microbiologia aplicada en la industria farmacéutica

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

3B-2

GUÍA DE PRÁCTICAS

Unidad académica: EAP DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

MICROBIOLOGÍA APLICADA A LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA

Autor (es): Mg. Ana María Chávez Fernández


INTRODUCCIÓN

La posibilidad de acceder a medicamentos seguros, eficaces y de calidad es un derecho esencial de

la población que siempre debe ser garantizado. El aseguramiento de la calidad implica un conjunto

de metodologías y procedimientos que exceden el control del producto terminado, e involucran

todos los aspectos que intervienen en el proceso de elaboración.

Entre estos aspectos puede mencionarse la forma y el modo en que se recibe la materia prima en el

establecimiento elaborador, los procesos de producción del medicamento, las características de los

espacios donde se llevan adelante esos procesos, los modos en que se depositan y tratan los

productos una vez terminados, y el funcionamiento del laboratorio de control de calidad de la

planta, entre otros. Estos controles se fundamentan en orientaciones técnicas que se basan en el

conocimiento exacto de la información contenida en las principales obras de referencia en general y

las consideraciones microbiológicas que aplican a la industria farmacéutica en particular, en la

preparación y el control de los medios de cultivo, las cepas de prueba, los equipos, los indicadores

biológicos para esterilización y los desinfectantes empleados en la industria farmacéutica, en el

aprendizaje de la metodología del análisis microbiológico del agua y la aplicación de los criterios e

interpretación de resultados en la industria farmacéutica y de la evaluación microbiológica de

cuartos limpios y ambientes controlados.

Además de ello deben conocerse las pruebas previas a la evaluación microbiológica de un producto

farmacéutico no estéril y estéril, las pruebas de aptitud de los métodos así como entender y

aplicar los criterios de validación de los métodos de análisis microbiológico.


I. PRÁCTICA Nº 1

REVISIÓN SISTEMÁTICA Y USO PRÁCTICO DE LAS OBRAS OFICIALES:

FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA (USP),

FARMACOPEA BRITÁNICA (BP)

Y FARMACOPEA EUROPEA (EP), EDICIONES VIGENTES

1.1 Marco teórico

El conocimiento de las principales obras oficiales de referencia es un requisito indispensable para el químico farmacéutico, entender la organización de su contenido permite consolidar su conocimiento de la industria farmacéutica en relación a las pruebas microbiológicas que aplican a los procesos de elaboración de productos farmacéuticos (materia prima, excipientes, almacenamiento, empaques, productos en proceso, productos terminados). La preparación de monografías se realiza en consulta con un grupo internacional de expertos y usando como referencia las farmacopeas vigentes. Se hace hincapié en el uso de métodos que estén al alcance de laboratorios de control de calidad modestamente equipados en países de escasos recursos. La certificación de la calidad de los productos farmacéuticos documentada en las farmacopeas, se basa en el objeto de comercio internacional de proporcionar un instrumento normativo y un vehículo para el intercambio de información entre las autoridades competentes de los países importadores y exportadores. Las actividades de armonización concentradas inicialmente en las prácticas adecuadas de fabricación se han complementado con directrices sobre la inspección de los fabricantes, la validación de los procesos de fabricación y las prácticas adecuadas de elaboración de productos farmacéuticos y biológicos destinados a la investigación. A medida que la producción local de productos farmacéuticos y biológicos aumente y se propague a los nuevos países fabricantes, esas directrices tendrán una creciente pertinencia, puesto que servirán de respaldo a las normas reconocidas internacionalmente, que forman la base de la garantía de la calidad. Continúa la labor de seleccionar productos internacionales de referencia o de "comparación" para uso en estudios de equivalencia y de elaborar los Principios rectores para la autorización reglamentaria de productos farmacéuticos intercambiables procedentes de distintas fuentes (genéricos). De tener éxito, la armonización de los requisitos farmacéuticos redundará en cuantiosos ahorros del tiempo y de los costos que exige la elaboración e investigación de nuevos medicamentos. Al estar de acuerdo sobre la documentación y los expedientes básicos comunes relacionados con eficacia, inocuidad y calidad, se facilitarán los exámenes reglamentarios y el reconocimiento internacional de los medicamentos autorizados. La organización de las obras oficiales involucra pues, las advertencias o noticias generales, las monografías (generales o por forma farmacéutica y específicas o de formas farmacéuticas) y los capítulos generales que incluyen los métodos de análisis.


Para que las normas y los patrones sean, primero, aplicables y, luego, debidamente cumplidos, todas las partes interesadas deben participar tan activamente como sea posible.

1.2 Competencias

- Relaciona los tipo de medicamentos y formas farmacéuticas, en función de los procesos de fabricación y los estándares que las obras oficiales exigen en cuanto criterios microbiológicos.

- Practica el uso de las farmacopeas, la organización de su contenido, la búsqueda de la información precisa en cuanto a estándares microbiológicos.

- Valora la importancia del cumplimiento de los estándares de las normas de calidad microbiológicas.

1.3 Materiales y equipos

- Texto de las principales obras oficiales (ediciones vigentes): o Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP). o Farmacopea Británica (BP). o Farmacopea Europea (EP).

1.4 Procedimiento

- Discusión del material bibliográfico revisado.

- Elaboración y presentación de un mapa mental del contenido de las obras oficiales revisadas, estableciendo un orden de prelación en cuanto a la forma en que se presentan los estándares en general y los criterios microbiológicos en particular.

- Presentación del reporte final con las conclusiones.

1.5 Resultados

Fig. 1.1. USP 32-NF 26 Fig. 1.2. EP 6º Edición Fig. 1.2. BP 2009


1.6 Cuestionario

- Defina lo siguiente:

o Farmacopea. o Estándar. o Monografía. o Artículo farmacopeico.

- ¿Cuál es la diferencia entre Especificación y Criterio de aceptación?. Explique y dé ejemplos.

1.7 Fuentes de información

- Farmacopea de los Estados Unidos de América 32º Rev.–Formulario Nacional 27º Ed. (USP 32- NF 27).

- Farmacopea Británica 2008 (British Pharmacopoeia, 2009), 2009. - Farmacopea Europea Sexta Edición (European Pharmacopoeia, 6º Ed.), 2009. - Farmacopea Internacional. Cuarta Edición. (International Pharmacopoeia, fourth

edition), 2008. - Ulises E. Mapas mentales una forma de estimular las ideas. [Blog en internet]. 2007,

Agosto. [acceso 26 de julio de 2009]; Disponible en: http://el50.com/2007/08/14/mapas-mentales-una-forma-de-organizar-y-estimular-las-ideas/Autor/es.


II. PRÁCTICA Nº 2

PREPARACIÓN Y CONTROL DE MEDIOS DE CULTIVO, CONTROL DE CEPAS DE PRUEBA, CONTROL DE EQUIPOS, REGISTRO Y EVALUACIÓN DE INFORMACIÓN

USO DE INDICADORES BIOLÓGICOS Y QUÍMICOS PARA ESTERILIZACIÓN EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA

2.1 Marco teórico

Las buenas prácticas en un laboratorio de microbiología involucra actividades que se basan en varios principios, tales como las técnicas asépticas, el control de los medios de cultivo, el control de las cepas de prueba, el control de los equipos, el registro detallado así como la evaluación de los datos y la capacitación del personal. La observancia de estos principios coadyuvará a la confiabilidad y reproducibilidad de los métodos microbiológicos, considerando la variabilidad que caracteriza a los mismos (véase USP 32, <1117> y <1111>).

El control per se requiere reconocer la importancia del uso de indicadores biológicos para esterilización, del uso de desinfectantes y además del uso de inhibidores de la actividad antimicrobiana; todos estos elementos necesarios para asegurar las buenas prácticas antes mencionadas (véase USP 32, <1035>).

2.2 Competencias

- Reconoce las técnicas que sustentan las buenas prácticas de un laboratorio microbiológico y aplicarlas.

- Aplica y experimenta las buenas prácticas microbiológicas ejecutando las operaciones per se.

- Asume la optimización de las prácticas microbiológicas en la liberación de productos farmacéuticos.


- Materiales, Reactivos y Medios de cultivo: o 30 Tubos estériles de 18 x 150 mm (con tapa rosa) o 28 Placas Petri estériles descartables o 12 Placas Rodac estériles descartables o 7 Frascos x 250 mL o 1 Frasco x 1 L o 4 Probetas x 100 mL ó x 250 mL o 1 Probeta x 1 L o 4 Beaker de 100 mL o 20 Pipetas x 1 mL o 4 Pipetas x 2 mL o 2 Micropipeta de 10-100 uL o 30 Tips o 2 Litros de agua destilada o 8 Baguetas de vidrio o 1 Baño de agua a ebullición o 4 Trípodes o 4 Ollas o 4 Guantes quirúrgicos estériles o 4 Apósitos de algodón o Cepas de estudio:


Staphylococcus aureus, cultivo de 24 horas en Agar Digerido de Caseína y Soja en tubo inclinado. Aspergillus niger, cultivo de 5 días en Agar Sabouraud en tubo inclinado ó Candida albicans, cultivo de 5 días en Agar Sabouraud en tubo inclinado.

- Reactivos: o Fosfato monobásico de potasio (0,034 g en 800 mL de agua destilada con Hidróxido

de Sodio o Ácido Clorhídrico 1N. o Polisorbato (0,05 gramos en 100 mL de buffer) o Agar Digerido de Caseína y Soja (6 g por cada 150 mL de agua destilada (3); 8 g por

cada frasco con 200 mL de agua destilada (1)). o Agar Sabouraud Glucosado (9,75 g por cada 150 mL de agua destilada (2); 6,5 g por

100 mL de Agar Sabouraud Glucosado(1)). o 4 Frascos con alcohol al 70% o 1 Frasco con Solución de Hidróxido de Sodio 1N o 1 Frasco con Solución de Ácido Clorhídrico 1N o 1 Frasco con Polisorbato 80 (Tween 80)

- Equipos: o Estufa u horno o Autoclave o 1 Vortex o 1 Potenciómetro o 2 Termómetros o 4 Balanzas

2.4 Procedimiento

2.4.1 Medios de Cultivo:

Operaciones preliminares: - Del personal y del área de trabajo: Proveerse de los elementos de protección necesarios para la práctica microbiológica.

Limpiar y desinfectar la zona de trabajo.

Registro: Cada vez que se prepara un medio de cultivo, se procede al registro respectivo en el formato correspondiente, en el cual se anotan los siguientes datos: fecha, nombre del medio de cultivo, lote, cantidad preparada, pH, número de lote asignado al medio preparado. Preparación:

Fig. 2.1. Elementos de protección

Fig. 2.2. Algodón y alcohol


- Escoger un recipiente limpio y de una capacidad que exceda aproximadamente en un 40%, el volumen del medio a preparar.

- Colocar la cinta indicadora de esterilización a todos los envases en donde se distribuirán los medios preparados.

- Rotular los envases con el nombre del medio de cultivo, lote de preparación y fecha de preparación.

- Medir en una probeta el volumen de agua purificada a usar. - Pesar la cantidad de medio de cultivo deshidratado siguiendo las indicaciones dadas por el

fabricante (etiqueta del frasco del medio respectivo). - Para el caso de un medio de cultivo no deshidratado, pesar los ingredientes Individualmente,

unirlos en un recipiente y luego proceder igual que el medio deshidratado. - En el recipiente elegido depositar una parte del agua medida, luego agregar el medio de

cultivo y completar con el resto del agua. - Disolver el medio, si se trata de caldos nutritivos, con suficiente agitación, si se trata de

medios de cultivo que contienen agar, disolver poco a poco con agua caliente hasta observar que el medio esté transparente.

- Tomar el pH del medio con el potenciómetro o con cintas indicadoras de pH de rango adecuado. Si fuera necesario, corregir el pH mediante el uso de NAOH ó HCl diluidos.

- Distribuir el medio de cultivo preparado en frascos, tubos u otro material según el análisis a realizar.

Esterilización - Cerrar los envases que contienen el medio de cultivo disuelto. - Proceder a la esterilización en autoclave siguiendo las indicaciones de esterilización para

cada medio. Control - Distribuir los medios que contienen agar y así lo requieran en placas petri estériles y dejarlos

solidificar. - Incubar los medios preparados incluyendo los distribuidos en las placas petri a una

temperatura de 30ºC – 35ºC por 48 horas. - Transcurrido el periodo de incubación retirar los medios y almacenarlos en condiciones

adecuadas hasta su uso.

Expiración - Los medios de cultivo preparados y esterilizados, ya Fig. 2.5. Rotulado de las placas

Fig. 2.3. Uso de la balanza para pesar medios de cultivo

AGAR PLATE COUNT

AGAR PLATE COUNT

Fig. 2.4. Rotulado del material de vidrio


sean conservados en los recipientes que fueron esterilizados o dispensados en otros envases en forma aséptica, serán utilizados hasta un mes después de su preparación, en la refrigeradora a una temperatura de 2ºC – 8ºC, luego del cual serán eliminados si no se utilizaron.

- También se pueden almacenar a temperatura ambiente protegidos de la luz por un período máximo de 15 días.

- Los frascos de medios de cultivo, cerrados, tendrán la vigencia que reporta el fabricante, siempre que hayan sido conservados en condiciones adecuadas.

- Los medios de cultivo se emplearán dentro de fecha de vigencia, salvo que presenten manifestación visible de su deterioro, por ejemplo: en medios no reconstituidos, cambio de color, apelmasamiento del polvo, etc. o en medios reconstituidos, agrietamiento por desecación, cambio de color.

2.4.2 Buffer Fosfato pH 7,2:

Solución Stock - Disolver 34 g de fosfato potasio monobásico en 500mL de agua purificada en una fiola de

1000 mL

Fig. 2.6.1. Estufa de esterilización Fig. 2.6.2. Uso de indicadores

Fig. 2.7.2.Indicadores Químicos y Biológicos

Fig. 2.6. Control de los medios de cultivo


- Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 - Homogenizar y esterilizar a 121ºC - Guardar en la refrigeradora de 2ºC – 8ºC Solución de uso - Para 1 Litro, transferir 1,25 mL de la solución stock a una fiola de 1000 mL - Añadir aproximadamente 500mL de agua purificada, agitar, luego añadir 1g de tween 80,

agitar y llevar a volumen con agua purificada. - Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 - Esterilizar.

2.5 Resultados

Registrar los resultados obtenidos. Presentación del reporte final con las conclusiones.

2.6 Cuestionario

- Explique la diferencia entre un método trazable y otro que no lo es. - Presente un formato de reporte que demuestre la trazabilidad en la preparación de los

medios de cultivo del laboratorio de microbiología? Explique y dé ejemplos.

2.7 Fuentes de información - Farmacopea de los Estados Unidos de América 32º Rev.–Formulario Nacional 27º Ed. (USP

32- NF 27). - Cuesta A. Aseguramiento de calidad. Medios de Cultivo y Reactivos. [Internet]. 2006,

Noviembre. [acceso 26 de julio de 2009]; Disponible en: http://www.rlc.fao.org/es/inocuidad/codex/rla3014/pdf/presen3.pps


III. PRÁCTICA Nº 3

TOMA DE MUESTRA Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA

CRITERIOS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA

3.1 Marco teórico

El agua se usa ampliamente como materia prima, ingrediente y disolvente en el procesamiento, formulación y fabricación de productos farmacéuticos, ingredientes farmacéuticos activos (API), productos intermedios, artículos farmacopeicos y reactivos analíticos. Para asegurar el cumplimiento de determinadas normas de calidad microbiogica y química mínimas, el agua usada en la producción de fármacos o la que usa como fuente de alimentación para la preparación de distintos tipos de aguas purificadas debe cumplir los requisitos de las reglamentaciones básicas relativas al agua potable (véase USP 32, <1231>).

3.2 Competencias

- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realización de controles microbiológicos del agua.

- Aplica y experimenta la metodología existente para el análisis de agua en la industria farmacéutica.

- Distingue los requerimientos de los tipos de agua en la industria farmacéutica.


- Materiales o 4 Frascos estériles x 500 mL con 0,5 mL de Tiosulfato de Sodio al 3% o 4 Frascos x 500 mL con 300 mL de agua destilada estéril o 4 Mecheros Bunsen o 4 Mecheros de alcohol o 8 Pipetas bacteriológicas de vidrio estériles x 10 mL con algodón o 4 Equipos de filtración estériles (embudo y porta membrana) dos para agua potable y

otro dos para agua purificada o 4 Bombas de vacío o 4 Kitasatos estériles x 1 L o 30 Membranas filtrantes de 0,45 μm de diámetro con cuadrículas, estériles o 8 Pinzas estériles o 10 Placas petri con agar recuento de placa (plate count) o agar de recuento de placa

de métodos estándar o TGYA. o 4 Frascos con 100 mL de Agar Recuento de Placa (Plate Count) o Agar de Recuento de

Placa de Métodos Estándar o TGYA licuado o 12 Pipetas estériles x 1 mL ó x 2 mL o 24 Placas Petri estériles o 4 Placas con Agar Mac Conckey. o 4 Placas con Agar Cetrimide.

- Medios de Cultivo o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Métodos

Estándar (TGYA): 4,125 g para 150 mL para 6 placas con medio solidificado. o Agar de Recuento de Placa (plate count) o Agar de Recuento de Placa de Métodos

Estándar (TGYA) 2,35 g por cada 100 mL de medio licuado. o Agar Mac Conckey, 8 g para 160 mL de medio. o Agar Cetrimide, 7,2 g para 160 mL de medio.

3.4 Procedimiento

- Toma de muestra: o Desinfectar el grifo o punto de salida del agua, flameando con un mechero de alcohol.


o Dejar correr 1 o 2 minutos el agua y proceder a la toma de muestra de 300 mL a 500 mL.

o Si se trata de aguas de cisterna o pozos, se sumergirá el frasco sin tapa, permitiendo el ingreso del agua.

o Utilizar un frasco estéril de boca ancha con tapa rosca para la toma de muestra; si se trata de agua potable el frasco deberá contener 1 mL de tiosulfato de sodio por cada litro de agua muestreada (inactivando el cloro presente en el agua potable).

o La muestra debe tomarse con sumo cuidado evitando rozaduras y lo mas estéril como sea posible, en el caso de agua potable o de cisterna.

o Procesar la muestra dentro de las dos primeras horas después de haber sido recolectada y si no fuera posible se deberá mantener la muestra en refrigeración (2ºC a 8ºC durante máximo 12 horas).

o Cerrar herméticamente el frasco y etiquetar. - Recuento

o Rotular el material a utilizar. o Volumen de muestra:

Vertido en Placa: 1,0 mL Este método se aplica para agua potable. Filtración por Membrana: 100 mL y 10 mL

Este método se aplica para agua destilada y agua potable; en el caso de agua destilada se filtran volúmenes de 100 mL para cada medio a emplear (APC, MC, AC) y en el caso de agua potable se filtran 10 mL también para cada medio (APC, MC, AC).

o Medio de cultivo: Agar Recuento de Placa de Método Estándar o TGYA o Agar Plate Count

o Condiciones de Incubación: 30ºC a 35ºC. o Tiempo de incubación: 48 a 72 horas.

Método de Filtración por Membrana

Método de Vertido en Placa

3.5 Resultados Registrar los resultados obtenidos.

3.6 Cuestionario - Defina:

o Niveles de alerta o Niveles de acción.

- Sustente el seguimiento microbiológico que aplica a los diferentes tipos de agua.



- World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 929, Thirty-ninth report. 2005. Annex 3. WHO Good Manufacturing Practices: water for pharmaceutical use.

Fig. 3.1. Sistema de filtración: Filtración por Membrana

Fig. 3.2. Siembra por vertido en placa


IV. PRÁCTICA Nº 4

TOMA DE MUESTRA Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AMBIENTES Y SUPERFICIES

CRITERIOS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA

4.1 Marco teórico

Dado que los microorganismos se desarrollan en una amplia variedad de ambientes naturales, es importante controlar su presencia, más aún cuando en la industria farmacéutica se llevan a cabo procesamientos asépticos de fármacos a granel, formas farmacéuticas y en ciertos casos, dispositivos médicos, además de la necesidad de la necesidad del establecimiento y control de la calidad microbiológica de ambientes controlados (véase USP 32, <1116>).

4.2 Competencias

- Reconoce la importancia y adquiere destreza en la realización de controles microbiológicos de los ambientes en la industria farmacéutica.

- Aplica y experimenta la metodología para la toma de muestra de ambientes y superficies.

- Observa las especificaciones y requerimientos de los cuartos limpios y ambientes controlados en la industria farmacéutica.

4.3 Materiales y Equipos

- Materiales:

o 4 Láminas de papel manteca estériles de dimensión A4, que en la parte central presenten un recuadro recortado de 10 x 10 cm

o 4 Tubos de 30 x 20 mm conteniendo 10 hisopos estériles cada uno o 12 Tubos estériles de 18 x 150 mm o 20 Pipetas estériles x 1 ó 2 mL o 1 Vortex o 40 Placas Petri estériles descartables o 4 Probetas estériles x 100 mL o 4 Frascos de 100 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja. o 4 Frascos de 100 mL Agar Sabouraud Glucosado. o 4 Tubos con 5 mL de Cloruro de Sodio al 0,9 %. o 12 Placas Rodac con Agar Digerido de Caseína y Soja*. o 16 Placas Petri con Agar Digerido de Caseína y Soja*.

- Medios de Cultivo y Reactivos:

o Agar Digerido de Caseína y Soja: 4 g por cada 100 mL de medio. o Agar Sabouraud Glucosado: 6,5 g por cada 100 mL de medio. o Cloruro de Sodio: 0,45 g de Cloruro de Sodio en 50 mL de agua destilada

4.4 Procedimiento

- Microorganismos Viables Transportados por el Aire: o Placas de Sedimentación.

- Microorganismos Viables en Superficies: o Placas de contacto Rodac (Replicate Organism Direct Agar Contact). o Hisopado.

_________________________ * Material preparado en la práctica Nº 2


- Control de ambientes

o Seleccionar el área del laboratorio para realizar el control ambiental. o Colocar placas petri con Agar Digerido de Caseína de Soya (por duplicado cada

punto a monitorear) por espacio de 20 minutos como mínimo. o Realizar el mismo procedimiento pero esta vez exponiendo placas petri con agar

Sabouraud Glucosado. o Luego de la exposición, proceder a incubar: o Las placas de Agar Digerido de Caseína de Soya a 30ºC a 35 oC, por dos días o Las placas de Agar Sabouraud Glucosado a 20 ºC a 25 oC, por cinco días. o Realizar las observaciones diarias de las placas para evidenciar el crecimiento

microbiano y reportar los resultados obtenidos. o Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos: o Para las bacterias realizar primero la coloración Gram. o Para los hongos preparar láminas con hidróxido de potasio (KOH).

- Control de superficies

Seleccionar el método adecuado para los objetos asignados. o Placas RODAC:

Aplicar la placa sobre la superficie a evaluar. o Hisopado:

a. Embeber el hisopo en solución salina e hisopar según el tipo de superficie a evaluar.

- Usando la plantilla con la superficie delimitada haciendo uso de las láminas con el área de 10 x 10 cm. , haciéndolo primero en forma horizontal, luego vertical, en diagonal de derecha a izquierda y después de izquierda a derecha. - Hisopado directo.

b. Terminada la operación introducir el hisopo en un tubo que contiene 5 mL de solución salina, rotular y agitar en un vortex por 1 minuto.

c. Tomar 1 mL y trasladarlo a una placa estéril para adicionarle 15 mL de agar digerido de caseína y soja.

d. Incubar de 30º a 35ºC por 48 a 72 horas. e. Reportar las observaciones y anotar los resultados obtenidos. f. Realizar las observaciones al microscopio y reportar los resultados obtenidos:

i. Para las bacterias realizar primero la coloración Gram. ii. Para los hongos preparar láminas con hidróxido de potasio (KOH).

4.5 Resultados

Registrar los resultados obtenidos.

Fig. 4.1. Hisopos Fig. 4.2. Solución de enjuague

Fig. 4.3. Placas Rodac


4.6 Cuestionario

- ¿ En qué se basan las diferentes normativas que clasifican los ambientes controlados? - ¿ Qué clase de ambientes requieren un constante monitoreo ambiental ?




V. PRÁCTICA Nº 5

PRUEBAS DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO Y APTITUD DEL MÉTODO PREVIO

AL ANÁLISIS DE UN PRODUCTO FARMACÉUTICO NO ESTÉRIL: LISTA DE

CHEQUEO Y EJECUCIÓN

5.1 Marco teórico

El examen microbiológico de productos farmacéuticos no estériles incluye en primera instancia las pruebas de recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pueden desarrollarse en condiciones aeróbicas. Si los productos a examinar poseen actividad antimicrobiana, ésta deberá eliminarse o neutralizarse para lo cual los inactivadores deberán ser de probada eficacia además de ser inocuos para los probables microorganismos contaminantes. Previo al análisis deberán realizarse la prueba de promoción de crecimiento y la prueba de aptitud del método de recuento, ésta última será definida según la naturaleza del producto y el límite de microorganismos requerido (véase USP 32: <61>, <62>).

5.2 Competencias

- Reconoce la necesidad de ejecutar procedimientos previos a las pruebas microbiológicas de recuento en productos no estériles.

- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de promoción de crecimiento y de aptitud de los métodos de recuento microbiano.

5.3 Material y Equipos

- Materiales o 35 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL). o 15 Tubos con 10 mL de Buffer pH 7,2 (volumen total 350 mL) más Polisorbato al

0,05% o 88 Placas Petri estériles o 5 Pipetas de 0,1 ó 1,0 mL o Gradillas o 15 Espátulas de Drigalsky estériles o 24 Pipetas de 2,0 mL o 12 Placas con Agar Manitol Salado o 12 Placas con Agar Cetrimide o 12 Placas con Agar Sabouraud o 4 Frascos con 100 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o 4 Frascos con 100 mL de Agar Manitol Salado o 4 Frascos con 100 mL de Agar Cetrimide o 4 Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud o 8 Tubos com 9 mL de Caldo Agar Digerido de Caseína y Soja o 4 Tubos com 9 mL de Caldo Sabouraud

- Medios de Cultivo y Reactivos: o Fosfato monobásico de potasio o Agar Manitol Salado o Agar Cetrimide o Agar Sabouraud o Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Manitol Salado o Agar Cetrimide o Agar Sabouraud Glucosado o Caldo Digerido de Caseína y Soja o Caldo Sabouraud

- Cepas de estudio:


o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos 5 a 7 días.

o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos 24 horas antes de la práctica.

o 4 Cultivos puros de Pseudomonas aeruginosa en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos 24 horas antes de la práctica.

5.4 Procedimiento

Para la prueba de promoción del crecimiento de los medios se emplearán los métodos de: Vertido en placa, Extensión en superficie e Inoculación Directa utilizando: a. Agar Digerido de Caseína y Soja. b. Agar Saboureaud Dextrosa. c. Agar Cetrimide. d. Agar manitol salado. e. Caldo Digerido de Caseína y Soja.

- Promoción del Crecimiento de los Medios (Medio más inóculo)

o Inocular los medios con no más de 100 ufc de los siguientes microorganismos. - Staphylococcus aureus (ATCC 6538) o ambiental, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) o ambiental, para los medios medios (a) y (b).

o Inocular los medios con no más de 100 ufc de los siguientes microorganismos. - Aspergillus niger (ATCC 16404) o ambiental, para el medio (d).

o Incubar de 30ºC a 35ºC por tres días para el caso de las bacterias y de 20ºC a 25ºC por 5 días para el caso de hongos.

o Reportar los resultados obtenidos teniendo en consideración que el resultado no debe diferir en un factor mayor que 2 a partir del valor calculado en medios sólidos.

- Método de Vertido en Placa (véase figura 3.2.):

o Agregar 1 mL de la suspensión (inóculo de 100 ufc) y 15 a 20 mL de los medios sólidos adecuado según sea el caso, manteniendo la temperatura de a no más de 45ºC.

o Incubar según se indicó anteriormente. o Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido en

cada medio. o Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.

- - Método de Extensión en Superficie:

o Esparcir un volumen de 0,1 mL de suspensión (inóculo de 100 ufc) en las placas que contienen los medios según sea el caso.

o Incubar según se indicó anteriormente. o Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido en

cada medio o Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.

- Inoculación Directa:

Fig. 5.1. Siembra en Superficie


o Agregar un inóculo de suspensión bacteriana correspondiente equivalente a 100 ufc, al caldo específico.

Tabla 5.2. Preparación de las Cepas para las Pruebas de de Promoción de Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento e Presencia del Producto

5.5 Resultados

Emisión de reporte final.

5.6 Cuestionario

- ¿ Cuál es la finalidad para la aplicación de los diferentes métodos de recuperación de microorganismos ?

- De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecución de las pruebas de promoción de crecimiento ¿a qué microorganismos se restringiría esta prueba preliminar?



- Farmacopea Internacional. Cuarta Edición. (International Pharmacopoeia, fourth edition), 2008.

Promoción de Crecimiento Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto Microorganismos

Preparación de

Cepas RTMA RTCHL RTMA RTCHL

S. aureus ADCS o CDCS

30 – 35ºC 18 – 24 h

ADCS o CDCS ≤ 100 ufc 30 – 35ºC ≤ 3 d

__

ADCS o CDCS (NMP) ≤ 100 ufc 30 – 25ºC ≤ 3 d

__

P. aeruginosa ADCS o CDCS

30 – 35ºC 18 – 24 h


__


__

B. subtilis ADCS o CDCS

30 – 35ºC 18 – 24 h


__


__

C. albicans A. SAB o C.SAB

20 – 25ºC 2 – 3 d

ADCS ≤ 100 ufc 30 – 35ºC ≤ 5 d

A. SAB ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d

ADCS ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d

SAB ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d

A. niger A. SAB o PDA

20 – 25ºC 5 – 7 d

ADCS ≤ 100 ufc 30 – 35ºC ≤ 5 d

A. SAB ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d

ADCS ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d

SAB ≤ 100 ufc 20 – 25ºC ≤ 5 d


VI. PRÁCTICA Nº 6

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE FORMAS SÓLIDAS ORALES: TABLETAS Y CÁPSULAS

VALIDACIÓN DEL MÉTODO

61.1 Marco teórico

El análisis microbiológico de estas formas farmacéuticas incluye pruebas que permiten calcular el número de microorganismos aeróbicos viables y el número de hongos filamentosos y levaduras presentes, así como determinar la ausencia de especies microbianas patógenas consideradas como indicadores de contaminación(véase USP 32: <61>, <62>).

6.2 Competencias

- Reconoce la importancia de comprobar la aptitud de los métodos de análisis: recuento y pruebas de microorganismos específicos.

- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de microorganismos específicos de una forma farmacéutica sólida oral.


- Materiales o 24 Tubos x 9 mL de Buffer pH 7,2 o 12 Tubos con 9 mL de Caldo Mossel o 12 Frascos de 250 mL, con 90 mL de Buffer pH 7,2 o 8 Frascos de 250 mL, con 100 mL de Buffer pH 7,2 o 4 Frascos con 200 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o 4 Frascos con 200 mL de Agar Sabouraud Dextrosa. o 4 Frascos con 90 mL de Caldo Mossel. o 16 Frascos con 90 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Mac Conckey o 4 Frascos con 100 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis. o 12 Placas con Agar Manitol Salado o 4 Placas con Agar Cetrimide o 16 Placas con Agar Violeta Rojo Bilis. o 32 Pipetas de 1 mL, ó 2mL o 12 Pipetas de 10 mL. o 1 Baño María a 22,5 ºC o 20 Pipetas de 5 mL. o 4 Asas de siembra

- Medios de Cultivo y Reactivos o Buffer pH 7,2 o Caldo Mossel o Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Glucosado o Caldo Mossel o Agar Digerido de Caseína y Soja o Caldo Mac Conckey o Caldo Rappaport Vassiliadis. o Agar Manitol Salado o Agar Cetrimide o Agar Violeta Rojo Bilis

- Cepas de estudio:


o Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, cultivo de 24 horas en Agar Digerido de Caseína y Soja en solución amortiguada de fosfato monobásico de potasio de pH 7,2 que permitan obtener inóculos de 100 ufc.

o Aspergillus niger, cultivo en solución amortiguada de fosfato monobásico de potasio más 0,05 % de polisorbato 80, de pH 7,2 de 5 días que permita obtener inóculos de 100 ufc.

6.4. Procedimiento

6.4.1.Criterios a aplicar según la solubilidad de las muestras:

Proceder a preparar las muestras a analizar para cada una de las siguientes pruebas según los criterios que se describen:

a. Productos solubles en agua: Dilución 1 en 10 (o adicionales de ser necesario) del producto a examinar (ajustando el pH de 6 a 8, de ser necesario), en: - Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 - Solución Amortiguada de Fosfato de pH 7,2 - Caldo Digerido de Caseína y Soja

b. Productos no grasos insolubles en agua: Ídem al anterior; puede añadirse un tensoactivo (1 g por L de polisorbato 80).

6.4.2. Pruebas de Verificación de Propiedades de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de los Medios Analizar cada preparación de medio verificando las propiedades promoción de crecimiento de los medios en general, así como las propiedades inhibitorias específicas y las propiedades indicadoras de los medios selectivos y diferenciales, según sea el caso (véase tabla 6.1.a. y b.).

Tabla 6.1.a. Propiedades de Promoción de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios Prueba Medio Propiedad Cepa

Prom. de crecimiento E. Coli / P. aeruginosa C. Moss

Inhibitoria S. aureus Bacterias Gram- Negativas

tolerantes a la Bilis VRB Prom. Crecim + Indic. E. Coli / P. aeruginosa

Prom. De crecimiento E. coli C.Mc

Inhibitoria S. aureus Escherichi coli MC Prom. Crecim + Indic. E. coli

Tabla 6.1.b. Propiedades de Promoción de Crecimiento, Inhibitorias e Indicadoras de los Medios

Prueba Medio Propiedad Cepa Prom. de crecimiento S. typhimurium

CRV Inhibitoria S. aureus

Prom. Crecim + Indic. S. typhimurium Salmonella

XLD Indicadora E. coli

Prom. de crecimiento P. aeruginosa Pseudomona aeruginosa CT

Inhibitoria E. coli Prom. Crecim + Indic. S. aureus

Staphylococcus aureus Mn Inhibitoria E. coli

C.Ref Prom. de crecimiento Cl. sporogenes Clostridios

A.Col Prom. de crecimiento Cl. sporogenes

C.Sab Prom. de crecimiento C. albicans Candida albicans

SAB Prom. Crecim + Indic. C. albicans

Fig. 6.1. Dilución de la muestra a evaluar


6.5. Pruebas de Aptitud de los Métodos de Recuento y de Microorganismos Específicos: Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra de 1 en 10, al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio indicado en una cantidad de no más de 100 ufc (medio más producto a analizar y más inóculo). Realizar la prueba según se indica en el período más corto de incubación; cualquier actividad antimicrobiana, requiere de la neutralización correspondiente.

A. Aptitud del Método de Recuento a. Inoculación y dilución: Agregar a las muestras de productos preparadas y a un control (sin

producto), un volumen de suspensión microbiana para obtener un inóculo de 100 ufc. b. Recuperación de microorganismos en presencia de producto: Filtración por Membrana (véase figura 3.1.): - Transferir una cantidad que represente 1 g del producto al filtro de membrana con un

volumen adecuado de diluyente. - Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja

para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA). - Transferir el filtro de membrana a la superficie del Agar Saboureaud Dextrosa para

determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL). - Incubar. - Realizar el recuento y reportar. Recuento en Placa: Trabajar por duplicado cada medio y usar el recuento medio del resultado. - Método de Vertido en Placa (véase figura 3.2.):

Agregar 1 mL de la muestra preparada y 15 a 20 mL de los medios sólidos, Agar Digerido de Caseína y Soja, y,

Agar Saboureaud Dextrosa según sea el caso, manteniendo la temperatura de ambos medios a no más de 45ºC.

Incubar según se indica en 5.1.c. Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido

en cada medio Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.

Método de Extensión en Superficie: - Agregar de 15 a 20 mL de los medios sólidos, Agar Digerido de Caseína y Soja, y,

Agar Sabouraud Dextrosa según sea el caso, mantenidos a la temperatura de no más de 45ºC, a cada placa. Dejar solidificar. Esparcir un volumen de 0,1 mL de la muestra preparada. Incubar. Realizar el recuento y reportar la media aritmética del número de ufc obtenido

en cada medio Contrastarlo con el número de ufc del inóculo original.

c. Neutralización/Eliminación de la actividad Antimicrobiana: - Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra

preparada y diluida versus el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra control.

- Si se inhibe el crecimiento en un factor mayor a 2 modificar el procedimiento según se indica a continuación: i. Aumentando el volumen del diluyente o medio de cultivo. ii. Incorporando agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente. iii. Filtración por membrana. iv. Una combinación de todos los anteriores.

B. Aptitud de los métodos para las pruebas de microorganismos específicos. a. Bacterias Gram –Negativas Tolerantes a la bilis (véase Fig. 6.2.a). Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Caseína y

Soja. Mezclar e incubar a 20º - 25ºC por 2 horas (suficiente para resucitar bacterias), pero no más de 5 horas.

- Prueba de Ausencia: usar un volumen correspondiente a 1 g del producto e inocular Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias: incubar de 30º a 35ºC, durante


24-48 horas. Subcultivar en Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa; incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.

- Prueba Cuantitativa: inocular Caldo Mossel para enriquecimiento de Enterobacterias con preparaciones que contengan 0,1 0,01 g y 0,001 g ó mL de la muestra a evaluar; incubar a 30º - 35ºC durante 18-24 horas. El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias; indicar la menor cantidad de producto que produce resultado positivo y la mayor cantidad de producto que produce resultado negativo(véase Tabla 6.2.a.).

Tabla 6.2. Interpretación de Resultados en la Prueba Cuantitativa de Bacterias Gram Negativas Tolerantes a la Bilis

Resultados para cada cantidad del producto Cantidad probable de

bacterias

0,1 g ó mL 0,01 g ó mL 0,001 g ó mL (por g o mL del producto)

+ + + Más de 103

+ + - Menos de 103 y más de 102

+ - - Menos de 102 y más de 10 - - - Menos de 10

CDCS (90mL) 10 g ó 10mL

20 – 25ºC 2 – 5 h

30 – 35ºC 24 – 48 h

0,1 g. o mL 0,1 g. o mL 0,1 g. o mL.

Caldo Mossel (100mL)

30 – 35ºC 24 – 48 h

Caldo Mossel (10mL)

VRB

Prueba de Ausencia Prueba Cuantitativa

10mL

VRB

Fig. 6.2.a. Bacterias Gram Negativas Tolerantes a a la

Bilis

30 – 35ºC 24 – 48 h


b. Salmonella: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Caseína y Soja; usar no menos de 10 g ó 10 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Transferir 0,1 mL a 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis para Enriquecimiento de Salmonella, e incubar a 30º - 35º C, durante 18-24 horas. Subcultivar en una placa de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-48 horas (véase Fig. 6.2.b.).

El crecimiento de colonias color rojo (con o sin centro negro) indica posible presencia de Salmonella, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación.

c. Escherichia coli: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Mac Conckey e incubar a 42º - 44º C, durante 24-48 horas. Subcultivar en una placa de Agar Mac conckey a 30º-35ºC por 18-72 horas.

El crecimiento de colonias indica posible presencia de E. coli, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación (véase Fig. 6.2.c-e.).

d. Pseudomonas aeruginosa: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo Digerido de Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Subcultivar en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-72 horas.

Fig. 6.2.b. Samonella sp.

CDCS (90mL) 10g o 10mL

30 – 35ºC 18 – 24 h

30 – 35ºC 18 – 48 h

0,1mL

Caldo Rappaport –Vassiliadis (10mL)

XLD

30 – 35ºC 18 – 24 h


El crecimiento de colonias indica posible presencia de Ps. aeruginosa, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación (véase Fig. 6.2.c-e.).

Fig. 6.2.c-e. Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus; Clostridium sp.y Candida albicans

e. Staphylococcus aureus: Preparar las muestras e inocularlas, usando como diluyente Caldo

Digerido de Caseína y Soja; usar 1 g ó 1 mL para inocular Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Agitar y transferir 1 mL a 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja e incubar a de 30º a 35ºC durante 18-24 horas. Subcultivar en una placa de Agar Cetrimide. Incubar a una temperatura de 30º-35ºC por 18-72 horas.

El crecimiento de colonias color amarillo, o blanco rodeado de amarillo indica posible presencia de Staphylococcus aureus, lo cual debe confirmarse con pruebas de identificación (véase Fig. 6.2.c-e.).

6.4.4. Prueba de Producto: Proceder de la misma forma que en A. y B. pero sin inóculo. 6.5 Resultados

Emisión de reporte final. 6.6 Cuestionario - Si se trata de realizar el examen microbiológico de un antibiótico, explique las operaciones

preliminares y fundamente su respuesta. - De no contar con suficiente material de vidrio para la ejecución de todos las pruebas

preliminares ¿Qué haría? ¿Obviaría alguna de ellas? ¿Procedería a la ejecución de todas consecutivamente? Si es así ¿En qué orden procedería ? Fundamente su respuesta.

6.7 Fuentes de información - Farmacopea de los Estados Unidos de América 32º Rev.–Formulario Nacional 27º Ed. (USP 32-

NF 27). - Farmacopea Internacional. Cuarta Edición. (International Pharmacopoeia, fourth edition),

2008.

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Clostridium sp.

Dilución 1/10

Candida albicans

Escherichia coli

30 – 35ºC 18 - 72 h Anaerobiosis

30 – 35ºC 48 h

CDCS (100mL)

10mL 10mL

42 – 44ºC 24 - 48 h

30 – 35ºC 18 - 72 h

30 – 35ºC 18 - 72 h

80ºC10 min

30 – 35ºC 24 – 48 h

C.T.

Diluyente (90mL)

Caldo MC (100mL)

A.Col. A.Col.

SAB.

M.C.

Mn.

30 – 35ºC 18 - 24 h

Anaerobiosis30 – 35ºC

48 h

Caldo SAB (100mL)

Caldo Ref.(100mL)

Caldo Ref.(100mL)

30 – 35ºC3 - 5 d

10mL


VII. PRÁCTICA Nº 7

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE FORMAS SÓLIDAS ORALES: TABLETAS Y CÁPSULAS


7.1 Marco teórico

Este ensayo aplica alas formas farmacéuticas semisólidas y líquidas y también como en la práctica precedente incluye pruebas que permiten calcular el número de microorganismos aeróbicos viables y el número de hongos filamentosos y levaduras presentes, así como determinar la ausencia de especies microbianas patógenas consideradas como indicadores de contaminación (véase USP 32: <61>, <62> y <1111>).

7.2 Competencias

- Aplica y experimenta la metodología para las pruebas de recuento y de microorganismos específicos de una forma farmacéutica semisólida y líquida.

- Reconoce las diferencias en la metodología para el análisis microbiológico de formas farmacéuticas no estériles sólidas, semisólidas y líquidas.


- Materiales

o Frascos de 250 mL, con 5 g de Polisorbato estéril o 8 Frascos de 250 mL, con 85 mL de Buffer, pH 7,2 o 27 Tubos con 9 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja o 6 Tubos con 9 mL de Buffer, pH 7,2 o Kitasatos estériles de 1 L o Equipos de filtración estériles o Pinzas estériles o Placas de Agar Digerido de Caseína y Soja o Placas de Agar Sabouraud Dextrosa. o 12 Membranas filtrantes estériles o Frascos con 90 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja. o Frascos con 100 mL de Caldo Mac Conckey o Tubos con 10 mL de Caldo Rappaport Vassiliadis. o Placas con Agar Mac Conckey o Placas con Agar Xilosa Lisina Desoxicolato o Placas con Agar Manitol Salado o Placas con Agar Cetrimide o 9 Placas don Agar Digerido de Caseína y Soja o Frascos con 90 mL de Buffer pH 7,2 o Pipetas de 10 mL. o 12 Pipetas de 1 ó 2 ó 5 mL o Pipetas de 0,1 mL o Gradillas

- Medios de Cultivo y Reactivos

o Polisorbato estéril o Buffer, pH 7,2 o Caldo Digerido de Caseína y Soja o Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud o Caldo Digerido de Caseína y Soja


o Caldo Mac Conckey o Caldo Rappaport Vassiliadis. o Agar Mac Conckey o Agar Xilosa Lisina Desoxicolato o Agar Manitol Salado o Agar Cetrimide o Agar Digerido de Caseína y Soja

7.4 Procedimiento

7.4.1. Pruebas de Verificación de las Propiedades de Promoción de Crecimiento e Inhibitorias de los Medios y Aptitud de las Pruebas de Recuento y de Microorganismos Específicos Proceder para las siguientes pruebas según se muestra en el texto correspondiente de la practica Nº 6.

7.4.2. Prueba de Producto: Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inóculo. Proceder para las siguientes pruebas según se muestra en el texto correspondiente de la practica Nº 6.

7.5 Resultados


7.6 Cuestionario

- Elabore tres mapas mentales que involucren todas las actividades y pruebas del examen microbiológico para una forma farmacéutica no estéril sólida, semisólida y líquida.





VIII. PRÁCTICA Nº 8


PRUEBAS DE APTITUD DEL MEDIO PREVIO AL ANÁLISIS DE UN PRODUCTO

FARMACÉUTICO ESTÉRIL

8.1 Marco teórico


8.2 Competencias




o 12 Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2 o Tubos con 10 mL de Buffer, pH 7,2, más Polisorbato o Frascos con 150 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Frascos con 100 mL de Agar Sabouraud Dextrosa o 21 Pipetas de 0,1 y 1 ,0 mL estériles o Kitasatos estériles de 1 L o Equipos de filtración estériles o Pinzas estériles o Membranas filtrantes estériles o Balanzas o Jeringas de 20 mL descartables estériles o 18 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1 o Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Líquido o Frascos con 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja o Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos 5

a 7 días. o Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos

24 horas antes de la práctica.

Microorganismo Incubación Medio de Cultivo

Especie Cepa ATCC T° Tiempo

Caldo Tioglicolato S. aureus

C. sporogenes P. aeruginosa

19404 30–35°C 3 días

Caldo Casoy B. subtillis 6538 6633 9027

30–35°C 3 días

Caldo Casoy B. subtillis C. albicans

A. niger

10231 16404 20–25 °C 5 días


7.4 Procedimiento



7.5 Resultados


7.6 Cuestionario





- World Health Organization. WHO Technical Report Series, No. 902, Thirty-six report. 2002. Annex 6. Good manufacturing practices for sterile products.


IX. PRÁCTICA Nº 9

ANÁLISIS DE UN PRODUCTOS FARMACÉUTICO ESTÉRIL Y

VALIDACIÓN DEL MÉTODO (TRANSFERENCIA DIRECTA: DISPOSITIVO MÉDICO Y

POLVO PARA RECONSTITUIR)

9.1 Marco teórico


9.2 Competencias




o 4 Kitasatos estériles de 1 L o 4 Equipos de filtración estériles o 8 Pinzas estériles o 6 Membranas filtrantes estériles o 1 Bomba de vacío o 8 Jeringas de 20 mL descartables estériles o 12 Frascos con 100 mL de peptona pH 7,1 o 8 Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Líquido o 8 Frascos con 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja

9.4 Procedimiento



9.5 Resultados



PRUEBA DE ESTERILIDAD: Método de Transferencia Directa

9.6 Cuestionario






TTrraannssffeerriirr llaass mmuueessttrraass aa uunn ffrraassccoo qquuee ccoonntteennggaa

11000000 mmLL ddee ccaallddoo tthhiioogglliiccoollaattoo yyaa oottrroo ffrraassccoo qquuee ccoonntteennggaa 11000000

mmLL ddee ccaallddoo ttrriippttiiccaassee ssooyyaa

CCoonn aayyuuddaa ddee ppiinnzzaass eessttéérriilleess

LLiimmppiiaarr llaa ssuuppeerrffiicciiee ddee llaass eennvvoollttuurraass qquuee

ccoonnttiieenneenn llaass mmuueessttrraass ccoonn aallccoohhooll aall 7700%% yy

aabbrriirrllaass ccuuiiddaaddoossaammeennttee ccoonn ttiijjeerraass eessttéérriilleess

CCaallddoo ttiioogglliiccoollaattoo,, aa 2200 aa 2255ººCC

CCaallddoo ttrriippttiiccaassee ssooyyaa aa 3300 aa 3355ººCC

LLlleevvaarr aa iinnccuubbaarr ppoorr 1144

ddííaass::

AAuusseenncciiaa ddee

ccrreecciimmiieennttoo:: eell pprroodduuccttoo ccuummppllee

ccoonn llooss rreeqquueerriimmiieennttooss ddee

llaa pprruueebbaa

PPrreesseenncciiaa ddee ccrreecciimmiieennttoo:: eell

pprroodduuccttoo nnoo ccuummppllee ccoonn llooss

rreeqquueerriimmiieennttooss ddee llaa pprruueebbaa


X. PRÁCTICA Nº 10

ANÁLISIS DE UN PRODUCTOS FARMACÉUTICO ESTÉRIL Y VALIDACIÓN DEL

MÉTODO (FILTRACIÓN POR MEMBRANA: SOLUCIÓN INYECTABLE).

10.1 Marco teórico


109.2 Competencias




o 3 Balanzas o 8 Frascos con 100 mL de Medio Tioglicolato Líquido o 8 Frascos con 100 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja o 4 Frascos con 500 mL de Medio Tioglicolato Líquido o 4 Frascos con 500 mL de Caldo Digerido de Caseína y Soja o 4 Cultivos puros de Aspergillus niger en Agar Sabouraud (agar inclinado), de por lo menos

5 a 7 días. o 4 Cultivos puros de Staphylococcus aureus en Agar Casoy (agar inclinado), de por lo menos

24 horas antes de la práctica.

10.4 Procedimiento



10.5 Resultados



PRUEBA DE ESTERILIDAD:

Método de Filtración por Membrana

10.6 Cuestionario






TTrraannssffeerriirr eell ccoonntteenniiddoo ddee llaass mmuueessttrraass aa ttrraavvééss llaa uunniiddaadd ddee ffiillttrraacciióónn eessttéérriill ((ccoonn

llaa mmeemmbbrraannaa ffiillttrraannttee ddee δδ::4477 mmmm yy ppoorroo:: 00,,4455 μμ..

2200 aa 2255ººCC

3300 aa 3355ººCC LLaa oottrraa mmiittaadd aa 110000 mmLL ddee ccaallddoo

tthhiioogglliiccoollaattoo

TToommaarr eell ccoonntteenniiddoo ddee llaass aammppoollllaass ccoonn uunnaa

jjeerriinnggaa eessttéérriill

LLiimmppiiaarr llaa ssuuppeerrffiicciiee ddee llaass

aammppoollllaass ccoonn aallccoohhooll aall 7700%%

EEnnjjuuaaggaarr llaa mmeemmbbrraannaa ccoonn aagguuaa ppeeppttoonnaaddaa

DDeessmmoonnttaarr eell eeqquuiippoo aassééppttiiccaammeennttee yy ccoonn ppiinnzzaass eessttéérriilleess ttoommaarr llaa mmeemmbbrraannaa

ccoorrttaarrllaa yy ttrraannssffeerriirr::

UUnnaa mmiittaadd aa 110000 mmLL ddee ccaallddoo

ttrriippttiiccaassee ssooyyaa,, iinnccuubbaarr aa

IInnccuubbaarr ppoorr 1144 ddííaass aa......


XI. PRÁCTICA Nº 11

OPERACIONES PREPARATORIAS PARA LA PRUEBA DE ENDOTOXINAS

BACTERIANAS, CÁLCULOS PARA HALLAR EL MVD: LISTA DE CHEQUEO

DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE ENDOTOXINAS PARA ARTÍCULOS NO

FARMACOPEICOS

11.1 Marco teórico


Consiste en verificar si el Reactivo de Lisado de Amebocitos (LAL) tiene la sensibilidad etiquetada y/o se encuentra dentro de los rangos aceptables (0,5 lambda a 2 lambda). Para esto, se enfrentan diferentes concentraciones de un Control Estándar de Endotoxinas con el reactivo de LAL.

Se reconstituye el Control de Endotoxinas (5 000 EU/vial) con 5 mL de agua apirógena certificada, homogenizándola en un vortex por 30 minutos.

Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma aséptica hasta obtener concentraciones de endotoxina de: 2 λ, λ, 0,5 λ, 0,25 λ, las cuales son equivalentes a:

Spike*: 0,6 UE/ mL 2 λ: 0,06 UE/ mL λ: 0,03 UE/ mL 0,5 λ: 0,015 UE/ mL 0,25 λ: 0,0075 UE/ mL

11.2 Competencias




o 2 Baño María a 37ºC o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm o 4 Cronómetros o 4 Termómetros o 4 Micropipetas de 100 uL (Eppendorf) o 4 Micropipetas de 10 uL (Eppendorf) o 4 Agitadores Vortex o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirógenos de 10 x 75 mm o 4 Cajas de tips apirógenos de 5 a 100 uL o 1 Caja de tiras indicadoras de pH o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180ºC x 3 horas) envueltas

en paquetes de 8 tubos con papel aluminio. o 10 Pipetas de 10 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio. o 10 Pipetas de 5 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio. o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio.


o 1 Frasco de control estándar de endotoxina o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus o 8 Frascos de agua LAL

11.4 Procedimiento



11.5 Resultados


11.6 Cuestionario






XII. PRÁCTICA Nº 12

PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS Y PRESENTACIÓN DE UNA MATRIZ QUE

INCLUYE TODAS LAS ACTIVIDADES INVOLUCRADAS

12.1 Marco teórico




Usando micropipetas calibradas y tubos despirogenados, se hacen diluciones en forma aséptica hasta obtener concentraciones de endotoxina de: 2 λ, λ, 0,5 λ, 0,25 λ, las cuales son equivalentes a:

Spike*: 0,6 UE/ mL 2 λ: 0,06 UE/ mL λ: 0,03 UE/ mL 0,5 λ: 0,015 UE/ mL 0,25 λ: 0,0075 UE/ mL

12.2 Competencias




o 2 Baño María a 37ºC o 4 Gradillas para 40 tubos de 10 mm x 100 mm o 4 Gradillas para tubos de 18 x 150 mm o 4 Cronómetros o 4 Termómetros o 4 Micropipetas de 100 uL (Eppendorf) o 4 Micropipetas de 10 uL (Eppendorf) o 4 Agitadores Vortex o 8 Paquetes de 50 tubos cada uno apirógenos de 10 x 75 mm o 4 Cajas de tips apirógenos de 5 a 100 uL o 1 Caja de tiras indicadoras de pH o 50 Tubos de 18 x 150 mm despirogenizados con tapas de acero (180ºC x 3 horas) envueltas

en paquetes de 8 tubos con papel aluminio. o 10 Pipetas de 10 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio. o 10 Pipetas de 5 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio. o 20 Pipetas de 1 a 2 mL despirogenizadas a 180ºC x 3 horas con papel aluminio.


o 1 Frasco de control estándar de endotoxina o 8 Frascos del reactivo Lisado de Amebocitos de Limulus o 8 Frascos de agua LAL

12.4 Procedimiento




12.5 Resultados


12.6 Cuestionario

- Elabore un alista de verificación sobre todas las actividades y pruebas del examen microbiológico para una forma farmacéutica no estéril sólida, semisólida y líquida.





XIII. PRÁCTICA Nº 13

PRUEBA DE POTENCIA ANTIBIÓTICA PARA UN ANTIMICROBIANO:

OPERACIONES PRELIMINARES, PREPARACIÓN DE MATERIALES, ESTÁNDAR,

INÓCULOS Y EJECUCIÓN DEL ANÁLISIS

13.1 Marco teórico

Este ensayo aplica a las formas farmacéuticas semisólidas y líquidas y también como en la práctica precedente incluye pruebas que permiten calcular el número de microorganismos aeróbicos viables y el número de hongos filamentosos y levaduras presentes, así como determinar la ausencia de especies microbianas patógenas consideradas como indicadores de contaminación (véase USP 32: <61>, <62> y <1111>).



13.2 Competencias




o 3 Frascos x 50 mL o 3 Frascos x 100 mL o 3 Frascos x 400 mL o 3 Frascos x 1 L o 2 Frasco Roux o 30 Perlas de vidrio o 60 Placas Petri o 10 Pipetas x 1 mL o 10 Pipetas x 2 mL o 10 Pipetas x 5 mL o 10 Pipetas x 10 mL o 4 Sacabocado o 4 Beaker x 10 mL o 3 Alcohol al 70% x 200 mL o 3 Gasa

13.4 Procedimiento


13.4.2. Prueba de Producto: Proceder de la misma forma que en 1.4.1. pero sin inóculo.


Proceder para las siguientes pruebas según se muestra en el texto correspondiente de la practica Nº 6.

POTENCIA ANTIBIÓTICA:

Método Cilindro-Placa de Cultivo

13.5 Resultados


13.6 Cuestionario






XIV. PRÁCTICA Nº 14

SEMINARIO DE INVESTIGACIÓN: PRESENTACIÓN DEL PROTOCOLO DE VALIDACIÓN

DE UN MÉTODO MICROBIOLÓGICO

14.1 Marco teórico

El monitoreo analítico de un producto farmacéutico, o de ingredientes específicos dentro del producto, es necesario para garantizar su inocuidad y eficacia a través de todas las fases de su vida de estantería, incluyendo almacenamiento, distribución y uso. Este monitoreo debería realizarse de acuerdo con las especificaciones validadas durante el desarrollo del producto.

El propósito principal de la validación analítica es garantizar que un procedimiento analítico seleccionado de resultados reproducibles y confiables que son adecuados para el propósito intentado. Es necesario definir en forma apropiada tanto las condiciones en las cuales el procedimiento va a ser usado como el propósito para el cual es intentado. Estos principios se aplican a todos los procedimientos descritos en un farmacopea o no descritos en una farmacopea usados por la empresa fabricante. Estas pautas se aplican a los procedimientos usados para examinar atributos químicos y fisicoquímicos, pero muchos son igualmente aplicables a procedimientos biológicos y microbiológicos.

De acuerdo a algunas personas es virtualmente imposible validar completamente los procedimientos de ensayo para cada microorganismo que podría ser objetable, sin embargo, los métodos son validados generalmente para la recuperación de “microorganismos indicadores” específicos propuestos por las farmacopeas y los que generalmente se requiere estén ausentes del producto.

La validación del método demuestra que cualquier sustancia inhibitoria presente en la muestra ha sido neutralizada/inactivada o diluida a niveles por debajo del nivel inhibidor. Involucra la inoculación de medios de cultivo con niveles bajos de microorganismos inhibidores específicos, en presencia y en ausencia del material a ser ensayado.

La capacidad de los medios para promover el crecimiento de los microorganismos puede afectarse por el proceso de preparación del medio, por los procesos de esterilización y de almacenamiento. La edad de los medios de cultivo puede afectar sus propiedades de promoción del crecimiento y de selectividad. Por esta razón, la vida de estantería de los medios de cultivo debería ser validada y los medios no deben usarse más allá de su fecha de vencimiento. Todos los lotes de medios de cultivo preparados deben ser sometidos a Control de Calidad para garantizar que los medios son adecuados para sus fines propuestos. Los métodos que el fabricante seleccione deben poder detectar confiablemente la presencia de microorganismos objetables tales con especies de Pseudomonas, hongos, Escherichia coli, etc.

14.2 Competencias

- Diseña el protocolo de validación de un método microbiológico y realiza la parte experimental a nivel grupal como actividad colaborativa recopilando la data de todos los ensayos.

- Asume la importancia de la validación de un método microbiológico presentando el estudio completo en el tiempo establecido.


14.3 Material de Revisión Bibliográfica Mejía L. Validación de la Técnica para la Cuantificación de Tilosina en un producto sólido.

Pontificia Universidad Javeriana. Tesis : Bogotá. 2008. 14.4 Procedimiento Diseño de un protocolo de validación en base a la revisión del material bibliográfico propuesto

además de cinco fuentes similares en contenido y nivel.

14.5 Resultados

Exposición del protocolo final.

14.6 Cuestionario

- Elaboración del glosario específico relacionado a validación de métodos analíticos y validación de métodos microbiológicos.




- Mejía L. Validación de la Técnica para la Cuantificación de Tilosina en un producto sólido. Pontificia Universidad Javeriana. Tesis : Bogotá. 2008.

microbiologia aplicada en la industria farmacéutica

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