Universidad Tecnolgica de PueblaCarrera de Qumica rea Tecnologa AmbientalAsignatura: Microbiologa Ambiental

Prctica No. 9 Cuantificacin de bacterias Coliformes Totales y Fecales de una muestra de Agua por la metodologa de filtro de membrana.Objetivo: Conocer y aplicar la metodologa de filtro de membrana para evaluar la calidad sanitaria del agua y obtener un resultado directo de la concentracin de bacterias Coliformes.

Introduccin:Antes de la segunda guerra mundial se empez a pensar en la aplicacin de filtros de membrana en el examen bacteriolgico del agua (recuento de bacterias, determinacin de Coliformes, aislamiento de patgenos).Alemania y Rusia fueron los primeros pases en aplicar esta tcnica y principalmente Alemania, cuando tuvo muchos de sus laboratorios destruidos por el efecto de la guerra.En 1955 la dcima edicin de los Standard Methods for Examinatin of Water, Sewage and Industrial Wastes lo inclua como mtodo tentativo en la determinacin de coliformes. Posteriormente, en las ediciones 11 y 12 ediciones de la publicacin, este mtodo se hizo oficial para la determinacin de coliformes.Actualmente la prueba de filtro de membrana est siendo utilizada como un mtodo normalizado para evaluar la calidad sanitaria del agua y definir su potabilidad. La mayora de las muestras de agua puede ser analizada por los mtodos de filtros de membrana.La prueba de Filtro de Membrana es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numricos ms rpidos que el mtodo de los tubos mltiples. Este mtodo es muy til para controlar las posibles situaciones de urgencia en relacin con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales.Ventajas del uso de Filtro de membrana para las aguas:1. Rapidez en la obtencin de resultados 2. Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar. 3. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fcilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente. Sin embargo, esta tcnica tiene limitaciones sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias No Coliformes. Para estas aguas, y tambin en caso de que no se haya utilizado anteriormente la tcnica del filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la tcnica de fermentacin en tubos mltiples para demostrar la aplicabilidad y comparabilidad de aqulla.Principio del mtodo:Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Mtodo):Se hace pasar al vaco parte de la muestra por una membrana de filtracin de acetatos de celulosa con poros y dimetro de 0.45 m que capte la bacteria, en tanto que permita el paso libre del H2O., la membrana de filtracin se coloca aspticamente en una caja de petri en medio de cultivo nutritivo, o en un cojincillo absorbente saturado con un medio de cultivo nutritivo, se incuba, se examina la membrana con microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias.MARCO TERICO Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C.

Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.Una elevada proporcin de los coliformes que existen en los sistemas de distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.

Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto de vista metodolgico Escherichia coli es el Coliforme s es positivo a la prueba del Indol.

Filtros de superficie de membrana Elaborados generalmente de acetato de celilosa o nitrato de celulosa, contiene poros de tamao uniforme. Se puede saturar rapidamente y la velocidad del filtrado a traves de ella es muy lenta.Membrana de nitrato de celulosa.La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la fabricacin de filtros de membrana. Estas membranas son de naturaleza hidroflica, es muy uniforme lo que permite excelentes niveles de retencin de partculas y un comportamiento perfecto en pruebas microbiolgicas. Membrana de acetato de celulosa Son de naturaleza hidroflica, permite gran capacidad de carga y altas velocidades de flujo, por lo que resulta apropiado para la esterilizacin y clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites. Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por la superficie de la membrana y el remanente permanecen o se concentra all. El volumen del flujo y otras partculas finas de menor tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana del sitio de filtrado.

METODOLOGA 1 Pinza de punta redonda

1 Equipo de Filtracin esterilizado

1 mechero

1 Matraz de Kitasato

1 Bomba de Vaco

1 Vaso de precipitados de 250ml

2 Membranas para filtrar con poro de 0.45m estriles

4 Pipetas de 10 ml estriles

Materiales, equipos y reactivos

Materiales

1 parrila

1 esptula

1 matraz erlenmeyer de 250 ml

1 matraz erlenmeyer de 100 ml

1 varilla de vidrio

1 probeta de 100 ml

1 balanza granataria

1 pipeta Pasteur

10 tubos de 13 x 100 mm

1 gradilla

1pipeta de 1 ml

1 pipeta de 5 ml

1 matraz aforado de 200ml

2 matraces aforados de 50 ml

1 vaso de precipitados de 200 ml

1 vidrio de reloj

Reactivos:

Fosfato dicido potsio (KH2PO4)

Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)

NaOH 1 N

Medios de cultivo: TSI, SIM, UREA, RM-VP, Endo

Reactivo para Tincin de Gram

Reactivo de Kovacs

Alcohol etlico

Agua destilada

MetodologaDeterminacin de Coliformes totales y coliformes fecales por la metodologa de Filtro de MembranaA. Procedimiento para la preparacin de los materiales y equipos a utilizar.El equipo de filtracin debe estar esterilizado al comienzo de cada serie de filtraciones que pueden ser 30 o ms muestras. Una filtracin en serie se considera interrumpida si hay un intervalo de 30 minutos o ms entre las filtraciones de las muestras.1. La esterilizacin del equipo de filtracin debe realizarse en autoclave, separando ambas partes del equipo y envolvindolas en papel grueso; 121C por 15 minutos.2. Los filtros de membrana se deben esterilizar en un recipiente (vidrio) por autoclave, 121C por 10 minutos, al finalizar la esterilizacin, deje que el vapor escape rpidamente para reducir en lo posible la acumulacin de agua de condensacin en los filtros.3. Pinzas. Se seleccionarn las que tienen extremos redondos y punta recta, no es conveniente que tengan rugosidades, pues pueden daar las membranas al momento de trasladarlas al equipo de filtracin.4. Almohadillas absorbentes para medios de cultivo. Deben ser de papel filtro, con medidas de 48 mm de dimetro y un grosor suficiente para absorber 1.8 a 2.2 ml de medio de cultivo. Deben ser esterilizados previamente en autoclave a 121C durante 10 minutos.5. Incubadora de bao de agua (bao Mara). Debe mantener la temperatura a 44 +/- 0.5C, con agitador para mantener la temperatura uniforme.6. Matraz de Kitasato. Deben ser de vidrio; se colocan entre el equipo de filtracin y la bomba de vaco.7. Vasos de precipitado con alcohol al 95% para esterilizar las pinzas.8. Bomba de vaco.9. Placas de Petri estrilesMedios de cultivo y diluciones10. Agar Endo o almohadilla embebida con medio Endo. Preparar y esterilizar conforme lo establece el vial del medio de cultivo.11. Preparacin del agua de dilucin amortiguadaSolucin stock AFosfato dicido potsico (KH2PO4) 34 gAgua destilada 1000 mlDisolver el fosfato dicido de potasio en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1 N y completar el volumen para un litro, con agua destilada.Solucin Sotck BSulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)50 gAgua destilada 1000 mlDisolver el sulfato de magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 litro.Preparacin del agua de dilucin amortiguada.Agregar 1.25 ml de la solucin Stock A y 5 ml de la solucin Stock B a una litro de agua destilada. Distribuir en cantidades de 90 ml. Esterilizar a 121C por 15 minutos.Nota: considere que cada frasco contendr adems 10 ml de muestra.12. Preparar 50 ml de solucin de hidrxido de sodio 1 N14. Esterilizar 2 frascos conteniendo 100 ml de agua de dilucin amortiguada cada uno.15. Esterilizar 4 pipetas de 10 ml.16. Esterilizar un frasco para recolectar la muestra.

B. Procedimiento para la dilucin de las muestras:Para aguas residuales domsticas es necesario previamente diluir las muestras teniendo en consideracin que el nmero ideal de colonias en el filtro de membrana sea de 20 a 60 para la determinacin de Coliformes.

Tipo de muestraVolumen necesario

10-110-210-310-410-510-610-7

Agua residual crudaxxxx

Agua residual efluente primarioXxx

Agua residual efluente secundarioxXx

Agua residual efluente terciarioXxXx

El equipo de filtracin debe estar esterilizado al comienzo de cada serie de filtraciones. Se considera interrumpida una filtracin en serie cuando hay un intervalo de 30 minutos o ms entre las filtraciones de muestras.

Si es necesario esterilizar el equipo durante el da varias veces, es aconsejable exponer el embudo y el soporte a la luz ultravioleta durante dos minutos. La esterilizacin puede ser efectuada tambin con agua hirviendo.Par asegurar que no existe contaminacin, al comenzar las pruebas se debe someter a filtracin unos 100 ml de agua dilucin estril, antes de iniciar la filtracin de las muestras.

C. Filtracin y siembra de la muestra (operacin repetida por dos).Elegir la dilucin adecuada y filtrarla hacindola pasar a travs de la membrana de celulosa de 0.45 m.Posteriormente lavar el embudo tres veces con volmenes de 20-30 ml de dilucin estrilCon la pinza estril retirar la membrana de la unidad de filtracin y colocar con extremo cuidado sobre la placa del agar Endo o sobre la almohadilla impregnada con caldo Endo.Apoyarse en el siguiente diagrama:

Diagrama de la cuantificacin de bacterias Coliformes por la Metodologa de Filtro de Membrana10-410-310-210-1

10 ml10 ml10 ml10 ml

90 ml de dilucin amortiguada90 ml de dilucin amortiguada90 ml de dilucin amortiguada90 ml de dilucin amortiguada

Muestra de agua cruda

Volumen a filtrar10 ml10 ml10 ml10 ml

Equipo de filtracin estril

Transferir la membrana utilizando pinzas estriles

Placas con agar Endo o con almohadillas impregnadas con caldo Endo

Volumen de muestra original filtrada 0.0001 mlVolumen de muestra original filtrada 0.001 mlVolumen de muestra original filtrada 0.1 ml

Volumen de muestra original filtrada 0.01 ml

44C44C35C

35C44C44C35C35C

35C incubacin/24h con paos hmedos en la estufa Recuento de colonias con reflexin de brillo verde amarillento metlico Reportar como: UFC de Coliformes Totales/100ml (Multiplicar por el factor de dilucin empleado en su caso).

44C incubacin/24h en Bao Mara Recuento de colonias con reflexin de brillo verde amarillento metlico Reportar como: UFC de Coliformes Fecales/100ml.(Multiplicar por el factor de dilucin empleado en su caso).

En ambos casos comprobar la presencia de bacterias Coliformes con las pruebas bioqumicas: TSI, SIM, UREA, OXIDASA, RM-VP, TINCIN DE GRAM, siguiendo las temperaturas de incubacin como corresponde en casa caso.

RESULTADOS

Se llevaron a cabo 2 diluciones (10-2 )Agua de dilucin amortiguadora

Resultados

2 diluciones X 90 ml =180 ml

180ml + 800ml (dilacin amortiguadora para lavar cada filtro)=980ml

980 ml + 20 de excedente =1000ml

Solucin stock A Solucin stock B

Fosfato didico de potasio 34g Sulfato de magnesio heptahidratado 50g

Agua destilada 1000ml Aguas destilada 1000ml

Clculos para agar ENDO Para 3 placas de 35ml c/u = 115 ml

41.5g1000ml

4.7725 g 115ml

Salida PTR (efluente)

Dilucin UFC/100mlCT (37C)UFC/100mlCF(44C)

10-1IncontableIncontable

10-2IncontableIncontable

10-324 colonias= 24,000 UFC/100ml de CT.8 colonias= 8,000 UFC/100ml de CF

10-4Incontable5 colonias= 5,000 UFC/100 ml de CF

Salida del canal de juncos

Dilucin UFC/100ml CT (37C)UFC/100ml CF (44C)

10-1Incontable Incontable

10-2IncontableIncontable

10-3IncontableIncontable

10-460 coloniasCT = 600,000 UFC/100ml51 coloniasCF= 510,000 UFC/100ml

ANLISIS DE RESULTADOS Recuento de las colonias Tras la incubacin, se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del agar. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC se corresponde con una clula viable.Cuando se obtienen recuentos de ms de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar resultados errneos debido a la superpoblacin, ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento

Cuestionario1. Cul es el uso recomendado de los filtros de membrana?Se debe utilizar filtros de membrana con un diametro de poro que permita una completa retencin de las bacterias colifotmes. Solo se emplean filtros en los que se haya comprovado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por garantia del fabricante, que permita una retencin de las bacterias caloformes. Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados o en todo caso esterilizar en el laboratorio en la autoclave por 15 minutos a 120C 2. Cules son las limitaciones del filtro de membrana? Tiene limitacin para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias No Coliformes3. Adems de la filtracin, qu otros mtodos fsicos hay para el control de microorganismos?Las de tubos mltiples 4. Cul es la ventaja y desventaja de usar el mtodo de filtro de membrana para la determinacin de bacterias coliformes?Ventajas del uso de Filtro de membrana:Rapidez en la obtencin de resultados Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy fcilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente. Desventajas:Interfieren los altos niveles de turbiedad Las altas concentraciones de no coliformes interfieren en el recuento.

Conclusin El conteo con filtro membrana es un conteo real y no estadstico, a diferencia del ensayo con tubos mltiples; los dos resultados no son iguales y generalmente se obtiene una recuperacin ms alta de coliformes en el conteo con filtro membrana; adems, el conteo en filtro membrana puede hacerse a las 24 horas y no es necesario esperar las 48 horas requeridas en el ensayo de tubos de fermentacin, en su etapa presuntiva.La tcnica del filtro membrana puede usarse con mucho xito en el anlisis de aguas salinas y otras, sin embargo, tiene limitaciones en el anlisis de aguas turbias o aguas con proporciones altas de bacterias no coliformes, debido a que el filtro puede obstruirse.BibliografaMicrobiologa. Pelczar/Reid/Chan. 1977. Cuarta Edicin. Editorial Mc Graw HillMtodos Normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales. APHA, AWWA, WPCF. 1992. Ediciones Daz de Santos.

UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PUEBLACARRERA QUMICA REA AMBIENTAL

RBRICA PARA EVALUAR REPORTES DE PRCTICAS DE LA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA AMBIENTALCUATRIMESTRE: MAYO/AGOSTO-3013No.ConceptoPonderacinCalificacin

1.El Marco terico fundamenta los temas sustantivos de la prctica.1 punto

2.La Metodologa contempla con detalle: los requerimientos en materiales, equipos y reactivos, el procedimiento 0.5 puntos

3Los resultados se expresan adecuadamente utilizando nombres y frmulas1 punto

4.La discusin de los resultados es congruente con el objetivo1 punto

5.La conclusin describe la evidencia y tiene una aplicacin con el perfil profesional.2 puntos

6La bibliografa consultada y reportada es acorde al tema0.5 puntos

7.El trabajo se elabor respetando reglas ortogrficas y redaccin.1 punto

8Las respuestas del cuestionario tienen congruencia con el desarrollo de la prctica y las observaciones registradas durante la misma.1 punto

9.La entrega del reporte de la prctica fue en tiempo y forma.1 punto

10.Durante la prctica se condujo con las medidas pertinentes y adecuados de seguridad e higiene1 punto

Total10

Observaciones:

Universidad Tecnolgica de Puebla

Carrera: Qumica rea Tecnologa Ambiental

Asignatura: Microbiologa Ambiental

Prctica 7: Cuantificacin de bacterias Coliformes Totales y Fecales de una muestra de Agua por la metodologa de filtro de membrana. Nombre del alumno: Marlen Tlapanco ContrerasGrado: 3do Grupo: A

Nombre del profesor(a): Maria Oneida Rosado Garca

13-agosto- 2013