UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADORFACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

CARRERA DE MEDICINALABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 3: Tinciones diferenciales

Elaborada por: Gabriela Vasco, César PadillaRevisada por: Judith Torres, septiembre 2018

Resultado de aprendizaje: Entender el fundamento de las tinciones Gram y Ziehl-Neelsen

Las bacterias normalmente son transparentes al microscopio, por lo que utilizamos coloraciones de las diferentes estructuras de las membranas de los microorganismos para poder visualizarlas. Las coloraciones en los laboratorios de microbiología han permanecido a través del tiempo como la piedra angular para el diagnóstico primario y han guiado el tratamiento empírico del médico, antes de tener los resultados del cultivo.

La interpretación incorrecta de las coloraciones puede tener consecuencias adversas en la salud del paciente. La mayor cantidad de errores se dan por una mala calidad de la muestra, mala realización del frotis, mala interpretación de lo observado en la coloración e interpretación equívoca de los resultados.

Preparación del extendido (frotis): es la colocación de una parte de una muestra o de un cultivo sobre una placa de portaobjetos.

Si la muestra es un líquido se pone una gota sobre el portaobjetos y se deja secar o se coloca una gota de metanol sobre el líquido y se espera a que se evapore.

Si la muestra fue obtenida con un hisopo entonces se pasa el mismo sobre el portaobjetos realizando un trazado de izquierda a derecha. Se pueden hacer varias líneas paralelas de un largo mayor de tres centímetros. Para confirmar que el frotis no fue muy grueso se coloca la placa sobre un pedazo de papel periódico y se verifica que pueden leer las letras que están detrás del frotis:

Si se quieren colorear bacterias a partir de un cultivo se coloca una gota de solución fisiológica (salina 0,85%) sobre el portaobjetos Con un palillo o asa bacteriológica se toma la colonia bacteriana del cultivo y se la diluye en la gota.

Se debe fijar el frotis antes de la coloración para evitar que se desprenda la muestra. A continuación tres formas de hacerlo:

Se coloca en una placa calentada a 60°C por pocos minutos.

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Se cubre con metanol al 95% hasta que se evapore Se puede pasar tres veces la placa sobre una llama.

COLORACIÓN GRAMLa más útil de las tinciones es la de Gram, que se usa para identificar si las bacterias tienen una pared bacteriana Gram positiva (o grampositiva) o Gram negativa (o gramnegativa). Las bacterias que no se tiñen con éste método son:

Algunos microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., Chlamydia).

Los que carecen de pared celular (p. eje., mycoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej.,

espiroquetas). Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej.,

mycobacterias).

Las fuertes reacciones químicas que sufren las bacterias sobre la tinción también pueden afectar a otros componentes que se encuentren en las muestras, pudiendo entonces identificar las siguientes características:

Forma y reacción Gram de la bacteria: cocos, bacilos, grampositivos, gramnegativos Agrupación: racimos, cadenas, pares, etc. Cantidad: 1, 2, 3, etc. x campo o por +, ++, +++, ++++ Elementos acompañantes: núcleos de PMN, eritrocitos, detritus, células, etc.

Los pasos de la tinción Gram son:

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1. Se pone una gota de colorante Cristal violeta sobre el frotis y se lava: todas la bacterias se verán de color morado

2. Se pone una gota de Lugol o alcohol yodado sobre el frotis y se lava: éste compuesto forma un complejo con el cristal violeta que lo permite fijarse a la membrana de las bacterias. Las bacterias no cambian de color

3. Se pone una gota de Alcohol-cetona sobre el frotis: éste compuesto diluye (cetona) la membrana externa de las bacterias gramnegativas y por lo tanto el colorante sale de esas bacterias, mientras que deshidrata (alcohol) la capa de peptidoglucano de las grampositivas con lo que el colorante queda fijado. Las gramnegativas pierden el color y las grampositivas mantiene el color morado.

4. Se pone una gota de Safranina sobre el frotis. El compuesto confiere una coloración rosada, por lo que las bacterias gramnegativas se tomarán dicho color, y las grampositivas seguirán siendo moradas.

Causas que alteran la coloración Gram

Edad de la bacteria. (pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gramnegativos)

Errores del operador. (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias grampositivas se tiñan como gramnegativas)

Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar. Para mejor entendimiento de la coloración de Gram revisar: http://jcm.asm.org/content/54/6/1442.long y http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0163658.

COLORACION ZIEHL-NEELSENLa tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Las mycobacterias absorben los colorantes muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formación de vapores. Una vez que las mycobacterias han absorbido el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol ácido resistente o BAAR y aparecen en el preparado microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos se tiñen de acuerdo con la contra-tinción.

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Las mycobacterias no son el único grupo que tienen propiedades alcohol-ácido resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial así como Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con ácido alcohol.

La muestra más examinada es el esputo. Sin embargo, dado que el mycobacterium puede afectar a cualquier órgano, con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras muy variadas como: orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias de piel, hueso, aspirado gástrico, lavado bronquial, etc.

Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y 10 μm de largo. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul. A veces se observan con gránulos o cuentas intensamente coloreados en el interior, pueden aparecer como bastones muy largos o como bacilococos.

OBSERVACION DE LA TINCIÓN Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x).

AUTOEVALUACION E INVESTIGACION1. Cite 2 ejemplos de microorganismos grampositivos y gramnegativos.2. Enumere 3 diferencias entre grampositivos y gramnegativos3. Investigar que debe constar en un reporte (resultado) de coloración Gram?4. Indicaciones para solicitar una coloración Gram y Ziehl-Neelsen5. En una coloración Gram se reporta detritus celulares cuál es la importancia:6. En el reporte de gram se indica la presencia de bacterias por cruces (+) o número por

campo (1-2xc) que es lo correcto?7. Estudiar estructura de la pared de los Gram positivos, Gram negativos y Micobacterias8. Traer solicitud de laboratorio donde se solicita coloración de Gram y Ziehl-Neelsen

(originales de hospitales, clínicas, etc. nacionales)9. Traer reporte de resultados de coloración de Gram y Ziehl-Neelsen (originales de hospitales,

clínicas, etc. nacionales)

BIBLIOGRAFÍAKoneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana,Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México 2002.Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2004.

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Universidad Central del EcuadorFacultad de Ciencias Médicas

Carrera de Medicina

PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE: DOCENTE: FECHA: AYUDANTE:PARALELO: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

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Universidad Central del EcuadorFacultad de Ciencias Médicas

Carrera de medicina

POST-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE: DOCENTE: FECHA: AYUDANTE:PARALELO: GRUPO:

PREGUNTA 1.

PREGUNTA 2

PREGUNTA 3

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