medios de cultivo, siembra de bacterias

8/10/2019 Medios de Cultivo, Siembra de Bacterias

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Universidad Nacional de

CajamarcaFacultad de iencias Veterinarias

Escuela Acadmico Profesional de

Medicina Veterinaria

INFORMES DE PRCTICAS

ASIGNATURA : BATERIOLOGIA VETERINARIA

DOCENTE : Dr. JOSE RAFAEL BAUTISTA

ALUMNOS : CASANOVA HOYOS ELMER

SANCHEZ MEGO LUIS ALBERTO

CICLO : IV

Cajamarca, Noviembre de 2011


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MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin.

Un medio de cultivo consiste en ungel o una solucin que cuenta con losnutrientes necesarios para permitir(bajo condiciones favorables de pH ytemperatura) el crecimiento de virus,microorganismos, clulas o inclusopequeas plantas. Segn qu sequiera hacer crecer, el medio requerirunas u otras condiciones.Generalmente se presentandesecados en forma de polvo fino ogranular antes de ser preparados, alprepararse podemos encontrarlos enestado slido, semislido y lquido. Elobjetivo ltimo del cultivo es variado:antibiograma, identificacin,multiplicacin. Los Virus, por ejemplo,son obligados parsitos intracelularespor eso necesitan de un medio quecontenga clulas vivas.

Clasificacin:

Segn sus cualidades fsicasdistinguimos:

Lquidos Semi-slidos Slidos

Segn su formulacin:

Qumicamente definidos: se conoce exactamente la cantidad de cada uno de loscompuestos que hay en el medio.

Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura,sangre,...). Por tanto, no se conoce exactamente cul es la composicin del medio.Sin embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes todos o casi todos loselementos que una clula puede requerir.

Segn su uso:

Medio General: Es aquel medio donde crecen todo tipo de microorganismos,excepto aquellos que necesitan de unas condiciones especiales.

Ejemplo:Agar CLED
http://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Virushttp://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismohttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulahttp://es.wikipedia.org/wiki/Plantahttp://es.wikipedia.org/wiki/Virushttp://es.wikipedia.org/wiki/Par%C3%A1sitoshttp://es.wikipedia.org/wiki/Levadurahttp://es.wikipedia.org/wiki/Sangrehttp://es.wikipedia.org/wiki/Agar_CLEDhttp://es.wikipedia.org/wiki/Agar_CLEDhttp://es.wikipedia.org/wiki/Sangrehttp://es.wikipedia.org/wiki/Levadurahttp://es.wikipedia.org/wiki/Par%C3%A1sitoshttp://es.wikipedia.org/wiki/Virushttp://es.wikipedia.org/wiki/Plantahttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulahttp://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismohttp://es.wikipedia.org/wiki/Virushttp://es.wikipedia.org/wiki/PH


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Selectivos: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupodeterminado (hongos,bacterias entricas,protozoos).

Diferenciales:permiten identificar una especie o grupo por su crecimiento ya seapor su metabolismo, respiracin, etc.

Ejemplo: Medio deMcConkey

De enriquecimiento:son medios diseados para permitir el crecimiento del mximonmero de especies posible. Pueden usarse, por ejemplo, para estudiar todos losmicroorganismos presentes en una muestra.

Mnimo: contienen la mnima cantidad de nutrientes posible que permite elcrecimiento de una especie.

De transporte: est preparado para servir de almacenamiento temporal aespecmenes transportados. manteniendo su viabilidad y su concentracin.

Simple.

AGAR MAC CONKEY

USO:El Agar MacConkey es un medio selectivo y diferencialrecomendado para el cultivo y aislamiento demicroorganismos Gram negativos a partir de muestrasclnicas, de alimentos, agua, productos lcteos yproductos farmacuticos. En este medio se aslan ydiferencian bacilos entricos Gram negativosfermentadores y no fermentadores de la lactosa.

EXPLICACIN:El Agar MacConkey en su frmula original fue utilizado para diferenciar cepas de

Salmonella typhosa de otros miembros del grupo coliforme. La frmula fue modificadapara mejorar el crecimiento de cepas de Salmonella y Shigella y con ello tambin semejoraron las reacciones diferenciales entre los microorganismos patgenos entricosy el grupo coliforme.El Agar MacConkey contiene cristal violeta y sales biliares como inhibidores deorganismos Gram positivos. Las colonias aisladas de bacterias que fermentan lalactosa son rosadas y pueden estar rodeadas de una zona de precipitado de salesbiliares el cual es debido a una cada en el pH por la fermentacin de la Lactosa. Lascolonias que no fermentan la lactosa (como las de S. typhi, S. paratyphi y S. disentery)permanecen incoloras.

FORMULA:

Digerido Pancretico de Gelatina 17.0 Sales Biliares 1.5Digerido Pptico de Tejido Animal 1.5 Cloruro de Sodio 5.0Digerido Pancretico de Casena 1.5 Cristal Violeta 0.001Lactosa 10.0 Agar Bacteriolgico 13.5 Rojo Neutro 0.03 pH 7.1 0.2
http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_selectivohttp://es.wikipedia.org/wiki/Hongohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_ent%C3%A9ricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Protozoohttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_diferencialhttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Agar_McConkeyhttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_enriquecimientohttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_m%C3%ADnimohttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_transporte_(microbiolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_transporte_(microbiolog%C3%ADa)http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_m%C3%ADnimohttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_enriquecimientohttp://es.wikipedia.org/wiki/Agar_McConkeyhttp://es.wikipedia.org/wiki/Especiehttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_diferencialhttp://es.wikipedia.org/wiki/Protozoohttp://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_ent%C3%A9ricahttp://es.wikipedia.org/wiki/Hongohttp://es.wikipedia.org/wiki/Medio_selectivo


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PREPARACIN:

Mtodo:Suspender 50g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suavehasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-

50C y vaciar en placas de Petri estriles.

Procedimiento:Inocular las placas por estra o con hisopo, asegurndose de que con cualquiera delos dos mtodos se tengan colonias aisladas. Incubar las placas a 35 0.2C durante18 a 24 hrs. Si no hay desarrollo a las 24 hrs, reincubar las placas por 24 horas ms.

RESULTADOS: Los microorganismos lactosa positiva dan colonias de color rosa con o sin zona de

precipitado alrededor. Los microorganismos lactosa negativos dan colonias incoloras o de color muy

claro.

Almacenamiento: 2-30 C. Caducidad: 5 aos en frasco cerrado. Presentacin: Frasco con 450 g. Caja con 20 sobres para un litro. Medio preparado en paquete con 10 placas.

Bi bl io grafa:

3. Food and Drug Administration. 1995 Bacteriological analytical manual, 8th ed. AOAC International.Gaitherrsburg, MD.

4. Gray, L.D. 1995 Escherichia, Salmonella, Shigella and Yersinia, p450-456. In P.R. Murray, E.J.Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken

(ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

AGAR NUTRITIVO

USO:

El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una ampliavariedad de microorganismos.

EXPLICACIN:

A principios de 1900 la APHA (American Public Health Association) sugiri estaformulacin como un medio de cultivo estndar para el anlisis de agua. El Agar Nutritivo

se encuentra descrito en los Mtodos estndar de la APHA y de la AOAC (Association ofOficial Analytical Chemists) para el anlisis de agua, leche y sus derivados, alimentos yotros materiales. El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para elcultivo de microorganismos no fastidiosos.En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrgeno, vitaminasy carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.


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FORMULA:

Peptona de Gelatina 5.0 Extracto de Carne 3.0Agar Bacteriolgico 15.0 pH 6.8 0.2

PREPARACIN:

Mtodo:Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suavehasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C(15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C yvaciar en placas de Petri estriles.

Procedimiento:1. Inocular las placas con una asada y sembrar por el mtodo de estra.2. Incubar las placas a 35 C durante 18 a 24 horas.

RESULTADOS:

El crecimiento de bacterias no fastidiosas se observa como colonias translcidas.

Almacenamiento: 2-30 C.

Caducidad: 5 aos en frasco cerrado.

Presentacin: Frasco con 450 gCaja con 20 sobres para un litroMedio preparado en paquete con 10 placasMedio preparado en caja con 10 Tubos

Bi bl io gr afa:

1. American Public Health Association. 1917. Standard methods of water analysis, 3rd ed.American Public Health Association. Washington, D.C.2. American Public Health Association. 1923. Standard methods of water analysis, 5th ed.

American Public Health Association. Washington, D.C.

AGAR SANGRE

USO:La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para elaislamiento y cultivo de una amplia variedad demicroorganismos, adicionado de sangre es til para el cultivo de

microorganismos fastidiosos. Este medio tambin es conocidocomo BAB por sus siglas en ingls.

EXPLICACIN:La Base de Agar Sangre generalmente es suplementada con sangre de carnero, conejo ocaballo al 5-10% para aislar cultivar y estudiar reacciones hemolticas de una ampliavariedad de microorganismos fastidiosos patgenos.


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Almacenamiento: 2-30C.Caducidad: 5 aos en frasco cerradoPresentacin: Frasco con 450 g

Caja con 20 sobres para un litroMedio preparado Agar Sangre en paquete con 10 placas.

Bib li ogr afa1. Atlas, R. 1993. Handbook of microbiological media, p. 136-138. CRC. Press. BocaRaton, FL.

AGAR GC gelosa chocolate

USO:

La Base de Agar Gelosa Chocolate es un medio utilizado con variossuplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeaey otros microorganismos fastidiosos. Este medio tambin esconocido como Base de Agar GC.

EXPLICACIN:

En 1945 Johnston describi un medio adecuado para observar lascolonias de Neisseria gonrrhoeae en 24 horas en lugar de las 48 horas generalmenterequeridas. El crecimiento acelerado fue debido a una reduccin en la concentracin deagar. Investigando el crecimiento de algunas cepas de neumococos se observ que elmedio conteniendo los factores de crecimiento glutamina y cocarboxilasa permiti unamejor recuperacin. A partir de esta observacin se desarrollaron suplementos deenriquecimiento que junto con la hemoglobina hacen a la Base de Agar GC un mediosuperior.

La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando essuplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para elcrecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria, as como suplementos(disponibles comercialmente) que proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina,coenzimas, hemina, vitaminas, aminocidos, dextrosa y otros factores de crecimiento,todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophilus y Neisseria.

Cuando a esta base se le adiciona adems inhibidores selectivos como el VCN o VCNTse prepara el Agar Thayer Martn y Thayer Martn Modificado

FORMULA:

Mezcla de Peptonas 15.0 Fosfato Dipotsico 4.0Almidn de Maz 1.0 Fosfato Monopotsico 1.0Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriolgico 10.0pH 7.2 0.2


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PREPARACIN:Mtodo:Suspender 7.2 g del medio en 100 mL de agua purificada para obtener una base de dobleconcentracin, mezclar y dejar reposar durante 5 minutos, calentar con agitacinfrecuente hasta completar la disolucin del polvo y hervir durante un minuto. Por otro lado,preparar 100 mL de una solucin de hemoglobina al 2% adicionando gradualmente agua

a 2 g de hemoglobina seca para obtener una solucin uniforme.

Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar lassoluciones a una temperatura de 45-50 C, mezclar y agregar los dems ingredientesdependiendo del medio que se desee preparar. Homogenizar y vaciar en placas Petriestriles.

Procedimiento:1. Procesar las muestras y sembrar las placas inicialmente en forma de Z yposteriormente estriando.2. Incubar en atmsfera aerbica enriquecida con CO2 a 35 2C por 18 a 24 y hasta 48horas y observar el crecimiento.

RESULTADOS:

La morfologa tpica colonia se describe en la siguiente tabla:

Haemophilus influenzae Colonias pequeas, hmedas, perladas con caracterstico olorhmedo.Neisseria gonorrhoeae Colonias pequeas grisceas o incoloras, mucoides.Neisseria meningitidis Colonias medianas a grandes, de color azul grisceo, mucoides.Estreptococcus pneumoniae Colonias pequeas, planas, pueden aparecer verdes por ladecoloracin del medio.

Almacenamiento: 2-30C.

Caducidad: 5 aos en frasco cerrado.

Presentacin: Frasco con 450 gCaja con 20 sobres para un litroMedio preparado Agar Gelosa Chocolate paquete con 10 placas.

Bi bl io grafa:

1. Isenberg, H.D. (Ed.). 1992. Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1 AmericanSociety for Microbiology, Washington, D. C.

2. Spray, 1930. J. Lab. Clin. Med. 16:166.


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CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS

INTRODUCCIONUn medio de cultivo intenta el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, paraobservar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al

contar con material en cantidad suficiente. Por ello constare de lagunas propiedades(pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de aero-anaerobiosis, etc.), que sern lasms idneas para la bacteriaque deseamos estudiar y secitan en cada una de ellas enparticular, en la bacteriologasistemtica.Los medios de cultivo sedividen por su finalidad en:medios de enriquecimiento quetratan de aumentar el nmerode bacteria existentes, si

consideramos que seencuentran en cantidad muyexigua, a la vez que inhiben laflora de asociacinacompaante (y de aislamiento(que tienen por fin conseguiruna colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todassus propiedades); los dos primeros son principalmente lquidos y los segundos,slidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algn componente quepermite o no le crecimiento de una especie bacteriana, carcter de importancias parasu identificacin, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies que hay que

testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores (sustancias quevaran su coloracin segn el pH del medio) u otros ndices de reacciones qumicasdefinidas.

Ambos medios selectivos o diferenciales pueden ser lquidos o slidos.

OBJETIVOS

Identificar mtodos eficaces para el aislamiento de microorganismos.

Conocer algunos mtodos para obtener un cultivo puro.

El objetivo clsico del aislamiento es la separacin de los microorganismos en grupos,que puedan identificarse siguiendo los principios de la microbiologa.


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MATERIALES Mecheros Asas, agujas e hisopos de inoculacin Placas petri

METODOSCULTIVO PLACA AGARSe utilizan variaos mtodos de siembra por estras en superficieentre las cuales tenemos el mtodo francs y el clsico, la finalidadde estos, es obtener colonias separadas.

METODO FRANCES (Estra compuesta)Se flamea el asa y se toma la muestra del material a estudiar.Coloque el inoculo en uno de los extremos de la caja de petri con el

medio de cultivo indicado.


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CULTIVO EN AGAR NUTRITIVOEl crecimiento de las bacterias en medios lquidos semanifiesta por la aparicin de: turbidez o sedimento, velo en lasuperficie del medio y olor caracterstico.Para la siembra proceda de igual manera que en el casoanterior pero utilizando el asa y agitndola en un medo liquido.Incube a 37 grados por 24 o 48 horas, interprete los resultados.


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BIBLIOGRAFA.Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos.http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de%20

microoorganismos.pdf Fecha de consulta: 22-04-2010.


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ANTIBIOGRAMA

Introduccin:Un antibitico es una sustancia de origenbiolgico que inhibe el crecimiento de los

microorganismos a concentraciones muybajas. Un antibiograma es un estudio de lasensibilidad "in vitro" de unmicroorganismo patgeno frente a lassustancias antimicrobianas. Existendistintos mtodos siendo los msimportantes los de:

Difusin: Habitualmente cualitativos.Atendiendo al halo de inhibicin queaparece alrededor del disco, se clasifican los microorganismos como sensibles(S), intermedios (I) o resistentes (R) segn sea la eficacia obtenida por el agenteantimicrobiano frente al microorganismo.

Dilucin: Es un estudio cuantitativo. Se emplean una serie de tubos con distintasconcentraciones de agente antimicrobiano (4-128 _g/ml).Se observa el crecimiento de los microorganismos mediante la aparicin deturbidez, o el cambio de color del indicador incorporado al medio.La sensibilidad de una bacteria a un antibitico viene dada por la:

C.M.I. es la concentracin mnima inhibitoria, representa la mnima cantidad deantimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo.

C.M.B. concentracin mnima bactericida. Es la concentracin mnima que matael microorganismo. Normalmente, la CMI es suficiente para combatir unadeterminada infeccin ya que los mecanismos inmunitarios se encargan deeliminar al microorganismo.

Deteccin de beta lactamasas: Algunos microorganismos son capaces deproducir estas enzimas, que destruyen los derivados del grupo de las penicilinas,hidrolizando el anillo betalactmico. Se aplica esta prueba a los siguientesmicroorganismos: Staphylococcus aureus, Haemphilus influenzae y Neisseriagonorrhoeae.El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una de las pruebasutilizadas para determinar la sensibilidad de un microorganismo frente a unantibitico. En esta prueba se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie deun medio de agar a una solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtroo en pastillas.


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Procedimiento:

1. Preparar 3 placas Petri con agar Meller Hinton.2. A partir de un cultivo fresco de las bacterias que hay que ensayar (E. coli,

Staphilococcus,...), inocular 4-5 colonias en un tubo con 5 ml de caldo TSB.3. Utilizando un hisopo de algodn sumergirlo en el inculo y eliminar el excesopresionndolo sobre la pared interna del tubo.4. Inocular la superficie de una placa de agar Meller Hinton con el hisopopasndolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo,pasar el hisopo por el reborde de la placa.5. Dejar secar 10 min con la tapa algo abierta (junto al mechero).

6. Preparacin de los discos con antibitico. Disolver una cpsula, comprimido,gragea o vial de antibitico en agua destilada; elegir una presentacin de

antibitico fcilmente soluble (Calcular el volumen de dilucin que precisa cadatipo de antibitico, segn la tabla 8.1).7. Preparar un banco de diluciones (-1, -2) con agua destilada.8. Con micropipeta Pasteur impregnar los discos para antibiograma con 1 gota demicropipeta (32 _l) de las disoluciones de antibitico (se puede utilizar la mismapipeta si se realiza de menor a mayor concentracin). Anotar la concentracin y elvolumen de antibitico aadido en cada disco.9. Colocar el disco de antibitico (con pinzas estriles) sobre la superficie del agary apretarlo suavemente sobre la superficie del medio. Los discos no deben estar a

menos de 15 mm de los bordes de la placa y a unos 20 mm uno de otro para queno se superpongan las zonas de inhibicin. (No mover los discos una vezimplantados).10. Realizar la operacin con:

a. Placa 1 (Staphilococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Amoxicilina.b. Placa 2 (Staphylococcus):3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Penicilina Gc. Placa 3 (E. Coli): 3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Amoxicilina,3 discos con las diluciones (1,-1, -2) de Penicilina G.


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Tabla 8.1. Halos de inhibicin aceptables segn las normas de la NCCLS para losantibiogramas de difusin

Antibitico /carga

del disco (g)

Halos de inhibicin (mm)

E. coliATCC25922

S. aureusATCC 25923 E. coliATCC 25922

Amicacina/30 19-26 20-26 18-26Amoxicilina-clavulnico/20/10 19-25 28-36 NAAmpicilina/10 16-22 27-35 NACefazolina/30 23-29 29-35 NACefotaxima/30 29-35 25-31 18-22Ceftazidima/30 25-32 1 16-20 22-29Cefuroxima/30 20-26 27-35 NACloranfenicol/30 21-27 19-26 NA

Ciprofloxacina/5 30-40 22-30 25-33Clindamicina/2 NA 24-30 NADoxiciclina/30 18-24 23-29 NAEritromicina/15 NA 22-30 NAGentamicina/10 16-21 19-26 19-27 16-21Imipenem/10 26-32 NA 20-28

cido nalidxico/30 22-28 NA NANitrofurantona/300 20-25 1 18-22 NANorfloxacina/10 28-35 17-28 22-29Oxacilina/1 NA 18-24 NAPenicilina G/10 NA 26-37 NA

Piperacilina/100 24-30 NA 25-33Tobramicina/100 18-26 19-29 19-25Trimetoprim/Sulfametoxazol/1,25/23,75

24-32 24-32 NA

Vancomicina/30 NA 15-19 NA

NA = No aplicable


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LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

Medir los dimetros de las zonas de inhibicincompleta (incluyendo el dimetro del disco), usandouna regla o calibrador. Se debe mantener iluminada

la parte posterior de la placa petri con una luzreflejada localizada a unos cuantos centmetrossobre un fondo negro. Tener la precaucin deobservar la placa siguiendo una vertical directa paraevitar una lectura errnea de las marcas de la reglapor efecto de paralelismo. En los mediossuplementados con sangre, las zonas son medidasen la parte superior de la superficie del agar yretirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zonade la hemlisis sino la de inhibicin del crecimiento.

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