CICLO ESTRAL

La mayoría de los mamíferos tiene una temporada específica para aparearse y cuando una hembra acepta al macho y copula se dice que está en calor o en estro. El tiempo de duración y las manifestaciones externas del estro difieren en las diversas especies animales, pero un hecho común es la disponibilidad de la hembra para aceptar al macho.

En los mamíferos domésticos el estro suele coincidir con la ovulación (la vaca es una excepción, ya que la ovulación ocurre de 10 a 11 horas después que el estro ha terminado), para asegurar que los ovocitos y espermatozoides estén presentes a un mismo tiempo para mantener una tasa alta de fertilización, ya que la vida del ovocito después de la ovulación y del espermatozoide dentro del tracto reproductor femenino es corta. La duración del ciclo estral y del estro varía en cada especie. Muchos animales además, despliegan cambios en sus patrones conductuales y características físicas externas.

El periodo durante el cual el tracto genital presenta una serie de cambios morfológicos y funcionales, determinados por la influencia de hormonas hipofisiarias (FSH y LH) y ováricas (estrógenos y progesterona), han permitido distinguir las fases del ciclo estral: Proestro, estro, metaestro y diestro.

En algunos casos (vaca, cerdo, rata, ratón) los ciclos suelen suceder ininterrumpidamente mientras no haya preñez, estos animales son poliestrales continuos. En otros, los estros tienen relación con periodos o estaciones de reproducción y presentan dos, tres o cuatro ciclos en cada periodo de reproducción, a éstas especies se les conoce como poliestrales estacionales. Los que sólo tienen un ciclo en cada periodo de reproducción son monoestrales estacionales. En ambos los periodos de reproducción están separados por una fase llamada anestro, durante la cual no se presenta el ciclo estral y se caracteriza por el predominio de leucocitos en el frotis vaginal.

En mamíferos rumiantes, algunos ungulados y perisodáctilos, el epitelio vaginal no refleja la actividad ovárica.

La determinación de la fase del ciclo estral se lleva a cabo mediante la toma de un frotis vaginal, donde es posible observar los cambios citológicos de las células de descamación de la vagina.

En la rata podemos encontrar tres tipos de células: Células epiteliales superficiales queratinizadas, células epiteliales basales y leucocitos polimorfonucleares.

Durante el proestro el epitelio de la vagina se engrosa, como resultado de la proliferación de las capas profundas, siendo las capas superficiales aún nucleadas, mientras que por debajo de éstas aparecen células con gránulos de queratohialina.

En el estro el epitelio vaginal engrosado se queratiniza en sus capas más superficiales y las células tienen una apariencia cornificada. Este periodo se caracteriza por la aceptación del macho por la hembra.

Si el animal no copula entra en metaestro. Durante este periodo el epitelio vaginal se adelgaza, desaparece la membrana basal y los leucocitos polimorfonucleares invaden el epitelio.

En la etapa siguiente, el diestro, el epitelio vaginal aún es delgado y los leucocitos llegan hasta las capas superficiales del epitelio vaginal.

OBJETIVODeterminar las etapas del ciclo estral en la rata por medio de frotis vaginal.

MATERIALRatas o ratonas sexualmente madurasSolución salina isotónicaSolución de lugolPipeta Pasteur o puntas de micropipetaBulbosPortaobjetos y cubreobjetosMicroscopio óptico

Representación esquemática de las fases del ciclo estral en la rata, donde se señalan algunas características distintivas de cada fase (Tomado de Hafez, 1970).

PROCEDIMIENTOI. Localiza el orificio vaginal e introduce en la vagina la punta de una pipeta Pasteur con

aproximadamente 0.15 ml de solución salina. Presiona el bulbo para introducir la solución salina y permite que el bulbo recobre su forma original para que de esta manera se reabsorba la solución (No debes introducir aire durante el procedimiento, ya que esto puede causar infecciones, ni estimular mucho la vagina porque se puede producir pseudopreñez).

Deposita una gota de la solución que ha lavado la vagina sobre un portaobjetos perfectamente limpio, agrega una gota de lugol y coloca un cubreobjetos perfectamente limpio (Evita tocar con los dedos la punta de la pipeta y los cubreobjetos, ya que las células que se descaman de nuestra piel pueden interferir en la interpretación del frotis).

Finalmente, observa al microscopio y determina la fase con ayuda del esquema donde se aprecian cada una de las etapas.

II. Cuestionario:1. ¿Qué son los ciclos reproductivos?2. ¿Qué factores afectan las temporadas reproductivas?3. Elabora un cuadro comparativo donde se muestren ejemplos de temporadas reproductivas para las distintas clases de vertebrados.4. ¿Qué tipo de folículo debe estar en relación con la etapa observada en el frotis?¿Por qué?5. ¿Qué diferencias existen entre el ciclo estral y el ciclo menstrual?6. ¿Explica cuál es la importancia de conocer el ciclo estral en mamíferos no primates?

BIBLIOGRAFÍA Austin C. R. y Short, R. V. 1982. Células germinales y fertilización. La Prensa

Medica Mexicana, S. A. Hafez, E. S. 1970. Reproduction and breeding techniques for laboratory animals. Van, Tienhoven A. 1983. Reproductive physiology of vertebrates.

Ubicación del orificio vaginal que se encuentra en posición posterior al orificio anal (Tomada de Hafez, 1970).

ANÁLISIS SEMINAL

El plasma seminal en el cual se encuentran los espermatozoides durante la eyaculación provee de nutrientes, capacidad amortiguadora y actúa como un vehículo fluido para la transferencia de espermatozoides del aparato reproductor masculino al femenino. Es una mezcla de secreciones de las glándulas accesorias. Su volumen y composición son variables entre las diferentes especies de vertebrados.

Los fluidos seminales son una solución fisiológica, la cual estimula tanto la movilidad como el metabolismo del espermatozoide salido del epidídimo. También tiene capacidad amortiguadora para combatir la condición ácida de la vagina, la presencia de prostaglandinas por ejemplo, puede generar contracciones en el aparato reproductor femenino para ayudar al transporte de espermatozoides. El pH del plasma seminal es alrededor de 7.0, debido a la presencia amortiguadora del bicarbonato, ácido cítrico, proteínas y aminoácidos.

Algunos animales como las aves, producen poco plasma seminal (0.3 ml) con una alta concentración de espermatozoides (7x106/l). El toro generalmente eyacula 4 ml o más, pero la densidad de espermatozoides es baja (1x106/l). El volumen promedio en el humano es de 3 ml, con una densidad ligeramente por debajo de 100 000 células/l.

Una característica única de los espermatozoides eyaculados u obtenidos del epidídimo de mamíferos, es que no son capaces de fertilizar a un ovocito, debido a que necesitan ser capacitados en el tracto reproductivo de la hembra. La capacitación involucra la pérdida de proteínas de superficie y depende de la composición del ambiente del tracto reproductivo de la hembra.

Posición de las glándulas sexuales accesorias.

OBJETIVO1. Conocer las características del semen humano2. Observar los cambios en la movilidad espermática de gametos en epidídimo de ratón

MATERIALBataGuantesSemen fresco obtenido en un frasco limpio(después de un periodo de abstinencia de 3-6 días)Epidídimo de ratón o rataPipetas PasteurPipetas de 1 mlPipeteadorBulbosPortaobjetos y cubreobjetosPapel sedaPapel indicador de pHMicropipetasPuntas para micropipeta de 200 y 1000 lFormaldehído al 3.5%Eosina amarillenta al 2% en PBS (0.1M pH 7.9)Aceite de inmersiónCámara incubadora a 37CPBS 0.1 M pH 7.9Cámara de Neubauer2 Microscopios ópticos por equipoJeringa de plástico de 10 ml sin aguja o probeta de 10 mlHipoclorito

PROCEDIMIENTOI. Examen macroscópico inicial:Antes de iniciar algún procedimiento con las muestras los integrantes del equipo deberán ponerse guantes. Las muestras se incuban a 37C hasta su licuefacción, ya que inmediatamente después de su obtención éste se coagula, para posteriormente

Características de los espermatozoides durante su paso por el epidídimo humano

realizar el análisis seminal. Los parámetros a valorar son: volumen, color, movilidad, concentración, morfología y viabilidad.

Volumen: Con una jeringa o una probeta mide la cantidad de semen obtenido.

Observa el color de la muestra y determina el pH con ayuda del papel indicador de pH. Observa bien el aspecto de la muestra (si existe o no la presencia de sangre o color diferente al normal, demasiados grumos, etc.)

Determina la consistencia: Con ayuda de una aguja determina la filancia, esto es, jala la muestra para formar un hilo.

Licuefacción: Si es posible determina el tiempo de aparición del coágulo desde el momento de obtener la muestra.

II. Examen microscópico:Movilidad espermática: Analiza una alícuota de 10 l de semen, puesta directamente en un portaobjetos, coloca un cubreobjetos de 22x22 mm. Valora 100 espermatozoides para obtener el porcentaje de cada grado.Movilidad normal, si la movilidad total es mayor del 60% (Grados A y B)Grado A ó movilidad progresiva rápida, comprende a los que atraviesan el campo con movimientos de traslación rápidos y lineales.Grado B ó movilidad progresiva lenta, incluye a los espermatozoides con movimientos lentos o aquellos que pese a moverse rápidamente no progresan en su movilidad.Grado C ó con movilidad no progresiva, aquellos que se mueven en su lugar.Grado D, comprende a los inmóviles que a través de estudios de viabilidad se pueden diferenciar de los muertos.

Viabilidad: Coloca 10 l de muestra y 10 l de eosina amarillenta al 2% en PBS 0.1M pH 7.9, en un portaobjetos. Cuenta 100 espermatozoides y diferencia los vivos sin teñir de los muertos teñidos.

Recuento de espermatozoides o concentración espermática: La cuenta de espermatozoides se realiza mediante la lectura en la cámara de Neubauer bajo el microscopio con el objetivo 40x utilizando diluciones de la muestra original (1:10, 1:100) en formaldehído al 3.5%, para fijarlos y evitar que se muevan durante el conteo, asegurando así que la lectura sea más precisa. El volumen de la cámara es de 0.0001 ml en la parte central de los recuadros pequeños. Se cuentan las cabezas únicamente de los espermatozoides dentro de los cuatro cuadros marcados en la figura, que no estén entre dos cuadros. El valor obtenido de espermatozoides se multiplica por 5 para saber

cuantos hay en 0.0001. Realiza el cálculo de cuantos espermatozoides hay en 1 ml, considerando las diluciones hechas.

Volumen= Area x Altura

Volumen= 1mm2 x 0.1mm=0.1mm3

0.1mm3= 0.0001 ml

Morfología: De los espermatozoides fijados (utilizados en el parámetro anterior), coloca 10 l de muestra en un portaobjetos y observa al microscopio con el objetivo 100x. Valora 100 espermatozoides y clasifícalos en normales, con defectos de la cabeza, defectos de flagelo y defectos de la pieza intermedia, para obtener los porcentajes de morfología.

III. Movilidad de los espermatozoides en el epidídimo:Para determinar cambios de movilidad de espermatozoides obtenidos de las diferentes partes del epidídimo de ratón, hazlo conforme al primer punto del apartado II.

Parámetros normalesLa espermatobioscopia se divide en dos partes, examen microscópico y macroscópico.

Aspecto de la Cámara de Neubauer

Morfología espermática: A) Alteraciones de la cabeza, B) Alteraciones de la pieza media, C) Alteraciones de la cola del espermatozoide (Tomado de Pomerol y Arrondo, 1994).

Los valores normales del análisis macroscópico inicial son:ASPECTO: Gris-opalescente y homogéneo, la presencia de hilos sanguinolentos y otro color indican probables infecciones venéreas o uretrales.LICUEFACCION: En algunos casos completa en 60 minutos, menos de 30 anormal (Sin presencia de coágulo, problemas de glándulas accesorias)VOLUMEN: En población mexicana 2-4.4 ml, normal.CONSISTENCIA: Goteo con jeringa forma un hilo de no más de 2 cm, normal (Mayor a este valor, demasiada viscosidad con probables problemas infecciosos o prostáticos).pH: Normal entre 7.2 y 7.8 (Medir antes de una hora). Un pH menor indica azoospermia, mayor a este rango probable infección.

Examen microscópico:CONCENTRACIÓN: Normal 20 x106, aunque se puede considerar normal arriba de 50x106 por mililitro.VIABILIDAD: 75% ó más espermatozoides vivos.

ANÁLISIS CELULAR:Tipos de células presentes: La presencia de células de la línea espermática inmaduras, leucocitos (más de 1x106/ml), eritrocitos, neutrófilos o eosinófilos, bacterias, células epiteliales, es anormal y sugiere la presencia de probable infección de glándulas accesorias.Presencia de aglutinación: Espermatozoides pegados por la cabeza, cola con cola, pieza intermedia con pieza intermedia u otras combinaciones, puede indicar la existencia de alguna causa de infertilidad.Morfología: Es normal un 30% ó más con morfología normal. El porcentaje de malformaciones no debe exceder el 2%, un mayor porcentaje puede indicar problemas genéticos o farmacológicos en la línea espermática o en la espermatogénesis. (Datos tomados del Manual de laboratorio de la OMS para el examen del semen humano. Ed. Panamericana, 3ª edición, Buenos Aires, Argentina.)

Formulario de registro de muestra para análisis de semenAspecto1. Normal 2. Anormal

Licuefacción1. Normal 2. No hay licuefacciónConsistencia1. Normal 2. AnormalVolumen (ml)pHMotilidad (100 espermatozoides)a) Progresión lentab) Progresión lineal lenta o no linealc) Motilidad no progresivad) Inmóviles

a)b)c)d)

Viabilidad (%vivos)Concentración de espermatozoides por mlMorfologíaCabeza% normales% ovales grandes% duplicados/dobles% amorfos% redondos% en alfilerPieza intermedia% normales% gota citoplásmicaCola% normales% anormales (cola doble, enrollada)Células germinales inmaduras

IV. Cuestionario:1. ¿Cuál es la importancia de hacer un análisis seminal?2. ¿Qué importancia tiene la capacitación espermática?3. Elabora los esquemas necesarios para observar todas las estructuras internas y externas de un espermatozoide.4. ¿Qué es la licuefacción del semen?5. ¿En qué sitios puede ocurrir la inseminación en los vertebrados?

BIBLIOGRAFIA Hing-Sing Yu. 1994. Human Reproductive Biology. CRC Press, Inc. Mann T. Y Lutwak-Mann C. 1981. Male reproductive function and semen. Pomerol Monseny, J. M., Arrondo Arrondo, J. L. 1994. Práctica Andrológica.

Ediciones Científicas y Técnicas, S. A.