cuadernillo practicas farma1 1314

PRACTICAS DE FARMACOLOGA I DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGA

FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SEVILLA

Prcticas de Farmacologa y Farmacoterapia I

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VALORACIN DE LA ACTIVIDAD PSICOTROPA

DE FRMACOS


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1. VALORACIN DE FRMACOS PSICOTROPOS

1.1. INTRODUCCIN

Los psicofrmacos son sustancias que deprimen, estimulan o alteran la naturaleza de la conducta y/o de las reacciones emocionales y por ello son empleados en el tratamiento de las enfermedades mentales.

Tanto en animales como en el hombre no existe un criterio nico que permita clasificar un frmaco psicotrpico, siendo necesaria una verdadera batera de mtodos de estudio. Los mtodos de investigacin bsica, aunque presentan un valor provisional dada la dificultad en la extrapolacin de resultados obtenidos desde el animal de experimentacin hacia el hombre, permiten valorar molculas seleccionadas con potencial aplicacin teraputica.

A continuacin se describen los mtodos principales.

1.1.1. Pruebas de Comportamiento general

Esquema de Irwin

En la valoracin preliminar de nuevos frmacos posiblemente activos sobre SNC ocupa un lugar destacado el Esquema de Irwin. Su sencilla realizacin as como la suficiente validez de los datos aportados hacen que su prctica sea de gran utilidad antes de proseguir la investigacin con pruebas de mayor complejidad. El desarrollo de esta batera de ensayos quedara resumido en tres grandes apartados:

Estudio de comportamiento (alerta, aseo, irritabilidad)

Estudio neurolgico (temblores, convulsiones, ataxia)

Estudios relacionados con el SNA (salivacin, hipotermia, midriasis)

Efecto de Doma

Animales naturalmente hostiles como el mono rhesus, pueden adquirir un comportamiento normal, fciles de manejar, cooperativos, por accin de frmacos con accin tranquilizante.

Facilitacin de hipnticos.

Un efecto comn de los tranquilizantes mayores es la facilitacin de los hipnticos y de los anestsicos generales que se pone de relevancia por la prolongacin de la actividad de los mismos.

Reaccin emocional.

En determinado espacio especialmente indicado para este tipo de experimentacin, caja de campos, se valora la mayor o menor sensibilidad y adaptacin del animal ante las nuevas circunstancias ambientales. Adems de observar la actividad motora desarrollada por el animal, es til y sencillo anotar el nmero de defecaciones producidas.


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1.1.2. Actividad motora

La accin de frmacos tranquilizantes y relajantes musculares, activos a nivel central, puede ser estudiada ensayando las modificaciones inducidas en modelos relacionados con la actividad motora.

Actgrafos

La motilidad espontnea del animal se cuantifica mediante aparatos denominados actgrafos.

El ms sencillo consistira en una jaula ligera suspendida de un soporte cuyos movimientos son registrados. Existen sistemas ms complejos compuestos de clulas fotoelctricas sensibilizadas en relacin con la actividad del animal.

Trastornos de la marcha

Se registran los cambios producidos en la marcha del animal previamente impregnado con determinado colorante en sus extremidades. Las marcas producidas presentaran ciertos cambios o irregularidades cuando el animal sufre ataxia.

Prueba del cilindro rotatorio

Consiste en un cilindro con capacidad de giro segn determinadas condiciones previamente establecidas. Se registra el tiempo que tarda en caer el animal.

Prueba de la chimenea

Se introduce el animal, ratn, en un tubo de vidrio con la cabeza hacia abajo, anotando el tiempo que tarda en recobrar la posicin normal.

Estudio sobre cambios catatnico o catalpticos.

Molculas con accin neurolptica tienen la propiedad de producir en la animales un estado caracterizado por la permanencia de los mismos en posiciones anormales.

Excitacin provocada

El estudio de agentes con posible accin anticonvulsivante puede realizarse estimulando previamente al animal con frmacos como estricnina, picrotoxina o cardiazol, productores de convulsiones de diferentes caractersticas, y ver la accin antagonista del frmaco en estudio.

Pruebas de traccin, evasin y curiosidad.

1.1.3. Ensayos sobre aprendizaje y memoria

Adems de los ensayos anteriormente citados, los estudios se pueden completar con otros test

neurofarmacolgicos relacionados con los cambios en conducta exploratoria y emocional.

Prueba del laberinto.

Los laberintos pueden ser de distinta complejidad e incluso introducir determinada recompensa.

Anotaramos el tiempo que tarda en encontrar la salida, as como el nmero de errores cometidos. Previamente el animal habr sido sometido a un periodo de aprendizaje.


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Autoestimulacin

Esta tcnica consiste en implantar electrodos permanentes en determinados centros cerebrales del animal y conectados a un dispositivo por el cual reciben determinadas descargas elctricas al presionar una palanca. Los animales curiosamente reciben satisfaccin al autoestimularse. Algunos frmacos alteran la velocidad de esas estimulaciones en distintas zonas del cerebro, como es el caso del ratn y las anfetaminas o el gato y la morfina.

1.1.4. Reflejos condicionados

Respuesta de fuga y evitacin

El animal, normalmente rata, es colocado en una jaula cuya base recibe una descarga elctrica de determinadas condiciones preestablecidas y algo dolorosas. Posteriormente, la rata es sometida a una fase de aprendizaje ensendola a evitar la descarga pasando antes al compartimento prximo, concretamente al observar determinada seal de aviso como puede ser un timbre o una luz. Este tipo de ensayo son especialmente tiles en la valoracin de frmacos antidepresivos. Los animales por tanto han de sufrir previamente determinada alteracin neurolgica que se aproxime a un posible cuadro depresivo. Es til entonces utilizar el modelo de shock inescapable consistente en sesiones diarias de descargas elctricas y que terminan generando en el animal un cuadro de estrs emocional.

Este conjunto de pruebas son algunas de las que podran realizarse para valoracin de frmacos activos sobre el SNC. No obstante el estudio completo, profundizando en su mecanismo de accin, necesitara pruebas ms concretas y sofisticadas de tipo electrofisiolgico (EEG), bioqumico (actividad sobre determinados enzimas, binding en receptores cerebrales) o anatomopatolgicos

1.2. MATERIAL Y MTODOS

1.2.1. Animales y sustancias ensayadas

Se toman dos grupos de ratones (n=12)

1. Grupo Control (vehculo, agua)

2. Grupo tratado con el frmaco psicodepresor- Diazepam (2mg/Kg)

A cada animal (uno por alumno) se le aplica, va i.p. 0.25 ml de las soluciones de los frmacos en estudio. Mantendremos una secuencia de 15 min entre cada animal.

Pasados 30 min se procede a la valoracin de los cambios inducidos segn los tipos de test propuestos. Las pruebas han de hacerse en silencio mximo, siendo imprescindible que la manipulacin se intente realizar en idnticas condiciones para todos los animales.

Test de la curiosidad (Test de Boisier-Simon)

En primer lugar, cada animal, y segn la secuencia de aplicacin de 5 min, es colocado en el centro de una plancha agujereada situada a 50 cm del suelo. Se contabiliza el nmero de veces que introduce la cabeza de forma contundente en los orificios no valorndose aquellas realizadas consecutivamente en el mismo orificio o en el borde de dicha plancha. Los resultados se anotarn segn las observaciones obtenidas durante cada minuto, de los cinco que dura la prueba. Es decir, representamos n de veces en un minuto durante 5 min, obtenemos por tanto 5 valores para cada animal.

Test de la Actividad Motora Espontnea (Actmetro)

El actmetro mide la motilidad del animal a travs de un sistema de sensoresnmero de movimientos del animal mediante un actmetro(0-5, 5-10 y 10-15) por un periodo total de 15 minutos.

Test de la Coordinacin Motora (Rota

Consiste en medir el tiempo que el animal es capaz de mantenerse sobre un cilindro que gira a una velocidad constante de 5 rtiempo.

Test de la Tracci

Utilizaremos un alambre horizontal del que colgaremos al ratn por las extremidades anteriores. Anotaremos el tiempo que tarda en caer dentro del tiempo asignado a la prueba (120 s).

1.3. EXPRESIN DE RESULTADOS

1.3.1. Representacin grfica

Se calcula para cada grupo, y segn los resultados obtenidos en los distintos ensayosrealizados, la media error standard.

En el TEST DE LA CURIOSIDADabscisas los minutos (de 1 a 5) que ha durado la ( error) de los resultados obtenidos en cada minuto. Obtendremos dos tipos derelacionados con los dos tratamientos a los que hemos sometido a los animalesgrupo diazepam).

Prcticas de Farmacologa

Test de la Actividad Motora Espontnea (Actmetro)

El actmetro mide la motilidad del animal a travs de un sistema de sensoresnmero de movimientos del animal mediante un actmetro. Se contabilizarn intervalos de 5 minutos

15) por un periodo total de 15 minutos.

st de la Coordinacin Motora (Rota-Rod)

Consiste en medir el tiempo que el animal es capaz de mantenerse sobre un cilindro que gira a una velocidad constante de 5 r.p.m. Un frmaco que afecte a la coordinacin motora reducir este

raccin (Julon-Courvoisier)


EXPRESIN DE RESULTADOS

Representacin grfica

calcula para cada grupo, y segn los resultados obtenidos en los distintos ensayoserror standard.

TEST DE LA CURIOSIDAD realizaremos un grfico en el cual representamos enabscisas los minutos (de 1 a 5) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las

error) de los resultados obtenidos en cada minuto. Obtendremos dos tipos derelacionados con los dos tratamientos a los que hemos sometido a los animales


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El actmetro mide la motilidad del animal a travs de un sistema de sensores. Se contabilizar el Se contabilizarn intervalos de 5 minutos

Consiste en medir el tiempo que el animal es capaz de mantenerse sobre un cilindro que gira m. Un frmaco que afecte a la coordinacin motora reducir este


calcula para cada grupo, y segn los resultados obtenidos en los distintos ensayos

realizaremos un grfico en el cual representamos en prueba y en ordenadas los valores de las medias

error) de los resultados obtenidos en cada minuto. Obtendremos dos tipos de respuesta relacionados con los dos tratamientos a los que hemos sometido a los animales (grupo control y

Para el TEST DE LA TRACCINgrupos ( error estndar) y los resultados los representamos en un grfico tipo histograma barras).

TEST DE LA ACTIVIDAD MOTORA ESPONTNEA

Realizaremos un grfico en el cual representamos en abscisas los intervalos en minutos (05-10, 10-15 min.) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las medias (resultados obtenidos en cada intervalo.


TEST DE LA TRACCIN calcularemos la media de los valores obtenidos con los dos error estndar) y los resultados los representamos en un grfico tipo histograma

EST DE LA ACTIVIDAD MOTORA ESPONTNEA

os un grfico en el cual representamos en abscisas los intervalos en minutos (015 min.) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las medias (

resultados obtenidos en cada intervalo.


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calcularemos la media de los valores obtenidos con los dos error estndar) y los resultados los representamos en un grfico tipo histograma (grfico de

os un grfico en el cual representamos en abscisas los intervalos en minutos (0-5, 15 min.) que ha durado la prueba y en ordenadas los valores de las medias (error) de los

Para el TEST DE LA COORDINACION MOTORA obtenidos con los dos grupos ( histograma (grfico de barras

1.4. ANLISIS ESTADSTICO

El anlisis estadstico nos permite conocer si las diferencias observadas entre los resultados de los dos grupos de animales son significativas o no. Si las diferencias fueran efectivamente significativas podramos afirmar que diazepam disminuye la curiosidad y traccin de los anAsimismo podramos asegurar que diazepam disminuye la actividad motora, ya que estas pruebas evalan dicha capacidad.

Las diferencias que observemos a simple vista no tienen porqu ser significativas, es necesario la realizacin de pruebas matemtigrupo se parecen entre s y que son distintos de los de otro grupo.

Los conceptos que vamos a manejar para ello son los siguientes:

Media:

Error estndar:

Desviacin estndar:

Grado de libertad:

Debemos elegir correctamente la prueba de significacin ms adecuada para nuestro experimento. El test adecuado para este tipo de prueba es utilizaba el matemtico que describi por primera vez este tratamiento de los datos). Es muy til para comparar dos grupos de datos, como en nuestro caso, en el que tenemos un grupo control y un tratamiento. Mediante la siguiente frmula, co

Obtendremos una t calculada que comparamos en una tabla con la t terica para los mismos grados de libertad. Al valor terico que se le asemeja, le corresponde un valor de probabilidad, p.


Para el TEST DE LA COORDINACION MOTORA calcularemos la media de los valores error estndar) y los resultados los representamos en un grfico tipo

ANLISIS ESTADSTICO

nos permite conocer si las diferencias observadas entre los resultados de los dos grupos de animales son significativas o no. Si las diferencias fueran efectivamente significativas podramos afirmar que diazepam disminuye la curiosidad y traccin de los anAsimismo podramos asegurar que diazepam disminuye la actividad motora, ya que estas pruebas

Las diferencias que observemos a simple vista no tienen porqu ser significativas, es necesario la realizacin de pruebas matemtico-estadsticas que nos confirmen que todos los resultados de un grupo se parecen entre s y que son distintos de los de otro grupo.

Los conceptos que vamos a manejar para ello son los siguientes:

=

Error estndar: ES= n-1 / n

Desviacin estndar: n-1 = 1 Grado de libertad: g.l.= n-1

Debemos elegir correctamente la prueba de significacin ms adecuada para nuestro El test adecuado para este tipo de prueba es el de la t de Student

utilizaba el matemtico que describi por primera vez este tratamiento de los datos). Es muy til para comparar dos grupos de datos, como en nuestro caso, en el que tenemos un grupo control y un tratamiento. Mediante la siguiente frmula, comparamos dos medias y las dos desviaciones standard:



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calcularemos la media de los valores error estndar) y los resultados los representamos en un grfico tipo

nos permite conocer si las diferencias observadas entre los resultados de los dos grupos de animales son significativas o no. Si las diferencias fueran efectivamente significativas podramos afirmar que diazepam disminuye la curiosidad y traccin de los animales. Asimismo podramos asegurar que diazepam disminuye la actividad motora, ya que estas pruebas

Las diferencias que observemos a simple vista no tienen porqu ser significativas, es necesario la estadsticas que nos confirmen que todos los resultados de un

Debemos elegir correctamente la prueba de significacin ms adecuada para nuestro t de Student (seudnimo que

utilizaba el matemtico que describi por primera vez este tratamiento de los datos). Es muy til para comparar dos grupos de datos, como en nuestro caso, en el que tenemos un grupo control y un

mparamos dos medias y las dos desviaciones standard:



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Esta p, nos da la probabilidad de que nuestros valores no sean diferentes, es decir, que mientras ms pequea sea mayor ser la probabilidad de que nuestra afirmacin sea correcta.

Generalmente no se da el valor exacto de p, sino que se agrupa de la siguiente manera:

p > 0.05: valores no significativos

p


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GASTROENTEROPATA POR ANTIINFLAMTORIOS NO ESTEROIDEOS (AINE)


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2. EVALUACIN DEL DAO DE LA MUCOSA GSTRICA POR DICLOFENACO Los AINE son un grupo de frmacos ampliamente utilizados en clnica con interesantes

propiedades analgsicas, antiinflamatorias y antipirticas. Sin embargo, su efecto indeseable ms significativo es el dao que provocan sobre la mucosa gstrica.

Para poder evaluar este efecto lesivo hemos administrado por va oral el frmaco en estudio, diclofenaco (DC), a la dosis de 100 mg / Kg de animal.

2.1. Animales de experimentacin

Este estudio ha sido realizado con ratas Wistar de ambos sexos y de peso medio comprendido entre 180-220 g, suministrados por el Centro de Produccin y Experimentacin Animal de la Universidad de Sevilla, mantenidos en condiciones estndares de estabulizacin a 24-25 C, a 70-75% de humedad y sometidas a un rgimen de luz de doce horas al da y alimentacin controlada.

Veinticuatro horas antes de comenzar los ensayos, los animales fueron mantenidos en ayunas, pero con libre acceso al agua, y se dispusieron en jaulas individuales, con rejillas altas en el fondo para evitar la coprofagia.

El nmero de animales utilizado en el estudio ha estado comprendido entre 8-14/grupo.

Todos los protocolos llevados a cabo han seguido las recomendaciones de la Unin Europea relativas a la experimentacin animal (Directiva del Consejo de Europa 86/609/CEE).

2.2. Sustancia ensayada y tratamiento

Se ha ensayado una dosis de diclofenaco (DC) de 100 mg/ kg de animal, en forma de solucin de preparacin extempornea en agua destilada y administrada va oral (v.o.) por sonda intragstrica (1 mL/ 100 g de animal).

2.2.1. Valoracin macroscpica del dao gstrico

Al finalizar el periodo establecido, 3 h, los animales son sacrificados con hidrato de cloral (24 % p/v), los estmagos son extrados, abiertos por la curvatura mayor y lavados con solucin salina fisiolgica, procedindose a valorar el dao gstrico. Las lceras son medidas y el resultado final expresado como superficie de estmago lesionada (mm2). La magnitud del dao tambin se evalu de acuerdo con la siguiente escala:

No lesin. Presencia de hiperemia y/o petequias. 1-5 lceras pequeas menores de 3 mm. Ms de 5 lceras pequeas menores de 3 mm o una lcera mayor de 3 mm. Varias lceras mayores de 3 mm. lceras perforadas.

Los resultados obtenidos se expresaron como ndice de ulceracin (IU), y se compararon con los de un grupo control que slo recibi el vehculo, 1 mL de agua destilada/ 100 g de animal.


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Dao macrocpico y microscpico inducido por Diclofenaco (tomado de Gut Liver. 2012 April; 6(2): 210217.

2.2.2. Procedimiento de obtencin y conservacin de las muestras

Tras la evaluacin del dao macroscpico, y para llevar a cabo los estudios mecansticos, los estmagos fueron depositados en una placa sobre hielo y sometidos a un raspado con ayuda de un porta objetos.

Las muestras son congeladas -80C hasta las determinaciones bioqumicas posteriores.

2.2.3. Preparacin de las muestras para los estudios bioqumicos

1. Descongelar el tejido 2. Pesar 100 mg de tejido aprox. 3. Homogenizar en tampn pH 7.4 (dilucin 1/10), en frio 4. Agitar 5. Centrifugar 13.200 rpm, 20 min, 4C. 6. Nos quedamos con el sobrenadante donde determinaremos la actividad MPO y

niveles de NO por Reaccin de Griess.

2.3. Valoracin del infiltrado inflamatorio gstrico asociado al tratamiento con Diclofenaco. Actividad Mieloperoxidasa (MPO)

Los neutrfilos estn involucrados en una serie de desrdenes gastrointestinales, entre los que se incluyen las lesiones gstricas. Estos leucocitos migran al rea inflamada y se transforman en clulas secretoras, liberando RLO, enzimas lisosomales, etc., y originando la reaccin tisular que coadyuvar a la produccin del dao macroscpico (Bjarnason y col.,1993).

La determinacin de la actividad mieloperoxidasa (MPO), protena constitutiva de los neutrfilos, es un mtodo para cuantificar el grado de infiltracin leucocitaria inflamatoria. Esta enzima es liberada a los fluidos extracelulares, donde oxida a haluros y tiocianatos a los correspondientes


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cidos hipohalurosos (Klebanoff, 1988). Estos cidos reaccionan con los substratos disponibles, disminuyendo as su reactividad y adems, participan en la gnesis de potentes oxidantes como las cloraminas.

Para la medida de esta actividad enzimtica hemos seguido el mtodo propuesto por Bradley y col. (1982), basado en la oxidacin, dependiente de H2O2, usado como donador de hidrgeno, de un donador artificial de electrones, orto-dianisidina, con produccin de un cromgeno amarillo anaranjado cuya absorbancia se mide espectrofotomtricamente.

ORTO- DIANISIDINA COMPUESTO CROMOGENO

El tiempo mximo para la determinacin de dicha enzima es de 2 semanas (-40 C), perodo en el que se mantiene inalterada su actividad.

2.4. Protocolo de la determinacin de la Actividad de la Mieloperoxidasa (MPO) (Bradley y col., Journal Investigative Dermatology, 78, 206-209,1982)

2.4.1. Determinacin espectrofotomtrica

Para la determinacin espectrofotomtrica, se realiza una dilucin previa (1:25) de las distintas muestras en tampn fosfato potsico 50 mM pH 6.0. Una alcuota de 50 l de cada una de ellas, se colocar en los respectivos pocillos de la microplaca. Posteriormente, se aaden 50 l de cada uno de los reactivos: O-dianisidina (0.067%), HETAB (0.5%) y agua oxigenada al 0.003%, consecutivamente.

A. Colocar en la microplaca las distintas muestras, segn el siguiente esquema (Fig.1):

1. En los pocillos de la columna 1, se colocan 50 L de las distintas MUESTRAS CONTROL.

2. En los pocillos de la columna 2, se colocan 50 L de las distintas MUESTRAS DE DICLOFENACO.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A Blanco Blanco

B CS1 DC1

C CS2 DC2

D CS3 DC3

E CS4 DC4

F CS5 DC5

G CS6 DC6

H

Fig. 1: Esquema de la colocacin de las distintas muestras en la microplaca

H2O2 H2O

MPO

=450 nm


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B. Posteriormente se aade sobre las muestras los siguientes reactivos 1. 50 L de O-Dianisidina 2. 50 L de HETAB 3. 50 L de agua oxigenada (H2O2)

C. Lectura de la Absorbancia: despus de 5 min. se mide la absorbancia a 450 nm de longitud de onda en el lector de placa

2.4.2. Reactivos

Preparar en el momento de usar, mantener en fro y en oscuridad. En un matraz aforado preparar 25 ml de o-Dianisidina al 0.067 % p/v en agua

destilada (16.75 mg/25 mL). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

En un matraz aforado preparar 25 ml de HETAB 0,5 % p/v en tampn fosfato pH 6.0 (125 mg/ 25 mL). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

En un matraz aforado preparar agua oxigenada 0.003% v/v (9,09 L /100 mL agua destilada). Posteriormente, se divide dicho volumen en dos tubos falcon.

2.4.3. Expresin de los resultados

Los resultados finales de la prctica se expresan en Unidades de MPO/ mg tejido. Las unidades (U) de actividad enzimtica son obtenidas por el incremento de la Absorbancia

( Abs450nm) producido por unidad de tiempo (1 minuto). Por tanto, para determinar las Unidades de MPO/ mg tejido hay que realizar el siguiente

clculo:

Clculo de mg tejido: 100 mg tejido x 1ul x 50ul = 0,2 mg tejido

1000 ul 25 ul

Unidades de MPO / mg tejido: U MPO

Se expresarn los resultados como la media de los valores obtenidos de las unidades de MPO (media error) para los dos grupos: SC: control sano y DC: tratados con diclofenaco.

Dilucin de la muestra

Volumen final

aadido al pocillo

Cantidad de tejido pesado

0,2 mg tejido x Tiempo (5 min)


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2.5. Evaluacin de la produccin de xido ntrico (NO)

2.5.1. NO en la inflamacin.

En el tracto gastrointestinal, el NO participa en la modulacin del tono de las clulas musculares lisas, tanto en la regulacin del peristaltismo intestinal como en el vaciado gstrico. En condiciones fisiolgicas, el NO acta como un mediador endgeno en la reparacin y el mantenimiento de la integridad de los tejidos, presentando propiedades gastroprotectoras contra diferentes tipos de agentes agresivos. Sin embargo, altas concentraciones de NO estn relacionadas con numerosos procesos patolgicos, incluyendo todas las enfermedades gastro-intestinales inflamatorias crnicas, como la lcera pptica y lagastritis crnica, entre otras.

El NO es un radical libre gaseoso que en los mamferos se sintetiza a partir del aminocido L-arginina por accin de la enzima NO sintasa (NOS). Se trata de una reaccin molecular compleja que necesita oxgeno molecular y coenzimas como la tetrahidrobiopterina, NADPH, FAD y FMN. Como productos de la reaccin aparecen el NO y L-citrulina. En condiciones aerobias, el NO se oxida espontneamente formando metabolitos ms estables como son nitratos y nitritos. Este radical libre gaseoso difunde fcilmente desde las clulas donde se produce a las clulas musculares lisas.

Fig. 1. Papel de la NOS en la generacin de NO

Existen tres isoenzimas de NOS: inducible (iNOS), neuronal constitutiva (nNOS) y endotelial constitutiva (eNOS). Las isoenzimas constitutivas generan pequeas cantidades de NO (del orden de nM), mientras que la isoforma iNOS produce cantidades mucho mayores (del orden de M) que caracterizan algunos estados patolgicos en los que se induce la expresin de esta enzima. La iNOS se expresa en macrfagos, hepatocitos, neutrfilos, musculatura lisa y clulas endoteliales en respuesta a diversos estmulos inmunolgicos como el IF- o el TNF-. Tambin es inducido por el propio lipopolisacrido bacteriano a travs de la activacin del NF-.

L-Arginina+ O2

NADPH

xido

Ntrico

Sintasa L-Citrulina+ NO

NO-

3

NO-

2

FAD FMN BH4


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Fig 2. Induccin de iNOS en leucocitos polimorfonucleares (neutrfilos y macrfagos)

2.5.2. Deteccin de la concentracin de NO

La determinacin del radical NO por s slo, es difcil debido a su naturaleza como radical y su corta vida media. Por lo tanto, la medida de la produccin del radical NO se realiza mediante la determinacin de productos finales del NO, nitratos y nitritos. Estas medidas se llevan a cabo con la Reaccin de Griess, basada en la determinacin de nitritos.

Una alcuota de 10 l de muestra se adiciona a cada pocillo de una placa de ELISA. A continuacin, se aaden 5 l de nitrato reductasa (10 U/ml), 5 l de tampn HEPES (0,5 M), 5 l de FAD (0,05 mM), 5 l de NADPH (1 mM) y 20 l de agua destilada. Incubamos a 37 C durante 15 minutos.

Posteriormente se incorpora 5 l de lctico deshidrogenada (1500 U/ml) y 5 l de cido pirvico (100 mM), con objeto de regenerar el NADPH consumido por la nitrato reductasa, se incuba a 37 C durante 5 min.

Se colocan 100 l de cada una de las muestras de la curva patrn en la columna 1.

Finalmente se aaden 100 l de Reactivo de Griess, y se incuba 5 minutos a temperatura ambiente, realizando la determinacin espectrofotomtrica a 543 nm, en el lector de placas.

Los valores de nitritos se interpolan en la pendiente de la curva patrn elaborado y se expresan como concentracin (M) de nitritos en plasma.


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Ejemplo distribucin de las muestras en la placa:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Blanco CS1 DC3 B P200 CS2 DC4 C P100 CS3 DC5 D P50 CS4 DC6 E P25 CS5 F P10 CS6 G P5 DC1 H P2,5 DC2

2.5.3. Resumen del Protocolo

1. Se aaden 10 l de los blancos y 10 l las muestras 2. Sobre las muestras se aaden: 5 l de nitratro reductasa, 5 l de tampn HEPES, 5 l de la

solucin de FAD, 5 l de solucin de NADPH y 20 l de agua destilada. 3. Se incuba a 37 C durante 15 minutos. 4. Se aaden sobre las muestras: 5 l de lactato deshidrogenasa y 5 l de solucin de cido

pirvico. 5. Se incuba a 37 C durante 5 minutos. 6. Se aaden 100 l de cada una de las muestras de la curva patrn: P200, P100, P50, P25,

P10, P5, P2.5 7. Se aade sobre todos los pocillos 100 l del Reactivo de Griess 8. Se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos 9. Determinacin espectrofotomtrica a 543 nm.

2.5.4. Expresin de los resultados

Los valores de nitritos se obtuvieron de una recta patrn previamente elaborada por regresin lineal. Se expresan como concentracin (M) de nitritos en plasma.


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2.5.5. ESQUEMA CURVA DE PATRN PARA NITRITOS 200 L NaNO2 +

4800 L PBS

200 M

100 M

50 M

25 M

10 M

2.5 M

5 M

1000 L+1000 L PBS

125 L+1125 L PBS

125 L+1125 L PBS

125 L+1125 L PBS

750 L+750 L PBS

375 L+375 L PBS

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