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Cultivos Microbianos Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, Noviembre 2005

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Relaciones entre nutricin, metabolismo y crecimiento Excepto algunos tomos de C de los nucletidos, la asimilacin del C deriva de 8 intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato. hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh hhhhhhhhhh

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Conceptos bsicos de cintica microbiana estado fisiolgico de la clula (flujos metablicos) q i velocidad especfica de consumo de sustrato o formacin de producto ( q i mmol/ g biomasa x h ) r i velocidad volumtrica de consumo de sustrato o formacin de producto r i ( mmol/ litro x h ) V r O2 = q O2 * X r i = q i * X X concentracin de biomasa Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades ! q O2 qSqS qpqp q CO2 O2O2 S CO 2 P

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Rendimientos verdaderos y mantenimiento d1 CH 2 O + 1 NH 3 + 1 O 2 g1 biomasa + 1CO 2 + w1H 2 O + h 1 d2 CH 2 O + 2 NH 3 + 2 O 2 s2 producto + 2 CO 2 + w2H 2 O + h 2 d3 CH 2 O + 3 O 2 mantenimiento + 3 CO 2 + w3 H 2 O + h 3 Rendimientos verdaderos (d1+d2+d3) = d, (1+ 2) =, (1+ 2+ 3) = , (1+ 2+ 3) = , Si d=1 =a, =b, = y co2/s CH 2 O + a NH 3 + b O 2 y x/s biomasa + y p/s producto + y co2/s CO 2 + w H 2 0 + h Rendimientos experimentales rxrx r sx rprp r sp r sm r s, r O2 r x, r p rsrs S NH 3 O2O2 rNrN r O2

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Ecuacin lineal de consumo de sustrato (ELCS) m s = 0.05 g glucosa / g biomasa x h (h -1 ) y x/s / y x/s 0.050,645 0.10,78 0.30,92 r p = 0

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Factores que afectan la velocidad de crecimiento () Ecuacin de Monod = f(S) membrana celular S ext E S int qsqs qiqi Temperatura pH H2O Composicin del medio cultivo restricto cultivo irrestricto f(S) S (g/l) Ks = ug a mg/l

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Crecimiento de Saccharomyces cereviseae Efecto de y el sustrato limitante en la fisiologa microbiana El metabolismo de S cereviseae es netamente oxidativo hasta una de 0.2-0.25 h -1. Por encima de este valor se induce la fermentacin alcohlica dando lugar a un metabolismo mixto oxidativo-fermentativo. El rendimiento celular disminuye. La produccin aerbica de etanol en S. cereviseae se denomina Efecto Crabtree < crit > crit

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Efecto de y el sustrato limitante en la fisiologa microbiana Parmetros de crecimiento y actividad -galactosidasa Cultivo Continuo ( = 0.1 h -1 ) Nutriente limitante Yx/s g/g Actividad LAU/mg Carbohidratos totales % Protena % Glucosa0.440.193042.5 Lactosa0.47183043.5 Amonio0.383.25229 Batch (fase estacionaria) Lactosa0.404.3 -- Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 C, pH 4.7, Medio definido

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Sistemas de cultivo Los procesos fermentativos pueden dividirse bsicamente en 2 grandes grupos Fermentaciones lquidas sumergidas (FLS) Contenido de agua del medio 90-95 % Fermentaciones en sustrato slido (FSS) El medio son partculas hmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre

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Reactores empleados en fermentaciones lquidas sumergidas

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Fermentacin en sustrato slido Hay dos formas bsicas de cultivos slidos Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales) Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano) Comparacin a nivel de microescala entre FLS y FSS

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Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato slido

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Comparacin entre FSS y fermentacin lquida sumergida FSSFermentacin sumergida Medios simples. Requieren adicin de agua o una solucin mineral. Sustratos variables Medios con mayor cantidad de ingredientes, mayor costo. Buena reproducibilidad en medios definidos Bajo H20 reduce riesgos de contaminacinMayores riesgos de contaminacin Medios concentrados. Elevada concentracin de producto Menor volumen de reactor Medios diludos, Volmenes de fermentacin grandes. Altas concentraciones de medio puede afectar crecimiento. Alimentacin de sustrato es comn Menor consumo de energia para aerearTransferencia G-L es generalmente limitante Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusin puede limitar el proceso Mezclado intenso. La difusin de nutrientes es generalmente no limitante Remocin de calor es crtica. Transferencia de calor por evaporacin puede ser importante Alto contenido de agua facilita control de T ra Control del proceso dificultosa. Estimacin de biomasa no es directa Amplio desarrollo en sistemas de medicin y control Downstream processing simple. Contaminacin de producto con componentes del medio es alta Bajos volmenes de efluentes lquidos La remocin de grandes volmenes de agua aumenta costos en los procesos de separacin y purificacin Cintica y fenmenos de transporte poco conocidos Modelos cinticos y difusionales

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Operacin de reactores Ecuaciones de balance interfase G-L C o, F o, C, F S VLCVLC Y o, F go Y, F gs VGYVGY Fase lquida Fase gaseosa

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Cultivo Batch Es el cultivo mas simple Volumen constante Cerrado para fase lquida Fo = Fs = 0 Composicin inicial del medio determina el curso del cultivo Fase exponencial inculo

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Cultivo Batch Balance para biomasa Lag exponencial desaceleracin estacionaria m (pendiente) = max

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Velocidades de crecimiento de microorganismos y clulas Cultivo (h -1 ) tiempo de duplicacin (h) bacterias0,6-1,40,5-1,15 levaduras y hongos filamentosos 0,2-0,61,15-3,0 clulas animales0,01-0,0417-70 clulas vegetales0,007-0,0323-100

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Fase de desaceleracin y estacionaria Puede deberse a inhibicin por producto, agotamiento de nutrientes, limitacin por oxgeno En medios complejos la fase de desaceleracin es mas extendida en comparacin con medios definidos. La caracterstica de la biomasa al final del batch puede ser controlada con la composicin inicial del medio (el cultivo puede limitarse en C, N, P, etc) En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a la falta de nutrientes (condicin de starvation): supervivencia prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de stress (salino, trmico, oxidativo, osmtico), etc. Hay expresin diferencial de genes al entrar al estado estacionario Algunas clulas pierden la capacidad de reproducirse, pero se mantienen viables (viables no cultivables)

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Desventajas del cultivo batch Dificultad de controlar el , excepto variando la composicin del medio o las condiciones de proceso Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido al aumento de la presin osmtica del medio o toxicidad de nutrientes Alta demanda de oxgeno puede generar una limitacin debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir O 2 al medio Inconvenientes para remover calor Tiempos muertos entre procesos disminuye la productividad. Pie de cuba

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Cultivo continuo El tipo bsico es el quimiostato, que consiste en una suspensin celular perfectamente mezclada a la cual se adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira cultivo a igual velocidad, de este modo el V L es cte. La composicin del medio que se alimenta se disea segn que sustrato es el limitante Fo, Ci reservorio bomba Fo BIOREACTOR rebalse medio fresco Cio Ci

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Cultivo continuo inicio alimentacin transitorio estacionario X s

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Cultivo continuo en e.e

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Balance de biomasa Cultivo continuo Balance de sustrato Balance de producto

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Cultivo continuo Balance de sustrato con mantenimiento (r p = 0)

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Cultivo continuo max = 1.0 h -1 Y x/s = 0,5 gX /gS m s = 0,05 gS/gX h Ks = 5 mg/l S 0 = 2,0 g/l

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Aplicaciones del cultivo continuo Estudios fisiolgicos. Se puede discriminar el efecto de la velocidad de crecimiento y de las condiciones de cultivo en la fisiologa celular. Varo la composicin del medio y parmetros del cultivo a =cte Varo manteniendo cte el resto de los parmetros Muestreo estadstico en el estado estacionario Inconvenientes del sistema continuo Inestabilidad gentica de la cepa, prdida de plsmidos Contaminacin Imposibilidad de establecer estado estacionario

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Cultivo batch alimentado (B.A) reservorio bomba F(t) BIOREACTOR C(t) V(t) Vo Vf Vr = Vf - Vo C(t) Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen vara con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A Controlado por alimentacin: el cultivo sigue el curso que le dicta la alimentacin Con alimentacin controlada: el estado del cultivo ( captado por sensores ) controla la alimentacin

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Cultivo B. A Balance de biomasa Balance de sustrato Balance de producto

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Cultivo B. A

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El objetivo del BA es bsicamente controlar el Limitar la demanda de O 2 del cultivo Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto osmtico y txico de nutrientes Incrementar el q p (metabolitos secundarios, protenas recombinantes) para maximizar el Yp/s. Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en levaduras)