caracterización y métodos de estudio - apache2 ubuntu...
TRANSCRIPT
2 DNAs, uno lineal y otro circular, de igual composicion, tienen
distinta densidad??
Separación por centrifugación
de equilibrio en gradiente de densidad de en CsCl
δ
Concentración: 0.7% a 2%.
0.7% DNA grandes (5–10kb)
2% fragmentos pequeños (0.2–1kb).
Para muy pequenos = polyacrylamide gel
Buffer: TBE = Tris Borate EDTA o TAE tris Acetato
Electroforesis en gel de agarosa
Superenrrollamiento (ADN circular)
Lk (numero de enlace) = Tw + Wr
Tw = número de vueltas de la hélice
Wr = grado de retorcimiento o
superenrrollamiento
Lk define la topología del ADN.
Para acomodar del desenrrollamiento,
el DNA se retuerce -2 vueltas.
El superenrrollamiento (-) (o right-
handed) introduce una tensión que
favorece el desenrrollamiento
Lk solo cambia por ruptura de un
enlace fosfodiester (topoisomerasas)
Tw= 12 vueltas
Wr= 0 vueltas
Lk=12 vueltas
Tw= 14 vueltas
Wr= -2 vueltas
Lk=12 vueltas
desenrollo
Los agentes intercalantes (bromuro de etidio) desenrollan el ADN
introducen superenrrollamientos (+)
El grado de
superenrrollamiento
afecta la densidad
del ADN
expuestos diferentes
tiempos a
topoisomerasas
Ni la sedimentación con ClCs ni la electroforesis en gel de
agarosa puede discernir entre ADN superenrollado (+) o (-)
ADN genómico:
lineal (o circular)
gran tamaño
lenta renaturalizacion
menor estabilidad
ADN plasmídico:
generalmente
circular(superenrrollado)
pequeño tamaño
facil renaturalizacion
mayor estabilidad
Obtención de DNA plasmídico
ADN genómico:
adherido a la membrana
esencial para la
supervivencia y normal
funcionamiento
ADN plasmídico:
libre
resistencia a antibióticos,
producción de toxinas,
etc.
Obtención de DNA plasmídico
Lisis alcalina:
buffer + EDTA (quelante de Ca+2 y Mg+2)
0.2M NaOH + SDS 1% (pH 12.0-12.5)
Ruptura de membrana celular
Desnaturalización selectiva de DNA genómico y proteínas
Lisis de RNA
Neutralización con alta [sales]:
AcK 3M
Renaturalización y agregado insoluble de DNA genómico
Precipitación de complejos SDS-proteínas K-SDS-membrana y
RNA de alto peso molecular:
Los 3 mayores contaminantes macromoleculares co-precipitan y pueden ser removidos
por ultracentrifugación
Obtención de DNA plasmídico
Concentrado del DNA plasmídico:
Precipitación con alcohol y bajas temperaturas
Eliminación de sales y electrolitos pequeños:
Lavado con etanol
Electroforesis en gel de agarosa
Detección con bromuro de etidio
Obtención de DNA plasmídico
Southern blot (DNA)
Se usan enzimas de restricción para cortar el ADN en pequeños
fragmentos.
Se realiza una electroforesis en gel de agarosa para separar por tamaño.
Si algunos de los fragmentos quedaron grandes (> 15 kb), se trata ton HCl
para despurinizar y romperlo en pedazos mas chicos para que sea mas
eficiente la transferencia del gel a la membrana.
Se trata el gel con NaOH para desnaturalizar el dsADN, esto favorece la
unión a la membrana y destruye cualquier ARN residual
Southern blot (DNA)
Se coloca una hoja de nitrocelulosa o nylon sobre el gel, presionando. El ADN
con carga (-) se une a la membrana con carga (+)
Calentar la membrana a 80 °C por 2 horas o exponerla a UV para fijar el ADN.
Exponer la membrana a la sonda radiactiva o fluorescente para hibridizar.
Para asegurar la union específica de la sonda, se usa ADN de salmon para
bloquear la superficie de la membrana.
Se lava la sonda con buffer y se revela la membrana