis de frecuencias de los mismos. En la Figura 4.14, se

muestran los perfiles de energía a lo largo de los caminos de disociación por los

mecanismos estudiados, con las estructuras correspondientes a los puntos

estacionarios encontrados. Los parámetros geométricos más significativos de estas

estructuras calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) se exhiben en la Figura

4.15 mientras que algunos ángulos de enlace también importantes se resumen en el

Capítulo 5 (Tablas 5.20 y 5.21, pág. 252).

Como se nota en la Figura 4.14, la pérdida de agua (21PA) constituye el canal de

fragmentación de menor energía, como se había observado previamente en los

experimentos IRMPD de la sección 4.3. El valor aquí calculado está próximo al medido

e informado en la literatura222 para el complejo análogo Ca(H2O)52+ (27 ± 2 kcal mol-1).

La pérdida de catecol y los procesos de separación de carga requieren la transferencia

de una molécula de catecol desde la esfera interna de coordinación de solvente a la

externa, donde se une a través de un enlace de hidrógeno con la molécula de agua

formando el intermediario 21De. Al separarse el catecol del calcio, un protón podría

ser transferido desde la molécula de agua a la molécula de catecol en la segunda

esfera de coordinación, permitiendo de ese modo la formación de dos iones

monocargados que se separan mutuamente por repulsión culómbica a través de

21TSC.

Vale la pena notar que la similitud entre las barreras energéticas para la

separación de cargas (21TSC) y la pérdida neutra de catecol (Camino B) a partir del

ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) indicaría que se pueden originar los iones

producto [Ca(catecol)(H2O)-H]+ (21PC), [(catecol)H]+ (21Ha) (camino C) y

[Ca(catecol)(H2O)]2+ (21PB). Este hecho resulta consistente con el espectro de masa

tándem (Figura 4.5, pág. 169), donde se observan ambos iones fragmento. Por otra

parte, el valor calculado para la formación de 21PB está próximo al valor medido e

informado en la literatura222 para la energía de la pérdida simultánea de dos moléculas

de agua a partir del complejo análogo Ca(H2O)52+ (62 ± 3 kcal mol-1).

Los parámetros geométricos de la estructura 21TSC (Figura 4.15), resultaron

similares a aquellos encontrados221 en la estructura análoga calculada a partir de

[Ca(H2O)2]2+, aunque con distancias de separación ligeramente mayores en este

trabajo, probablemente a causa de la estabilización por el ligando catecol adicional

quelando al calcio.


190

Figura 4.14. Perfil de energía para los caminos de pérdida de ligandos y de separación de

carga a partir del ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) con las estructuras de los estados

de transición, intermediarios y productos de disociación primarios obtenidos al nivel de

teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Las energías en kcal mol-1 incluyendo correcciones de energía

de punto cero (ZPE) son mostradas para todas las estructuras que corresponden a puntos

estacionarios.

En la Figura 4.16, se muestran el conjunto de estructuras calculadas con los

parámetros geométricos más significativos para el ion aducto [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+

(22Da1, 22Da2 y 22Da3) así como para el estado de transición para la separación de

carga (22TSC1 y 22TSC2) y los productos de disociación de los caminos estudiados

(22PA, 22PB y 22PC) mientras que algunos ángulos de enlace también importantes

se resumen en el Capítulo 5 (Tabla 5.22, pág. 253).


191

Figura 4.15. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel

de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), correspondientes a los puntos estacionarios del perfil de

energía a partir del ion aducto [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) mostrados en la Figura 4.14.


192

Figura 4.16. Parámetros geométricos significativos de las estructuras optimizadas al nivel

de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), obtenidas para el ion aducto [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+

(22Da1-3), el estado de transición para la separación de cargas (22TSC1-2) y los productos

de disociación primarios de los caminos estudiados (22PA, 22PB y 22PC).


193

Como puede observarse en la Figura 4.16, las estructuras de los complejos de

calcio(II) con resorcinol presentan una mayor libertad conformacional a causa de la

coordinación monodentada de los ligandos y la mayor distancia entre los grupos

hidroxilo que permite la formación de puentes de hidrógeno interligando. Debe tenerse

presente además que las estructuras mostradas fueron obtenidas a partir de un

muestreo parcial y no exhaustivo de la SEP, debido a la cantidad de grados de libertad

que exhiben estos complejos, y por lo tanto, podrían no representar las

conformaciones correspondientes a los mínimos de menor energía. Puede verse

entonces la importancia de IRMPD para la selección de las estructuras precisas.

Sin embargo, el valor energético de estas estructuras optimizadas sirve como

parámetro para comprobar si las estructuras propuestas no presentan al menos,

valores comparables con los de las estructuras análogas con catecol, así como los

complejos de calcio con agua. En la Tabla 4.10, se presentan los valores de las

energías relativas para los estados de transición de la separación de carga y sus

productos, así como para los productos de pérdida de agua y de ligando a partir de los

iones aducto de calcio dicargados con dos ligandos y una molécula de agua,

calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p). Además, se incluyeron los valores

de literatura disponibles determinados experimentalmente para los complejos de

calcio(II) análogos.

A partir de la Tabla 4.10 se encuentra que las estructuras con catecol presentan

una barrera energética ~12 kcal mol-1 mayor que las de resorcinol para los caminos de

disociación B (pérdida de ligando neutro) y C (separación de carga), mientras que la

misma es 2 kcal mol-1 menor para la pérdida de agua (A). Esta diferencia resulta

acorde con el modo de coordinación de ambos ligandos, es decir, bidentado para el

catecol y monodentado para el resorcinol, ya que como se observa en el perfil de la

Figura 4.14, los intermediarios de las estructuras de catecol donde un ligando se

coordina de forma monodentada (21Dc y 21Dd) presentan una diferencia de energía

similar relativa a la estructura más estable (21Da), donde el modo de coordinación es

bidentado.

Por otra parte, si bien los valores calculados para los complejos de catecol se

correlacionaron bien con los disponibles medidos experimentalmente en complejos de

calcio dicargados con agua, no ocurrió lo mismo para los de resorcinol, en especial

para la pérdida de agua. Esto podría deberse a las interacciones intermoleculares


194

presentes en las estructuras propuestas para los clusters de resorcinol

monohidratados, 22Da1-3 (Figura 4.16), que presentan un puente de hidrógeno entre

la molécula de agua y uno de los ligandos, que se encuentran ausentes en los

complejos dicargados de calcio microhidratados con NC < 7.

Tabla 4.10. Energías relativas a 0K calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) a

partir de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da) y [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+ (22Da1) para los

caminos de separación de carga y pérdida de ligandos

Estructura Energíaa / kcal mol-1

Complejo Energíab / kcal mol-1

Estructura Energíaa / kcal mol-1

Complejo Energíab / kcal mol-1

22Da1 0 [Ca(H2O)3]

2+ 0

21Da 0 [Ca(H2O)5]2+ 0

22Da2 0.4

22Da3 0.8

21PA + H2O

29.9 [Ca(H2O)4]

2+

+ H2O 27 ± 2

22PA + H2O 32.3

[Ca(H2O)2]2+

+ H2O 41 ± 2

21PB + 21a 61.2

[Ca(H2O)3]2+

+ 2H2O 62 ± 3

22PB + 22a 49.0

21TSC 57.0 22TSC1 45.4 [CaOH(H2O)]+

+ H3O+ 39 ± 4

22TSC2 45.6

21PC + 21Ha 24.0

22PC + 22Ha 11.3

a Evaluaciones de energía calculadas al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) incluyendo correcciones de punto cero. b Valores umbrales energéticos determinados experimentalmente en la Ref. 222.

Los cálculos computacionales al nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p) sugieren que

en el caso de los complejos dicargados de calcio con catecol y resorcinol

monohidratados, la pérdida de una molécula de agua es el canal de fragmentación de

menor energía seguido por productos de separación de carga y la pérdida de una

molécula neutra de ligando, en acuerdo con las especies observadas al efectuar CID

sobre los iones aducto dicargados de calcio con estos compuestos. Sin embargo, los

canales de fragmentación de mayor energía presentaron diferencias apreciables entre

ambos sistemas, ofreciendo una barrera menor en 12 kcal mol-1, en el caso del

resorcinol. Esta diferencia se origina en el diferente modo de coordinación de ambos

ligandos, facilitándose la ocurrencia de procesos de separación de carga para ligandos

monodentados, como el resorcinol, justificando así las diferencias entre isómeros

antes observadas en los espectros de masa.


195

4.5. Aplicación del uso de soluciones de metales a la detección en HPLC-MS

A pesar de que la derivatización no es generalmente necesaria para el análisis de

compuestos por LC-MS, ya que hoy en día existen fases cromatográficas y

condiciones experimentales que permiten el análisis de prácticamente cualquier

compuesto, puede resultar conveniente para aumentar la intensidad de las señales al

alterar las propiedades de ionización de las moléculas analizadas5. La derivatización

postcolumna es un método comúnmente empleado en cromatografía líquida (LC) para

mejorar la sensibilidad de la detección con distintos detectores, como por ejemplo UV

o fluorescencia, de ciertas clases de analitos. De manera análoga, también se ha

empleado en LC-MS. Por ejemplo, se empleó la adición postcolumna de reactivos

como hidróxido de trimetilfenilamonio, 2-mercaptopiridina y cloruro de benzoílo para la

detección de compuestos relacionados con armas químicas223 mejorando la

sensibilidad de compuestos difíciles de ionizar por APCI.

Sobre la base de la riqueza de información disponible de la química de

coordinación, las sales de metales, principalmente de plata, han sido aplicadas como

agentes de complejación postcolumna permitiendo aumentar la sensibilidad en la

ionización por ESI-MS de una amplia clase de compuestos a través de la formación de

complejos estables con este metal por interacciones -catión metálico170. Otra

implementación del uso de metales postcolumna fue en una estrategia LC-MS/MS,

para el análisis y diferenciación de isómeros de diglicósidos de flavonoides en

mezclas39 empleando también plata mientras que una estrategia similar fue usada

para la elucidación estructural de hidratos de carbono224 empleando cloruro de cobalto.

Teniendo en cuenta estos antecedentes y la capacidad de los dihidroxiarenos de

formar complejos con metales225, se evaluó la posibilidad de emplear una solución

metálica como aditivo postcolumna en HPLC para el análisis de mezclas de los

isómeros de dihidroxiarenos, previamente diferenciados individualmente por infusión

directa en la sección 4.2. Se analizó una mezcla de los compuestos 21-24 en

cantidades equimolares. Los complejos de los compuestos detectados por ESI-MS, se

obtuvieron mezclando el efluente de salida de la columna de HPLC con la solución del

metal, introducida por la bomba de jeringa de infusión directa, a través de una unión en

T ubicada antes de la entrada a la fuente de ionización. Entre los metales estudiados

en la sección 4.2, se escogió el calcio para realizar este estudio por ofrecer una buena

diferenciación entre los isómeros.


196

La separación cromatográfica óptima entre los isómeros fue lograda usando una

columna con fase estacionaria modificada con grupos pentafluorofenilo (PFP) bajo las

condiciones de gradiente de acetonitrilo:agua que se detallan en el capítulo 5 (pág.

207). Otras condiciones experimentales testeadas fueron el uso de fase reversa (RP-

C18) y de interacción hidrofílica HILIC, así como diferentes fases móviles conteniendo

metanol y soluciones diluidas de ácido fórmico (0.1 %) en agua. Los cromatogramas

de corriente total de iones (TIC) obtenidos sin y con el agregado postcolumna de calcio

se muestran en la Figura 4.17. En ambos casos se muestra el cromatograma UV

obtenido en forma simultánea. En los cromatogramas UV de la Figura 4.17 pueden

observarse los 2 pares de compuestos isoméricos con tiempos de retención (TR) 1.8 /

2.1 min y 5.5 / 5.8 min, correspondientes a los dihidroxibencenos y dihidroxinaftalenos,

respectivamente.

Observando los espectros ESI-MS obtenidos con el agregado postcolumna de

calcio a los tiempos de retención correspondientes a los compuestos 21-24, resulta

posible determinar la identidad de cada uno de los isómeros de los dihidroxiarenos

eluídos. Los espectros correspondientes a los 4 compuestos se muestran en la Figura

4.18. Las especies observadas en los espectros de masa de los picos con TR 2.1, 5.5 y

5.8 min de la Figura 4.18 resultaron coincidentes con las ya identificadas en la Tabla

4.2 (pág. 160) para el catecol 21, 1,3-naftalendiol 24 y 2,3-naftalendiol 23,

respectivamente. Sin embargo, en el espectro de masa restante correspondiente al

compuesto 22, se observaron iones aducto de calcio con acetonitrilo, no

evidenciándose la presencia del resorcinol en ninguno de ellos.

Por este motivo, se investigó si la falla en la detección del resorcinol podría

deberse a un efecto del solvente empleado dado que los experimentos antes

realizados habían empleado soluciones metanólicas de los analitos y no se había

probado con acetonitrilo. Al repetir los experimentos de infusión directa con soluciones

de resorcinol en acetonitrilo mezcladas con cloruro de calcio acuoso se comprobó la

presencia únicamente de iones aducto conteniendo la sal de metal junto al solvente

empleado. De esta manera, quedó en evidencia la importancia del solvente en la

formación de los iones aducto con resorcinol, a diferencia de los otros compuestos

para los que no hubo diferencias.


197

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

TIC +MS

Cromatograma UV, 190-950 nm

TIC +MS


Tiempo [min]

Intens. [mUA] x105

Intens. [u.a.] x106

Intens. [mUA] x105

Intens. [u.a.] x106

a)

b)

22

21

23

24

22

21

23

24

Figura 4.17. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla

equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (a) y con

agregado postcolumna de calcio (b) empleando un gradiente de acetonitrilo:agua (pág. 207)


198

[2M+Ca+2H2O]++ 198.0442

[M+Ca+2H2O-H]+ 235.0279

[3M+Ca]++ 260.0600

+MS, TR 5.8 min

23

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 161.0588

+MS, TR 5.5 min

24

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

115.9563

[M+Ca-H]+ 148.9901

185.0102

[2M+Ca+H2O-H]+ 277.0363

+MS, TR 2.1 min

21

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

115.9565

152.9499

249.0065

334.8695 472.7878

+MS, TR 1.8 min

22

0

500

1000

1500

2000

2500

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Figura 4.18. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna

de calcio obtenidos a partir de una mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos 21-24.

Intens. [u.a.] x105

Intens. [u.a.] x104

Intens. [u.a.] x104

Intens. [u.a.]


199

Cabe destacar que la fase móvil utilizada siempre resulta de un compromiso entre la

eficiencia cromatográfica y la sensibilidad en la detección debido al efecto producido

sobre la ionización226. Así, al cambiar el solvente orgánico de la fase móvil por

metanol, no fue posible resolver la mezcla de los naftalendioles aunque sí la de los

dihidroxibencenos. Luego, partiendo de una mezcla equimolar (1 mM) de los

compuestos 21 y 22 se optimizaron las condiciones de separación con la misma

columna, pero utilizando un gradiente de metanol:agua (capítulo 5, pág. 207). En la

Figura 4.19 se observan los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) junto al

cromatograma UV obtenido con el agregado postcolumna de calcio, donde pueden

observarse los dos compuestos a TR 3.1 y 3.6 min. Los espectros de masa

correspondientes a estos tiempos de retención se muestran en la Figura 4.20. Como

se observa al comparar los espectros de la Figura 4.20 con los correspondientes de la

Figura 4.18, al emplear metanol se observaron los iones aducto con calcio

característicos de ambos isómeros y con intensidades mayores, mejorando así la

sensibilidad del análisis de los mismos para su diferenciación (cf. Fig. 4.4 d y c, pág.

167).

0.0

0.5

1.0

1.5

0

2

4

6

0 1 2 3 4 5 6

TIC +MS


Intens.[u.a.] x106

Intens.[mUA] x105

Tiempo [min] Figura 4.19. Cromatogramas de corriente total de iones (TIC) y UV para una mezcla

equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21 y 22 por LC/MS con agregado

postcolumna de calcio empleando un gradiente de metanol:agua (pág. 207).

22 21


200

Figura 4.20. Espectros de masa ESI-MS obtenidos por LC-MS con agregado postcolumna de

calcio a partir de una mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21 y 22.

En la Figura 4.21 se muestra la superposición entre los cromatogramas de

corriente total de iones (TIC) en ausencia y con agregado postcolumna de calcio de la

mezcla de los 4 compuestos. El efecto más importante que puede observarse reside

en las intensidades de los picos de los compuestos 21, 23 y 24, y en las abundancias

absolutas de los iones respectivos en los espectros de masa, cuyos picos base

aumentan casi diez veces. Resultados similares fueron observados al emplear una

solución equimolar 10 veces más diluida (0.1 mM) aunque con una solución equimolar

100 veces más diluida (0.01 mM) ya no fueron detectadas señales atribuibles a los

compuestos en el cromatograma TIC.

Por último, se observó el efecto de variar el flujo de la bomba de jeringa, por la cual

se introduce el agente de complejación para ser mezclado con el efluente de la

columna vía una conexión en T. No se observaron diferencias apreciables utilizando

[2M+Ca+2H2O]++ 148.0309

277.0412

+MS, TR 3.6 min

21

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

[M+H]+ 111.0466

[M+Ca+H2O-H]+ 167.0049

295.0582

+MS, TR 3.0 min

22

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z

Intens.[u.a.] x105

Intens. [u.a.] x104


201

un flujo entre 3 y 5 l / min, por lo que se empleó el primer valor que fue el usado

corrientemente en los experimentos de infusión directa realizados. Sin embargo, se

observó que un aumento del flujo a un valor mayor al doble (~ 8 l / min) elevaba la

línea de base del cromatograma, es decir, disminuía la relación señal / ruido, mientras

que la disminución del flujo a menos de la mitad (~1.5 l / min), si bien bajaba la línea

base del cromatograma, reducía en mayor proporción la señal, por lo que también

disminuía la relación señal / ruido. En consecuencia, el valor de flujo usado resultó

óptimo bajo las condiciones experimentales empleadas.

Figura 4.21. Comparación entre los cromatogramas de corriente total de iones (TIC) para una

mezcla equimolar (1 mM) de los compuestos isómeros 21, 22, 23 y 24 por LC/MS sin (línea

negra) y con (línea roja) agregado postcolumna de calcio.

Este ejemplo muestra que la metodología empleada de complejación postcolumna

puede ser utilizada como método para diferenciar isómeros por ESI-MS luego de su

separación por HPLC. De esta manera, con un simple experimento LC-ESI-MS, se

puede derivar información estructural a partir de los espectros de masa observados de

acuerdo al metal agregado postcolumna, evitando el uso de experimentos LC-MS/MS.

El agregado de un agente de complejación postcolumna puede constituir además

un método para el análisis de analitos difíciles de ionizar en modo positivo, permitiendo

su observación o aumentando su sensibilidad, como fue observado para la mayor

parte de los compuestos estudiados. Además, resulta simple ya que requiere sólo una

conexión en T y como la complejación ocurre postcolumna, el espectro de masa puede

modificarse sin cambiar los tiempos de retención de LC, brindando una confirmación

altenativa y permitiendo la identificación de diferentes isómeros como fue ilustrado en

este caso.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tiempo [min]

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

TIC +MS

mezcla 21, 22, 23 y 24 (1mM) sin calcio agregado mezcla 21, 22, 23 y 24 (1mM) con calcio agregado

22 21

23

24

Intens. [u.a.] x106


202

4.6. Conclusiones

La complejación con iones metálicos, a partir de los iones aducto generados por

electrospray, permitió encontrar diferencias en los espectros de masa entre cada par

de isómeros de dihidroxiarenos, de manera análoga a lo observado en los capítulos

precedentes con otros compuestos. Los metales trivalentes, como aluminio y galio,

exhibieron principalmente iones aducto conteniendo ligandos desprotonados para los

isómeros con sustitución orto, mientras que en aquellos con sustitución meta

predominaron los iones aducto con ligandos en su forma neutra. Esta tendencia fue

menos evidente con los metales divalentes como cobalto y cobre que mostraron en

general más especies comunes a ambos isómeros.

En particular, la complejación con calcio presentó un comportamiento llamativo con

los isómeros de dihidroxibenceno y dihidroxinaftaleno, observándose en los espectros

iones aducto dicargados para las estructuras con sustitución orto, mientras aquellas

con sustitución meta mostraron iones aducto monocargados con un ligando

desprotonado. Esta aparente contradicción con lo observado en los capítulos

precedentes para la complejación diferencial con calcio (II) fue explorada en

profundidad mediante distintos experimentos en conjunto con cálculos

computacionales.

A partir de experimentos en los que se aumentó la concentración de una base,

agregada a la solución previo a la infusión de la mezcla de cada compuesto con calcio,

se observó un aumento en la abundancia de iones aducto conteniendo especies

desprotonadas, aunque estos cambios no explicaron las diferencias entre isómeros

observadas en los espectros. Por otra parte, al modificar los parámetros

instrumentales de transporte de los iones generados en la fuente de ionización, y

realizar luego experimentos CID sobre los iones aducto con calcio dicargados, se

observaron iones fragmento conteniendo ligandos desprotonados. Este indicio, que

podría explicar las diferencias observadas entre isómeros en términos de las energías

involucradas para este proceso, fue investigado por cálculos computacionales.

Para realizar el estudio de los caminos de disociación de los iones aducto

dicargados con calcio, se realizó primeramente un estudio estructural de los mismos.

Las estructuras en fase gaseosa de los clusters microhidratados de calcio(II) con

catecol fueron elucidadas por experimentos de espectroscopia IRMPD en combinación

con cálculos computacionales. La concordancia hallada a partir de la comparación


203

entre los espectros IRMPD y los espectros de absorción IR de las estructuras

calculadas de menor energía, pemitió la asignación de los rasgos espectrales y por

ende de los motivos de unión estructurales. De esta manera, fueron caracterizadas las

geometrías de los iones aducto microhidratados de calcio(II) con catecol, quedando en

evidencia el valor de la espectroscopía IRMPD como medio para comprender la

estructura de los iones observados en los espectros de masa.

La exploración de los caminos de disociación de los complejos dicargados de

calcio con catecol y resorcinol monohidratados, mediante cálculos computacionales al

nivel de teoría B3LYP/6-311+G(d,p), mostró la pérdida de agua como el camino de

menor energía, en concordancia con lo observado en los experimentos IRMPD para

los complejos de calcio con catecol microhidratados. Los caminos de disociación

restantes de mayor energía (separación de carga y pérdida de una molécula neutra de

ligando), cuyos productos habían sido observados a partir de experimentos CID,

mostraron diferencias en las barreras energéticas calculadas para los complejos de

ambos isómeros. Estas diferencias originadas por el distinto modo de coordinación de

ambos ligandos, explicaría la mayor ocurrencia de procesos de separación de carga a

partir de iones aducto dicargados con ligandos monodentados, como el resorcinol,

dando como resultado la generación de especies monocargadas.

Finalmente, como la complejación con metales resultó prometedora, tanto en la

detección como diferenciación de los dihidroxiarenos por MS en modo positivo, se

evaluó su aplicación práctica como método de detección en HPLC/ESI-MS. La

implementación de una solución de metal como agente complejante postcolumna,

ejemplificada con el calcio, mostró un aumento de sensibilidad en la detección de los

compuestos estudiados, brindando además información estructural útil a partir de las

especies iónicas observadas.


204

205

Detalles experimentales

5.1. Espectrometría de Masa

5.1.1. Equipamiento y metodología

Todos los espectros de masa y MS/MS fueron realizados utilizando un

espectrómetro de masa de alta resolución Bruker micrOTOF-Q II (UMyMFOR, FCEN,

UBA) equipado con las fuentes ESI, APCI o APPI. Este equipo tiene una configuración

QqTOF. Las condiciones típicas de operación de estas fuentes API se muestran en la

Tabla 5.1 y en la Figura 5.1 se esquematiza la interfase de las fuentes de ionización.

La fragmentación por CID de los iones seleccionados en el cuadrupolo Q por m/z

se realizó en una celda de colisión consistente en un cuadrupolo (q) de sólo

radiofrecuencia (RF) con argón de ultra alta pureza como gas de colisión. El

cuadrupolo Q (filtro de masa) se fijó normalmente con una ventana de 1.0 Da para la

transmisión/ aislamiento de los iones precursores. La celda de colisión se fijó a una

energía de 9.0 eV con un flujo de gas de colisión a un valor de 30% del máximo,

fijando la RF a 150 Vpp. Para los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 166), la

energía de la celda de colisión se fijó a 6.0 eV con un flujo de gas de colisión de 5%

del máximo y la RF fijada a 100 Vpp.

Tabla 5.1. Parámetros operacionales típicos de las fuentes API empleadas

Parámetro ESI APCI APPI

Offset de la Placa Final (V) -500 -500 -500

Voltaje del Capilar (kV) 4.5 4 4.2

Nebulizador (bar) 0.4 2.0 2.0

Gas secado (N2) (l / min) 4.0 3.0 3.0

Temperatura secado (ºC) 180 180 180

Temperatura vaporizador (ºC) NA 180 180

Energía de fotones de la lámpara de Kripton (eV) NA NA 10

Corona (mA) NA 4000 NA

5

Capítulo

Capítulo 5 Detalles experimentales

206

Figura 5.1. Esquema de la interfase entre la fuente de ionización ESI y la entrada al TOF.

En las fuentes de APCI y APPI se incorporan los elementos 1: Vaporizador y 2: aguja de

descarga corona (APCI) o lámpara de Kriptón (APPI).

La calibración de masa con múltiples puntos fue llevada a cabo usando una

solución de formiato de sodio desde m/z 50 hasta 900 en el modo de iones positivo. La

adquisición de los datos y el procesamiento se realizaron usando el software Bruker

Compass Data Analysis versión 4.0 suministrado con el instrumento.

Las soluciones se inyectaron en la fuente por infusión directa usando una bomba

de jeringa KDS 100 a un flujo de 3 l / min.

IRMPD: Los análisis de espectroscopía IRMPD de la sección 4.3 fueron realizados

en un espectrómetro de masa tándem FT-ICR (Bruker Apex Qe) equipado con una

fuente ESI (Apollo II), un cuadrupolo como filtro de masa, un hexapolo como celda de

colisión/ acumulación y un imán de 7 T. Dos configuraciones experimentales basadas

en el acoplamiento del espectrómetro con distintos láseres IR fueron empleadas.

Para el rango espectral de 900-1700 cm-1 fue usado el FEL IR de Centre Laser

Infrarouge d’Orsay (CδIO) operado a 45 εeV. δa salida del FEδ consiste en

macropulsos de 8 s de duración con una frecuencia de repetición de 25 Hz, estando

compuesto cada uno por 500 micropulsos, de unos pocos picosegundos de duración.

La potencia de salida del láser medida antes y después de los experimentos varió

entre 400 y 600 mW en el rango de frecuencias de 800-1600 cm-1. La longitud de onda

del láser fue registrada con un monocromador acoplado a un detector de arreglo

piroeléctrico. El ancho espectral (anchura a media altura, FWHM) fue menor a 0.5% de

la longitud de onda central. Más detalles sobre el funcionamiento de este equipo

experimental puede encontrarse en la Ref. 227.

Detalles experimentales Capítulo 5

207

El rango espectral de 3450-3750 cm-1 fue registrada acoplando un sistema láser

oscilador/amplificador paramétrico óptico (OPO/OPA) (LaserVision). Este sistema láser

es bombeado por un non-seeded láser de Nd:YAG (1064 nm, 550 mJ/ pulso, ancho de

banda ~1 cm-1) Innolas SpitLight 600 que entrega pulsos de 4-6 ns de duración

funcionando a 25 Hz. La energía típica de salida del OPO/OPA fue de 12-13 mJ/ pulso

a 3600 cm-1 con un ancho de banda (FWHM) de ~5 cm-1.

HPLC: Los estudios de HPLC de la sección 4.5 se realizaron acoplando el

cromatógrafo líquido Agilent 1200 Series LC al espectrómetro de masa variando

algunos de los parámetros operacionales de la Tabla 6.1. A saber, voltaje del capilar: 4

kV, nebulizador: 3.0 bar, gas secado: 6.0 L / min y temperatura secado: 200 °C.

La fase móvil estuvo compuesta por los solventes agua (A) y acetonitrilo o metanol

(B) grado LCMS. Se utilizó una columna Luna PFP (Phenomenex, tamaño de partícula

3 m, longitud 10 cm, diámetro interno 2 mm), realizando la corrida en condiciones

isotérmicas (T= 30°C) con un flujo de 0.3 ml / min. Para la separación de los

compuestos 21-24 con acetonitrilo, se empleó un gradiente (t = 0-1 min, A:B 70:30 => t

= 15 min, A:B 0:100). Por otro lado, para la separación de los compuestos 21-22 con

metanol, se empleó otro gradiente (t = 0-1 min, A:B 70:30 => t = 4 min, A:B 60:40) => t

= 5-7 min, A:B 0:100). Otras columnas empleadas fueron Luna C18 (Phenomenex,

tamaño de partícula 3 m, longitud 10 cm, diámetro interno 2 mm) y Kinetex HILIC

(Phenomenex, tamaño de partícula 2.6 m, longitud 15 cm, diámetro interno 2.1 mm).

La introducción de las muestras al HPLC se realizó a través del inyector

automático del equipo fijando el volumen de inyección en 5 l. Para los experimentos

con adición de metal postcolumna de la sección 4.5, se mezclaron el efluente de salida

de la columna de HPLC con la solución de metal (introducida por la bomba de jeringa

a 3 l / min) vía una T ubicada antes de la entrada a la fuente de ionización.

5.1.2. Preparación de las muestras

Los N-óxidos de la 2- y 3- hidroxipiridina (1 y 2) y los dihidroxiarenos 21-26 se

compraron a Sigma-Aldrich. El metanol y acetonitrilo de grado LCMS y el agua de

grado HPLC se compraron a Carlo-Erba o Tedia. El acetato de amonio, puriss. p.a.

para MS y el hidróxido de tetrametilamonio (TMAOH) se compraron a Sigma-Aldrich.


208

Para los experimentos de la sección 2.3 (pág. 31), se prepararon los compuestos

deuterados 1d y 2d a partir de 12 mg de 1 y 2, respectivamente, agregando agua

deuterada más gotas de dimetilsulfóxido-d6 hasta disolverlas y luego liofilizando hasta

sequedad. Esta operación se repitió 2 veces más, agregando sólo agua deuterada la

última vez. Las muestras deuteradas se disolvieron en agua deuterada (1 ml) más

gotas de ácido acético-d4 hasta disolución, previo a la infusión en el espectrómetro de

masa.

Las soluciones stock de los iones metálicos, cada una a una concentración de 10

mM, fueron preparadas usando agua a partir de las sales de MgCl2-6H2O, AlCl3, CaCl2,

Sc(OTf)3, VOSO4-5H2O, FeCl3-6H2O, CoCl2-6H2O, NiSO4-7H2O, CuSO4-5H2O, ZnCl2 y

GaCl3, obtenido a partir de Ga2O3 por tratamiento con HCl (c) a reflujo228. En el caso de

los cationes trivalentes, se agregó un pequeño exceso de HCl (0.1M) para evitar la

precipitación de los óxidos hidratados.

Las soluciones de los analitos 1-26 se prepararon usando metanol a una

concentración de 10 mM. En el caso de los experimentos ESI sin metales, se

agregaron 50 l de una solución 10 mM de acetato de amonio en metanol:agua

(50:50) a 50 l de las soluciones de cada compuesto previo a la infusión directa.

Las soluciones de los metales en agua se agregaron en exceso a las soluciones de

cada compuesto (aproximadamente en relaciones 2-3:1). Esta preparación se realizó

en el momento previo a la inyección en el espectrómetro de masa, registrando los

espectros de masa después de 5 min de infusión con el fin de dejar que ocurra la

estabilización de las especies.

Para los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 164), se realizaron agregados de

0, 10, 30, 50, 70 y 90 l de una solución acuosa 50 mM de TMAOH a distintos tubos

conteniendo mezclas preparadas en el momento a partir de 300 l de la solución

metánolica de cada analito (10 mM) + 600 l de la solución acuosa del metal (10 mM),

completando el volumen final de cada tubo a 1 ml con agua. Los tubos así preparados

para cada compuesto con los distintos agregados fueron luego inyectados

inmediatamente en el espectrómetro de masa.

En los experimentos de IRMPD de la sección 4.3.2 (pág. 174), se utilizó una

solución, preparada antes de la infusión, mezclando una solución metanólica de

catecol (1 mM) con una solución acuosa de CaCl2 (1 mM) en relación 1:1. Estas


209

concentraciones fueron también utilizadas para las soluciones de catecol y resorcinol

empleadas en los experimentos de la sección 4.2.2 (pág. 164).

5.1.3. Material suplementario de MS

Tabla 5.2. Especies identificadas en el espectro de ESI-MS de una mezcla (1 mM /1

mM) de CaCl2 en agua / catecol en metanol, con sus relaciones m/z medidas y error en

ppm y mDa.

m/z medida FM Especies m/z Err [mDa] Err [ppm]

65.9954 C 6 H 4 Ca O [Ca(catecol)-H2O]++ 65.9939 -1.6 -23.7

74.9997 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(catecol)]++ 74.9991 -0.6 -7.7

84.0048 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)]++ 84.0044 -0.4 -4.5

91.0122 C 7 H 10 Ca O 3 [Ca(catecol)(MeOH)]++ 91.0122 0.0 0.2

92.023 C 6 H 4 O [(catecol)-H2O]+· 92.0257 * *

93.0109 C 6 H 10 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2]++ 93.0097 -1.2 -12.6

100.0173 C 7 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)(MeOH)]++ 100.0175 0.2 2.0

102.0149 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3]++ 102.0150 0.0 0.4

109.0231 C 7 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)2(MeOH)]++ 109.0228 -0.3 -2.7

111.017 C 6 H 14 Ca O 6 [Ca(catecol)(H2O)4]++ 111.0203 * *

130.0183 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)2]++ 130.0175 -0.8 -6.2

139.0229 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)2(H2O)]++ 139.0228 -0.1 -0.8

148.0284 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(catecol)2(H2O)2]++ 148.0281 -0.3 -2.0

148.994 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(catecol)-H]+ 148.9910 * *

167.0015 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)-H]+ 167.0016 0.1 0.3

184.97 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2-H]+ 185.0121 * *

185.0355 C 18 H 18 Ca O 6 [Ca(catecol)3]++ 185.0359 0.5 2.5

194.0393 C 18 H 20 Ca O 7 [Ca(catecol)3(H2O)]++ 194.0412 1.9 9.8

259.0272 C 12 H 11 Ca O 4 [Ca(catecol)2-H]+ 259.0278 0.6 2.2

259.0272 C 24 H 22 Ca 2 O 8 [Ca2(catecol)4-2H]++ 259.0278 0.6 2.2

*Solapamiento de picos observado.

Tabla 5.3. Especies identificadas en el espectro de masa tándem del ion aducto

[Ca(resorcinol)(H2O)]2+ con una energía de colisión de 8 eV (sistema de referencia

laboratorio), con sus relaciones m/z medidas y error en ppm y mDa.

m/z medida FM Especies m/z err [mDa] err [ppm]

111.0425 C 6 H 7 O 2 [(resorcinol)H]+ 111.0441 1.6 14.4

148.9888 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(resorcinol)-H]+ 148.9910 2.2 14.7

166.9998 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)-H]+ 167.0016 1.76 10.5

185.0122 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2-H]+ 185.0121 -0.03 0.2

203.0183 C 6 H 11 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)3-H]+ 203.0227 4.36 21.5


210

Tabla 5.4. Especies identificadas en el espectro de masa tándem del ion aducto

[Ca(catecol)(H2O)]2+ con una energía de colisión de 8 eV (sistema de referencia

laboratorio), con sus relaciones m/z medidas y error en ppm y mDa.


75.0000 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(catecol)]++ 74.9991 -0.9 -11.9

84.0042 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)]++ 84.0044 0.2 2.3


93.031 C 6 H 5 O [(catecol)H-H2O]+ 93.0335 * *

102.0144 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3]++ 102.0150 0.6 5.8


111.037 C 6 H 7 O 2 [(catecol)H]+ 111.0441 * *

130.0180 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(catecol)2]++ 130.0175 -0.4 -3.4

139.0230 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(catecol)2(H2O)]++ 139.0228 -0.2 -1.2

148.0275 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(catecol)2(H2O)2]++ 148.0281 0.6 3.8

148.995 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(catecol)-H]+ 148.9910 * *

157.0326 C 12 H 18 Ca O 7 [Ca(catecol)2(H2O)3]++ 157.0334 0.8 4.9

167.0012 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(catecol)(H2O)-H]+ 167.0016 0.4 2.3

185.0115 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(catecol)(H2O)2-H]+ 185.0121 0.6 3.5

203.0212 C 6 H 11 Ca O 5 [Ca(catecol)(H2O)3-H]+ 203.0227 0.5 4.3

*Solapamiento de picos observado.

Tabla 5.5. Especies identificadas en el espectro de ESI-MS de una mezcla (1 mM /1

mM) de CaCl2 en agua / resorcinol en metanol, con sus relaciones m/z medidas y error

en ppm y mDa.


74.9988 C 6 H 6 Ca O 2 [Ca(resorcinol)]++ 74.9991 0.36 4.8

84.0052 C 6 H 8 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)]++ 84.0044 -0.80 -9.5

91.0123 C 7 H 10 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(MeOH)]++ 91.0122 -0.02 -0.2

93.0094 C 6 H 10 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2]++ 93.0097 -0.3 -3.2

100.0167 C 7 H 12 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)(MeOH)]++ 100.0175 0.83 8.3

102.0143 C 6 H 12 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)3]++ 102.0150 0.68 6.7

109.0231 C 7 H 14 Ca O 5 [Ca(resorcinol)(H2O)2(MeOH)]++ 109.0228 -0.31 -2.8

111.0422 C 6 H 7 O 2 [(resorcinol)H]+ 111.0441 1.87 16.9

118.0281 C 7 H 16 Ca O 6 [Ca(resorcinol)(H2O)3(MeOH)]++ 118.0281 0.01 0.1

130.0175 C 12 H 12 Ca O 4 [Ca(resorcinol)2]++ 130.0175 0.04 0.3

139.0216 C 12 H 14 Ca O 5 [Ca(resorcinol)2(H2O)]++ 139.0228 1.21 8.7

148.0270 C 12 H 16 Ca O 6 [Ca(resorcinol)2(H2O)2]++ 148.0281 1.05 7.1

148.9913 C 6 H 5 Ca O 2 [Ca(resorcinol)-H]+ 148.9910 -0.29 -1.9

157.0325 C 12 H 8 Ca O 7 [Ca(resorcinol)2(H2O)3]++ 157.0334 0.84 5.4

166.9994 C 6 H 7 Ca O 3 [Ca(resorcinol)(H2O)-H]+ 167.0016 2.16 12.9

185.0100 C 6 H 9 Ca O 4 [Ca(resorcinol)(H2O)2-H]+ 185.0121 -2.1 -11.5


211

5.2. Espectroscopía RMN

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C fueron medidos en un

espectrómetro Bruker Avance II 500 (UMyMFOR) operando a 500.13 y 125.77 MHz,

respectivamente. Los espectros de RMN 2D HSQC-DEPT y HMBC fueron adquiridos

utilizando secuencias de pulsos estándar provistas en el software del equipo. Los

espectros fueron adquiridos a partir de soluciones de las muestras a temperatura

ambiente en tubos de 5 mm.

Se utilizó deuterocloroformo (CDCl3) para disolver las muestras, a menos que los

compuestos fueran insolubles. En caso que fueran ligeramente solubles, se agregaron

unas gotas de metanol-d4 (2%) y de lo contrario se usó dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6).

La concentración de todas las soluciones estuvo entre 0.01 y 0.1 mol dm-3. Los

solventes deuterados utilizados fueron adquiridos a Sigma-Aldrich.

Los desplazamientos químicos (δ) de 1H y 13C están expresados en ppm

empleando tetrametilsilano (TMS) como estándar interno (0.00 ppm) en soluciones de

CDCl3 o referenciando al pico central del solvente (δ = 2.50 ppm y 39.50 ppm en 1H y

en 13C, respectivamente) cuando se usó DMSO-d6. Las constantes de acoplamiento

(J) se informan en Hz y las multiplicidades se citan como singulete (s), singulete ancho

(sa), doblete (d), doble doblete (dd), doble doble doblete (ddd), triplete (t), doble triplete

(dt), cuarteto (q) y multiplete (m).

5.3. Otras técnicas empleadas para la caracterización de los compuestos

Los puntos de fusión (Pf) fueron determinados en un aparato Fisher Johns y no

están corregidos. Los espectros de absorción IR fueron adquiridos en un

espectrofotómetro FT-IR Nicolet Magna 550 (UMyMFOR). Se utilizó la técnica de film,

disolviendo la muestra en CH2Cl2 y evaporando una gota de la solución sobre una

pastilla de NaBr. Los espectros UV-visible fueron registrados en un espectrofotómetro

con arreglo de diodos HP 8453 (FOMEC), utilizando los solventes que se señalan en

cada caso. Las técnicas anteriores fueron solamente utilizadas para la caracterización

de aquellos compuestos para los que no se encontraban datos descritos en la

literatura.


212

5.4. Métodos cromatográficos

Las cromatografías en capa delgada para fines analíticos o preparativos fueron

realizadas usando placas de sílica gel de 20 × 20 cm preparadas sobre hojas de

aluminio (Merck F254) de 0.2 mm de espesor con indicador de fluorescencia a la

longitud de onda de 254 nm.

Como solventes de elución se utilizaron mezclas de los siguientes solventes:

ciclohexano (Cy), acetato de etilo (AcOEt), ácido acético (AcOH), diclorometano

(CH2Cl2), metanol (CH3OH), cloroformo (CHCl3), acetona ((CH3)2C=O) y tolueno

(PhMe). A saber, solvente I, Cy:AcOEt:AcOH (1.5:8.0:0.5); solvente II, CH2Cl2:MeOH

(8:2); solvente III, CHCl3:(CH3)2C=O (1:1); solvente IV, CH2Cl2:MeOH (9:1); solvente V,

PhCH3:(CH3)2C=O (1:1); solvente VI, PhCH3:(CH3)2C=O (7:3). Los solventes

empleados fueron purificados por destilación. Las mezclas de solventes están

expresadas en relaciones de volúmenes (v/v).

Como agentes reveladores se utilizaron luz UV (=254 nm y =366 nm), vapores

de I2, vainillina/ H2SO4 (c) con posterior calentamiento en estufa a 110ºC229 y/o FeCl3/

H2SO4 (c) con posterior calentamiento en estufa a 110ºC229.

La cromatografía flash en columna seca230 fue empleada para realizar un

fraccionamiento rápido del extracto crudo de reacción, obteniendo la separación de los

compuestos de acuerdo a sus polaridades. Se emplearon embudos con placa filtrante

de vidrio sinterizado, poro 3 o 4, de diámetro 8.5 cm y altura 6 cm. La muestra se

sembró en pastilla utilizando sílicagel 60 G (Merck) como fase estacionaria y eluyendo

con gradiente de polaridad creciente, según se indica, con aplicación de succión.

La resina de intercambio Dowex 50WX4 (catiónica fuerte, forma H+) fue utilizada

en un cartucho de 3 ml, acondicionada por lavados sucesivos con soluciones acuosas

de NaCl 4N (10 ml) y HCl 4N (10 ml). Finalmente, se lavó con agua destilada varias

veces antes de usarla. Los compuestos fueron eluídos utilizando agua destilada.

5.5. Tratamiento de los datos para PCA

PCA fue aplicado al conjunto de datos representado por matrices de 22 muestras

(compuestos sintetizados 3a-13b) y un número de variables dado según el caso,

utilizando el software MATLAB v. 7.0 (MathWorks Inc.) sin pre-procesamiento de los


213

datos. A partir de los valores de los pesos (loadings) obtenidos, fue generado el gráfico

de puntuaciones (scores) para visualizar las relaciones entre los datos.

Tabla 5.6. Resumen de las intensidades de los iones* observados en los espectros de

masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con calcio (Ca).

Comp 2 1 1

2 1 1 1

2 1 1 2

2 1 1 3

2 1 1 4

1 1

M +

Na

1 1 1

1 1 1 1

1 1 1 2

1 1 1 0 1

1 1 1 1 1

1 1 1 2 1

2 2 1

2 2 1 1

2 2 1 2

2 2 1 3

1 2 1

1 2 1 1

1 2 1 2

1 2 1 0 1

1 2 1 1 1

2 3 1

2 3 1 1

1 3 1 0 1

2 4 1

3a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1 2

3b 1 1 1 1 1 4 3 3 3 1 1 4 3 1 1

4a 1 4 3 1 2 2

4b 2 1 1 1 2 2 1 1 2 4 1 2 2 1 1 1

5a 4 1 1 1 1

5b 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1 1

6a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 1 1

6b 1 1 1 1 4 1 1 2 1 1 2 1 1 3 4 1 1 1

7a 2 2 2 2 1

7b 1 1 4 1 1 2 3 1 1

8a 1 1 4 3 2 1 1 1 2 1

8b 4 1 3 2 2 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1

9a 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 2 4 4 1 1

9b 1 1 1 1 4 1 1 1 1 4

10a 1 1 3 1 4 4 2 2

10b 1 1 2 2 3 4 1 2 2 1 2 1 1 2 2 1

11a 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 3 1 2 1 4 1

11b 4 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1

12a 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 2 1

12b 1 1 1 3 1 1 1 1 1 2 1 1 4 4 2 1 1

13a 2 2 2 2 1 1 1 2 1 2 2 2 4 1 1 1 1

13b 1 1 2 4 1 4 1 1 2 3 2 1 1

* El rango de intensidad relativa se indica con un número: 1 (5-25%); 2 (25-50%); 3 (50-75%); 4 (75-

100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 95).


214


masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con cobre (Cu).

Comp * 1 1

1 1

1 1 1

* 1 1 1

1 1 1 1

* 1 1 1 1

1 1 1 2

1 1 1 0 1

1 2 1

* 1 2 1

2 2 1

2 2 2 0 1

2 2 2 1 1

2 2 2 2 1

2 3 1 1

2 3 2 0 1

2 3 2 1 1

3a 1 4 1 2 3 1 1 1

3b 1 4 1 1 1 1 1 1

4a 2 3 1 4 1 1

4b 4 1 1 1 1

5a 1 3 1 1 4 2 2 1

5b 2 4 1 3 4 1 2 1

6a 4 1 1 2 1 3 2

6b 4 1 2 2 1 1 1

7a 4 1 1 1 1

7b 2 2

8a 1 2 4 4 3

8b 4 1 1 1

9a 4 2 2 2 1 1 1

9b 2 4 1 1 4 1 1

10a 4 1 4 1 1

10b 4 1 1 1

11a 4 1 2 1 1 3

11b 4 1 1 2

12a 3 1 1 2 1 4 1

12b 3 1 2 4 1 4 4 1

13a 1 4 1 1 2 1 1 1 2 1

13b 4 1 2 2 2 1 1


100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 109).


215


masa obtenidos por ESI de los compuestos (M) 3a-13a; 3b-13b con aluminio (Al).

Comp 1 1

1 1 1 1

1 1 1 2

a

1 1 1 1 1

1 1 1 2 1

b

1 1 1 0 2

1 1 1 1 2

1 2 1

1 2 1 1

1 2 1 0 1

1 2 1 1 1

1 2 1 0 2

1 2 2 2 3

1 3 1

1 3 2 1 1

1 3 2 0 2

1 3 2 1 3

3a 4 1

3b 4 1

4a 3 4 1 1

4b 4 1 4 1 1

5a 4 1 2 1

5b 4 4 1 1

6a 4 1

6b 4 1

7a 4 1 1 1 3

7b 4 1 1 1 1 1

8a 2 4 4 1

8b 4 1 2 2 3

9a 3 1 4

9b 4 2

10a 2

10b 4 1

11a 4 1 2 1 1

11b 4 1 1 1

12a 4 1 1

12b 4 1 1

13a 4 2 3 1

13b 4 1 1


100%). Los iones se encuentran identificados con el código numérico (pág. 123). a [M+Al+H2O+CH3OH-2H]+

b [M+Al+Cl+H2O+CH3OH-H]+


216

5.6. Síntesis de los compuestos

En todos los casos, la evaporación de los solventes fue efectuada a temperaturas

menores a 40ºC y a presión reducida en evaporador rotatorio Büchi o en evaporador

centrífugo SpeedVac SC210A.

Los datos de los espectros RMN 13C se encuentran en la tabla 3.16 (pág. 139).

2-Cloropirazina 1-óxido (3a)- 3a fue preparado a partir de 2-cloropirazina 3

adaptando el método de Mixan y Pews124. A una solución enfriada a 10ºC de

cloropirazina 3 (3 mmol, 264 l) en ácido sulfúrico concentrado (2 ml) con agitación,

fue agregado gota a gota persulfato de potasio (3.3 eq, 892 mg) suspendido en 1 ml

de ácido sulfúrico concentrado, manteniendo luego la mezcla de reacción a

temperatura ambiente por 24 horas. La solución fue diluida con 6 ml de agua fría,

neutralizada con KOH y luego extraída con diclorometano (3 10 ml), el cual fue

secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo

proporcionó el producto crudo (276 mg), como un sólido impurificado con el N-óxido

isomérico 3b. Una porción (35.5 mg) fue purificada por cromatografía en capa delgada

preparativa de sílica gel desarrollando la placa sucesivamente 2 veces con el mismo

solvente (Solvente V, Rf 3a 0.67; Rf 3b 0.73) proporcionando 3a puro (11.8 mg).

Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.65 sa (1H, H-3), 8.37 d (1H, J = 4.0 Hz,

H-5), 8.23 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6) (cf. Ref. 124). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 131.0016

(7.1 ppm).

2-Cloropirazina 4-óxido (3b)- 3b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 3

adaptando el método de Sato126. A una solución de cloropirazina 3 (1 mmol, 88 l) en

diclorometano (0.5 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-

cloroperoxibenzoico (mCPBA) (1 eq, 227 mg, 77% pureza) disuelto en 0.5 ml de

diclorometano, y luego la mezcla de reacción fue mantenida a temperatura ambiente

por 7 horas. El solvente fue extraído con solución saturada de bicarbonato de sodio (3

5 ml), luego lavado con agua destilada y finalmente fue secado sobre sulfato de

sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (54

mg), como un sólido impurificado con mCPBA. Una porción (30.7 mg) fue purificada

por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel (Solvente I, Rf 3b 0.68)

proporcionando 3b puro (13.7 mg). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.26

da (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 8.16 dd (1H, J = 1.5; 1.0 Hz, H-3), 8.03 dd (1H, J = 4.0; 1.5

Hz, H-5) (cf. Ref. 124). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 131.0000 (5.1 ppm).


217

Figura 5.2. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-cloropirazina 3a y 3b.


218

2-Aminopirazina 1-óxido (4a)- 4a fue preparada a partir de 2-aminopirazina 4 por

un método similar al método de Sato126. A una solución de 2-aminopirazina 4 (1 mmol,

95.1 mg) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-

cloroperoxibenzoico (mCPBA) (1.4 eq, 318 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de

metanol, y luego la mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente por 24

horas. El pH se ajustó a 9 con amoníaco concentrado y el precipitado fue filtrado. La

evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo, como un sólido

impurificado con mCPBA y el 1,4-dióxido de la 2-aminopirazina. Una porción del

residuo fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel

(Solvente II, Rf 4a 0.34), obteniéndose 4a puro (2.5 mg). Espectro RMN 1H (DMSO-d6,

500 MHz), , ppm: 8.12 d (1H, J = 0.5 Hz, H-3), 8.11 d (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 7.70 d

(1H, J = 4.0 Hz, H-5), 7.02 sa (N-H2) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 112.0507

(1.4 ppm).

2-Aminopirazina 4-óxido (4b)- 4b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 4-

óxido 3b por un método similar al descrito por Klein et al127. Una suspensión de 2-

cloropirazina 4-óxido 3b (0.03 mmol, 4.5 mg) en amoníaco concentrado (48 l) fue

calentado en un vial sellado a 115-120ºC por 2.5 horas. La solución fue diluida con un

pequeño volumen de metanol y concentrada in vacuo hasta sequedad. El residuo

impurificado con el reactivo de partida fue purificado por cromatografía en capa

delgada preparativa de sílica gel (Solvente III, Rf 0.43) proporcionando 4b puro (3.0

mg, 78%) como un sólido cristalino. Espectro de RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), ,

ppm: 7.85 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 7.46 dd (1H, J = 1.5; 0.8 Hz, H-3), 7.45 dd

(1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 6.62 sa (N-H2) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z

112.0510 (4.2 ppm).


219

Figura 5.3. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-aminopirazina 4a y 4b.


220

2-Metilpirazina 1-óxido (5a)- 5a fue preparado a partir de 2-metilpirazina 5 por

una adaptación del método descrito por Sato126. A una solución de 2-metilpirazina 5 (1

mmol, 91.4 l) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-

cloroperoxibenzoíco (mCPBA) (1.1 eq, 257 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de

metanol, manteniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 4 horas. El

solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con cloroformo (3 5 ml). La

evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (89 mg), como un

sólido impurificado con mCPBA y el 1,4-dióxido de la 2-metilpirazina. Una porción fue

purificada por cromatografía en capa delgada preparativa de sílica gel desarrollando la

placa sucesivamente 2 veces con el mismo solvente (Solvente III, Rf 5a 0.44; Rf 5b

0.38) brindando los productos puros 5a (5.2 mg) y 5b (3.3 mg). Espectro RMN 1H

(CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.46 sa (1H, H-3), 8.34 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.14 d (1H,

J = 4.0 Hz, H-6), 2.48 s (3H, CH3) (cf. Ref. 231). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 111.0556 (3.2

ppm).

2-Metilpirazina 4-óxido (5b)- 5b fue preparado a partir de la 2-metilpirazina 3 por

una adaptación del método descrito por Sato126. El procedimiento experimental ha sido

descripto previamente en la síntesis de 5a. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), ,

ppm: 8.36 da (1H, J = 4.0 Hz, H-6), 8.00 m (1H, H-3), 7.96 m (1H, J = 4.0 Hz, H-5),

2.53 sa (3H, CH3) (cf. Ref. 231). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 111.0560 (6.5 ppm).


221

Figura 5.4. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metilpirazina 5a y 5b.


222

2-Acetilpirazina 1-óxido (6a)- 6a fue sintetizado por oxidación de 2-(1-

hidroxietil)pirazina 1-óxido 11a con dióxido de manganeso activado preparado de

acuerdo a Attenburrow et al132. A una solución de 2-(1-hidroxietil)pirazina 1-óxido 11a

(0.03 mmol, 4.4 mg) en cloroformo (1 ml) con agitación, fue agregado un exceso de

dióxido de manganeso activo recién preparado (30 eq, 80 mg aprox), manteniendo la

mezcla de reacción a temperatura ambiente por 24 horas. La suspensión fue filtrada

usando un lecho de Celite y lavada con abundante cloroformo caliente. Después de la

evaporación del solvente orgánico recogido, se obtuvo 6a puro (3.6 mg, 83%) como

cristales.

Pf. 60-62°C. IR (NaBr, film, max cm-1): 3102 ( C-H), 1692 ( C=O), 1586, 1509,

1447, 1413, 1359, 1326 ( N-O), 1283, 1241, 1182, 1098, 1039, 874, 576, 552. UV max

CH3OH nm (log ): 234 (4.3), 274 (4.1). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm:

8.89 sa (1H, H-3), 8.51 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.09 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 2.79

s (3H, CH3). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 139.0497 (3.3 ppm).

2-Acetilpirazina 4-óxido (6b)- 6b fue preparado a partir de 2-acetilpirazina 6 por

un método similar al descrito por Sato126. A una solución de 2-acetilpirazina 6 (0.82

mmol, 100 mg) en metanol (1 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-

cloroperoxibenzoico (0.9 eq, 207 mg, 77% pureza) disuelto en 1 ml de metanol,

manteniendo la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 15 horas. La solución

fue concentrada a un pequeño volumen in vacuo y enfriada en baño de hielo. Parte del

precipitado fue filtrado y lavado con metanol para proporcionar 6b puro (11 mg) como

cristales.

Pf. 151°C (sub), 187-188 °C (descomp). IR (NaBr, film, max cm-1): 3089, 3070,

3057 ( C-H), 1696 ( C=O), 1578, 1421, 1358, 1322 ( N-O), 1279, 1242, 1095, 1002,

910, 858, 750, 596, 534. UV max CH3OH nm (log ): 234 (4.3), 273 (4.1). Espectro

RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.64 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.51 dd (1H, J =

4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.19 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 2.72 s (3H, CH3). HRMS-ESI:

[M+H]+ m/z 139.0511 (6.6 ppm).


223

Figura 5.5. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-acetilpirazina 6a y 6b.


224

2-Carboxipirazina 1-óxido (ácido 1-óxido 2-pirazincarboxílico) (7a)- 7a fue

preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a por un método similar al

descrito por Klein et al127. Una suspensión de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a

(0.095 mmol, 14.6 mg) en amoníaco concentrado (0.5 ml) fue calentada a 115-120ºC

en un vial sellado por 2.5 horas. La solución resultante fue evaporada a sequedad in

vacuo y acidificada con ácido acético. Luego, la solución fue extraída con acetato de

etilo (3 5 ml). La evaporación del solvente in vacuo dio un producto crudo (9 mg),

como un sólido blanco. Una porción del sólido (3 mg aprox.) fue disuelta en agua y

pasada a través de una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La

elución con 10 ml de agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó

el producto 7a (2 mg) como cristales puros. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), ,

ppm: 9.09 da (1H, H-3), 8.80 da (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.63 d (1H, J = 4.0 Hz, H-6) (cf.

Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0288 (4.5 ppm).

2-Carboxipirazina 4-óxido (ácido 4-óxido 2-pirazincarboxílico) (7b)- 7b fue

preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b por un método similar al

descrito por Klein et al128. Un suspensión de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b

(0.05 mmol, 8 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.3 ml) fue calentada a 100-110ºC en un

vial sellado por 2.5 horas. La solución resultante se pasó a través de una columna de

la resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de agua destilada y

la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 7b (8.2 mg; 93%) como

cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 8.63 da (1H, J = 4.0 Hz, H-

6), 8.62 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.50 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz; H-5) (cf. Ref. 129).

HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0299 (3.3 ppm).


225

Figura 5.6. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-carboxipirazina 7a y 7b.


226

2-Hidroxipirazina 1-óxido (8a)- 8a fue preparado a partir de 2-cloropirazina 1-

óxido 3a por un método similar al descrito por Klein et al128. Una suspensión de 2-

cloropirazina 1-óxido 3a (0.08 mmol, 10.4 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.5 ml) fue

calentada a 100-110ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La solución se pasó a través

de una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de

agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 8a (7.5

mg; 62%) como cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 8.11 sa

(1H, H-3), 7.97 d (1H, J = 4.5 Hz, H-6), 7.32 d (1H, J = 4.5 Hz, H-5) (cf. Ref. 232).

HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 113.0351 (4.5 ppm).

2-Hidroxipirazina 4-óxido (8b)- 8b fue preparado a partir de 2-cloropirazina 4-

óxido 3b por un método similar al descrito por Klein et al128. Una suspensión de 2-

cloropirazina 4-óxido 3b (0.03 mmol, 4 mg) en hidróxido de sodio 1N (0.5 ml) fue

calentada a 90-100ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La solución se pasó a través de

una columna de resina Dowex 50WX4 en forma protonada. La elución con 10 ml de

agua destilada y la evaporación a sequedad in vacuo proporcionó el producto 8b (2.2

mg; 47%) como cristales. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 7.56 da

(1H, J = 5.5 Hz, H-6), 7.51 dd (1H, J = 2.0; 0.8 Hz, H-3), 7.15 dd (1H, J = 5.5; 2.0 Hz,

H-5) (cf. Ref. 233). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 113.0347 (1.2 ppm).


227

Figura 5.7. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-hidroxipirazina 8a y 8b.


228

2-Metoxipirazina 1-óxido (9a)- 9a fue preparada a partir de la 2-cloropirazina 1-

óxido 3a por un método similar al descrito por Okada et al129. A una solución enfriada a

5ºC de metóxido de sodio 0.3 M, preparada a partir de sodio (3.4 mg) y metanol (0.5

ml), fue agregado 2-cloropirazina 1-óxido 3a (0.08 mmol, 10.9 mg) con agitación y

enfriamiento, y luego la mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente por

24 horas. El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con

diclorometano. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto 9a (9.3

mg, 88%) como cristales. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.29 sa (1H, H-

3), 8.18 d (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.17 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 4.19 s (3H, CH3) (cf.


2-Metoxipirazina 4-óxido (9b)- 9b fue preparado a partir de la 2-cloropirazina 4-

óxido 3b por un método similar al descrito por Houminer et al130. A una solución

agitada de 2-cloropirazina 4-óxido 3b (0.13 mmol, 16.6 mg) en metanol (0.5 ml) a 5ºC,

fue agregado una solución 0.27 M de metóxido de sodio (0.5 ml). La solución fue

calentada a 90-100ºC en un vial sellado por 2.5 horas. La mezcla de reacción fue

enfriada a temperatura ambiente, diluida con agua (0.5 ml) y extraída con acetato de

etilo (3 x 0.5 ml). El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue solubilizado con

diclorometano. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto 9b (11.4

mg, 71%) como cristales. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.00 da (1H, J

= 4.0 Hz, H-6), 7.78 dd (1H, J = 1.3; 0.8 Hz, H-3), 7.75 dd (1H, J = 4.0; 1.3 Hz, H-5),

4.00 s (3H, CH3) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 127.0512 (8.1 ppm).


229

Figura 5.8. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metoxipirazina 9a y 9b.


230

2-Acetamidopirazina (N-(Pirazin-2-il)acetamida) (10)- 10 fue preparado a partir

de 2-aminopirazina 4 por un método similar al descrito por Zafar et a121. A una solución

de 2-aminopirazina 4 (0.5 mmol, 47.9 mg) en diclorometano (1 ml) a 0ºC fue agregado

anhídrido acético (54.7 l, 1.1 eq). La solución fue agitada por 12 horas a temperatura

ambiente y luego el solvente fue evaporado a presión reducida. El residuo resultante

fue secado bajo vacío por varias horas y el producto seco fue disuelto en hidróxido de

potasio (0.6 mmol, 35 mg) en 1 ml de agua. La solución fue extraída con

diclorometano (3 5 ml) y el extracto orgánico combinado fue secado sobre sulfato de

sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo

(38.1 mg), como un sólido amarillo pálido impurificado con el reactivo de partida. La

mezcla cruda fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa en sílica

gel (Solvente IV, Rf 10 0.5; Rf 4 0.3), obteniéndose el producto 10 (13.2 mg, 19%)

como un sólido blanco cristalino. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.56 sa

(1H, H-3), 8.40 sa (N-H), 8.36 d (1H, J = 2.5 Hz, H-5), 8.23 dd (1H, J = 2.5; 1.5 Hz, H-

6), 2.28 s (3H, CH3) (cf. Ref. 234). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 138.0675 (9.8 ppm).

Figura 5.9. Espectro RMN 1H de 2-acetamidopirazina 10.


231

2-Acetamidopirazina 1-óxido (N-(1-óxido-Pirazin-2-il)acetamida) (10a)- 10a fue

preparado a partir de 2-acetamidopirazina 10 por una adaptación del método descrito

por Sato126. A una solución de 2-acetamidopirazina 10 (0.1 mmol, 13.2 mg) en metanol

(0.5 ml) con agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-cloroperoxibenzoico (mCPBA)

(1.2 eq, 26.6 mg, 77% pureza) disuelto en 0.5 ml de metanol, manteniendo la mezcla

de reacción a temperatura ambiente por 5 horas. El solvente fue evaporado in vacuo y

el residuo fue extraído con diclorometano (3 5 ml). La evaporación del solvente in

vacuo proporcionó el producto crudo (14.6 mg), como un sólido impurificado con el

material de partida y mCPBA. La mezcla cruda fue purificada por cromatografía en

capa delgada preparativa en sílica gel desarrollando la placa sucesivamente 2 veces

con el mismo solvente (Solvente V, Rf 10 0.7; Rf 10a 0.5; Rf 10b 0.4) para

proporcionar en forma pura 8 (6.4 mg), 10a (1.9 mg) y 10b (0.4 mg) como sólidos

cristalinos. Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.67 d (1H, J =

1.0 Hz, H-3), 8.24 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.17 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6), 2.35 s

(3H, CH3) (cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 154.0621 (6.2 ppm).

2-Acetamidopirazina 4-óxido (N-(4-óxido-Pirazin-2-il)acetamida) (10b)- 10b fue

preparado a partir de 2-acetamidopirazina 8 por una adaptación del método descrito

por Sato126. El procedimiento experimental ha sido previamente descrito en la síntesis

de 10a. Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.22 sa (1H, H-3),

8.12 dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 7.88 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 2.23 sa (3H, CH3)

(cf. Ref. 150). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 154.0618 (4.6 ppm).


232

Figura 5.10. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-acetamidopirazina 10a y 10b.


233

2-(1-hidroxietil)pirazina (11)-11 fue sintetizada por reducción121 de 2-acetilpirazina

6. La solución de 2-acetilpirazina 6 (0.8 mmol, 96 mg) en metanol (5 ml) fue tratada

con exceso de borohidruro de sodio a 0ºC y la mezcla fue agitada a temperatura

ambiente por 4 horas. Luego, se agregó agua seguido de unas pocas gotas de ácido

acético. La solución fue extraída con acetato de etilo (3 10 ml) y el extracto orgánico

combinado fue secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in

vacuo proporcionó el producto 9 (69.5 mg, 72%) como un aceite. Espectro RMN 1H

(CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.68 sa (1H, H-3), 8.52 m (2H, H-5 y H-6), 5.00 q (1H, J =

6.5 Hz, C-H), 3.58 sa (O-H), 1.57 d (1H, J = 6.5 Hz, CH3) (cf. Ref. 234). HRMS-ESI:

[M+H]+ m/z 125.0717 (5.9 ppm).

Figura 5.11. Espectro RMN 1H de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11.


234

2-(1-hidroxietil)pirazina 1-óxido (11a)- 11a fue preparado a partir de 2-(1-

hidroxietil)pirazina 11 por una adaptación del método descrito por Sato126. A una

solución de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11 (0.6 mmol, 69.5 mg) en metanol (0.5 ml) con

agitación, fue agregado gota a gota ácido 3-cloroperoxibenzoíco (1.0 eq, 123 mg, 77%

pureza) disuelto en 0.5 ml de metanol, manteniendo la mezcla de reacción a

temperatura ambiente por 4 horas. La mezcla de reacción fue neutralizada con

solución de bicarbonato de sodio saturada (2 ml) y fue extraído con acetato de etilo (3

5 ml). El solvente fue evaporado in vacuo y el residuo fue extraído con diclorometano

(3 3 ml). La evaporación del solvente in vacuo proporcionó el producto crudo (37.9

mg), como un sólido impurificado con el reactivo de partida. Una porción de la mezcla

cruda fue purificada por cromatografía en capa delgada preparativa en sílica gel

desarrollando la placa sucesivamente 2 veces con el mismo solvente (Solvente VI, Rf

11 0.5; Rf 11a 0.3; Rf 11b 0.2) proporcionando en forma pura 9a (6.1 mg) y 11b (6.9

mg) como sólidos cristalinos junto a 11 (9.9 mg).

Pf. 110-112 °C. IR (NaBr, film, max cm-1): 3310 ( O-H), 3082, 3015 ( C-H), 1590,

1464, 1412, 1373, 1308, 1256, 1201, 1108, 1060, 1018, 862, 569. UV max CH3OH nm

(log ): 222 (4.2), 268 (4.0). Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.58 sa (1H,

H-3), 8.46 d (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.13 dd (1H, J = 4.0; 0.8 Hz, H-6), 5.16 dq (1H, J =

6.5; 5.0 Hz, CH), 4.51 d (1H, J = 5.0 Hz, O-H), 1.67 d (3H, J = 6.5 Hz, CH3). HRMS-

ESI: [M+H]+ m/z 141.0658 (0.1 ppm).

2-(1-hidroxietil)pirazina 4-óxido (11b)- 11b fue preparado a partir de 2-(1-

hidroxietil)pirazina 9 por una adaptación del método descrito por Sato126. El

procedimiento experimental ha sido previamente descrito en la síntesis de 11a.

Pf. 146-148 °C (desc). IR (NaBr, film, max cm-1): 3283 ( O-H), 3072, 2991, 2978,

2886 ( C-H), 1593, 1463, 1404, 1360, 1333, 1307, 1277, 1257, 1193, 1156, 1131,

1103, 1067, 1038, 1009, 963, 910, 865, 768, 693, 649, 593. UV max CH3OH nm (log ):

223 (4.2), 269 (4.2) . Espectro RMN 1H (2% CD3OD en CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.41

dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-6), 8.30 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3), 8.01 dd (1H, J = 4.0;

1.5; H-5), 4.90 q (1H, J = 6.5 Hz, CH), 3.99 sa (O-H), 1.55 d (3H, J = 6.5 Hz, CH3).

HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 141.0661 (1.6 ppm).


235

Figura 5.12. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-(1-hidroxietil)pirazina 11a y 11b.


236

2-(Metoxicarbonil)pirazina (2-pirazincarboxilato de metilo) (12)- 12 fue preparado a

partir de 2-carboxipirazina 5 por un método similar al descrito por Ligiero et al123. A una

suspensión bajo agitación de 2-carboxipirazina 5 (4.0 mmol, 499 mg) en 3 ml de

metanol, fue agregado gradualmente 1 ml de ácido sulfúrico gota a gota. Después de

72 horas a temperatura ambiente, se cortó la reacción por el agregado de 7 ml de una

solución acuosa de bicarbonato de sodio 2.5 M. La mezcla fue concentrada bajo

presión reducida, y la solución fue extraída con diclorometano (3 10 ml), secando los

extractos orgánicos combinados sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del

solvente in vacuo proporcionó el compuesto 10 puro (362.4 mg; 65%) como cristales

blancos. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 9.34 d (1H, J = 1.5 Hz, H-3),

8.79 d (1H, J = 2.5 Hz, H-5), 8.73 dd (1H, J = 2.5; 1.5 Hz, H-6), 4.06 s (3H, CH3) (cf.


Figura 5.13. Espectro RMN 1H de 2-metoxicarbonilpirazina 12.


237

2-(Metoxicarbonil)pirazina 1-óxido (2-pirazincarboxilato de metilo, 1-óxido)

(12a)- 12a fue preparada a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12 adaptando el

método de Sato125. A una solución enfriada a 10 ºC de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12

(2.6 mmol, 361.7 mg) en ácido sulfúrico concentrado (2 ml) se agregó gota a gota

persulfato de potasio (1.2 eq, 877 mg) suspendido en 1 ml de ácido sulfúrico

concentrado, con agitación y luego la mezcla de reacción fue mantenida a temperatura

ambiente por 40 horas. La solución fue diluida con 6 ml de agua helada, neutralizada

con KOH y luego extraída con diclorometano (3 10 ml). El solvente fue evaporado in

vacuo y el residuo (171 mg) fue purificado por cromatografía flash en columna seca de

sílica gel eluyendo primero con Cy: AcOEt (9:1) para recuperar el material de partida

12 (27.2 mg). La elución posterior con Cy: AcOEt (6:4) proporcionó el producto puro

12a (25.4 mg) como un sólido cristalino. Una porción del producto puro 12b fue

obtenida por elución con Cy: AcOEt (4:6) (6 mg) como un sólido cristalino. Espectro

RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.89 sa (1H, H-3), 8.49 d (1H, J = 4.5 Hz, H-5),

8.15 dd (1H, J = 4.5; 0.8 Hz, H-6), 4.02 s (3H, CH3) (cf. Ref. 125). HRMS-ESI: [M+H]+

m/z 155.0458 (4.3 ppm).

2-(Metoxicarbonil)pirazina 4-óxido (2-pirazincarboxilato de metilo, 4-óxido)

(12b)- 12b fue preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 12 adaptando el

método de Sato125. El procedimiento experimental ya se ha descrito para la síntesis de

12a. Espectro RMN 1H (CDCl3, 500 MHz), , ppm: 8.76 dd (1H, J = 1.5; 0.5 Hz, H-3),

8.57 dd (1H, J = 4.0; 0.5 Hz, H-5), 8.22 dd (1H, J = 4.0; 1.5 Hz, H-5), 4.06 s (3H, CH3)

(cf. Ref. 125). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 155.0446 (3.3 ppm).


238

Figura 5.14. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-metoxicarbonilpirazina 12a y 12b.


239

2-Carbamoilpirazina 1-óxido (2-pirazincarboxamida, 1-óxido) (13a)- 13a fue

preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 10a por un método similar al

descrito por Bundesmann, et al131. A un vial de reacción equipado con una barra

agitadora magnética bajo atmósfera de nitrógeno, conteniendo 2-

(metoxicarbonil)pirazina 1-óxido 12a (0.06 mmol, 10 mg) y cloruro de amonio (0.28

mmol, 15 mg) fueron agregados 0.5 ml de una solución de metóxido de magnesio 0.21

M en metanol. El vial de reacción fue sellado y calentado a 80ºC por 24 horas. La

mezcla de reacción fue concentrada y tratada con 1 ml de solución saturada de cloruro

de amonio y luego 1 ml de agua. La mezcla resultante fue ajustada a pH 5 con ácido

clorhídrico, y fue agitada por 20 min para disolver las sales de magnesio. La solución

fue extraída con acetato de etilo (3 5 ml) y el extracto orgánico combinado fue

secado sobre sulfato de sodio anhidro. La evaporación del solvente in vacuo

proporcionó el producto crudo (9.3 mg) como un sólido, impurificado con el producto

hidrolizado 7a. Una porción fue purificada por cromatografía en capa delgada

preparativa en sílica gel (Solvente IV, Rf 13a 0.5; Rf 7a 0.1) para dar 13a puro (3 mg)

como un sólido cristalino. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm: 9.24 sa (N-

H), 9.14 sa (1H, H-3), 8.67 da (1H, J = 4.0 Hz, H-5), 8.49 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6),

8.37 sa (N-H) (cf. Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z 140.0457 (2.0 ppm).

2-Carbamoilpirazina 4-óxido (2-pirazincarboxamida, 4-óxido) (13b)- 13b fue

preparado a partir de 2-(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 12b por un método similar al

descrito por Bundesmann, et al131. A un vial de reacción equipado con una barra

agitadora magnética bajo atmósfera de nitrógeno, conteniendo 2-

(metoxicarbonil)pirazina 4-óxido 10b (0.05 mmol, 7 mg) y cloruro de amonio (0.17

mmol, 9 mg) fueron agregados 0.5 ml de una solución de metóxido de magnesio 0.21

M en metanol. El vial de reacción fue sellado y calentado a 80ºC por 24 horas. La

mezcla de reacción fue concentrada y tratada con 1 ml de solución saturada de cloruro

de amonio y luego 1 ml de agua. La mezcla resultante fue ajustada a pH 5 con ácido

clorhídrico, y fue agitada por 20 min para disolver las sales de magnesio, luego de lo

cual la amida precipitada fue filtrada, lavada con agua y secada para dar 13b puro (3

mg, 47%) como un sólido cristalino. Espectro RMN 1H (DMSO-d6, 500 MHz), , ppm:

8.58 dd (1H, J = 4.0; 1.0 Hz, H-6), 8.54 dd (1H, J = 2.0; 1.0 Hz, H-3), 8.48 dd (1H, J =

4.0; 2.0 Hz, H-5), 8.29 sa (N-H), 8.01 sa (N-H) (cf. Ref. 129). HRMS-ESI: [M+H]+ m/z

140.0464 (6.6 ppm).


240

Figura 5.15. Espectros RMN 1H de los N-óxidos de 2-carbamoilpirazina 13a y 13b.


241

5.7. Métodos computacionales

Todos los cálculos fueron realizados usando el paquete computacional Gaussian

03235.

5.7.1. Optimización de geometrías

Las geometrías de las moléculas neutras o cargadas, así como los estados de

transición, fueron optimizadas empleando el funcional híbrido B3LYP73,74 de la teoría

del funcional de la densidad (DFT), variando el conjunto de funciones base empleado

según el caso. En los estudios de la sección 2.3 (pág. 34), se utilizó el conjunto de

funciones base 6-31++G(d,p) mientras que en la sección 2.5 (pág. 56), fue usado el

conjunto de funciones base 6-31+G(d,p) para obtener las geometrías de los complejos

neutros, monocargados y dicargados. Este mismo conjunto de funciones base fue

también utilizado en las secciones 4.3 y 4.4 para realizar una primera búsqueda de la

geometría de los complejos correspondientes a puntos estacionarios, que una vez

hallados fueron reoptimizados usando el conjunto de funciones base 6-311+G(d,p).

Para los sistemas de capa abierta (doblete o triplete) estudiados en el capítulo 2,

fueron usados cálculos sin restricciones de spin (UB3LYP).

Los estados de transición en las secciones 2.3 y 4.4, fueron localizados (en

primera aproximación) realizando barridos de la superficie de energía potencial (SEP).

Partiendo de un punto estacionario mínimo de la SEP, se varió con un paso discreto

una de las coordenadas internas de la estructura asociada con la coordenada de

reacción buscada, realizando optimizaciones de geometría de la estructura para cada

variación hasta encontrar un máximo. Las SEPs para el estado singulete y triplete

estudiadas en la sección 2.3 se obtuvieron por el mismo método pero variando

discretamente dos de las coordenadas internas mientras se optimizaban las

coordenadas restantes para cada par de valores.

5.7.2. Cálculo de las funciones de Fukui

Los sitios más probables de protonación para las moléculas neutras de la sección

2.3 y los complejos con calcio neutros y cargados de la sección 2.5 fueron

determinados a través del análisis de la función electrofílica de Fukui (Apéndice A.1,

pág. 257). Para determinar la función electrofílica condensada de Fukui empleando la

ecuación A.1.3, se calcularon las poblaciones electrónicas de los átomos (ρk), usando


242

los esquemas de partición de la densidad electrónica conocidos como análisis de

población de Mulliken (MPA)80 y análisis de población natural (NPA)81, sobre la

geometría optimizada correspondiente a la estructura de la molécula de interés. Por un

lado, se realizó el cálculo con una multiplicidad singulete y carga cero para la especie

neutra (N electrones), y por otro lado, se repitió el cálculo con una multiplicidad doblete

y carga +1 (N-1 electrones), empleando en este caso el cálculo sin restricciones de

spin (Apéndice A.2). En el caso de los complejos monocargados de la sección 2.5, el

cálculo inicial se realizó sobre la geometría optimizada del complejo con una

multiplicidad singulete y carga +1 (N electrones), repitiendo el cálculo con una

multiplicidad doblete y carga +2 (N-1 electrones), empleando nuevamente el cálculo

sin restricciones de spin en este caso. En las Tablas 5.9, 5.11 y 5.12 se muestran los

valores obtenidos por aplicación de esta metodología.

La determinación de la función condensada de Fukui empleando la ecuación A.1.7

(Apéndice A.1, pág. 257) utilizada en la sección 2.3, se realizó a partir de un cálculo de

orbitales moleculares sobre la estructura de la molécula de interés, recogiendo los

coeficientes de los orbitales atómicos correspondientes al orbital molecular ocupado

de mayor energía (HOMO). Luego, elevando al cuadrado cada coeficiente y realizando

la suma total de los mismos, fueron normalizados. De esta manera, la suma de las

funciones condensadas de Fukui resulta igual a 1 y se obtienen valores comparables a

los de las metodologías anteriores. Finalmente, la función condensada de Fukui sobre

cada átomo fue calculada sumando los coeficientes al cuadrado normalizados

pertenecientes a los orbitales centrados sobre dicho átomo. Los valores obtenidos por

esta aproximación se recogen en la Tabla 5.10.


243

Tabla 5.9. Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fK-) para los

N-óxidos isómeros de hidroxipiridina.

Método MPA fk

– NPA fk– HOMO fk

–

Sitio (k) 1a 1b 2 1a 1b 2 1a 1b 2

N-1 0.05 -0.01 -0.01 0.08 -0.02 -0.05 0.19 0.10 0.04

C-2 -0.04 0.01 0.03 -0.02 0.08 0.07 0.03 0.11 0.07

C-3 0.16 0.07 0.00 0.15 0.02 0.01 0.15 0.01 0.02

C-4 -0.02 0.08 0.19 0.00 0.13 0.20 0.00 0.10 0.19

C-5 0.16 0.07 0.00 0.19 0.07 -0.01 0.20 0.06 0.01

C-6 0.02 0.01 0.07 0.05 0.04 0.13 0.06 0.03 0.14

N-O 0.12 0.37 0.37 0.11 0.40 0.40 0.09 0.51 0.51

C-O 0.25 0.12 0.07 0.27 0.11 0.06 0.29 0.09 0.02

Los valores en negrita indican el sitio de protonación más probable para cada estructura.

Tabla 5.10. Energías de protonación (kcal mol-1) para los N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina.

1-hidroxipiridina

-2-ona 1a 2-hidroxipiridina

N-óxido 1b 3-hidroxipiridina

N-óxido 2 Posición dEa dE relb dEa dE relb dEa dE relb

N-1 -177.6 39.96 c c -176.9 48.79

C-2 -167.6 50.01 -172.5 47.36 -197.7 28.01

C-3 -198.7 18.86 c c -153.5 72.20

C-4 -164.9 52.69 -183.2 36.63 -199.9 25.83

C-5 -198.5 19.08 c c -166.9 58.80

C-6 -170.9 46.70 -183.8 36.07 -201.1 24.63

N-O c c -219.8 0 -225.7 0

C-O -217.6 0 c c -171.3 54.34

Los valores en negrita indican el sitio de protonación más favorable para cada isómero. a dE: diferencia de energía entre la molécula neutra y protonada

b dE rel: diferencia de energía relativa a la estructura protonada más estable de cada isómero.

c Iones inestables.


244

Tabla 5.11 Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico (fk-)

calculadas para los complejos neutros con calcio y dos ligandos de N-óxidos de

hidroxipiridina.

Método MPA fk

– NPA fk-

Sitio (k) 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C

N-1 0.02 0.02 0.01 0.00 0.02 -0.01 -0.01 -0.02

C-2 -0.02 0.03 0.04 -0.01 0.02 0.08 0.08 0.01

C-3 0.07 0.03 0.01 0.03 0.04 -0.02 -0.02 0.00

C-4 0.00 0.06 0.06 0.09 0.02 0.08 0.07 0.11

C-5 0.08 0.00 0.00 -0.01 0.08 0.00 0.01 -0.01

C-6 -0.01 0.05 0.04 0.05 0.00 0.10 0.08 0.09

O(I) 0.11 0.02 0.05 0.15 0.11 0.02 0.05 0.17

O(II) 0.09 0.14 0.13 0.05 0.09 0.16 0.15 0.05

Ca 0.01 0.02 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.02

N-1’ 0.02 0.02 -0.01 0.00 0.02 -0.01 -0.02 -0.02

C-2’ -0.02 0.03 -0.01 -0.01 0.02 0.08 0.01 0.01

C-3’ 0.07 0.03 0.02 0.03 0.04 -0.02 0.00 0.00

C-4’ 0.00 0.06 0.09 0.09 0.02 0.08 0.11 0.11

C-5’ 0.08 0.00 -0.01 -0.01 0.08 0.00 -0.01 -0.01

C-6’ -0.01 0.05 0.05 0.05 0.00 0.10 0.08 0.09

O(I’) 0.11 0.02 0.16 0.15 0.11 0.02 0.17 0.17

O(II’) 0.09 0.14 0.06 0.05 0.09 0.16 0.06 0.05

Los valores en negrita indican los sitios de protonación más probables para cada complejo.


245

Tabla 5.12 Funciones condensadas de Fukui para el ataque electrofílico calculadas

para los complejos monocargados con calcio y dos ligandos de N-óxidos de

hidroxipiridina.

Método MPA fk

– NPA fk-

Sitio (k) 1C-IHa 1C-IHb I,II’-

2C-IIHa II,II’-

2C-IHa 1C-IHa 1C-IHb I,II’- 2C-IIHa

II,II’- 2C-IHa

N-1 0.02 0.02 0.03 0.03 0.01 0.01 0.00 -0.01

C-2 -0.02 -0.02 0.02 -0.07 0.00 0.00 0.00 0.01

C-3 0.07 0.06 -0.02 0.08 0.05 0.04 0.00 0.01

C-4 -0.01 -0.01 0.05 0.04 0.01 0.01 0.03 0.06

C-5 0.05 0.05 0.01 0.01 0.06 0.05 0.01 0.01

C-6 0.01 0.01 0.02 0.04 0.02 0.02 0.04 0.07

O(I) 0.01 0.01 0.05 0.05 0.02 0.01 0.04 0.05

O(II) 0.06 0.05 0.01 0.07 0.06 0.04 0.01 0.08

Ca 0.03 0.02 0.03 0.04 0.01 0.01 0.01 0.01

N-1’ 0.04 0.02 0.00 0.01 0.04 0.03 -0.01 -0.01

C-2’ -0.03 -0.03 0.02 -0.03 0.02 0.04 0.02 0.02

C-3’ 0.11 0.10 0.04 0.08 0.08 0.05 0.02 0.03

C-4’ -0.01 0.00 0.10 0.07 0.01 0.03 0.16 0.12

C-5’ 0.10 0.10 0.01 0.01 0.13 0.12 -0.02 -0.01

C-6’ 0.01 -0.01 0.06 0.05 0.03 0.01 0.13 0.12

O(I’) 0.08 0.17 0.22 0.12 0.09 0.18 0.24 0.13

O(II’) 0.16 0.13 0.12 0.12 0.17 0.14 0.13 0.13

Los valores en negrita indican los sitios de protonación más probables para cada complejo.


246

5.7.3. Caracterización de las estructuras calculadas

Las estructuras optimizadas fueron caracterizadas por análisis de frecuencias

armónicas como mínimos locales (todas las frecuencias reales) o puntos de

ensilladura de primer orden (una frecuencia imaginaria). En la sección 2.3, se

realizaron además cálculos de coordenada de reacción intrínseca (IRC)91 para verificar

que las estructuras de los estados de transición localizadas estuvieran conectadas con

los puntos estacionarios mínimos correspondientes a reactivos y productos.

Las energías relativas fueron siempre calculadas incluyendo correcciones para la

energía vibracional de punto cero (ZPE) usando el mismo nivel de teoría. En la sección

2.3 (pág. 34), se realizaron además lecturas de energía (single point) empleando el

método MP2 sobre el conjunto de estructuras optimizadas, utilizando para los sistemas

de capa abierta, cálculos de capa abierta restringidos (ROMP2). Los valores obtenidos

a partir de estos cálculos se muestran en la Tabla 5.13. En las Tablas 5.14 y 5.19 se

encuentran los valores energéticos de las estructuras calculadas para los complejos

de calcio con los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina y dihidroxibencenos,

respectivamente.

En la sección 4.3 (pág. 170), las frecuencias vibracionales armónicas fueron

escaladas por un factor de 0.98 y 0.95, en las regiones de la huella digital y de

estiramiento O-H, respectivamente, para su comparación con los espectros IRMPD.

Los espectros de barras de IR calculados fueron convolucionados con una función

gausiana con un ancho a media altura (FWHM) de 10 cm-1 para facilitar la

comparación con los espectros experimentales.

Las Tablas 5.15-5.18 y 5.20-5.22 reunen algunos parámetros geométricos

seleccionados de las estructuras calculadas para los complejos de calcio con los N-

óxidos isómeros de hidroxipiridina y dihidroxibencenos, respectivamente.


247

Tabla 5.13. Energía total, corrección de energía de punto cero y valor esperado de spin de las estructuras calculadas para los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina.

Estructura

UB3LYP/6-31++G(d,p)

ROMP2/ 6-31++G(d,p) // UB3LYP/

6-31++G(d,p)

Energía total (hartree)

Corrección ZPE

(hartree) <S

2> Energía total (hartree)

[I+H] -399.06391 0.10931 0.00000 -397.92695

[II+H] -399.06301 0.10992 0.00000 -397.92635

[III+Ha] -399.05554 0.10922 0.00000 -397.92080

[III+Hb] -399.05697 0.10916 0.00000 -397.92255

[I+H-(N)OH] -323.21172 0.09226 0.76510 -322.25905

[II+H-(N)OH] -323.22231 0.09264 0.76520 -322.27118

[I/II+H-(C)OH] -323.13004 0.09158 0.75850 -322.18131

[III+Ha-(N)OH] -323.20660 0.09167 0.76140 -322.25622

[III+H-(C)OH] -323.13341 0.09187 0.75750 -322.18624

[III+Hb-(N)OH] -323.20712 0.09164 0.76120 -322.25692

[I+H]t -398.94195 0.10514 2.01570 -397.77930

[II+H]t -398.94532 0.10499 2.00590 -397.78893

[III+Ha]t -398.95109 0.10558 2.02850 -397.78766

[III+Hb]t -398.95212 0.10555 2.02690 -397.78931

[I+H]‡t -398.94092 0.10406 2.01070 -397.78048

[II+H]‡t -398.94489 0.10388 2.01750 -397.78619

[III+Ha]‡t -398.94668 0.10416 2.02830 -397.78691

[III+Hb]‡t -398.94757 0.10418 2.02690 -397.78807 [II+H]‡s -398.98183 0.10523 0.00000 -397.83833

[II+H-H2O]s -322.54312 0.07952 0.00000

-321.60572

[II+H-H2O]t -322.53686 0.07705 2.04400 -321.57793

[I/II+H]‡s -399.05579 0.10848 0.00000 -397.92091

[I/II+H]‡t -398.92886 0.10338 2.01480 -397.76685

OH -75.73913 0.00843 0.75240 -75.54112

H2O -76.43412 0.02126 0.00000 -76.23337


248

Tabla 5.14. Energía total y corrección de energía de punto cero de las estructuras

calculadas para los complejos con calcio y los N-óxidos isómeros de hidroxipiridina

calculados al nivel de teoría B3LYP/6-31+G(d,p).

Estructura Energía total (hartree)

Corrección ZPE (hartree)

Estructura Energía total

(hartree) Corrección

ZPE (hartree)

1C -1473.97744 0.17314 I,I’-2C -1473.81723 0.17068

1C-IHa -1474.34040 0.18566 I,II’-2C -1473.83091 0.17062

1C-IHb -1474.33903 0.18612 II,II’-2C -1473.84000 0.17110

1C-IHc -1474.33097 0.18551 I,I’-2C-IIHa -1474.24450 0.18507

1C-IIHa -1474.33207 0.18605 I,II’-2C-IIHa -1474.25434 0.18539

1C-IIHb -1474.33201 0.18608 I,II’-2C-IIHb -1474.24274 0.18484

1C-IIHc -1474.32521 0.18583 II,II’-2C-IHa -1474.25915 0.18348

1C-I,II’Ha -1474.58504 0.19744 II,II’-2C-IHb -1474.25535 0.18437

1C-I,II’Hb -1474.58214 0.19645

II,II’-2C-IHc -1474.23206 0.18373

1C-I,I’Ha -1474.56989 0.19711 I,II’-2C-I’,IIHa -1474.55631 0.19689

H2O -76.43405 0.02130

I,II’-2C-II,II’Ha -1474.49304 0.19692

H3O+ -76.70777 0.03430

II,II’-2C-I,II’Ha -1474.49551 0.19751

CH3OH -115.73487 0.05123

II,II’-2C-I,I’Ha -1474.55737 0.19634

CH3OH2+ -116.03328 0.06416

II,II’-2C-I,I’Hb -1474.55740 0.196436

Ca(II) -676.86695

1 -398.71701 0.09694 2 -398.69575 0.09694


249

Tabla 5.15. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos neutros con

calcio y dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.

Longitud Enlace (Å) 1C I,I’-2C I,II’-2C II,II’-2C

N-O(I) 1.341 1.353 1.355 1.282

N-O(I’) 1.341 1.353 1.283 1.282

C-O(II) 1.276 1.250 1.244 1.313

C-O(II’) 1.276 1.250 1.315 1.313

O(I)-Ca 2.314 2.122 2.294 -

O(II)-Ca 2.317 - 2.239 2.241

Ángulo Enlace (º)

O(I)-Ca-O(I’) 131.9 177.6 - -

O(II)-Ca-O(II’) 132.7 - - 150.1

O(I)-Ca-O(II’) 132.5 - 147.5 -

Tabla 5.16. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos monocargados

con calcio y dos ligandos de N-óxidos de 2-hidroxipiridina 1.

Longitud Enlace (Å) 1C-IHa 1C-IHb 1C-IHc 1C-IIHa 1C-IIHb 1C-IIHc

N-O(I) 1.388 1.390 1.376 1.326 1.326 1.342

N-O(I’) 1.365 1.347 1.353 1.350 1.354 1.353

C-O(II) 1.269 1.267 1.288 1.354 1.354 1.324

C-O(II’) 1.282 1.300 1.289 1.289 1.285 1.289

O(I)-Ca 2.639 2.681 - 2.325 2.323 2.258

O(II)-Ca 2.278 2.283 2.278 2.517 2.515 -

O(I’)-Ca 2.347 2.259 2.249 2.258 2.280 2.249

O(II’)-Ca 2.257 2.316 2.245 2.279 2.257 2.244

O(I)-H 1.032 1.007 0.980 - - 2.024

O(II)-H - - 2.001 0.971 0.971 0.977

O(I’)-H 1.568 - - - - -

O(II’)-H - 1.684 - - - -


250

Tabla 5.17. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos monocargados

con calcio y dos ligandos de N-óxidos de 3-hidroxipiridina 2.

Longitud Enlace (Å)

I,I’-2C- IIHa

I,II’-2C- IIHa

I,II’-2C- IIHb

II,II’-2C -IHa

II,II’-2C -IHb

II,II’-2C -IHc

N-O(I) 1.343 1.343 1.333 1.361 1.360 1.390

N-O(I’) 1.357 1.317 1.294 1.336 1.330 1.300

C-O(II) 1.330 1.322 1.349 1.315 1.314 1.300

C-O(II’) 1.264 1.326 1.318 1.321 1.322 1.316

O(I)-Ca 2.211 2.194 2.192 - - -

O(II)-Ca - - - 2.179 2.175 2.197

O(I’)-Ca 2.268 - - - - -

O(II’)-Ca - 2.165 2.229 2.169 2.185 2.230

O(I)-H - - - 1.101 1.059 0.975

O(II)-H 0.993 1.020 0.968 1.362 1.461 -

O(I’)-H - 1.588 - - - -

O(II’)-H 1.744 - - - - -

Tabla 5.18. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos dicargados con

calcio y dos ligandos de N-óxidos de hidroxipiridina.

LongitudEnlace (Å)

1C-I,II’Ha

1C-I,II’Hb

1C-I,I’Ha

I,II’-2C -I’,IIHa

I,II’-2C -II,II’Ha

II,II’-2C -I,II’Ha

II,II’-2C -I,I’Ha

II,II’-2C -I,I’Hb

N-O(I) 1.410 1.412 1.410 1.339 1.345 1.373 1.387 1.387

N-O(I’) 1.332 1.353 1.410 1.387 1.274 1.293 1.387 1.387

C-O(II) 1.271 1.273 1.272 1.341 1.340 1.323 1.308 1.308

C-O(II’) 1.377 1.324 1.272 1.310 1.416 1.428 1.308 1.308

O(I)-Ca 2.668 2.676 2.663 2.168 2.131 - - -

O(II)-Ca 2.244 2.228 2.240 - - 2.122 2.167 2.167

O(I’)-Ca 2.247 2.193 2.662 - - - - -

O(II’)-Ca 2.558 - 2.241 2.159 2.406 2.423 2.167 2.167

O(I)-H 0.975 0.975 0.975 - - 0.996 0.976 0.976

O(II)-H - - - 0.969 0.970 - - -

O(I’)-H - 2.089 0.975 0.976 - 1.773 0.976 0.976

O(II’)-H 0.972 0.972 - - 0.973 0.973 - -


251

Tabla 5.19. Energía total y corrección de energía de punto cero de las estructuras

calculadas para los complejos con calcio y los dihidroxibencenos calculados al nivel de

teoría B3LYP/6-311+G(d,p).

Estructura Energía total (hartree)

Corrección ZPE (hartree)

Estructura Energía total

(hartree) Corrección ZPE

(hartree)

21a -382.80698 0.10830 22a -382.80647 0.10818

21b -382.80021 0.10808 22Da1 -1519.26821 0.24449

21Ca -1059.89127 0.10918 22Da2 -1519.26751 0.24448

21Cb -1059.88584 0.10886 22Da3 -1519.26758 0.24508

21Cc -1059.88409 0.10881 22Ha -383.10201 0.11996

21Cd -1059.87928 0.11007 22TSC1 -1519.19343 0.24207

21Ce -1059.85129 0.10936 22TSC2 -1519.19329 0.24221

21Cf -1059.85141 0.11031 22PA -1442.75392 0.21879

21Cg -1059.83786 0.10568

22PB -1136.38120 0.13385

21Ch -1059.83360 0.10396 22PC -1136.14580 0.12216

21Da -1519.31290 0.24491

H2O -76.45846 0.02130

21Db -1519.29657 0.24503

21Dc -1519.29485 0.24547

21Dd -1519.29011 0.24429

21De -1519.25917 0.24440

21Ea -1595.81379 0.26936

21Eb -1595.81128 0.26912

21Ha -383.10646 0.12041

21TSA -1519.29433 0.24512

21TSB -1519.29442 0.24521

21TSC -1519.22064 0.24347

21PA -1442.80332 0.22011

21PB -1136.40639 0.13463

21PC -1136.16674 0.12305


252

Tabla 5.20. Parámetros geométricos seleccionados para los complejos

microhidratados dicargados con calcio y dos ligandos de catecol.

Ángulo Enlace (°) 21Da 21Db 21Dc 21Ea 21Eb

O1-Ca-O2 68.3 69.3 69.3 66.8 66.9

O1-Ca-O3 121.2 127.3 125.5 99.6 113.1

O1-Ca-O4 104.5 136.5 160.1

O1-Ca-O5 119.6 115.8 118.5 90.0

O2-Ca-O3 130.9

O3-Ca-O5 89.7

O4-Ca-O5 30.0

Ph1(plano)-Ca-O5 114.9 90.0

Ph1(plano)-Ph2(plano) 130.2 90.0 118.5

Tabla 5.21. Parámetros geométricos seleccionados para las estructuras de los puntos

estacionarios calculados a partir de [Ca(catecol)2(H2O)]2+ (21Da).

Ángulo Enlace (°) 21Dd 21De 21TSA 21TSB 21TSC 21PA 21PB 21PC

O1-Ca-O2 68.7 70.3 69.3 69.2 68.1 69.8 71.0 67.1

O1-Ca-O3 106.3 119.9 119.6 132.3 129.0 135.7

O1-Ca-O4

O1-Ca-O5 115.1 128.9 111.4 120.5 136.3

O2-Ca-O3 152.0 123.1

O3-Ca-O5 102.1 34.3 99.3 26.6

O4-Ca-O5 47.6

Ph1(plano)-Ca-O5 143.9 150.4 142.2 150.5

Ph1(plano)-Ph2(plano) 175.1 90.3 89.8


253

Tabla 5.22. Parámetros geométricos seleccionados para las estructuras de los puntos

estacionarios calculados a partir de [Ca(resorcinol)2(H2O)]2+.

Ángulo Enlace(°) 22Da1 22Da2 22Da3 22TSC1 22TSC2 22PA 22PB 22PC

O1-Ca-O2 118.3 110.9 105.6 152.7 141.5 141.2

O1-Ca-O5 110.6 111.7 127.2 136.1 136.2 135.4 137.7

O3-Ca-O5 127.5 127.0 24.3 26.8

O4-Ca-O5 43.8 43.6 45.4


254

255

Conclusiones generales y perspectivas

Si bien la espectrometría de masa puede parecer una técnica analítica poco

adecuada para diferenciar isómeros, la exploración de los caminos de disociación de

las moléculas protonadas puede mostrar diferencias significativas tal como se observó

para algunos de los ejemplos estudiados. Más aún, el empleo de soluciones de iones

metálicos agregadas a soluciones de los compuestos, generó especies características

o bien, perfiles de iones con distintas intensidades relativas que permitieron la

distinción entre isómeros en todos los casos estudiados. Una ventaja que presentan

las metodologías propuestas es que no requieren pretratamiento alguno de la muestra

más que su disolución en un solvente adecuado, pudiendo introducirse la solución del

metal ya sea por inyección directa o después de una separación cromatográfica.

La espectrometría de masa utilizando ionización por electrospray se complementó

bien con otras técnicas espectroscópicas, como la espectroscopía infrarroja (IR) o de

resonancia magnética nuclear (RMN), posibilitando en conjunto la elucidación o

caracterización estructural de moléculas orgánicas libres o formando complejos con

metales. En la actualidad existen equipos que acoplan la espectrometría de masa a las

técnicas espectroscópicas anteriores, IR y RMN, aunque sólo la primera

(espectroscopia IRMPD) permite aumentar la información estructural de los iones ya

que puede realizarse en fase gaseosa sobre las especies seleccionadas por su

relación m/z. Sin embargo, la realización de experimentos de espectroscopia IRMPD

se encuentra aún restringida a unos pocos laboratorios por el equipamiento e

infraestructura necesaria.

Por otro lado, en este trabajo, el análisis de isómeros de posición permitió estudiar

el efecto que tienen ciertas diferencias estructurales sobre las especies observadas

(molécula protonada y iones aducto con metales), que fueron interpretadas mediante

simulaciones computacionales. La diferenciación entre isómeros planteó

particularidades para cada sistema estudiado, tanto por los resultados experimentales

obtenidos como por las estrategias para su modelado, ilustrando la variedad de

factores que contribuyen a la observación de las especies registradas en los espectros

de masa. Así, para el análisis de los iones aducto formados por complejación con

Conclusiones y perspectivas

256

calcio, con los isómeros de dihidroxibenceno fue necesario considerar la estabilidad

frente a los caminos de disociación, mientras que con los N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina fue suficiente considerar la estabilidad relativa de las distintas especies

cargadas. Con los isómeros N-óxidos de pirazina se propuso un análisis exploratorio

por PCA de los datos debido a la dispersión de los mismos por influencia del grupo

sustituyente.

El efecto del sustituyente en particular, y la estructura base del anillo aromático en

general, demostró tener un papel fundamental en los espectros de masa obtenidos por

las metodologías ensayadas. Esto quedó en evidencia con la sustitución del grupo N-

óxido por un grupo fenol en los dihidroxiarenos, y el efecto de los sustituyentes en los

N-óxidos de pirazinas comparado con el sistema modelo de N-óxidos isómeros de

hidroxipiridina. En cambio, a través del análisis quimiométrico de los datos de RMN de

carbono-13 de los N-óxidos de pirazinas, pudo separarse el efecto del sustituyente de

forma independiente a la posición del grupo N-óxido, ponderando así su efecto.

Las metodologías desarrolladas en este trabajo no habían sido aplicadas con

anterioridad a la diferenciación de isómeros. Si bien mediante su aplicación se

encontraron diferencias entre isómeros, en general, el desafío estuvo en la

interpretación de las mismas. El conjunto de compuestos estudiado permitió evaluar

los alcances de las metodologías dejando vislumbrar algunos de los factores a

considerar para el análisis de sistemas similares más complejos. Otras estrategias que

podrían plantearse en el futuro para incorporar otros sistemas consisten en el análisis

de los complejos cargados presentes en las soluciones de los iones metálicos con los

compuestos a estudiar. De esta manera, podría investigarse si las especies

observadas en solución para distintos isómeros son transferidas sin alteraciones a la

fase gaseosa o si ocurren transformaciones durante la generación de los iones aducto

en la fuente de ionización. La comprensión de los procesos de formación de iones

podría sugerir qué propiedades energéticas y/o estructurales de las moléculas son

responsables de las especies observadas en los espectros de masa.

257

Apéndice

A.1. Funciones de Fukui

Durante una reacción química, la densidad electrónica del estado fundamental se

redistribuye, lo que puede racionalizarse en términos de la respuesta del sistema a un

cambio en el número de partículas N y/o el potencial externo v(r) (generado por los

núcleos)236. Las funciones de Fukui son índices locales que proveen información

relacionada con la reactividad en diferentes posiciones de una molécula. El concepto

se retrotrae a la teoría de orbitales frontera introducida por Fukui237, donde se

reconoce la importancia de éstos como factores que gobiernan la regioselectividad de

las reacciones químicas.

La función de Fukui de una molécula se define238 como la derivada de la densidad

electrónica ρ(r) respecto a un cambio en el número de electrones:

)(

)()(

rN

rrf

(A.1.1)

Como la densidad electrónica ρ(r) es una función discontinua del número de

electrones N, se utilizan distintos descriptores de reactividad para los ataques

electrofílico ( f ) y nucleofílico ( f ), en el cual un electrón es removido o adicionado

al sistema, respectivamente. Las funciones condensadas de Fukui se obtienen a partir

de integraciones aproximadas de las funciones de Fukui sobre regiones atómicas

concretas79. Dentro de la aproximación de diferencias finitas, la función de Fukui

condensada para un dado átomo k, puede ser calculada por las siguientes ecuaciones:

)()1( NNf kkk (A.1.2)

)1()( NNf kkk (A.1.3)

donde, ρk(N), ρk(N+1) y ρk(N-1) es la población electrónica del átomo k para la

especie neutra (N electrones) y para los correspondientes anión (N+1) y catión (N-1).

La población electrónica de las distintas especies se calculan usando la geometría

Apéndice

258

molecular de la especie neutra (como referencia) dado el requerimiento de potencial

externo v(r) constante en la ecuación (A.1.1).

Las funciones condensadas de Fukui poseen un único valor para cada átomo k de

la molécula aunque el mismo depende naturalmente de la aproximación involucrada

en la definición de la región atómica y más aún en la elección del análisis de población

para el cálculo de las cargas atómicas, que a diferencia de la densidad electrónica, no

son observables mecánico-cuánticos.

Por otro lado, las funciones de Fukui también pueden ser estimadas mediante la

teoría de los orbitales frontera239, mediante las fórmulas:

)()()()()(22

rrrrrf LUMOLUMOLUMOLUMO (A.1.4)

)()()()()(22

rrrrrf HOMOHOMOHOMOHOMO (A.1.5)

donde α y β se refieren al spin del electrón, y HOMO y LUMO a los orbitales

moleculares frontera, siendo HOMO el más alto ocupado y LUMO el más bajo

desocupado.

Al expandir los orbitales frontera en las ecuaciones (A.1.4) y (A.1.5) en término de

las funciones de base atómicas e integrando sobre coordenadas espaciales para

cumplir la condición de normalización se obtienen las funciones condensadas de

Fukui82:

OA

k

LUMOLUMOOA

k

LUMOk Scccf

2

(A.1.6)

OA

k

HOMOHOMOOA

k

HOMOk Scccf

2

(A.1.7)

donde cμ son los coeficientes de los orbitales atómicos (OA) que componen los

orbitales moleculares frontera y Sμv es la integral de solapamiento entre las funciones

base χμ(r) y χv(r). El primer término de las ecuaciones (A.1.6) y (A.1.7) representa la

mayor contribución mientras que el término conteniendo el solapamiento presenta una

contribución pequeña de valor negativo.

Apéndice

259

En relación al significado de la función condensada de Fukui, se puede decir que

un valor máximo de ésta, da cuenta de un mayor cambio en ρk debido a un cambio en

el número total de electrones. Por lo tanto, el valor máximo de fK+ o fK

- se asocia102 con

el sitio de la molécula más reactivo frente al ataque nucleofílico o electrofílico,

respectivamente.

A.2. Contaminación de Spin240

En sistemas en el estado fundamental singulete, donde los spines de todos los

electrones se encuentran apareados, para hacer más eficiente el cálculo, cada orbital

ocupado se llena con dos electrones. Esto se conoce frecuentemente como restricción

de spin y se indica con el prefijo R (restricted) antes del nombre del método.

Para sistemas con electrones desapareados, no es posible usar estos métodos, y

en su lugar, con frecuencia se utilizan cálculos sin restricciones de spin, indicados con

el prefijo U (unrestricted). En este caso, se emplean dos conjuntos de orbitales, uno

para los electrones alfa y otro para los beta. En general, estos conjuntos de orbitales

utilizan el mismo conjunto de funciones base pero poseen diferentes coeficientes en

los orbitales moleculares.

La desventaja de los métodos sin restricciones de spin es que la función de onda

deja de ser una autofunción del operador spin total S2, pudiendo introducirse así cierto

error en el cálculo que se conoce como contaminación de spin. La contaminación de

spin produce una función de onda que parece tener el estado de spin deseado pero en

realidad se encuentra mezclado con otros estados de spin distintos del deseado. Esto

puede resultar en una ligera disminución de la energía total calculada, a causa de una

mayor libertad variacional, o en un aumento, si un estado de mayor energía se

encuentra en la mezcla. Sin embargo, el cambio en la energía es un artefacto de una

función de onda incorrecta que puede afectar además las geometrías y análisis de

poblaciones. Como control de la presencia de contaminación de spin se compara el

valor calculado esperado para el spin total < S2 > con la multiplicidad de spin.

Es posible realizar también cálculos con restricción de spin para sistemas de capa

abierta que se indican con el prefijo RO (restricted open shell). De esta manera, se

evita la contaminación de spin a costa de un mayor costo computacional requerido por

Apéndice

260

el manejo de orbitales simplemente ocupados, doblemente ocupados y la interacción

entre ellos.

A.3. Parámetros relacionados con las energías de disociación

La fracción de un ión precursor Ip que sobrevive en un proceso CID es llamado

proporción subsistente (survival yield o SY) y depende de la constante de velocidad de

la reacción de descomposición k y del tiempo de reacción t en la celda de colisión

según la ecuación241:

kt

p

tp eI

ISY

0,

, (A.3.1)

donde Ip,0 es la intensidad del ion precursor a tiempo cero.

En el proceso de una colisión, la energía máxima disponible para convertirse de

energía cinética a energía interna es la energía relativa del centro de masa (Ecm)

relacionada con la energía de la colisión del sistema laboratorio (Elab) por la siguiente

relación242:

labp

cm ENm

NE (A.3.2)

donde N y mp representan las masas del gas de colisión y el ion precursor,

respectivamente. Los parámetros que afectan la energía interna de un ión precursor

en un experimento CID son propiedades del ion o del gas de colisión. Si el gas de

colisión no varía, entonces Elab (llamado también energía de colisión, CE) es un

parámetro experimental que puede variarse para establecer una correlación con la

constante de velocidad de una reacción de disociación específica.

Volviendo a la ecuación (A.3.1), como el tiempo de reacción en una celda de

colisión específica es constante, la proporción subsistente (SY) de un ión precursor a

diferentes energías de colisión se correlaciona con la constante de velocidad de

descomposición. Así, por ejemplo, la energía de colisión que resulta en un SY de 0.5

refleja la cantidad de energía cinética requerida para transferirse a energía interna del

ión precursor tal que la velocidad de reacción resulta en un 50% de descomposición

Apéndice

261

durante el tiempo de reacción determinado por la geometría de la celda de colisión del

instrumento utilizado. Como la constante de velocidad es dependiente de la estructura

del ión precursor, la energía de colisión que da una proporción subsistente de 50%

(CE50) también lo es.

A los fines prácticos27, la proporción subsistente experimental se calcula como la

relación entre la intensidad del ión precursor y la suma de intensidades del ión

precursor y los iones fragmento, como muestra la ecuación (A.3.3):

fp

p

II

ISYexp (A.3.3)

Se ha determinado que cuando se aumenta la energía de colisión, la proporción

subsistente del ión precursor decrece en una relación sigmoidea27 (A.3.4)

CEbsigmec

SY 1

1 (A.3.4)

La ecuación (A.3.4) puede transformarse en una relación lineal como se muestra

en la ecuación (A.3.5):

CEbcSY

SY

)ln(

1ln (A.3.5)

Así, b es la pendiente del segmento lineal y la ordenada al origen de la porción

lineal es el logaritmo natural de c. El punto donde el 50% del ion precursor permanece

intacto (CE50) no es más que la intersección del segmento lineal con el eje de las

abscisas.

A.4. Análisis de componentes principales (PCA)115,116

PCA es un método matemático para reducir la dimensionalidad de un conjunto de

datos que dependen de un gran número de variables interrelacionadas. Las variables

originales son transformadas en un nuevo conjunto de variables, los componentes

principales (PCs), que son combinaciones lineales de las variables originales pero no

correlacionadas. El primer PC corresponde a la dirección que tiene la mayor varianza

Apéndice

262

posible en los datos. Cada PC sucesivo es ortogonal a los previos y en general, los

primeros PCs explican la varianza de los datos.

Como los primeros PCs pueden ser interpretados como ejes de máxima varianza

de los datos, resulta interesante visualizar la distribución de los datos en este nuevo

conjunto de ejes. Cada PC se caracteriza por dos piezas de información llamadas

puntuaciones (scores) y pesos (loadings). Las puntuaciones contienen información

acerca de las muestras (en este caso, los compuestos estudiados) y los pesos llevan

la información de las variables (en este caso, se trata de la intensidad de los distintos

iones o los desplazamientos químicos de 13C). Los pesos representan la contribución

(son los coeficientes de las combinaciones lineales) de cada una de las variables

originales a las nuevas, i.e. PCs.

El gráfico que muestra la proyección de los datos de las muestras sobre el plano

de dos PCs diferentes (es decir, sus puntuaciones) se llama gráfico de puntuaciones

(scores plot) y resulta útil para la clasificación de las muestras. Por otro lado, la

proyección de las variables sobre el plano de dos PCs diferentes (es decir, sus pesos)

se conoce como gráfico de pesos (loadings plot) y se usa para identificar las variables

diagnósticas.

A.5. Espectroscopia de disociación multifotónica infrarroja (IRMPD)243

La energía máxima de los fotones infrarrojos usados para espectroscopía

(típicamente 800-4000 cm-1) está en el orden de 0.5 eV, mientras que la ruptura de un

enlace covalente en una molécula típicamente requiere unos pocos eV de energía, lo

que implica que la absorción de un único fotón no resulta en general en la disociación.

La espectroscopía IRMPD es una espectroscopía de acción en la cual se registra la

respuesta (disociación) de la molécula inducida por la absorción secuencial de varios

fotones, en lugar de la absorción directa de la luz incidente. La espectroscopía de

acción es una sonda espectroscópica viable para iones gaseosos cuya densidad

típicamente baja no permite el empleo de la espectroscopía de absorción directa.

Cuando la energía del flujo de fotones es resonante con un modo vibracional activo

de la muestra, una secuencia de múltiples eventos se desencadena. En una molécula

poliatómica, el número de grados de libertad vibracionales es tan grande que la

Apéndice

263

energía absorbida se disipa rápidamente (< picoseg) a otros modos en la molécula por

redistribución vibracional intramolecular (IVR)244,245. Esto significa que el estado

fundamental vibracional es regenerado y que la molécula puede ser calentada por el

bombeo continuo de la transición fundamental. La energía vibracional aumenta así,

redistribuyéndose a todos los modos de la molécula, lo que conduce a la disociación

cuando se alcanza un valor umbral246 (Figura A.1).

La absorción secuencial de fotones combinada con la relajación es mejor lograda

con fuentes de radiación IR de alta potencia y amplia sintonía como los láseres de

electrones libres (FELs). Los FELs usados para IRMPD emiten fotones en

macropulsos con una frecuencia del orden de Hz que a su vez están compuestos por

micropulsos que tienen una tasa de repetición del orden de GHz. Esta estructura

temporal permite un ciclo de absorción-relajación eficiente de los iones irradiados que

finalmente conduce a su disociación. La dependencia del rendimiento de

fragmentación con el número de onda de los fotones genera el espectro IRMPD

revelando las absorciones caracteristicas en el IR de la especie iónica seleccionada.

En la actualidad, la mayoría de los espectros IRMPD son medidos en dos

facilidades que cuentan con FELs ubicadas en Holanda (FELIX) y en Francia (CLIO),

ambas operando en la región de la huella dactilar (800-2500 cm-1 aprox). Cabe

mencionar que los espectros de IRMPD pueden ser también medidos con osciladores

paramétricos ópticos (OPOs) sintonizables de laboratorio, que típicamente proveen

fotones en el rango de 2500-4000 cm-1, cubriendo así los modos de estiramiento de los

enlaces X-H (X = C, N, O).

Figura A.1. Ciclos secuenciales de excitación–relajación durante la espectroscopía IRMPD.

Curva de energía potencial para la disociación del ion

Modo vibracional que absorbe

Tiempo de irradiación

Absorción de un fotón IR

264

Anexos

Anexo 1. Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados (Tomado de Ref.

99)

Isotopo # p # n Masa atómica Abundancia Peso atómico MS % Patrón isotópico Natural %

Anexos

265

Anexo 1. Perfiles isotópicos de los elementos químicos empleados (Tomado de Ref.

99)

Isotopo # p # n Masa atómica Abundancia Peso atómico MS % Patrón isotópico Natural %

Anexos

266

Anexo 2. Modos vibracionales calculados para el benceno (B3LYP/aug-cc-pVDZ),

identificados usando la notación de Wilson (Tomado de Ref. 198).

267

Bibliografía

Capítulo 1:

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