INTRODUCCION

Las poblaciones de las bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en su periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microorganismos en la mayoría de los casos depende de su número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos.

El aislamiento de los distintos microorganismos contenidos en una muestra problema se lleva a cabo sobre la superficie en un medio de cultivo solido contenido en una placa de Petri. Los medios de cultivo que se van a utilizar depende del tipo de muestra y los microorganismos presentes en ella, pero deben ser medios sólidos en placa. Así se usaran: medios nutritivos generales, medios selectivos, medios diferenciales o bien medios enriquecidos, si los microorganismos que se van aislar son nutricionalmente exigentes. Uno de los medios de cultivo que se podrían utilizar con este fin es el agar. Su deficiencia en electrolitos impide la invasión de la placa por microorganismos móviles, como son las especies del genero Proteus, facilitando así su aislamiento y posterior identificación.

OBJETIVOS

Preparar y realizar medios de cultivo de bacterias. Desenvolverse en el laboratorio utilizando las técnicas correspondientes de asepsia y

cuidados en la limpieza y protección personal.

MARCO TEORICO

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

MEDIOS DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autótrofos si es el CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizar) y heterótrofos si utilizan carbono orgánico. La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterótrofos y como CO2 para los autótrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Además, en ciertos casos, es necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056 esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo.

Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con

hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño.

MÉTODOS DE AISLAMIENTO

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Sin embargo, no todos los microorganismos presentes en las muestras ambientales son cultivables (microorganismos no cultivables). Esto es debido a dificultades intrínsecas en el cultivo (microorganismos parásitos de otros), al desconocimiento de los requerimientos específicos de cultivo, y a la existencia de grupos de microorganismos que deben mantenerse en equilibrio para poder sobrevivir (casos de sintrofía por ejemplo). Se estima que en sólo en torno al 1% de las bacterias del suelo al 0,1 - 0,01 % de las bacterias marinas son cultivables. Existen procedimientos de enriquecimiento del número de bacterias de ambientes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Winogradski que crea un microcosmos para enriquecer el número de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con objeto de facilitar su aislamiento.

CONCEPTO DE CULTIVO PURO

Se denomina cultivo puro (axénico) al que contiene sólo un tipo de microorganismos. Los cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos del mismo tengan la misma composición genética. Los cultivos puros son esenciales para poder estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce más sobre el funcionamiento de las comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiología de los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en condiciones de cultivos puros.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LÍQUIDO

Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase lag o de adaptación: durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.

2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que describiremos a continuación.

3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los ambientes naturales.

4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SÓLIDO

Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuando una célula aislada e inmóvil comienza a crecer sobre un substrato sólido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una célula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la producción de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el número inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un césped cuando

se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de microorganismos móviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trófico no se producen colonias aisladas sino formaciones más difusas o miceliares.

MATERIALES Y METODOS:

MATERIALES:

Material biológico: Escherichia coli. Placas Petri Pota objetos Cubre objetos Matraces Pipetas Tubos de ensayo Botellas de diferente capacidad. Reactivos y colorantes: peptona, glucosa, cloruro de sodio, agar cristal

violeta, safranina, alcohol, cetona, lugol. Equipos: Cámara de flojo laminar, autoclave, microscopio, horno, incubadora. Otros: micro tubos, mechero, papel kraft, micro pipetas.

PROCEDIMIENTO

Fase A: Preparación del medio de cultivo

Se utiliza el medio de cultivo AGP (agar, glucosa, peptona), Agar 14g, glucosa 5g y peptona 5g para un litro de agua destilada.

Mezclar en vasos separados: el agar se disuelve en agua fría. Agregar la solución a un matraz esterilizado y enrazar a un litro. Cubrir la boca del matraz con un papel metálico colocar otra cubierta con papel

kraft. Envolver todo el papel kraft y auto clavar a 120 0c durante 30 minutos. Terminada la operación, llevar el matraz a la cámara de flujo laminar.

Fase B: Siembra de bacterias

En las placas Petri previamente esterilizadas (al calor o en autoclave), transferir el medio de cultivo hasta un tercio de la placa, homogenizar con movimientos suaves y tapar la placa. Toda esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar.

Esperar 10 minutos hasta que solidifique el agar. Con un asa colle esterilizada a la llama coger una pequeña porción del inoculo

de Escherichia coli y sembrar en la placa Petri: el tipo de siembra será especificada por el conductor de práctica.

Cerrar la placa Petri dentro de la cámara de flujo laminar. Etiquetar.

Fase C: Incubación

La placa Petri se transfiere a la incubadora a una temperatura de 37.5 0C. La placa Petri se coloca en forma invertida dentro de la incubadora para evitar

el exceso de humedad sobre el cultivo. Luego de 48 horas la placa estará lista para la evaluación.

RESULTADOS

CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm . http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm . http://claudiazambrano.wordpress.com/2011/05/25/medios-de-cultivosolido-y-

liquido/ http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/salmoshigagar.htm.