metodos de cultivo y aislamiento de bacterias

Facultad de Ingeniería Química Maestría Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Mg. Blga. María Teresa Valderrama Rojas Mg. Blgo. Edgar Zárate Sarapura

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METODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentación. Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio para su estudio. La rápida multiplicación de estas diminutas criaturas constituve también una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas generaciones en un solo día, Es más, los conocimientos adquiridos en el estudio de los microorganismos pueden ser, a menudo, generalizados a los sistemas celulares, plantas y animales, incluida la especie humana. Para llevar a cabo experimentos con microorganismos es usualmente necesario cuítivarlos en el laboratorio. Obtención de un cultivo puro o axénico Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicos son muv raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. En lo que resta de este capítulo, estudiaremos los métodos para obtener y propagar los cultivos axénicos. Estos métodos se desarrollan para bacterias y hongos, pero con unas pequeñas modificaciones, también pueden ser aplicados a algas y protozoos. Los métodos para obtener cultivos axénicos de virus se describirán en el Capítulo 13. La obtención de un cultivo axénico es un proceso de dos etapas. Primero, hay que esterilizar todos los materiales para eliminar todos los microorganismos presentes en ellos. Segundo, hay que aislar y cultivar un solo microorganismo, para producir un clon de descendientes. La esterilización A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. La eliminación de todos los microorganismos se denomina esterilización. Los fundamentos de la esterilización y su aplicación en medicina clínica y en la industria se estudiarán en el Capítulo 9. En este capítulo describiremos solamente su relación con el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. Todos los aparatos y todo el material utilizado para obtener un cultivo axénico ha de esterilizarse. Esto incluye el medio, las sustancias líquidas o sólidas que se añadan como nutrientes al cultivo, los matraces, tubos de ensayo, las placas, los utensilios necesarios para transferir los cultivos de un recipiente a otro (pipetas, jeringas), etc. Como medios usuales de esterilización en el laboratorio se utilizan el calor, la filtración y los compuestos químicos. Esterilización por calorEl calor es el método de elección para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas. La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material depende de que se esté utilizando calor seco o calor húmedo. El calor húmedo mata los microorganismos más rápidamente que el calor seco. Cuando se utiliza calor húmedo, una temperatura de 121 oC durante 20 minutos proporciona condiciones fiables para esterilizar la mayor parte del material de laboratorio. El material voluminoso o los grandes volúmenes de líquido requieren un tiempo mayor para que la temperatura letal alcance el centro de los mismos. Por ejemplo, se tarda sólo 15 minutos en esterilizar 10 ml de líquido en un tubo de ensayo, pero aproximadamente una hora y l0 minutos en esterilizar un matraz de 10 litros de capacidad que esté lleno en sus dos terceras partes con líquido. Los objetos no pueden esterilizarse hirviéndolos en contenedores ahiertos, porque la esterilización requiere una temperatura superior a la de ebullición del agua (100 oC, al nivel del mar). Por este motivo, la esterilización por calor húmedo se realiza en camaras presurizadas. A una presión de 1 atmósfera, se puede calentar el agua a 121oC, sin que llegue a hervir. Cuando la cámara alcanza esta temperatura y presión, su con tenido puede ser esterilizado en 20 minutos, a condición de que todo el aire de la misma haya sido reemplazado por vapor de agua.



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La cámara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave (Figura 3.18). En muchos aspectos una autoclave se parece a una olla de presión casera. De hecho, en algunos pequeños laboratorios de microbiología se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes suficientemente fuertes para resistir la presión de vapor. Las autoclaves son grandes cámaras de acero inoxidable que funcionan automáticamente. Los objetos deben ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la esterilización no será efectiva.

Una autoclave utiliza vapor de agua a presión para esterilizar objetos mediante calor. La mayoría de los

autoclaves están diseñadas de manera que el mismo vapor hace salir el aire de la cámara. En caso contrario, los objetos que quedaran en las bolsas de aire no se esterilizarían. También están equipados

con indicadores que comprueban que se alcanza la temperatura precisa y se mantiene durante el tiempo necesario para la esterilización.

Los medios de cultivo y los materiales textiles, tales como toallas y batas de laboratorio, se esterilizan en la autoclave. También otros materiales secos que resisten las temperaturas altas, incluyendo pipetas de vidrio, matraces vacíos o tubos de ensayo, especialmente si la autoclave posee secado automático. Los materiales que se esterilizan en la autoclave quedan húmedos. El cristal y los instrumentos de metal también se pueden esterilizar por calor seco. Se colocan en hornos de aire caliente y se calientan a 170 oC durante 90 minutos. Las prendas textiles no pueden esterilizarse mediante esta técnica debido a que la elevada temperatura las carboniza. La llama de un mechero también se utiliza para esterilizar. Cada vez que un matraz o un tubo de ensayo se abre para añadir o sacar material, se pasa la boca del mismo a través de la llama de un mechero, a fin de destruir cualquier microorganismo que pueda haberse depositado allí. Este procedimiento disminuve



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la probabilidad de que las celulas microbianas caigan en el recipiente y contaminen su contenido. Las asas e hilos de siembra, que los microbiólogos utilizan para tomar microorganismos de un medio y llevarlos a otro, también se esterilizan flameándolos en la llama de un mechero Bunsen hasta la incandescencia. Este metodo de esterilización es rápido y cómodo, pero peligroso cuando se trabaja con microorganismos causantes de enfermedad. El calentamiento repentino en una llama puede formar un aerosol (suspensión de pequeñas gotas de liquido) que contenga celulas microbianas y que puede ser inhalado por la persona que esté trabajando en el laboratorio. La utilización de un pequeño horno para esterilizar las asas evita este riesgo. Filtración Las células microbianas pueden retirarse de los líquidos o gases por filtración. La filtración es lenta y cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razón, se utiliza sólo para los líquidos termolábiles, que no se pueden esterilizar en el autoclave. Los sólidos termolábiles también se pueden esterilizar por filtración, si previamente se disuelven en unl íquido. Tecnicamente, la filtración no esteriliza porque los virus pueden pasar a través de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayoría de los estudios de rutina que se llevan a cabo en el laboratorio. Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas están compuestas de nitrocelulosa, con un poro de diámetro constante. La nitrocelulosa es un derivado químico de la celulosa, que tambien se utiliza como explosivo. El diámetro de poro es aproximadamente 0,45 µm; este tamaño es lo suficientemente pequeño como para eliminar todos los microorganismos, con excepción de los virus y algunas bacterias muy pequeñas. Un líquido se filtra haciéndolo pasar a través de un filtro de membrana acoplado a un matraz especial. Para hacer pasar el líquido por el filtro se utiliza una bomba de vacío; los microorganismos quedan en la superficie de la membrana. La filtración es el método de elección para esterilizar soluciones de vitaminas, antibióticos v otros compuestos termolábiles, que son añadidos a los medios. Compuestos químicos La mayoría de los compuestos químicos no se pueden utilizar para esterilizar medios de cultivo, pues permanecen en ellos y son tóxicos para los microorganismos que luego se han de cultivar. sin embargo, son de uso común una vez que el experimento ha finalizado. El hipoclorito sódico (lejía doméstica) se utiliza para destruir los cultivos de la mayoria de los microorganismos patógenos, para que no contaminen el medio ambiente. También se utiliza para esterilizar la superficie de ciertos materiales biológicos, como las semillas y los tejidos vegetales. Los compuestos químicos también se usan para desinfectar los laboratorios. Por ejemplo, las sales de amonio cuaternario se utilizan en la desinfección de mesas, bancos, etc. En las grandes instituciones se usa el gas tóxico óxido de etileno para esterilizar materiales termolábiles, tales como ropas y contenedores de plástico. Este gas se aplica en cámaras presurizadas especiales, parecidas a la autoclave. AISLAMIENTO DE BACTERIAS: CULTIVO BACTERIANO El segundo paso para obtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio solido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido. Una colonia de bacterias de tamaño medio contiene, aproximadamente, 109 células individuales, casi tantos individuos como personas pueblan la Tierra. Para aislar células individuales, los microorganismos han de ser diluidos, debido al gran numero en que normalmente están presentes. La dilución se realiza, normalmente, por uno de los siguientes sistemas: siembra por estría en placa, vertido en placa y extensión en placa. El método de siembra por estría en placa Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petrí (a las placas Petri



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también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. La colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axenicos. Los métodos de vertido en placa y extensión en placa En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras creceran en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos. El crecimiento de los cultivos axénicos Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de nuevo). Seguramente, el investigador deseará obtener más células para poder trabajar con ellas. Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo, líquido o sólido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medios sólidos se hacen generalmente, añadiendo agar a los líquidos (ver cl recuadro "La despensa de Frau Hesse" en el Capítulo 1, para recordar las propiedades especiales del agar). Tipos de medios de cultivo El tipo de medio que utiliza un microbiólogo depende del microorganismo que está cultivando y el porqué de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mínimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rápida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composición y uso.



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Medios definidos Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros. Echerichia coli es capaz de crecer en un medio químicamente definido, de composición bastante sencilla. Este microorganismo requiere una fuente de carbono orgánica (por ejemplo, glucosa), pero puede obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de sales minerales. En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios químicamente muy complejos. Por ejemplo, la bacteria Leuconostoc citrovorum es extraordinariamente exigente ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse. Medios complejos Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja. Un medio líquido complejo se denomina caldo. La caseína u otras proteínas que se añaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio ácido, para hacerlas más solubles y, por tanto, más fáciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrólisis parcial rompe las proteínas en péptidos. Una hidrólisis total las degrada hasta aminoácidos. A las proteínas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosa-peptona, la triptona y la triptosa. A la caseína totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de caseína. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. También existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos específicos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que más se utiliza. Cuando este medio se solidifica con agar, se denomina agar nutritivo. Generalmente se prefiere la utilizacion de los medios complejos, ya que son fáciles de preparar y permiten un crecimiento rápido de los microorganismos. LA IMPORTANCIA DE SER PURO Todos los microbiólogos saben que han de trabajar con cultivos axénicos (puros) para que sus experimentos sean significativos. Pero incluso los microbiólogos más experimentados han cometido errores alguna vez. Esto le sucedió a Ralph Wolfe, uno de los microbiólogos americanos más distinguidos. En 1960 Wolfe obtuvo un cultivo puro de la bacteria Methanobacillus omelianskii. Este microorganismo es anaerobio estricto, capaz de producir metano (gas natural). Wolfe quería conocer de qué manera M. omelianskií producía gas metano a partir de etanol y anhídrido carbónico. El procedimiento estaba claro; tenía que lisar la bacteria y aislar las enzimas que catalizan la reacción, en un tubo de ensayo. Esto, aunque suena bastante simple, había sido intentado previamente por otros investigadores y todos habían fracasado. Wolfe lo intentó durante todo un año y tampoco tuvo éxito. De repente lo consiguió: una solución de enzima. sintetizaba metano en un tubo de ensayo! Se trataba de un descubrimiento espectacular, hasta que un colega se preguntó si el cultivo era axénico. Wolfe decidió volver a aislar el culfivo, pero en vez de añadir etanol y anhídrido carbónico al mismo, añadió hidrógeno y anhídrido carbónico. En el nuevo medio se desarrollaron colonias, pero cuando se transfirieron al medio con etanol y anhídrido carbónico no crecieron. ¿Qué había sucedido? Un colega, M.J. Wolin, se dio cuenta de lo que estaba sucediendo. Aunque M. omelianskii originaba colonias uniformes y aisladas en el medio original, se trataba de una mezcla de dos bacterias. Una, designada cepa S, convertía el etanol en hidrógeno gas. La otra, designada cepa M, convertía el hidrógeno gas y el anhídrido carbónico en metano. Ninguna de las dos podía crecer sola con etanol y anhídrido carbónico. Todos los experimentos de Wolfe se habían realizado con un cultivo mixto y tuvieron que repetirse para averiguar qué enzimas pertenecían a la cepa S y cuáles a la cepa M. ¿Qué lección puede aprenderse de la historia de Wolfe? Primero, que los problemas técnicos (tales como obtener un cultivo axénico), aunque son tan básicos que se explican en los textos introductorios,



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son reales e importunan a los más prestigiosos investigadores. Segundo, que incluso un buen microbiólogo puede equivocarse. Algunas especies pueden crecer juntas (para formar un consorcio) y parecer un cultivo axénico cuando realmente no lo son. MEDOS DE CULTIVO Medios selectivos Un medio selectivo favorece el crecímiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comun. Medios diferenciales Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado mieroorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina (Capítulo 22), se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hematíes. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemolisis (muerte y lisis de los hematíes). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias.

Ingredientes de un medio definido para el cultivo de Escherichia coli.

Ingrediente Cantidad Comentarios

KH2PO4 3,6 g Actúa como fuente de fosfato y como tampón

(NH4)2S04 2,0 g Fuente de nitrógeno y azufre

CaCl2 0,01 g Fuente de calcio, no se requiere cloruro

FeSO · 7 H2O 0,0005 g Fuente de hierro

MgSO4 ·7 H2O 0,02 g Fuente de magnesio. Como este compuesto es relativamente impuro también sirve como fuente de elementos traza

Glucosa 1,0 g Fuente de carbono

Agua destilada 1000 ml

Agar 15 g Se añade si se desea solidificar el medio

Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías (Capítulo 23). Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio está plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey actúa como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificación. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aquí, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterías sí lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias serán rojas, mientras que las restantes no lo seran.



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Ingredientes del caldo nutritivo, un medio complejo adecuado para el cultivo de muchas

especies de bacterias

Ingrediente Cantidad Comentarios

Peptona 5 g Caseína parcialmente ludrolizada por tripaina

Extracto de carne 3 g Concentrado desecado de un extracto de carne en agua caliente

NaCl 8 g Aliadido como osmorregulador

Agua destilada 1000 mL

Condiciones ambientales idóneas para el cultivo en el laboratorio Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente. En el laboratorio, también es preciso aportar las condiciones ambientales adecuadas. Tanto la temperatura como el pH deben estar dentro del intervalo apropiado; con respecto al oxigeno, según el caso, será aportado o eliminado. Temperatura Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento óptimo (Capítulo 8). Pero, en general, los microorganismos crecen mas rápidamente cuando se aumenta la temperatura, sin llegar hasta un punto en el cual se dañan las proteínas (Capitulo 2). Así pues, para favorecer un crecimiento rápido, las bacterias se suelen cultivar a la temperatura más alta a la cual crecen bien, y que suele ser la de su medio natural. Escherichia coli la bacteria que más frecuentemente se utiliza en investigación (Capítulo 5), se encuentra en el intestino humano y de otros mamíferos. Este microorganismo crece óptimamente a 37 oC, la temperatura del cuerpo humano. Los cultivos se mantienen a temperatura constante en incubadoras o en baños de agua, ambos controlados termostáticamente. Los incubadoras, o estufas, son cámaras con aire adecuados para el crecimiento tanto de cultivos sólidos como líquidos, preparados en cualquier recipiente, incluyendo placas Petrí, tubos de ensayo, o matraces. Los medios líquidos, distribuidos en tubos o matraces, también pueden ser incubados en baños de agua caliente. Estos baños resultan cómodos para incubar los cultivos que tienen que manipularse con frecuencia, en la misma mesa de trabajo.

Medio diferencial. Streptococcos pyogenes se diferencia de otras bacterias porque en agar sangre

lisa los hematíes creando una zona clara alrededor de cada colonia. pH El pH óptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente estrecho. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH próximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a 7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0. Aunque el pH de un



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medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano lo modifica. Esto sucede porque algunos microorganismos usan selectivamente algún componente ácido o básico del medio; o bien, porque algún producto de su metabolismo es un ácido o una base. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones (Capítulo 2). En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actúan como tampones débiles. Los tampones más eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato cálcico. Ambos se añaden normalmente como nutrientes (fuente de fósforo y calcio); pero si se desea que actúen como tampones se precisarán cantidades mayores. Oxígeno La concentración de oxígeno del medio es un determinante crítico para el crecimiento bacteriano (Capítulo 8). Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos, no pueden vivir sin oxígeno porque lo necesitan para obtener energía. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos, no pueden vivir en presencia de oxígeno, para ellos es un agente tóxico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxígeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxígeno si disponen de él, pero también pueden crecer sin él. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxígeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerófilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxígeno; las altas tensiones, como las que existen en el aíre son tóxicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendrá que suministrar, restringir o eliminar el oxígeno. Suministrar oxígeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen más rápidamente en su presencia, representa una dificultad técnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxígeno de la atmósfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios líquidos es más dificil, porque no existe demasiado oxígeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rápidamente. Todos los cultivos líquidos con más de uno o dos centímetros de profunditíad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a través del cultivo o agitándolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiología existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotación o a una agitación de vaivén, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxígeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibióticos, es un desafio para la ingeniería. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a través de ellos enormes cantidades de aire. La exclusión del oxígeno del ambiente de los anaerobios también plantea problemas técnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxígeno, sí el medio contiene un compuesto químico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato, que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxígeno. Los anaerobios también pueden cultivarse en placas Petrí, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se hava eliminado totalmente el oxígeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrógeno o argón. También se puede llevar a cabo una eliminación química del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes con unas mezclas (le reactivos que producen hidrógeno cuando se les añade agua; el hidrógeno reacciona con el oxígeno en presencia de un catalizador; la reaccion consume el oxígeno produciendo agua. Un método muy sencillo para dismínuir la concentración de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhidrido carbónico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo herméticamente; la vela consumirá oxígeno hasta que se extinga. Esta técnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del ácido láctico. También ha sido utilizada para microacrófilos, especialmente cuando el dióxido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposición al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal herméticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para



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añadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrógeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren técnicas más elaboradas. Es frecuente el uso de cámaras libres de oxígeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas. Algunos laboratorios tienen habitaciones libres de oxígeno, donde los técnicos trabajan con máscaras de oxígeno.

El oxígeno debe ser suministrado, eliminado o restringido dependiendo de los requerimientos de los microorganismos. Para los microaerófilos (que requieren bajas tensiones de oxígeno) y para los

anaerobios aerotolerantes (que pueden crecer en presencia de oxígeno o en su ausencia) se utilizan recipientes cerrados con una vela en su interior.

Conservación de los cultivos axénicos Una vez que se obtiene un cultivo axénico, hay que mantenerlo en el laboratorio para poder trabajar con él o intercambiarlo con otros científicos. Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco, mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro también puede mantenerse viable durante años sin hacerlo crecer periódicamente. A los cultivos que se mantienen en el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de colección. Muchos laboratorios poseen una colección dc cepas que se han aislado en el mismo o que han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que mantienen un número enorme de cultivos microbianos como un servicio a los microbiólogos. Existen muchas técnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi todas consisten en una desecación (eliminación del agua) o en un almacenamiento a baja temperatura. Los cultivos generalmente se desecan por liofilización (congelación y desecación). El método consiste en lo siguiente: el cultivo líquido se vierte en un pequeño vial o ampolla de vidrio y se añade leche descremada para proteger las células durante el proceso. La mezcla se congela en hielo seco y se expone al vacio para su sublimación (eliminación del agua congelada). Durante el proceso de sublimación las células permanecen congeladas. Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras aún se mantiene el vacío. Los cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente. Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfóxido (DMSO). Los tubos de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrógeno líquido o en un ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas. Microorganismos que no pueden ser cultivados en el laboratorio Muchas especies bacterianas no se pueden cultivar en un medio artificial. De hecho, se cree que sólo una mínima cantidad de las especies que existen en la naturaleza, pueden cultivarse en el laboratorio. Se pueden tomar muestras de suelo y contar el número de microorganismos con la ayuda de un microscopio. Si posteriormente se cultivan esas muestras, crecerán menos de la mitad de los organismos observados, independientemente de la técnica que se utilice.



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Algunas de las bacterias que causan enfermedades extremadamente serias no han podido cultivarse en medios de laboratorio pero puede hacerse en animales de experimentación. Por ejemplo, Treponema pallidum, causante de la sífilis, enfermedad de transmisión sexual, se cultiva en conejos (Capítulo 24); Micobacterium leprae, agente causal de la enfermedad de Hansen (lepra), se inocula en armadillos (Capitulo 26). Las riquetsias y clamidias y todos los virus requieren ser cultivados en sus células hospedadoras vivas, ya que son parásitos intracelulares obligados. Además de animales vivos, también pueden utilizarse cultivos de tejidos, cultivos de células animales. Con muy pocas excepciones, los microorganismos que no han podido cultivarse en el laboratorio, no han sido identificados. No sabemos cuántos de estos misteriosos seres existen o qué importancia puedan tener. Es de esperar, sin embargo, que con los modernos avances de la ingeniería genética, seamos capaces de identificar e incluso clasificar estos microorganismos en especies simplemente obteniendo pequeños fragmentos de sus genes. Cuando esto suceda, será posible el estudio de los microorganismos sin necesidad de cultivarlos.



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TÉCNICAS DE CULTIVO

TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Y TÉCNICA DE SIEMBRA POR DIFUSIÓN

EN PLACA.

Con un asa bacteriológica, se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo

hecho basado en agar y se siembra en el medio ya sea por estría o por difusión. Para sembrar por

difusión en placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra.

Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar quedan

las bacterias separadas unas de otras. Cuando se raya adecuadamente agar con el asa de siembras,

las células bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas áreas de la placa lo que

permite estar seguro que las colonias que se desarrollan a partir de una célula no se junte con la que

se está desarrollándose a partir de otra célula.

Cada colonia aislada es la descendencia de una sola célula y, por tanto, un cultivo puro. En las

especies donde las células se agrupan de forma característica, la colonia se desarrolla a partir de un

grupo de células del mismo tipo e igualmente representa un cultivo puro. Una porción de una colonia

que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro.

Las técnicas de siembra en placa por estrías o por difusión se puede hacer convencionalmente y con

equipo mínimo; éstos son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacteria en cultivo

puro. Una de sus limitaciones es que sólo pequeñas cantidades de la muestra pueden ser esparcidas

sobre la superficie del medio del cultivo.

TÉCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN PLACA Para obtener un cultivo axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.



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RESULTADOS Medio de cultivo:………………………………………………………………… Lectura de colonia: color, diámetro (mm), elevación, superficie, borde.



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MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA. Para obtener un cultivo axénico mediante este método, (a) hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener una muestra con sólo unos pocos cientos de bacterias, (b) verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c) Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y en su superficie (más grandes).

RESULTADOS Nº colonias………………………… Nº colonias………………………… Nº colonias………………………… Numeración final:……………………………………………..

1ra dilución 2da dilución 3ra dilución

metodos de cultivo y aislamiento de bacterias

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