clase 2 microbiologia aplicada a la mineria

Lixiviacin Microbiana

Dr. Mario Esparza Mantilla Laboratorio de Biominera. Departamento de Acuicultura. Facultad de

Recursos del Mar. Universidad de Antofagasta. Chile.

[email protected]

FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

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Mayo, 2013

A. ferrooxidans

Unidad I: MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

BIOMINERIA

Microbiologa

Gentica

Biologa Molecular

Bioinformtica

Bioprocesos

Bio-Hidrometalurga

UNIDAD II. LIXIVIACION MICROBIANA

A. caldus

Unidad III. OPERACIONES DE BIOHIDROMETALURGICA

Contenidos del curso terico- prctico

Desde las clulas microbianas a la obtencin industrial de metales

FACULTAD DE RECURSOS DEL MAR-DEPARTAMENTO DE ACUICULTURA

I UN

IDA

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Lixiviacin Microbiana

OBJETIVOS: Entrenar a los estudiantes en tcnicas de muestreo, aislamiento, conteo e identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes. CONTENIDOS: 1. Introduccin a la microbiologa. Los dominios de la vida. Bacterias, arqueas y eucarias. 2. Cintica de crecimiento microbiano. Parmetros de anlisis. 3. Fisiologa Microbiana. Metabolismo auttrofo y hetertrofo, nutrientes, demanda de oxgeno, carbono y sustratos energticos. 4. Muestreo y aislamiento de bacterias, recuento microbiano, caracterizacin morfolgica y cultivos slidos y lquidos de bacterias y arqueas biolixiviantes. 5. Identificacin molecular de microorganismos biolixiviantes. Anlisis de ADN y marcadores genticos asociados al metabolismo energtico de metales y al metabolismo de carbono.

Laboratorio de Biominera Dr. Mario Esparza Mantilla

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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

Cintica de crecimiento microbiano

Fisiologa Microbiana

Muestreo y aislamiento de bacterias

Recuento y caracterizacin microbiana

Identificacin molecular y genmica

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Introduccin a la Microbiologa


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MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERA

GEOMICROBIOLOGIA MINERA

Las clulas microbianas digieren minerales

Sulfuro Metlico (MFeS2)

Bacterias Biolixiviantes

M2+

Fe2+

Fe3+

S

SO42- + 2H+

M2+

1. Cmo realiza el proceso? 2. Qu elementos biolgicos tiene para

digerir el mineral? 3. Cmo evade la toxicidad del metal,

mecanismos?

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1. Comprender como crecen y funciona la clulas microbiana.

2. Entender el rol de la clula en un ambiente extremo: pH cido, poco sustrato, metales pesados, etc.


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MICROORGANISMOS BIOLIXIVIANTES

Fisiologa Microbiana: El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes

El cultivo debe asegurar que siempre haya suministro de fuentes energticas (Fe2+, S, etc), fuentes de carbono ( CO2, HCO3

-, Ca2CO3 ) y fuente de Nitrgeno ( sales de amonio), oxgeno (aireacin). Todo debe estar a pH cido y en agitacin constante (180 RPM) para asegurar la homogenizacin de los nutrientes.

El cultivo en laboratorio debe homologar las condiciones del ambiente natural

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2 Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.

Fisiologa Microbiana: Medio lquido 9K para A. ferrooxidans

1 Yates, J. R. & D. Holmes (1987). J. Bacteriol (169)5: 1861-1870.

Ingredientes 10X ( g/L) 1X( g/L)

(NH4)2SO4 150 15

KCI 5 0,5

K2HPO4 2,5 0,25

MgSO4 . 7H20 25 2,5

Ca(NO3)2 0.72 0,072

H2SO4 10N 50 ml 5

Almacenar a 4C.

FeSO4.7H2O 330 33

S 50 5

Na2S2O3.5H2O 50 5

O2 (72%)

CO2 (0,036%)

Aireacin

Aireacin

9K+ Fe 2+

9K+ S

9K+ S

H2

Carbono

Nitrgeno

Energa

Oxgeno

pH: 3,5

pH: 1,6

pH: 3,5




Los ingredientes para la receta del medio salino 9K


Schrader, J & D. Holmes (1998). J. Bacteriol (170)9: 3915-3923.


El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas muertas, clulas daadas y clulas viables.

Medio slido para A. ferrooxidans



Yong-Quan Li y cols (2011). J Curr Microbiol (2010) 60:1724.


El medio de cultivo de las bacterias lixiviantes permite conocer la morfologa de la colonia y es aplicable para poder aislar a las bacterias as como hacer anlisis de recuento de viables cultivables. Esto permite tener mayor informacin que el mtodo de recuento en cmara bajo microscopio en donde se cuentan clulas muertas, clulas daadas y clulas viables.

Medio slido para A. ferrooxidans


Compuesto Concentracin % Inhibicin

As (III) 200 ppm 70

As(V) 500 ppm 70

Fluoruro 4.7 ppm 100

Cianuro 6.2 ppm 99

Molibdato 1 mM 85

Nitrato 5.8g/l 100

Cloruro de sodio 5g/l 50

Cloruro de sodio 10g/l 90

Luz: la luz visible y la no filtrada tienen un efecto inhibitorio sobre algunas especies del genero Acidithiobacillus,

pero el frrico ofrece alguna proteccin a los rayos visibles.

Presencia de Inhibidores: en los procesos de molienda o por accin propia del agente lixiviante se liberan algunos

iones que en ciertas concentraciones resultan txicas para las bacterias ferroxidantes afectando el desarrollo bacterial.

La literatura seala que los niveles de tolerancia de las bacterias para ciertos metales es Zn+2= 15 72 g/l; Ni+2 =12

50 g/l; Cu+2 =15g/l; Ag+ =1ppb; UO2+2 = 200 500 mg/l, entre otros.


Jo, M (2008).

Inhibidores del crecimiento en A. ferooxidans


MICROBIOLOGIA BASICA Y APLICADA A LA MINERIA

Tcnicas microbiolgicas y herramientas para aislamiento y

cultivo de bacterias

Muestreo y aislamiento de bacterias biolixiviantes



Muestreo y aislamiento de bacterias acidfilas



Aislamientos de A. ferrooxidans



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Recuento microscpico en cmara de Petroff-Hausser

Determinacin del nmero ms probable

Mtodos basados en la reduccin de colorantes por viables (azul de metileno)

Recuento bacteriano basado en tcnicas moleculares (PCR y qPCR)



MADIGAN, M., MARTINKO, J. & PARKER, J. (2008). BROCK BIOLOGY OF THE MICROORGANISMS.

Discusin: viable/no viable; efecto del medio cultivo




Recuento por filtracin en membrana

Determinacin del nmero ms probable en placas de ELISA

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Recuento por siembra por extensin





Recuento en placa por siembra por incorporacin o extensin (solo crecen los microorganismos cultivables).





Recuento en placa mediante diluciones seriadas

Migracin celular por preferencia del oxgeno




Caracterizacin microbiana por tincin de Gram

Las bacterias biolixiviantes preferentemente son Gram negativas Por qu?


Tcnica de hibridacin fluorescente in situ (FISH): es una tcnica de tincion de cromosomas en la que se provoca que los cromosomas especificos brillen bajo el microscopio.

Microcolonias en DEFT: tcnica de epifluorescencia directa en filtro. En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina que tie especificamente los acidos nuclecos). La deteccion de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopia de fluorescencia o por cualquier otro metodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son mas facilmente detectables.

Recuento de microcolonias al microscopio: se aade un pequeo volumen de agar-cultivo a un portaobjeto y se incuba para seguir la formacion de microcolonias al microscopio.

Gotitas de agar: se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias

en las gotitas tras la incubacin.


Jo, M (2008).

Caracterizacin microbiana



Las bacterias Lixiviantes son o no sensibles a los antimicrobianos?




ETAPAS

UFC (bact/ml)

Preparacin de

inculo

Propagacin de

inculo

Proliferacin de

inculo

Anlisis Qumico y

Biolgico

108

104

Tiempo(h)

Fe2+ Fe3+ Potencial Redox

Velocidad de crecimiento ()

UFC= 106 bact/ml

500 ml (volumen total) 50 ml

(cultivo de trabajo)

106 bact/ml

5 ml (inculo)

104 bact/ml

Todos los matraces deben

contener al inicio del experimento 104 bact/ml

Los experimentos deben hacerse por triplicado


Preparacin de inculos de A. ferrooxidans


5000 ml (volumen total)

104 bact/ml

500 ml (volumen de

trabajo)

108 bact/ml

10 000 rpm x10 min 4C

Lavar 2 Veces

en 9K

Cosechar Pellet Celular

48 h

Resuspender Pellet Celular

1,0ml de Glicerol (50%)+ 9K Repartir 0,5 ml en dos nuevos

tubos y aforar a 1.0ml con Glicerol (50%) + 9K

Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10

10 bact/ml) y almacenar a -20C hasta su uso.


Preparacin de inculos de A. ferrooxidans


Alicuotar 40 tubos eppendorf de 1,5ml con 50 l de inculo (2,5x10

10 bact/ml) y almacenar a -20C hasta su uso.

Resuspender o llevar al vortex por 1 min

Aforar hasta 1 ml con 9K y traspasar a matraz con 49

ml de medio a usar (9K+Fe)

Incubar por 48h a

30C A 180 RPM

ETAPAS


Proliferacin de clulas de A. ferrooxidans


A. ferrooxidans

Aislamiento y cultivo de bacterias

Caractersticas de colonia,

forma y tamao Crecimiento en

placa

Aislamiento de

ADN

secuenciacin Respaldo y produccin de cultivos

tipo

Tiempo

+ A.ferrooxidans Fe 2+

Medio de cultivo 9K

ETAPAS


Produccin de cultivos tipo de A. ferrooxidans


A. ferrooxidans

Li y cols. (2011). Folia Microbiol 56:439451

Anlisis mediante microarreglos (ADN chip) en bacterias lixiviantes

L. ferrooxidans

Moreno-Paz , M. & V. Parro(2006) .Environmental Microbiology 8 (6), 10641073.

Identificacin molecular y genmica



Qu hacer para que las bacterias Biolixiviantes crezcan mas rpido a nivel industrial?

Perspectivas de la Microbiologa Minera

Ustedes deben responder y Tarea N1



Los Microorganismos biolixiviantes crecen muy lento. Por qu?

BIOMINERIA ( quimiolitoautotrofos oxidantes del hierro o azufre) La mayoria son bacterias entre ellas destacan Acidithiobacillus ferrooxidans Acidithiobacillus thiooxidans Thiobacillus Thiooxidans

Muchos de estos microorganismo son de inters biotecnolgico en:

Aplicacin Biotecnolgica Acelerar el crecimiento

Produccin de Biomasa

La realidad biolixiviante




Ingeniera Gentica en Bacterias Lixiviantes

En la industria de alimentos, la agricultura, la salud, entre otras usan organismos genticamente modificados (Transgnicos) para potenciar la productividad de sus procesos y tener sistemas biolgicos con capacidades mejoradas pero en la Industria de la Minera eso no ha ocurrido ni mucho menos se hace procesos biolixiviantes con microorganismos transgnicos

El Desafo

Realizar manipulacin gentica y producir microorganismos transgnicos con capacidades genticas mejoradas que permitan realizar los procesos biolixiviantes en menores tiempos que los microorganismos nativos.

Los Obstculos

Poca investigacin, escasa reproducibilidad experimental, no hay vectores eficientes de transferencia de material gentica, escaso crecimiento de bacterias mineras en medio solido en presencia de antibiticos o marcadores de seleccin y





Los Virus son excelentes vectores para hacer manipulacin gentica bacteriana


Kusano y cols., (1992). J Bacteriol. 174: 6617-6623.

Bacteria Tcnica

Acidiphilium sp. electropermeabilizacin

conjugacin

Acidithiobacillus thiooxidans

conjugacin

Acidithiobacillus ferrooxidans

electropermeabilizacin

Acidithiobacillus ferrooxidans

conjugacin



Estrategias para producir bacterias transgnicas Biolixiviantes




Los vectores conocidos de organismos acidfilos son:

Cardenas y Cols (2010). Appl Microbiol Biotechnol 88:605620.




Las bacteria lixiviante A. ferrooxidans presentan sistema inmune

Horvath.P, y cols (2010).Science. - Josiane E. & Garneau, Marie-ve Dupuis (2010) Nature.


Biologa sinttica en Biominera

Construccin de la bacteria ideal para la Minera (La bacteria Top1)


Alta resistencia a los metales

pesados

Alta produccin de biomasa

Alta recuperacin de

metales


Microbiologa Aplicada a la Minera

Anlisis y discusin de papers


Paper 1



Paper 2



Johnson, D.B ( 1998). FEMS Microbiol Ecol:307-317.



Hallberg, K.B ( 2010). Hidromet. 104:448-453



Rawlings, D.E & D. B. Johnson. ( 2007). Microbiol. 153: 315-324.



Brierley, C. D. ( 2008). Trans. Nonferrous Met. Soc. China..18: 1302-1310.



Donati, E & S. Wolfgang ( 2007). Microbial Processing of Metal Sulfides.



Preguntas


clase 2 microbiologia aplicada a la mineria

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