INMUNOMICOLOGIA2015

INFECCIONES POR INHALACION DE ESPORAS Histoplasmosis Blastomicosis Paracoccidioidomicosis CoccidioidomicosisAspergilosisZygomycosisCryptococosis

RESPUESTA INMUNOLOGICA DEL HUESPED MEDIACION CELULAR MEDIACION POR ANTICUERPOSIDRAGLUTINACIONHEMAGLUTINACIONINMUNOPRECIPITACIONRIA, ELISA, ETC.

INMUNODIAGNOSTICO DE HONGOS PATOGENOSINVESTIGACION DE ANTIGENOSAntigeno Polisacrido capsular : Cryptococcus neoformans:Exoantgenos de C. albicans puede diferenciar C. tropicalisDeteccin de los serotipos A y B de Candida albicans.Antgenos liberados en cultivo: Extractos de medios de cultivo

INVESTIGACION DE ANTICUERPOSTcnicas de IDD, B. dermatitidis, P. brasiliensis, H. capsulatum, C. immitis, Candida Aspergillus, etc.

Se han desarrollado diversos mtodos alternativos al cultivo que pueden proporcionar al clnico informacin rpida y fiable ante la sospecha de una micosis invasora. Entre estos mtodos destacan:Deteccin de antgenos, Deteccion de anticuerpos y Deteccion de componentes fngicos no antignicos. Algunas de estas tcnicas serolgicas ya se han convertido enherramientas bsicas en el laboratorio de Microbiologa Clnica actual, como:Deteccin del antgeno capsular de Cryptococcus neoformans Deteccin de galactomanano en pacientes con aspergilosis invasora.

DETECCION DE ANTIGENOCriptococosisLa deteccin de antgeno capsular en lquidos orgnicos y especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis criptoccica. Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez tcnica y especificidad de la prueba.Permite el diagnstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99% de las meningitis criptoccicas y el 67% de las criptococosis diseminadas. El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios das.Se utilizan dos tipos de tcnicas, una cualitativa y otra cuantitativa. La tcnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de criptococosis o para confirmar reinfeccin especialmente en el sida.

Antigeno cryptococo.La tcnica consiste en la deteccin de antgeno capsular criptoccico mediante anticuerpos monoespecficos dirigidos frente a l y unidos a partculas de ltex. La aglutinacin de las partculas de ltex tras la reaccin antgeno-anticuerpo se detecta a simple vista.. La tcnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimientode la evolucin de pacientes ya diagnosticados mediante el ttulo de antgeno capsular presente en la muestra clnica, que generalmente es suero o LCR. Es til para conocer la eficacia del tratamiento antifngico aplicado.

CRYPTOCOCOSIS LATEXFUNDAMENTOConsiste en la precipitacin de particulas de latex sensibilizadas con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C. neoformans en muestras de LCR, suero y orina.Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de pacientes con criptococosis menngea. El limite de deteccin es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .Una reaccion negativa no descarta infeccin.La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento progresivo de titulo es de mal pronostico. Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clnicos con pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion es separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la sensibilidad de la prueba.

CRYPTOCOCOSIS LATEX.LECTURA DE RESULTADOSLa lectura es visual y se debe realizarse de la siguiente manera:Negativo: suspensin granular muy fina con ausencia de aglutinacinPositivo +: suspensin con escasos grumos contra un fondo homogeneo lechoso.Positivo ++: suspensin con escasos a moderados grumos contra un fondo moderamente homogeneo.Positivo +++: suspensin con moderados a abundantes grumos contra un fondo claro.Positivo ++++:suspensin con abundantes grumos contra un fondo totalmente claro

CRYPTOCOCOSIS LATEX

TITULACION criptococos

Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar titulaciones para el seguimiento de tratamientos.Las diluciones recomendadas son: positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2; positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100 Posteriormente para muestras seriadas del mismo paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion de la aglutinacin.Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo equipo para evita variaciones.

Falso positivoLa sensibilidad vara entre el 93% y el 100% con un 93-98% de especificidad. Puede haber falsos positivos:Presencia de factor reumatoidePacientes con lupus Pacientes con sarcoidosis,Arrastre medio de cultivo de agar chocolate, Asas de platino o desinfectantes. Infeccin sistmica por Trichosporon ashaii

Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o2-mercaptoetanol.

CANDIDOSISDETECCION DE ANTIGENOS CIRCULANTES

La Candidosis diseminada representa una de las causas de infeccin ms importantes en lo que concierne a mortalidad y morbilidad en el paciente inmunocompetente e inmunocomprometido.Los mtodos habituales de diagnstico (hemocultivo) son negativos en las candidosis profundas.Los mtodos serolgicos no diferencian entre la colonizacin y la invasin.

Aglutinacin con particulas de ltex sensibilizadas:Acs. monoclonales anti mananosAcs. policlonales anti glucoprotenas

DETECCION DE ANTIGENO de CandidaCandidiasisLa deteccin de antgeno en pacientes con candidiasis invasora nos ha permitido solucionar el problema diagnstico que presenta esta micosis. La deteccin de manano parece ser ms sensible y especifica. Platelia Candida Ag (Bio-Rad)Es un ELISA que detecta manano en suero utilizando el anticuerpo monoclonal EBCA1. Este anticuerpo reconoce residuos -1,5 del manano de C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis y C. pseudotropicalis pero no de C. krusei. El lmite de deteccin de la prueba es 0,25 ng/ml de suero. .

DETECCION DE ANTIGENO de AspergillusAspergilosisLa deteccin de galactomanano mediante un ELISA permite el diagnstico de la aspergilosis invasora.Especificidad del 89,6% y sensibilidad del 87,5%. Esta prueba en algunos estudios se ha demostrado que es positiva antes de que aparezca la sintomatologa clnica.Platelia Aspergillus EIA (Bio-Rad)La prueba es un ELISA que detecta galactomanano en suero utilizando el anticuerpo monoclonal EBA-2, que reconoce el galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger. El lmite de deteccin de la prueba es 1 ng/ml de suero

DETECCION DE ANTIGENO de AspergillusActualmente, se considera un resultado positivo cuando el paciente presenta dos muestras consecutivas con un ndice 0,5.La deteccin de galactomanano puede verse disminuda en pacientes con enfermedad granulomatosa crnica y Sndrome de JobEl Platelia Aspergillus EIA no ha sido evaluado en profundidad en plasma, orina, BAL y LCR.La prueba puede dar positiva con hongos del gnero Penicillium, Alternaria y Paecylomyces.Alimentos como los cereales, pollo, pastas y productos lcteos pueden contener galactomanano que puede ser adsorbido en nios y pacientes con alteraciones en la barrera intestinal.Resultados falsos positivos en pacientes tratados con: piperacilina-tazobactam y amoxicilina-clavulnico

(REACCIONES SEROLOGICAS)AglutinacinFijacin de ComplementoInmunoprecipitacin en gel: InmunoelectroforesisInmunodobledifusinInmunofluorescenciaInmunoenzimtica (ELISA)Radioinmunologa

DETECCION DE ANTICUERPOSDificultad de preparacin de antgenos estandarizadosDbil ttulo de anticuerpos en el curso de las micosisUtilizacin generalmente para micosis profundasReacciones cruzadasEn cryptocosis no tiene utilidadCandidosis: actualmente detectan anticuerpos contra el manano, la enolasa y los antgenos del micelio.Aspergilosis: La deteccin de anticuerpos especficos en suero es, una prueba complementaria clsica para confirmar el diagnstico de aspergiloma pulmonar y de la aspergilosis broncopulmonar alrgica (ABPA). Las tcnicas empleadas son: la inmunodifusin doble (IDD) y contrainmunoelectroforesis (CIE)

Inconvenientes de la Inmunodifusion Es lenta, precisa de una incubacin de hasta 3 das, aunque a las 24 h ya se pueden observar arcos de precipitacin.Puede producir reacciones cruzadas entre distintas especies de Aspergillus y se extienden a otras especies de hongos e incluso algunas bacterias.Esta tcnica no distingue el tipo de anticuerpo especfico presente en el suero (IgG, IgM o IgE).Tiene una sensibilidad baja, Debido a ste problema esta tcnica no es de utilidad en aspergilosis invasoras.El factor reumatoide y la protena C-reactiva presentes en el suero pueden causar falsas precipitinas.

DIAGNOSTICO INMUNOLOGICODE LAS MICOSIS PROFUNDAS

DETECCION DE LA SENSIBILIDAD CUTANEAAntgeno : Histoplasmina (filtrado del cultivo miceliano)Reaccin positiva: Infeccin en evolucin ( infiltracin pulmonar, lesiones cutneas) o crnica ( calcificacin pulmonar, esplnica )Reaccin negativa: no excluye infeccin (comienzo, diseminacin, anergia).Induce la formacin de anticuerposPresencia de reacciones cruzadas con otras micosisUso epidemiolgico. Sin valor diagnstico

Antigeno de histoplasmaLas pruebas pueden aplicarse a muestras tales como: suero, plasma, liquido peritoneal o LCR de pacientes con enfermedad respiratoria, hepatoesplenomegalia, signos de infeccin sistmica extrapulmonar o con compromiso menngeo, en pacientes que vivieron o trabajaron en zonas endmicas de Histoplasma capsulatum

Inmunodifusion

INMUNODOBLE DIFUSION HC

TITULACIONM : La banda M se encuentra cerca del hoyo del antgeno Histoplasmosis aguda o cronica. de una infeccin pasada o de una prueba cutnea reciente.

H : la banda H cerca del hoyo del suero control positivo. Histoplasmosis activa y progresiva. Puede persistir de uno a dos aos

DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSActualmente se basa en la deteccin de D-arabinitol,DNA y (13)--D-glucano.El D-arabinitol es un metabolito producido por C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis y C. kefyr que puede detectarse mediante cromatografa gas-lquido o mediante una tcnica enzimticacomercializada en Japn. Niveles elevados de D-arabinitol se han detectado en pacientes concandidiasis invasora y su monitorizacin se ha mostrado til en el seguimiento de estos pacientes.La tcnica presenta falsos positivos en pacientes con insuficiencia renal o en tratamiento con esteroides y suele ser necesario ajustar las concentraciones de D-arabinitol con respecto a las de creatinina o L-arabinitol. El D-arabinitol tambin puede detectarse en orina.

DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSLa deteccin de (13)--D-glucano en plasma es otra posibilidad diagnstica en las micosis producidas por Candida, Aspergillus y Pneumocystis, El ser humano carece de glucanasas para digerir (13)--D-glucano y por tanto su eliminacin es lenta.Existen varias pruebas comercializadas para la deteccin (13)--D-glucano, siendo el Fungitell la ms recientemente comercializada. Las pruebas para detectar (13)--D-glucano pueden presentar falsos positivos en pacientes sometidos a hemodilisis con aparatos que tengan membranas de acetato de celulosa, o en tratamiento con albmina, inmunoglobulinas, algunos agentes anticancerosos ysulfamidasPneumocystis

REACCION DE AMPLIFICACION ENZIMATICA(PCR)

DIAGNOSTICO FUTUROSondas quimioluminiscentes marcadas con Ester de Acridina: H. capsulatum, B. dermatitides, C. immitis, C. neoformans. (100% de especificidad y 96% de sensibilidad).Identificacin rpida (2 h.) vs 3 das para la investigacin de exoantgenos de un cultivo miceliano de 7 a 10 das de desarrollo.

INMUNODIAGNOSTICO DEHONGOS PATOGENOSSONDAS NUCLEICAS

Hibridacin de ADN:Identificacin rpida, sensible y especfica del material gentico detectado con sondas de ADN marcado. Ventajas: Deteccin e identificacin simultnea, directamente de la muestra clnica o de colonias aisladas con ayuda de la amplificacin enzimtica, de sondas nuclicas

CANDIDOSIS

SONDAS NUCLEICAS

Han sido desarrolladas para:Tipiaje del ADN del gnero, especies de Candida.Identificacin de factores de virulencia C. albicans.Estudio de la morfognesis C. albicans.Modo de accin de antifngicos.

CRIPTOCOCOSISSONDAS NUCLEICAS

Permite identificar los 4 serotipos de C. neoformans ( Sonda Accu Probe Soc. Gen-Probe), con 100% de sensibilidad y especificidadIdentificacin muy rpida (1 h)42 cepas aisladas de enfermos fueron identificadas52 otras especies de levaduras no respondieron

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