carrera de especializacion en biotecnologia...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEN-INTI
Materia de Articulación CEBI_E5:
Biología Molecular:
Clase 4
Docente a cargo:
Dra. Ana Paula Domínguez Rubio
Transcripción eucariotas vs procariotas
ARNm procariotas vs. eucariotas
extremo 5’ trifosfato extremo 3’-OH
No se modifican los extremos
Se modifican los extremos
Caperusa Cola poli-A
ARNm
policistrónico
ARNm
monocistrónico
Capping Polyadenylation
ARN polimerasa II eucariota como una
“fábrica de ARN”.
2
3
1 A medida que la polimerasa transcribe el
ADN en ARN, transporta en su cola (C-
terminal domain o CTD) proteínas para el
procesamiento del ARN:
1) capping
2) splicing
3) poliadenilación
El procesamiento del ARN ocurre al mismo tiempo que la transcripción
El estado de fosforilación del CTD de la
polimerasa cambia durante la
transcripción y regula qué proteínas se van
pegando y despegando ARN polimerasa II
1) El capping del ARN es la primera modificación
de los pre-ARNm eucariotas
La tapa final contiene un nuevo enlace 5ʹ-5ʹ entre el
residuo de 7-metil G cargado positivamente y el
extremo 5 ʹ del transcrito de ARN
El capping del ARN es la primera modificación
de los pre-ARNm eucariotas
:
Enlace inusual 5ʹ a 5ʹ 7-metil G con el
resto del ARN.
Caperusa
La caperuza en el extremo 5ʹ de los
ARNm eucariota:
- permite distinguir los ARNm de los otros
tipos de moléculas de ARN presentes
en la célula
- tiene un papel importante en la
traducción de los ARNm en el citosol,
El capuchón 5ʹ-metilo también
Las secuencias codificantes (exones) de proteínas de los genes eucariotas se
interrumpen típicamente por secuencias intermedias no codificantes
(intrones).
Ambas secuencias intrón y exón se transcriben en el ARN el splicing de ARN
elimina las secuencias de intrones de los pre-ARNm recién transcritos
2) El splicing del ARN es la segunda modificación
de los pre-ARNm eucariotas
1977
Pre-
Sólo después de que hayan tenido
lugar el procesamiento y empalme
de los extremos 5ʹ y 3, dicho ARN
se denomina ARNm.
Splicing del ARN de los pre-ARNm eucariotas
Precursor de mRNA o pre-ARNm
ARNm
El splicing de intrones ocurre en secuencias
consenso
El intrón escindido a través del splicing forma un
lazo
La maquinaria que cataliza el splicing del pre-ARNm es
compleja: consta de cinco moléculas de ARN adicionales y
varios cientos de proteínas, y se hidrolizan muchas
moléculas de ATP por evento de splicing
Splicing alternativo
Algunos de los patrones de splicing son específicos para ciertos tipos de células:
- Ej. la α-tropomiosina producida en el músculo estriado es diferente de la obtenida del
mismo gen en el músculo liso.
Sitios de poliadenilación
Los exones de pueden empalmar empalmar de diferentes maneras se
producen diferentes pre-ARNm diferentes variantes de proteínas.
Gen de α-tropomiosina de rata.
El splicing se realiza por el spliceosoma
• Los pasos clave del splicing se realizan mediante moléculas de ARN en lugar
de proteínas.
• Las moléculas de ARN especializadas reconocen las secuencias de
nucleótidos que especifican dónde se realizará el empalme y también
catalizan la unión química del empalme.
• Estas moléculas de ARN, snRNAs (small nuclear RNAs), son relativamente
cortas (menos de 200 nucleótidos cada una), y hay cinco de ellas, U1, U2, U4,
U5 y U6.
• Cada uno está complejada con al menos siete subunidades de proteínas para
formar u snRNP (small nuclear ribonucleoprotein)
El splicing se realiza por el spliceosoma
El splicing es catalizado por un conjunto de snRNPs (que se muestran como círculos de
colores) más otras proteínas (la mayoría de las cuales no se muestran), que juntas
constituyen el spliceosoma.
El spliceosoma reconoce las señales de empalme en una molécula de pre-ARNm, une los
dos extremos del intrón y proporciona la actividad enzimática para los dos pasos de
reacción requeridos
El splicing se realiza por el spliceosoma
Un conjunto de proteínas llamado complejo
de unión exón (exon junction complex:
EJC) permanece en la molécula de ARNm
empalmada
Estas proteínas marcan el sitio de un evento de splicing exitoso e influyen en el
destino posterior del ARNm.
3) Corte y poliadenilación (cola de poliA) en el
extremo 3´
Secuencias de nucleótidos consenso de escisión y poliadenilación para
formar el extremo 3´del ARNm
Formación del extremo 3´ ARNm eucariota
Exportación del ARNm maduro al citosol
Exportación del ARNm maduro al citosol
. Después de que el ARNm se haya exportado al citosol, este receptor de
exportación se disocia del ARNm y se reimporta al núcleo, donde se puede
usar nuevamente. La verificación final indicada aquí, llamada desintegración
mediada por un sin sentido, se describirá más adelante en este capítulo.
Molécula de ARNm lista para la exportación y su transporte a través del poro
nuclear
El receptor de exportación nuclear para los ARNm es un
complejo de proteínas que se une a una molécula de ARNm una
vez que se ha empalmado y poliadenilado orrectamente
Algunas proteínas viajan con el ARNm a medida que se mueve a través del poro, mientras
que otras permanecen en el núcleo.
Los ARN no codificantes también se
sintetizan y procesan en el núcleo
ARN polimerasa I
Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en
realidad dos copias, dos alelos, cuyas secuencias son idénticas). El gen tiene 70
kpb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el citoplasma de fibroblastos
dos RNA mensajeros de 7,7 y 8,0 kb de longitud, respectivamente.
El de 7,7 kb es idéntico en secuencia al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que
carece de un segmento interno de 0,3 kb.
a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kpb) y sus
mensajeros (aproximadamente 8,0 kb)?
b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes?
Discuta los posibles mecanismos que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué
implicancias biológicas podría tener la presencia de los dos mRNAs?
Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que
otros sólo expresan el de 8,0 kb, y decide investigarlo usando hibridación de
sondas de cDNA radiactivo a preparaciones de mensajero total de distintos tejidos.
c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una
de las siguientes tres sondas? Justifique.
i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb.
ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb.
iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb.
PROBLEMA 4
Northern blot
El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA
transcripto primario y los exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro.
Se ha descripto splicing en transcriptos primarios tanto de RNAs mensajeros (el
más común) como de RNAs ribosomales y de transferencia (menos frecuentes).
Las reacciones de splicing pueden ser reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo
de ensayo si se colocan en el mismo los sustratos adecuados y las enzimas o
complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro« dos tipos distintos
de reacciones de splicing:
I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero.
II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal.
Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en
presencia o en ausencia de una preparación nuclear enriquecida en spliceosomas.
A distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron muestras y se las
sembró en calles de un gel de poliacrilamida donde, luego de la electroforesis, se
observan bandas radiactivas correspondientes a los sustratos, moléculas
intermediarias y productos de las reacciones. La posición de cada uno de éstos
está representada por diagramas, donde los rectángulos son exones y las líneas,
intrones.
PROBLEMA 5
Preguntas:
a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la
variación con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la
izquierda.
b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente?
c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la
preparación de spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras:
i) Calentamiento a 100ºC por 10 minutos y enfriamiento rápido en hielo.
ii) Digestión con una lipasa (enzima que degrada lípidos, es decir, grasas).
iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas).
iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA).
v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA). Nota: Las enzimas mencionadas fueron eliminadas antes de agregar la preparación de spliceosomas pre-
tratada al tubo donde se ensaya la reacción de splicing in vitro.
d) Identifique sustrato, producto/s e intermediario/s de la reacción e interprete la variación
con el paso del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda.
e) Dado que los patrones de bandas son idénticos en ambos paneles, es decir en
presencia o en ausencia de preparación de spliceosomas, ¿qué puede Ud. concluir sobre
el mecanismo del splicing de este RNA ribosomal comparativamente con el del RNA
mensajero?
f) ¿Cuál podría ser la causa de que la cantidad de la forma varíe con el tiempo de
incubación de manera diferente de la cantidad de la forma ?